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1000倍以上に感度が向上した高分解能固体NMR

大阪大学 蛋白質研究所

教授 藤原 敏道

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• 原子分解能での物質構造・機能解析法。化学構造解析、生体高分子の構造解析、材料構造解析、分子間相互作用解析などで必須の機器分析法

• X線結晶構造解析が及ばない非結晶の材料、生体膜にある蛋白質分子などの立体構造を解析可能

• 欠点は低感度。可視光分光などに比べてエネルギーなラジオ波を用いる分光学であるため

高分解能NMR分光の従来技術とその問題点

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• 高圧ヘリウムガスを循環させることにより、30K程度の極低温で試料ローターを10kHzで回転させる

• これを高磁場下でのサブミリ波照射と組み合わせて、電子スピン分極を利用する動的核分極法により高分解能固体NMRの感度を1000

倍以上向上させた

新技術である感度向上法、動的核分極の概要Dynamic Nuclear Polarization、 DNP

ΔE

N+

N–

M0=(γh/4π) (N––N+)

N+/N–=exp(–ΔE /kT)

ΔE =γB0=hν0

ν0 at 16.4 T T (N––N+)/(N–+N+) Enhancement

1H 700 MHz 300 K 0.006% 1

1H 700 MHz 20 K 0.08% 15

e 460 GHz 20 K 50% 9000

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温度20K、静磁場16.4Tでの磁化増大

e

1H−13C

1H−

Radical

ProteinTerahertz light source460-GHz tunable gyrotron

700MHz Solid-state NMR Low-temp MAS Probe Sample rotor

Low Temp

103-fold increase in

NMR sensitivity

Enhancing nuclear

polarizationPolarization

transfer

高磁場動的核分極

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Gyrotron #1(Freq-

modulation)

30KGyrotron #2

(Freq-

tunable)Closed-cycle

He-MAS system

700MHz/460GHz (16.4T) 動的核分極核磁気共鳴分光計

700 MHz NMR MW combiner

460GHz

Double-Gyrotron

Setup

20K MAS

HC-DNP probe

>10W >10W

QO transmission

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連続周波数可変ジャイロトロンFU CW VI

T. Idehara et al.、 J IR MM Waves 31、 775- (2010)

15T SCM

15T SCM

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•Use of axial mode jumps:mode=TE06q （q=1、 2、 3 …)

•Use of backward wave interaction

Univ of FukuiFar IR Region Research Center

B

D

R

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T ≤ 50 K T ≈ 300 K

700MHｚ-460GHｚでのヘリウム循環マジック角回転動的核分極核磁気共鳴装置

マジック角回転 (MAS)

Magic Angle Spinning

(1,1,1)

B0

z

y

x (1,1,0)

mas = 54.7°

3cos2mas1=0

mas

3.2-mm f ZrO2/Si3N4 Rotor

試料回転速度: 10 kHz

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Resonance Frequency 100 MHz

MAS Frequency 10 kHz

バリンの13C-NMRスペクトル

HOOC-CH-NH3

CH3 CH3

CH

10

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• ヘリウムガスの再利用により、ヘリウムの消費がない

• 冷凍機による冷却で長時間安定した極低温ガス流を供給できる

• 高出力ラジオ波およびサブミリ波に対して絶縁性の高い環境をもたらす

新技術：閉鎖系極低温ヘリウム循環法によるDNP-NMRの特徴

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• 従来の液体ヘリウムを気化させてローター回転する方法に比べて、ヘリウムガスを局所的に再利用するので超高感度NMR実験を経済的かつ安定に長時間実施できる

• 窒素ガスを用いる方法に比べて、より低温を利用できるためNMR測定の感度も向上する

新技術の従来技術との比較

16.4Tでの閉鎖系ヘリウムマジック角炭素13核磁気共鳴

εTemp: ≈ 10

40 K

300 K

7.6x

(1/ 1.3)x

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Disappearance of Leu Cd2

Appearance of Phe ring 13C

**

•4kHz MAS•10 hrs acq.•70kHz decoupling (15ms)

700MHzラジオ

波照射で放電がない

FWHH = 1、150Hz

T = 40K

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ペプチドのヘリウム循環マジック角回転炭素13核磁気共鳴

Spin Lock

Spin Lock

contact time

90x B1H

y

B1Cy

M yH B 1H

B 0

M yC B 1C

動的核分極プロトン炭素13核磁気共鳴パルス列

Hartmann-Hahn Condition:

gHB1H=gCB1Cy

Dec1H700 MHz

13C175 MHz

Electron460 GHz

CW/Pulse

Cross-Polarization

Cross-Polarization

Dec

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高磁場動的核分極用ラジカル化合物

1. g tensor

2. numb of radicals(concentration)

3. e-e distancesBDPA

TEMPOL

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AMUPOL

~33 K、14.1Tでのマジック角回転動的核分極核磁気共鳴

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1H Frequency (kHz)

Sample Temperature (K)

by 1-kHz MAS

Enhancementrelative to room-temp NMR

= 47 x 10 x 1.2 550(DNP) (Temp) (Low Noise)

Amino silane

SiO2

ON (2 scans)

ON (128 scans)

OFF

a

bc d e

？

アミノシラン修飾シリカへの動的核分極核磁気共鳴の応用

•Flexural strength

•Water resistance

•Better wetting

•Smoother surface

<Organo-functionalized materials>

Toray Research Center

動的核分極により材料の誘起ナノコーティング剤だけでなく微量副生成物カラバメートの観測ができた

Enhancement 150

εDNP~30

x

εBoltz~5

T =60 K、vR = 5 kHz

18

19

1.E-05

1.E-04

1.E-03

1.E-02

1.E-01

1.E+00

1 10 100

3

100

10

1

0.1

0.01

P / %

3

0.3

0.03

0.003

6 10 60 300 50030 100

T / K

30Electron Spin

Proton Spin

0.0056%1H-NMR

700 MHz

461 GHz6%

16.4 Tでの温度の関数としての分極

DNP-1H NMR

20%

0.05%1H-NMR

x 1000x 120

x 8.3

20

• 高分解能磁気共鳴測定の超高感度化

• より微量な試料を対象にした分子構造解析

• 材料界面や生体分子に関する原子分解能での構造および機能解析

想定される用途

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• 極低温20Kでの更なる試料高速回転

• 分光用高出力サブミリ波の発生と照射

• 超高感度化のための不対電子を持つ分子の開発

実用化に向けた課題

• 小型ローターの開発

• ジャイロトロンとサブミリ波伝送系の開発

• バイラジカルや遷移金属化合物の利用

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• 超高感度NMR解析法の応用課題の募集

• 材料系や生体分子系で詳細な解析が可能

• 解析対象系に合わせて、試料調製法や測定法を開発できる

• DNP装置の要素技術（極低温Heガス循環、高出力サブミリ波照射）の提供・協力

企業への期待

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発明の名称： NMRプローブ（循環方式冷却機を用いた動的核分極固体高分解能NMR装置）

出願番号： 特願2015-016082

出願人： 大阪大学、日本電子(株)

発明者： 中村新冶、松木陽、藤原敏道

本技術に関する知的財産権

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2006年-2011年 JST先端計測分析技術・機器開発プログラム機器開発タイプ（領域特定型）

2010年- 先端核磁気共鳴装置群の産業利用支援(文科省先端研究施設共用促進事業・阪大)

2011年-2014年 JST先端計測分析技術・機器開発プログラム「開発成果の活用・普及促進」

2014年- JST先端計測分析技術・機器開発プログラム最先端研究基盤領域機器開発タイプ

産学連携の経歴

先端NMR共用プラットフォーム施設

Riken YokohamaNMR facility

Osaka UnivInst. Protein Research

Yokohama City UnivHigh Field NMR

Soln：600x2、 700x2、 800x2、 900x3Solid：700 Pipeline from sample preparation to NMRHTS Magnet、 Isotope labaling

Soln：500、 600、 700、 800、 950Solid：900 Pharmaceutical Application LC-NMR NMR for Interaction Analysis

Soln：400、 500、 600、 800、 950Solid：500、 600、 700x2 Institute for Shared UseDNP-NMR、 Database BMRB

25900 MHz

900 MHz

700 & 600 MHz DNP

９５０ MHz

阪大蛋白研の高磁場NMR分光装置

Solution NMR

Solid-state NMR

８００ MHz ６００ MHz ５００ MHz

７００ MHz DNP

５００ MHz

４００ MHz９５０ MHz

World’s highest

SNR

High sensitivity by cryogenic detection systems

Auto-Exchanger for 60 samples

Hyperpolarizationwith 460GHz gyrotrons

６００ MHz DNP

19F-NMR probes

950 MHz:World’s highest sensitivity

400-950 MHz:Widest field range in Japan

600、 700 MHz DNPs:High-field DNP by He cooling

500-700 MHz:Dedicated SS-NMR spectrometers

NMR spectrometers with advanced technologies

enabling wide applications

26７００ MHz 80 kHz MAS by 1mm rotor

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大阪大学 藤原敏道

先端核磁気共鳴装置群の産業利用支援プログラム

ＴＥＬ 06－6879－8598

ＦＡＸ 06－6879－8599

e-mail tfjwr＠protein.osaka-u.ac

nmrkaihou＠protein.osaka-u.ac(測定依頼)

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