1. separa ČnÉ metÓdy · separačné metódy e-analytická chémia, Ústav analytickej chémie...

Separačné metódy

e-Analytická chémia, Ústav analytickej chémie STU, 2006 5

1. SEPARAČNÉ METÓDY

Separácia zmesi látok môže byť založená na dvoch princípoch:

1. rôzna distribúcia látok medzi dve fázy 2. rôzna rýchlosť pohybu jednotlivých látok v jednej fáze

Do prvej skupiny separačných metód možno podľa skupenstva fázových systémov zaradiť metódy ako sú destilácia, rektifikácia, zrážacie metódy, elektrolýza, sublimácia, kryštalizácia a pásmové tavenie. Uvedené klasické separačné metódy sú málo účinné a pri separácii zložitých zmesí látok sú úplne nepostačujúce. Z tohto dôvodu sa hľadali novšie a najmä účinnejšie metódy na separáciu zmesí látok, ktoré sa súborne nazvali chromatografické metódy.

Do druhej skupiny separačných metód sa zaraďujú metódy, pri ktorých sa separujú látky na základe rôznej pohyblivosti ich iónov v elektrickom poli. Do tejto skupiny patrí elektroforéza a izotachoforéza. 1.1. CHROMATOGRAFICKÉ METÓDY

Chromatografiu objavil v roku 1903 botanik M. S. Cvet, ktorý ako prvý rozdelil na stĺpci sorbentu zmes listových farbív. Odvtedy prešla chromatografia veľkým vývojom a v súčasnosti sa používa pri separácii veľmi zložitých vzoriek, ako sú napr. extrakty biologického materiálu alebo extrakty zo vzoriek životného prostredia. Často sa používa i pri kontrole rôznych výrobných procesov, v potravinárskej a vo farmaceutickej chémii a najmä pri stopovej analýze.

Pod názvom chromatografické metódy možno zahrnúť všetky operácie, ktoré sú založené na fyzikálno-chemických princípoch, pri ktorých dochádza k postupnému, mnohokrát opakovanému vytváraniu rovnovážnych stavov separovaných látok medzi dvoma fázami. Fáza, ktorá sa nachádza v chromatografickej kolóne alebo na tenkej vrstve sa nazýva stacionárna, fáza, ktorá zabezpečuje pohyb separovanej látky sa nazýva mobilná. Vo všeobecnosti, sa pre stacionárnu fázu používa výraz "sorbent".

Chromatografické metódy možno rozdeliť podľa viacerých hľadísk. Najčastejšie sa rozdeľujú do skupín podľa:

a) skupenstva mobilnej fázy b) separačného princípu c) experimentálneho usporiadania.

Separačné metódy


a) V prvom prípade, ak mobilnou fázou je plyn hovorí sa o plynovej chromatografii, ak je mobilnou fázou kvapalina ide o kvapalinovú chromatografiu. Menej častejšie sa používa ako mobilná fáza kvapalina, ktorá sa nachádza v kritickom stave a tento separačný systém sa nazýva chromatografia s mobilnou fázou v nadkritickom stave (supercritical fluid chromatogra-phy, SFC).

b) Základným predpokladom úspešnej separácie zmesi látok je ich rôzna interakcia so stacionárnou a mobilnou fázou. Tieto interakcie môžu byť založené na rôznych princípoch. Môže to byť:

• adsorpcia, • Nernstov rozdeľovací zákon, • výmena iónov, • chemická reakcia, • veľkosť molekúl (sieťový efekt).

Pri adsorpčnej chromatografii je stacionárnou fázou adsorbent (tuhá fáza). Separácia zmesi sa môže uskutočniť v roztoku, alebo v plyne.

Pri separácii zmesi na základe rozdeľovacieho zákona dochádza k rozpúšťaniu látok v dvoch navzájom obmedzene miešateľných fázach a k vytváraniu rozdeľovacích rovnováh. Stacionárna fáza je nanesená v podobe tenkého filmu na povrch inertného nosiča (napr. kremelina) definovaného zrnenia. Tento separačný mechanizmus sa môže využiť v systémoch kvapalina - kvapalina alebo kvapalina - plyn.

V prípade využitia separačného mechanizmu výmeny iónov je stacionárnou fázou ionex. Na základe chemisorpcie dochádza k výmene iónov medzi ionexom a látkou, ktorá sa nachádza v roztoku.

Separácia na základe chemickej reakcie medzi tuhou látkou (afinantom) a separovanou látkou sa využíva v afinitnej chromatografii.

Posledný mechanizmus je založený na rozdielnej veľkosti molekúl, pričom k separácii dochádza podľa efektívneho rozmeru molekúl. V systéme tuhá fáza - plyn ide o plynovú chromatografiu na molekulových sitách a v prípade separačného systému tuhá fáza - kvapalina ide o gélovú chromatografiu.

Okrem uvedených hlavných typov chromatografie sa uvádzajú aj ďalšie typy ako sú iónovo - párová chromatografia a chromatografia na chemicky viazaných fázach.

Pri separácii zmesi látok spravidla prevažuje jeden princíp, pričom niektoré ďalšie princípy separáciu ovplyvňujú menej. Prehľad základných typov chromatografie je uvedený v tab. 1.

c) Podľa experimentálneho usporiadania možno chromatografiu rozdeliť na kolónovú -separačný proces sa realizuje v chromatografickej kolóne naplnenej sorbentom a tenkovrstvovú (planárnu) - separačný proces sa realizuje na tenkej vrstve sorbentu. Okrem uvedených možností experimentálneho usporiadania možno chromatografický proces realizovať na papieri, ide o papierovú chromatografiu, kde ako stacionárna fáza je spravidla voda (napr. vzdušná vlhkosť) a nosičom stacionárnej fázy je papier (celulóza).

Podľa spôsobu dávkovania vzorky do chromatografickej kolóny a podľa zloženia mobilnej fázy možno chromatografiu uskutočniť tromi spôsobmi:

Separačné metódy


1. Frontálna chromatografia - roztok vzorky v mobilnej fáze (plyn alebo kvapalina) sa kontinuálne dávkuje do chromatografickej kolóny. Napr. pri separácii trojzložkovej zmesi A, B, C, z kolóny najprv bude vytekať čistá mobilná fáza, potom začne vytekať (eluovať) roztok zložky A, ktorá má najmenšiu afinitu k stacionárnej fáze, potom zmes A + B a nakoniec bude eluovať z kolóny pôvodný roztok - A + B + C. Touto technikou možno získať v čistom stave len prvú elujúcu sa zložku. Frontálna chromatografia sa v analytickej praxi používa zriedkavo, pretože po každej analýze je potrebné náplň kolóny regenerovať alebo ju vymeniť. Tabuľka 1 Základné typy chromatografie

mobilná fáza stacionárna fáza separačný

princíp druh chromatografie

označenie v literatúre

tuhá látka (adsorbent)

adsorpcia

adsorpčná chromatografia

GSC

tuhá látka (molekulové sito)

sieťový efet plynová chromatografia na molekulových sitách

plyn

kvapalina na tuhom nosiči

rozdeľovací zákon

plynová rozdeľovacia chromatografia

GLC

tuhá látka (adsorbent)

adsorpcia

kvapalinová adsorpčná

chromatografia

LSC, HPLC, TLC, HPTLC

tuhá látka (ionex) výmena iónov

ionexová chromatografia

IEC

kvapalina na tuhom nosiči rozdeľovací zákon

kvapalinová rozdeľovacia chromatografia

LLC, HPLC, TLC, HPTLC

kvapalina v dutinách gélu sieťový efekt

gélová permeačná chromatografia

GC, GPC

kvapalina

tuhá látka (afinant) chemická reakcia

afinitná chromatografia AC

2. Vytláčacia chromatografia - roztok vzorky sa dávkuje do chromatografickej kolóny

diskontinuálne a ako mobilná fáza sa použije rozpúšťadlo, ktoré má najvyššiu afinitu k stacionárnej fáze v porovnaní so separovanými látkami. Mobilná fáza má funkciu vytláčadla separovaných látok zo stacionárnej fázy. Poradie elúcie separovaných látok je podľa ich afinity k stacionárnej fáze. Vytláčacia chromatografia sa používa v kvapalinovej chromatografii a to najmä v adsorpčnej, afinitnej a v ionexovej chromatografii.

Separačné metódy


3. Elučná chromatografia - roztok vzorky sa dávkuje do chromatografickej kolóny jednorazovo a jednotlivé zložky sa silnejšie sorbujú na stacionárnej fáze ako mobilná fáza. Jednotlivé látky sa potom eluujú z kolóny podľa veľkosti ich sorpcie na stacionárnu fázu v podobe samostatných zón. Tento typ chromatografie sa v praxi používa najčastejšie, keďže uvedeným spôsobom možno dosiahnuť najlepšiu separáciu zmesi látok. Ak sa mení zloženie mobilnej fázy v priebehu chromatografického procesu napr. do mobilnej fázy sa pridáva kontinuitne rozpúšťadlo, ktoré má väčšiu sorpčnú schopnosť ako pôvodná mobilná fáza ide o gradientovú elúciu. Z polohy maxima elučného píku možno usudzovať na interakciu danej látky v chromatografickom systéme t.j. na interakciu so stacionárnou a mobilnou fázou. Zároveň z polohy maxima elučného píku možno vypočítať elučné charakteristiky separovanej zložky. V ďalšom texte sa opisuje len elučná chromatografia.

Pri dávkovaní zmesi látok do chromatografickej kolóny sa vytvorí zóna alebo pás, ktorý obsahuje zmes látok. Táto je potom unášaná pomocou mobilnej fázy a na základe rozdielnej interakcie molekúl separovaných látok so stacionárnou fázou dochádza k ich separácii. Jednotlivé zóny odseparovaných látok sa potom detekujú pri výstupe z kolóny v podobe elučných píkov.

Pri prechode látky chromatografickou kolónou prejde každá jej molekula z jednej fázy do druhej. Môžu nastať dva krajné prípady:

a) pri prechádzaní danej látky nedochádza k interakcii jej molekúl so stacionárnou fázou a v tomto prípade je jej rýchlosť prechádzania kolónou rovnaká ako rýchlosť mobilnej fázy, alebo

b) daná látka sa ireverzibilné sorbuje za daných separačných podmienok na stacionárnej fáze a látka ostáva v kolóne. Pri reálnej separácii je treba zabezpečiť, aby separačné podmienky boli také, aby nedochádzalo k uvedeným krajným prípadom.

Obr.1 Distribučná izoterma (a) a koncentračná zóna (b) látok A a B pri ideálnej, lineárnej chromatografii.

cm - koncentrácia látky v mobilnej fáze, cs - koncentrácia látky v stacionárnej fáze, A, B - separované zložky

Separačné metódy


Najjednoduchším modelom chromatografického procesu je ideálna lineárna chromato-grafia (obr. 1). Pri tomto modeli sa predpokladá, že separačná funkcia, ktorá vyjadruje distribú-ciu látky medzi stacionárnu a mobilnú fázu je lineárna a rovnováha sa ustaľuje okamžite. Predpokladá sa tiež, že pri separačnom procese sa neuplatňuje difúzia a že šírka zóny látky sa nemení a je určená pri dávkovaní.

Ďalším modelom je neideálna lineárna chromatografia, kde sa predpokladá, že separač-ná funkcia je tiež lineárna, rovnováha sa ustaľuje okamžite, ale pri separácii sa uplatňuje difúzia. Na základe difúzie sa jednotlivé zóny rozširujú v priebehu separačného procesu a koncentračné rozdelenie látky v zóne je podobné Gaussovmu rozdeleniu náhodných chýb (obr. 2).

Obr. 2 Distribučná izoterma (a) a koncentračná zóna (b) látok A a B pri neideálnej lineárnej chromatografii

cm - koncentrácia látky v mobilnej fáze, cs - koncentrácia látky v stacionárnej fáze; A, B - separované zložky

Pri neideálnej, nelineárnej chromatografii je separačná funkcia nelineárna a v chromato-

grafickom systéme sa uplatňuje difúzia a všetky nežiadúce javy, ktoré spôsobujú nesymetric-kosť chromatografických píkov (obr. 3).

Na základe látkovej bilancie zložky v chromatografickom systéme sa pre uvedené modely odvodili diferenciálne rovnice, ktorých riešenie opisuje hľadanú distribučnú funkciu. Pre model neideálnej lineárnej chromatografie, ktorý dostatočne vystihuje väčšinu chromatografic-kých analýz, bola odvodená diferenciálna rovnica druhého rádu, ktorej riešenie, po zjednodu-šení vyjadruje závislosť koncentrácie zložky v mobilnej fáze na výstupe z chromatografickej kolóny (c) od času t:

2R

max - 1 exp -

2t tc cσ

⎡ ⎤⎛ ⎞= ⎢ ⎥⎜ ⎟⎝ ⎠⎢ ⎥⎣ ⎦

(1.1)

kde c je koncentrácia zložky (mol⋅dm-3) v maxime píku, σ - smerodajná odchýlka, tR - elučný čas.

Separačné metódy


Obr. 3 Distribučná izoterma (a) a koncentračná zóna (b) látok A a B pri neideálnej a nelineárnej

chromatografii

cm - koncentrácia látky v mobilnej fáze, cs - koncentrácia látky v stacionárnej fáze; A, B - separované zložky

Na obr. 4 je znázornený symetrický chromatografický pík, ktorého tvar vyjadruje rovnica (1.1). Hodnota tR sa používa pri kvalitatívnej analýze, hodnota cmax sa uplatňuje v kvantitatívnej analýze a parameter σ charakterizuje kvalitu chromatografickej kolóny - čím je hodnota σ menšia, tým je kvalitnejšia kolóna. Podobnú rovnicu ako je rovnica (1.1) možno získať pre závislosť koncentrácie zložky v mobilnej fáze na výstupe z chromatografickej kolóny od objemu mobilnej fázy.

Obr. 4 Opis symetrického chromatografického píku

š - čas, pri ktorom sa nadávkovala vzorka (konvenčne je tS = 0), tR - elučný čas, σ - smerodajná odchýlka, Y - šírka píku, ktorá je daná priesečníkmi dotyčníc k ramenám píku so základnou líniou, Yh/2 - šírka píku v polovičnej výške, h - výška píku.

Separačné metódy


Na posúdenie kvality chromatografickej kolóny a chromatografických vlastností separo-vaných látok v danom systéme je nutné zaviesť ďalšie parametre. Medzi základné veličiny, ktoré charakterizujú kvalitu chromatografickej kolóny patrí výška teoretickej priehradky. Pred-pokladá sa, že chromatografický systém (kolóna alebo vrstva) možno rozdeliť na jednotlivé úseky (teoretické priehradky), v ktorých sa ustaľuje rovnováha rozdelenia danej látky medzi stacionárnu a mobilnú fázu. Rozdeľovacia konštanta KD potom charakterizuje toto rozdelenie podobne ako pri extrakcii. Jednotlivé úseky kolóny si možno predstaviť ako deliace lieviky. Je samozrejmé, že existencia teoretickej priehradky je hypotetická, pretože separačný proces v chromatografickej kolóne sa uskutočňuje kontinuálne, pričom model teoretickej priehradky predpokladá diskontinuálny proces. Výškový ekvivalent teoretickej priehradky H je taká dĺžka chromatografickej kolóny alebo vrstvy, na ktorej sa dosiahne rovnaká separácia zmesi látok ako na jednom stupni diskontinuálnej extrakcie. Počet teoretických priehradiek bude zároveň udávať počet rovnováh, ktoré ako keby sa uskutočnili v kolóne. Okrem ekvivalentu teoretickej priehradky (H) na charakterizovanie separačnej účinnosti možno použiť aj počet teoretických priehradiek (n), ktorý definuje vzťah:

LHn

= (1.2)

kde L je dĺžka chromatografickej kolóny. Počet teoretických priehradiek možno vypočítať z elučného času (tR) a smerodajnej

odchýlky chromatografického píku (σ) podľa rovnice: 2R2

tnσ

= (1.3)

kde σ2 je rozptyl chromatografického píku. Kombináciou rovníc (1.2) a (1.3) možno odvodiť vzťah medzi výškovým ekvivalentom

teoretickej priehradky (H) a rozptylom píku (σ2):

22R

LHt

σ= (1.4)

Pri neideálnej lineárnej chromatografii má koncentračná zóna chromatografovanej látky gaussovský profil, z čoho vyplýva, že pri opise rozdelenia látky v tejto zóne možno využiť poznatky, ktoré sa týkajú Normálneho rozdelenia chýb. Z teórie o chybách je známe, že celkový rozptyl je súčtom čiastkových rozptylov:

2 2i

2kσ σ= +∑ ∑σ (1.5)

kde σi2 je rozptyl píku spôsobený kolónovými efektami a σk

2 je rozptyl píku spôsobený mimokolónovými efektami.

Medzi kolónové efekty, ktoré spôsobujú rozširovanie zóny chromatografovanej látky, a tým zväčšovanie rozptylu, patria napr. turbulentný tok mobilnej fázy v chromatografickej kolóne, pozdĺžna difúzia látky v mobilnej a v stacionárnej fáze v zmysle koncentračného spádu, odpor pohybu látky v stacionárnej a v mobilnej fáze alebo odpor proti pohybu látky v mobilnej fáze, ktorá stagnuje v dutinách častíc náplne kolóny (stagnantná fáza). Pre jednotlivé rozptyly sa zistili matematické vzťahy, pomocou ktorých možno vypočítať celkový inkrement rozširovania píku vplyvom kolónových efektov.

Separačné metódy


Mimokolónové efekty, ktoré zapríčiňujú rozširovanie chromatografických píkov sú spôsobené predovšetkým: spojmi kapilár medzi dávkovacím zariadením a kolónou, spojmi medzi kolónou a detektorom, kyvetou detektora a dávkovacím zariadením. Aby tieto jednotlivé inkrementy mali čo najmenšiu hodnotu, musia sa použiť kvalitné spoje, musí sa použiť detektor s minimálnym objemom kyvety a použiť také dávkovacie zariadenie, ktoré má najmenší vplyv na rozširovanie zóny (napr. v kvapalinovej chromatografii trojcestný dávkovací ventil). 1.1.1. Elučné charakteristiky v chromatografii

Chromatografický proces sa môže realizovať v kolóne alebo v plošnom usporiadaní. Na charakterizovanie chromatografických vlastností separovaných látok v chromatogra-

fickej kolóne sa používa niekoľko veličín. Medzi hlavné chromatografické parametre možno zahrnúť predovšetkým elučný čas (tR) elučný objem (VR), redukovaný elučný čas (t′R) a redukovaný elučný objem (V′R).

Elučný čas je čas, ktorý uplynie od okamihu nadávkovania vzorky, až kým sa nevymyje uvažovaná látka z chromatografickej kolóny pri maximálnej koncentrácii. Tento čas závisí od rozmerov kolóny a od rýchlosti mobilnej fázy a z tohto dôvodu je potrebné pri uvádzaní hodnoty elučného času uviesť i tieto hodnoty.

Elučný objem je objem mobilnej fázy, ktorý pretečie cez chromatografickú kolónu od okamihu nadávkovania vzorky až kým sa nevymyje uvažovaná látka z chromatografickej kolóny v maximálnej koncentrácii. Hodnota elučného objemu závisí len od rozmerov kolóny a možno ju vypočítať podľa rovnice:

VR = Fm tR (1.6)

kde Fm je objemový prietok mobilnej fázy v kolóne.

Mŕtvy elučný čas (tM) je elučný čas látky, ktorá nie je zadržiavaná v kolóne a jej rýchlosť prúdenia cez kolónu je rovnaká ako rýchlosť mobilnej fázy. Pri jej prechode kolónou nedochá-dza k interakcii medzi stacionárnou fázou a molekulami látky. Mŕtvy elučný objem (VM) sa vypo-číta podľa rovnice:

VM = Fm tM (1.7)

Mŕtvy elučný objem zároveň udáva medzičasticový (medzerový) objem v chromatografickej kolóne alebo inými slovami objem mobilnej fázy v kolóne. Táto hodnota závisí od veľkosti častíc v kolóne, od kvality prípravy danej kolóny a prípadne od ďalších parametrov (napr. distribúcia velkosti častíc).

Redukovaný elučný čas (t′R) sa vypočíta podľa vzťahu:

t′R = tR – tM (1.8)

Redukovaný elučný objem (V′R) sa zistí podľa rovnice:

V′R = VR – VM (1.9)

Použitie redukovaného elučného objemu má predovšetkým výhodu v tom, že vyjadruje skutočný objem, ktorý je potrebný na vymytie danej látky z kolóny pri maximálnej koncentrácii.

Separačné metódy


Okrem hlavných elučných parametrov sa zaviedli i relatívne elučné charakteristiky, kto-rých hlavná výhoda je v tom, že nezávisia od niektorých parametrov ako napr. dĺžka kolóny, rýchlosť mobilnej fázy atď. Z tohto dôvodu ich možno použiť pri porovnávaní jednotlivých hodnôt medzi rôznymi laboratóriami, prípadne pri publikovaní v odborných časopisoch.

Medzi relatívne elučné charakteristiky patria elučný pomer (ri,s), kapacitný pomer (k), zbrzďovací faktor (R) a elučné indexy (I).

Elučný pomer možno vypočítať podľa rovnice:

R,ii,s

R,s

t

rt′

=′

(1.10)

kde t′R,i je elučný čas i - tej látky a t′R,s je elučný čas referenčnej látky, ku ktorej sa vzťahuje elučný pomer.

Kapacitný pomer udáva pomer látkových množstiev uvažovanej látky v stacionárnej a v mobilnej fáze. Látkové množstvo danej látky v stacionárnej fáze (ns) je úmerné času, v ktorom sa látka nachádza v stacionárnej fáze (t′R = tR – tM). Podobne platí, že látkové množstvo v mobilnej fáze (nm) je úmerné času, v ktorom sa látka nachádza v mobilnej fáze (tM). Hodnotu kapacitného pomeru možno potom vypočítať podľa vzťahu:

s R

m M

n tkn t

′= = (1.11)

Zbrzďovací faktor je pomerom rýchlostí danej látky a mobilnej fázy v chromatografickej kolóne:

i uRu

= (1.12)

kde ui je rýchlosť danej látky a u rýchlosť mobilnej fázy. Na základe definície rýchlosti (ui = L/tR a u = L/tM), pre výpočet hodnoty zbrzďovacieho

faktora možno použiť i tento vzťah:

M

R

tRt

= (1.13)

Z uvedených charakteristík najpresnejšie možno vypočítať hodnoty elučného pomeru, no na druhej strane nejednotnosť v určovaní referenčných látok na jeho výpočet spôsobuje, že získané hodnoty je možné len ťažko porovnávať z rôznych laboratórií. Aj z tohto dôvodu sa v chromatografii zaviedli ďalšie parametre - elučné indexy, ktoré vyriešili tento problém.

V kvapalinovej chromatografii sa za základ elučných indexov zvolili aromatické uhľovo-díky. Hodnoty elučných indexov jednotlivých aromatických uhľovodíkov sa navzájom líšili o 1 indexovú jednotku: benzén (I*1 = 1,00); naftalén (I*1 = 2,00); fenantrén (I*1 = 3) atď. Indexy 1, 2, 3 označujú počet benzénových jadier v kondenzovanom aromatickom uhľovodíku. Elučné indexy I* možno vypočítať podľa rovnice:

R,p+1* R,ii

R,p R,p

log logtt

I pt t

⎛ ⎞′⎛ ⎞ ⎛ ⎞′= + ⎜ ⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎜ ′ ′⎝ ⎠ ⎝ ⎠⎝ ⎠

⎟⎟ (1.14)

kde t′R sú redukované elučné časy látky i a polyaromatických uhľovodíkov, medzi ktorými daná

Separačné metódy


látka eluuje, p - počet benzénových jadier v kondenzovanom aromatickom uhľovodíku, ktorý eluuje pred látkou i, p + 1 - počet benzénových jadier v kondenzovanom aromatickom uhľovo-díku, ktorý eluuje za látkou i.

V plynovej chromatografii sa používajú elučné indexy, ktoré navrhol Kováts. Základom pre výpočet Kovátsových indexov (I*i) je homologický rad nasýtených uhľovodíkov a možno ich vypočítať podľa rovnice:

* R,ii

R,n R,n

100 100 log logt t

I nt t

⎛ ⎞′ ′⎛ ⎞ ⎛ ⎞= + ⎜ ⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎜ ′ ′⎝ ⎠ ⎝ ⎠⎝ ⎠

R,n+1 ⎟⎟ (1.15)

kde n je počet uhlíkových atómov v molekule alkánu, ktorý eluuje pred látkou i, n + 1 je počet uhlíkových atómov v molekule alkánu, ktorý eluuje za látkou i.

Hodnoty Kovátsovych indexov n-alkánov sa navzájom líšia o 100 Kovátsovych jednotiek pričom hodnota Kovátsovho indexu metánu je 100, napr. etán má 200, propán 300 atď. Publikované elučné indexy sa v plynovej chromatografii používajú veľmi často pri identifikácii. Keďže majú aditívny charakter - možno ich vypočítať aj z inkrementov jednotlivých častí molekuly. Porovnaním vypočítanej hodnoty Kovátsovho indexu danej látky z experimentálne nameraných veličín s vypočítanou hodnotou pomocou tabelovaných inkrementov možno bližšie charakterizovať danú látku, bez toho, že je k dispozícii štandard alebo publikovaný údaj.

Kombináciou rovníc (1.11) a (1.13) možno získať rovnicu na výpočet elučného času:

( )R M 1t t k= + (1.16)

alebo po vynásobení rovnice (1.16) prietokom mobilnej fázy Fm možno získať ďalšiu rovnicu na výpočet elučného objemu:

( )R M 1V V k= + (1.17)

Hodnotu kapacitného pomeru možno vypočítať podľa upravenej rovnice (1.11):

s s

m m

n c Vkn c V

= = s

m

sV

(1.18)

kde c sú koncentrácie danej látky v stacionárnej alebo v mobilnej fáze, V - objem fáz v chromatografickej kolóne, s - symbol pre stacionárnu fázu, m - symbol pre mobilnú fázu.

Kombináciou rovníc (1.17) a (1.18) možno odvodiť jednu zo základných rovníc pre elučný objem v kolónovej kvapalinovej chromatografii:

R m cV V D= + (1.19)

kde Dc sa nazýva koncentračný distribučný pomer a je definovaný vzťahom:

s

m

ccDc

= (1.20)

Pri odvodzovaní rovnice (1.19) sa predpokladá, že Vm = VM, keďže kvapaliny sú málo stlačiteľné.

V prípade ak látky nedisociujú ani neasociujú, možno rovnicu (1.19) napísať v tvare:

V′R = VR - VM = KD Vs (1.21)

kde KD je rozdeľovacia konštanta, ktorá je definovaná podľa Nernstovho rozdeľovacieho

Separačné metódy


zákona:

s

m m

DaKa c

= ≈ sc (1.22)

kde as a am sú aktivity danej látky v stacionárnej a v mobilnej fáze.

V plynovej chromatografii sú plyny stlačiteľné a z tohto dôvodu je potrebné redukovaný elučný objem (V′R) prepočítať na čistý elučný objem VN) podľa rovnice:

VN = V′R j = j KD Vs (1.23)

kde j je kompresibilný faktor, ktorý zohľadňuje stlačiteľnosť plynov a možno ho vypočítať podľa rovnice:

2

i

03

i

0

13 2

1

pp

jpp

⎛ ⎞−⎜ ⎟

⎝ ⎠=⎛ ⎞

−⎜ ⎟⎝ ⎠

(1.24)

kde pi je tlak na vstupe do chromatografickej kolóny a p0 je tlak na výstupe (spravidla atmosférický tlak).

Separačnú účinnosť chromatografickej kolóny alebo vrstvy možno charakterizovať poč-tom teoretických priehradiek, alebo počtom látok, ktoré možno v danom separačnom systéme rozdeliť.

Počet teoretických priehradiek v kolónovej chromatografii možno vypočítať podľa rovnice:

2 2R2

/ 2

16 5,54 h

tnY Y

= = R2

t (1.25)

kde Y je šírka píku pri základni daná vzdialenosťou priesečníkov dotyčníc k ramenám píku so základnou líniou, Yh/2 - šírka píku v jeho polovičnej výške.

Ďalším parametrom, ktorý charakterizuje separačnú účinnosť kolóny je píková kapacita (PC). Je definovaná vzťahom:

1/ 2R

M

1 ln4

tnPCt

= + (1.26)

kde tR je elučný čas látky, ktorá eluuje z kolóny ako posledná.

Hodnota píkovej kapacity vyjadruje maximálny počet píkov, ktoré možno v danom systéme oddeliť medzi elučnými časmi tR a tM.

Stupeň prekrytia dvoch vedľa seba eluujúcich sa látok možno vyjadriť rozlišovacím faktorom Rj,i, ktorý je definovaný vzťahom:

( )R,j R,ij,i

j i

2 =

t tR

Y Y−

+ (1.27)

kde tR sú elučné časy látok j a i, Y - šírka píkov pri základni.

Separačné metódy


Pre píky, ktoré eluujú tesne vedľa seba alebo sa čiastočne prekrývajú, možno predpo-kladať, že ich šírky pri základni sú rovnaké (Yj = Yi) a vzťah (1.27) možno napísať v tvare:

( )R,j R,ij,i

j

= t t

RY−

(1.28)

Kombináciou rovníc (1.25), (1.28) a (1.8) sa získa rovnica v tvare:

( )1/2R,j R,i

j,iR,j

= 4

t tnRt−

(1.29)

Úpravou rovnice (1.29) a dosadením z rovníc (1.10), (1.11) a (1.16) možno odvodiť vzťah: 1/2

j,ij,i j

j

1 =

4 1rnR

k−

+k (1.30)

Zohľadnením rovníc (1.10) a (1.11) možno upraviť rovnicu (1.30) na konečný tvar: 1/2

j,i jj,i

j,i j

1n = 4 1

r kR

r k−

+ (1.31)

kde n je počet teoretických priehradiek, k - kapacitný pomer, j - symbol označujúci neskôr sa eluujúcu zložku.

Z rovnice (1.31) vyplýva, že hodnotu Rj,i možno zvýšiť:

• pomocou väčšieho počtu teoretických priehradiek napr. predĺžením kolóny alebo zmenšením výšky teoretickej priehradky,

• zväčšovaním hodnoty kapacitného pomeru danej zložky, maximálne do hodnoty 10, pretože pri vyšších hodnotách sa rozlišovací faktor už podstatne nemení,

• zmenou elučného pomeru, nazýva sa tiež selektivita separačného systému, ktorý možno realizovať zmenami zloženia stacionárnej a mobilnej fázy.

Na kvantitatívne vyhodnotenie je potrebné, aby hodnota rozlišovacieho faktora bola aspoň 1,5, keď prekrývanie píkov dvoch vedľa seba eluujúcich sa zložiek je už zanedbateľné.

Rozlíšenie dvoch zložiek závisí aj od ich pomerného zastúpenia, ako je to zrejmé z obr. 5.

Základnou elučnou charakteristikou v chromatografických metódach s plošným usporia-daním je hodnota RF, ktorá je definovaná ako pomer rýchlostí danej látky (ui) a mobilnej fázy (uF):

iF

F

= uRu

(1.32)

Na výpočet hodnoty RF sa v praxi používa rovnica:

F = aRb

(1.33)

kde a je vzdialenosť stredu škvrny danej látky od štartu, b - vzdialenosť čela rozpúšťadla (mobilnej fázy) od štartu.

Separačné metódy


Obr. 5 Rozlíšenie dvoch píkov, ktorých relatívne veľkosti sú v pomere 1 : 1 (horná časť)

a 1 : 4 (dolná časť) s udanými hodnotami Rj,i

Na zlepšenie reprodukovateľnosti meraní sa používajú aj relatívne hodnoty (RF,rel), ktoré

sa vzťahujú na zvolený štandard:

F,iF,rel

F,s

= R

RR

(1.34)

Okrem uvedených charakteristík sa v chromatografii s plošným usporiadaním používa i hodnota RM, definovaná vzťahom:

MF

1 = log 1RR

⎛ ⎞−⎜

⎝ ⎠⎟ (1.35)

Veličina RM má aditívne vlastnosti, čo umožňuje vypočítať túto hodnotu i podľa jednotli-vých inkrementov, z ktorých sa skladá molekula skúmanej látky. Hodnoty inkrementov sú tabe-lované vždy pre daný chromatografický systém. Porovnanie vypočítanej hodnoty z experimen-tálne nameraných dát a hodnoty teoreticky vypočítanej pomocou inkrementov umožňuje bližšie charakterizovať skúmanú látku.

Separačnú účinnosť v chromatografii s plošným usporiadaním možno vyjadriť počtom teoretických priehradiek, ktoré sa vypočítajú podľa vzťahu:

2

d 0

= 16 anY Y⎛ ⎞⎜ −⎝ ⎠

⎟ (1.36)

kde Yd je šírka škvrny po chromatografickom vyvíjaní a Y0 šírka škvrny na štarte.

Separačné metódy


1.1.2. Prístrojová technika a vyhodnocovanie chromatografických záznamov

Schéma zapojenia chromatografickej kolóny v separačnom systéme je na obr. 6. Mobilná fáza zo zásobníka prúdi pomocou čerpadla, redukčného ventilu alebo samospádom cez dávkovacie zariadenie do chromatografickej kolóny, za ktorou je umiestnený detektor, kde sa detekujú jednotlivé dávkované látky. Odozva detektora sa sleduje pomocou registračného zariadenia. Vzorka sa musí dávkovať v najužšej možnej zóne, aby vplyv inkrementu dávkovania na výšku teoretickej priehradky bol čo najmenší.

Separácia v kolóne sa uskutočňuje pri definovanej teplote a z tohto dôvodu je potrebné použiť termostat.

Obr. 6 Schéma separačného systému s chromatografickou kolónou

1 - zásobník mobilnej fázy, 2 - dávkovač, 3 - chromatografická kolóna, 4 - detektor, 5 - registračné zariadenie, 6 - termostat.

Pohyblivou fázou v kolónovej chromatografii môže byť kvapalina alebo plyn. V plynovej chromatografii sa ako pohyblivá fáza používa plyn, ktorý sa nazýva aj nosný plyn, pretože zabezpečuje prestup látok cez kolónu. V kvapalinovej chromatografii je pohyblivou fázou kvapalina, ktorou možno výrazne ovplyvniť selektivitu separačného systému (rj,i) v rovnici (1.31). Zloženie pohyblivej fázy v kvapalinovej chromatografii môže byť rôzne a závisí od použitého separačného princípu. V kvapalinovej chromatografii sa používa i gradientová elúcia, keď sa zloženie mobilnej fázy v priebehu chromatografického procesu kontinuálne alebo diskontinuálne mení (napr. od 30 % metanolu vo vode do 100 % metanolu). Pomocou gradientovej elúcie možno značne skrátiť dobu analýzy, najmä v tom prípade, keď niektorá zložka má veľkú hodnotu kapacitného pomeru pri izokratickej elúcii (pohyblivá fáza má konštantné zloženie).

Separačné metódy


t

Dávkovanie vzoriek v plynovej chromatografii sa väčšinou uskutočňuje pomocou mikro-striekačiek prepichnutím vhodného uzáveru dávkovacieho priestoru. Iný spôsob dávkovania je pomocou trojcestných ventilov, ktorý sa využíva najmä vo vysokoúčinnej kvapalinovej chroma-tografii, kde kapilára s presne definovaným objemom sa naplní vzorkou a prepnutím ventilu sa pomocou pohyblivej fázy vzorka vedie do kolóny.

Chromatografické kolóny bývajú zhotovené zo skla alebo kovu a sú naplnené sorbentom podľa druhu separačného procesu. Dĺžka kolón v plynovej chromatografii býva od 0,1 do 4 m a priemer od 1 do 40 mm. Okrem náplňových kolón sa používajú aj kapilárne kolóny kde stacionárna fáza je nanesená na vnútornej strane kapiláry v podobe tenkého filmu. V plynovej chromatografii majú dĺžku od 10 do 300 m s priemerom od 0,05 do 1 mm. V kvapalinovej chromatografii je priemer kapilár oveľa menší medzi 5 až 10 μm a dĺžka je niekoľko metrov. V kvapalinovej chromatografii sa používajú aj kapilárne náplňové kolóny, ktorých priemer je od 30 do 100 μm.

Rozmery častíc pri náplňových kolónach v kvapalinovej chromatografii bývajú rôzne. Ak sa použije priemer častíc nad 100 μm ide o klasickú chromatografiu. Pri použití častíc s priemerom 3 až 40 μm je väčší styčný povrch medzi fázami, rovnováha medzi fázami pre danú látku sa bude "ustaľovať rýchlejšie" (nikdy sa nemôže dosiahnuť nakoľko ide o dynamický proces), z tohto dôvodu je možné dosiahnuť oveľa väčší počet teoretických priehradok, a preto ide o vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu (HPLC). Rozmery častíc v kolóne musia byť rovnakej veľkosti a presne definované - najčastejšie sa používajú častice priemeru 5 μm alebo 10 μm, s dĺžkou kolóny 10 až 15 cm.

Detektory sú zariadenia, ktoré sú umiestnené tesne za chromatografickou kolónou a detekujú látky, ktoré sa vymývajú z kolóny. Podľa toho, či sa detektormi sleduje koncentrácia alebo hmotnosť eluujúcej sa zložky rozoznávajú sa koncentračné detektory alebo hmotnostné detektory. Z analytického hľadiska je nutné poznať vzťah medzi odozvou detektora a koncentráciou resp. hmotnosťou sledovanej látky. Podľa možnosti je potrebné zvoliť detekčné podmienky tak, aby závislosť medzi koncentráciou (hmotnosťou) zložky a odozvou detektora bola lineárna.

Pre odozvu koncentračných detektorov (R) platí rovnica:

Rc = S1 c (1.37)

kde c je koncentrácia zložky (mol⋅dm-3) v pohyblivej fáze pri vstupe do detektora, S1 konštanta úmernosti - citlivosť detektora pre danú látku - udáva sa v jednotkách odozvy detektora (mV alebo mA) na jednotkovú koncentráciu zložky v mobilnej fáze.

Chromatografický záznam elúcie látky z kolóny je v podobe píku, ktorý je z hľadiska kvantity charakterizovaný jeho plochou (A). Potom možno napísať so zreteľom na rovnicu (1.37) vzťah:

2 2

1 1

t t

1t t

= d dcA R t S c=∫ ∫ (1.38)

Pri konštantnom prietoku mobilnej fázy možno určiť objem mobilnej fázy, v ktorom sa daná látka vymyla z chromatografickej kolóny do detektora (obr. 7) a tým i koncentráciu v rovnici (1.37) nahradiť priemernou koncentráciou:

Separačné metódy


1 mcM V

= (1.39)

kde M je molová hmotnosť uvažovanej látky, m - jej hmotnosť, V = V(t2) – V(t1) - vysvetlenie na obr. 7.

Obr. 7 Plocha chromatografického píku

R - odozva detektora, t - čas, š - štart (čas nadávkovania danej látky)

Dosadením vzťahu (1.39) do rovnice (1.38) možno získať:

( )2 11 t tS mA

M V−

= (1.40)

Ak sa do rovnice (1.40) dosadí definičný vzťah pre prietok Fm = V/(t2 – t1) získa sa vzťah:

*11

m m

S mAM F F

= =mS (1.41)

kde S*1 je citlivosť koncentračného detektora pre danú látku. Z rovnice (1.41) vyplýva, že okrem citlivosti detektora pre danú látku, plocha píku závisí

aj od objemového prietoku mobilnej fázy a aj z tohto dôvodu je potrebné udržiavať v chromato-grafickej kolóne konštantný prietok.

V prípade hmotnostných detektorov, odozva (Rm) je funkciou rýchlosti, akou sa do detektora privádza hmotnosť zložky:

2ddmmR St

= (1.42)

kde S2 je citlivosť hmotnostného detektora pre danú látku. Pre plochu píku možno napísať ako v predchádzajúcom prípade rovnicu:

2 2

1 1

t t

2 2t t

= d d mA R t S t S= =∫ ∫ m (1.43)

Separačné metódy


Z rovníc (1.41) a (1.43) vyplýva, že citlivosť detektora súvisí i so sledovanou látkou, a preto je potrebné pri kvantitatívnej analýze poznať odozvu detektora pre stanovovanú zložku, čo sa zisťuje pomocou referenčného materiálu.

Medza detekcie danej látky sa zvykne udávať ako trojnásobok strednej hodnoty šumu základnej línie detektora. V praxi to znamená, že výška píku musí byť trojnásobne väčšia ako amplitúda šumu základnej línie.

Detektory možno rozdeliť na deštruktívne, keď sa látka chemicky mení a nedeštruktívne, keď látka prechádza detektorom bez chemickej zmeny.

V plynovej chromatografii sa najčastejšie používa plameňovo ionizačný detektor, pracujúci na princípe zmeny vodivosti v plameni, do ktorého sa nosným plynom privádza látka z kolóny. Pri horení organických látok, obsahujúcich C - H väzby, v plameni vznikajú ióny, ktoré zvyšujú vodivosť medzi elektródami, na ktoré je vložené jednosmerné napätie (300 V) (obr. 8). Prítomnosť heteroatómov v molekule organickej látky spravidla znižuje odozvu detektora.

Obr. 8 Schéma plameňovo ionizačného detektora Ďalším často používaným detektorom je detektor pracujúci na princípe elektrónového

záchytu (ECD). Zo zdroja žiarenia napr. 63Ni sa emitujú elektróny, ktoré sú zachytávané predovšetkým elektronegatívnymi prvkami (napr. halogény) alebo funkčnými skupinami (-OH, =CO, -NO2 a pod.), čo sa prejaví zmenou transportu náboja, zvýšenou možnosťou rekombinácie iónov a poklesom elektrického prúdu medzi elektródami, kde sa vedie eluát z kolóny. Ak sa ionizujú látky v eluáte pomocou excitovaných atómov hélia, nesúcich vysokú energiu (He*), ide o héliový detektor. Na rovnakom princípe pracuje aj argónový detektor. Tepelnovodivostný detektor, nazývaný aj katarometer, pracuje na princípe ochladzovania odporového vlákna vyhrievaného elektrickým prúdom nosným plynom prúdiacim z kolóny. Ak sa z chromatografickej kolóny začnú vymývať separované zložky, zmenia sa tepelnovodivostné vlastnosti eluátu, čo sa prejaví zmenou odvodu tepla z odporového vlákna. Zmenou teploty vlákna sa zmení aj elektrický odpor čo sa zaregistruje rozladením Wheatstonovho mostíka, ktorého je odporové vlákno súčasťou (obr. 9). Veľmi výhodné je spojenie plynovej chromatografie s hmotnostným spektrometrom (v skratke GC - MS), čo je selektívny detektor, ktorý umožňuje jednotlivé separované zložky aj identifikovať. Používa sa najmä v oblasti

Separačné metódy


stopovej analýzy zložitých zmesí látok (extrakty vzoriek zo životného prostredia, z biologického materiálu atď.).

Obr. 9 Schéma tepelnovodivostného detektora

A - meracia časť, B - porovnávacia časť, 1 - vstup plynu do detektora, 2 - výstup plynu z detektora, 3 - vkladané jednosmerné napätie

V kvapalinovej chromatografii sa používajú rôzne typy detektorov, pracujúcich na rôznych princípoch. Často sa používajú refraktometrické detektory, ktoré sú neselektívne a pracujú na princípe merania zmeny indexu lomu mobilnej fázy pred vstupom a po výstupe z chromatografickej kolóny. Z tohto dôvodu sa nazývajú aj diferenciálne refraktometrické detektory. Index lomu sa môže merať na základe Snellovho zákona (deflexné detektory) alebo na základe Fresnelovho zákona (reflexné detektory). Nevýhoda týchto typov detektorov je ich nízka citlivosť, a preto sa nepoužívajú pri stopových analýzach. Medzi najpoužívanejšie typy detektorov v kvapalinovej chromatografii patria UV detektory, ktorými sa meria zmena intenzity žiarivého toku, vychádzajúceho zo zdroja, po prechode prietokovou kyvetou. Pracujú na princípe Lambert - Beerovho zákona. Citlivosť UV detektora závisí od optických vlastností separovaných látok, ktoré súvisia s hodnotou molového absorpčného koeficienta pri sledovanej vlnovej dĺžke (pozri optické metódy). Detektory na princípe absorpcie v oblasti infračerveného žiarenia (IR detektory) v kvapalinovej chromatografii sa používajú menej, pretože pri detekcii môže dochádzať k interferencii s mobilnou fázou. Možno ich použiť i v plynovej chromatografii. Fluorimetrické detektory merajú emisie žiarenia látok v prietokovej kyvete po excitácii iným žiarením (pozri optické metódy). Sú to veľmi selektívne detektory a používajú sa najmä v oblasti stopovej analýzy. V prípade, ak látka nemá fluorescenčné vlastnosti, možno z nej pripraviť derivát, ktorý možno registrovať fluorescenčným detektorom (derivatizácia vzorky). Ďalšia veľká skupina detektorov v kvapalinovej chromatografii sú elektrochemické detektory. Pracujú na rôznych princípoch napr. meranie vodivosti eluátu (konduktometrické detektory) alebo meranie elektrického náboja (coulometrické detektory). V súčasnosti sa využívajú najmä ampérmetrické detektory, ktoré možno použiť najmä pri reverzných systémoch - v mobilnej fáze sa nachádza voda. Pri detekcii sa využíva i hmotnostná spektrometria podobne ako v plynovej chromatografii s tým rozdielom, že zariadenia sú oveľa zložitejšie, pretože odstraňovanie kvapalnej fázy pred vstupom do hmotnostného spektrometra je náročnejšie ako odstraňovanie plynnej fázy.

Separačné metódy


Signál, ktorý sa získa pomocou detektora, sa transformuje na elektrickú veličinu a po zosilnení sa zaznamená zapisovačom alebo počítačom. Reakcia na odozvu detektora musí byť dostatočne rýchla a je výhodné použiť rôzne rozsahy zapisovača. Záznam z detektora sa nazýva chromatogram, ktorý sa vyhodnocuje.

Chromatogramy možno vyhodnocovať po stránke kvalitatívnej a kvantitatívnej.

Kvalitatívna analýza je založená na meraní elučných charakteristík, ktoré sa porovná-vajú s elučnými charakteristikami referenčných látok. Samotné chromatografické metódy nepatria medzi identifikačné metódy, ale v spojení s inými metódami napr. s hmotnostnou spektrometriou, IR spektrometriou, UV spektrometriou, sa môžu viac alebo menej priblížiť k identifikácii. Vychádza sa z predstavy, že je už oveľa menej látok, ktoré majú totožné chromato-grafické a tiež napr. optické vlastnosti, čím sa s väčšou pravdepodobnosťou môže zabrániť omylu pri identifikácii. Snaha je vždy získať čo najviac informácií o eluovanej látke a pri analýzach zložitých zmesí sa z tohto dôvodu často zapája za sebou viac detektorov, založených na rôznych princípoch detekcie a pomocou ktorých možno získať napr. UV alebo VIS spektrum eluovanej látky v sledovanej oblasti vlnových dĺžok (detektory s diódovým poľom).

Spoľahlivosť identifikácie možno zvýšiť i použitím viacerých separačných systémov a porovnaním elučnej charakteristiky látky s elučnou charakteristikou štandardu v týchto systé-moch - je menej pravdepodobné, že viaceré látky by mali rovnaké chromatografické vlastnosti v použitých separačných systémoch ako štandard.

Pri identifikácii látky je výhodné použiť selektívne detektory napr. spojenie GC - MS alebo najnovšie spojenie kvapalinová chromatografia - jadrová magnetická rezonancia (pozri optické metódy).

Kvantitatívna analýza je založená na meraní plochy chromatografických píkov (v prípade symetrického píku možno použiť i výšku) alebo pri plošnom usporiadaní experimentu sa meria plocha škvrny, pričom sa zistí ich závislosť od dávkovaného množstva. Keďže odozva detektora pre rôzne látky je rozdielna, treba pri kvantitatívnej analýze použiť referenčné látky. Smernicou lineárnej závislosti je citlivosť detektora pre danú látku. Pri kalibrácii detektora sa používajú najčastejšie metódy kalibračnej krivky alebo metóda štandardného prídavku. Ak sú píky symetrické, možno použiť miesto merania plôch i meranie výšky píkov. Meranie píkov je zložitejšie, keď dochádza k prekrývaniu viacerých píkov. V tomto prípade možno použiť i matematickú dekonvolúciu píkov, čo môže spresniť kvantitatívnu analýzu.

Pri plošnom usporiadaní experimentu sa kvantitatívna analýza robí rôznymi spôsobmi: porovnávaním plochy škvrny stanovovanej zložky s plochou škvrny referenčnej látky, fotometrickým alebo rádiometrickým vyhodnotením, alebo sa látka vyextrahuje z vrstvy vhodným rozpúšťadlom a jej množstvo sa stanoví vhodnou analytickou metódou.

Separačné metódy


1.2. KVAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIA

Klasická kvapalinová kolónová chromatografia je najstaršou separačnou metódou. V súčasnosti sa už veľmi málo používa, pretože analýzy sú veľmi zdĺhavé (niekoľko hodín až dní). Oveľa väčší význam má vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC), kde čas analýzy je oveľa kratší (do 30 minút) i keď vyžaduje náročnejšiu techniku. Veľké nároky sú najmä na vysokotlakové čerpadlá, pomocou ktorých sa pretláča mobilná fáza cez chromatografickú kolónu, pričom prietok musí byť konštantný. Pri použití kolón 10 cm dĺžky s 5 μm časticami je potrebné dosiahnuť tlak na hlave kolóny od 10 do 20 MPa v závislosti od viskozity mobilnej fázy a prietoku (spravidla býva 1 cm3⋅min-1). Pri použití menších častíc sa dĺžka kolóny značne skracuje napr. pri použití 3 μm častíc dĺžka kolóny býva 3 cm. Použiť menšie rozmery častíc sa neodporúča, pretože značne vzrastá tlak na hlave chromatografickej kolóny.

Separácia zmesi látok je založená na princípe rozdielnej afinity jednotlivých zložiek k stacionárnej a k mobilnej fáze. Je zrejmé, že čím dlhší čas látka bude v stacionárnej fáze, tým väčšia bude hodnota jej kapacitného pomeru. Separácia zmesi látok môže byť založená na rôznych princípoch: adsorpcia, rozpustnosť v stacionárnej fáze, chemisorpcia, sieťový efekt alebo špecifické interakcie. Podľa toho rozdeľujeme kvapalinovú chromatografiu na tieto základ-né typy:

1. Rozdeľovacia chromatografia - systém kvapalina/kvapalina, (obmedzene miešateľ-né), separácia je založená na Nernstovom rozdeľovačom zákone.

2. Adsorpčná chromatografia - systém kvapalina/tuhá fáza, separácia je založená na rozdielnej adsorpcii, ktorá závisí od polarity molekúl a polarity adsorbenta.

3. lonexová chromatografia - separácia je založená na princípe chemisorpcie, separujú sa najmä zmesi látok, ktoré sú dobre rozpustné vo vode.

4. Gélová chromatografia - separácia je založená na rôznej veľkosti molekúl separo-vaných látok, objemovo väčšie molekuly nemôžu prenikať difúziou do zosieťovaného gélu a z tohto dôvodu sa vymývajú z chromatografickej kolóny ako prvé.

5. Afinitná chromatografia - princíp separácie je založený na špecifických interakciách separovaných látok s afinantom, ktorý je naviazaný na nosič pomocou kovalentnej väzby.

Okrem uvedených hlavných typov kvapalinovej chromatografie sa používajú aj ďalšie typy chromatografie, pri ktorých sa uplatňuje niekoľko princípov súčasne. Patrí sem iónovo - párová chromatografia a chromatografia na chemicky viazaných fázach.

Ďalším druhom chromatografie je chromatografia s mobilnou fázou v nadkritickom stave ktorá tvorí prechod medzi kvapalinovou a plynovou chromatografiou.

Pri reálnych separáciách je spravidla jeden prevládajúci princíp separácie a ostatné separačné princípy viac alebo menej ovplyvňujú separáciu. Napr. pri separácii zmesi látok metódou rozdeľovacej chromatografie v kolóne naplnenej celulózou (nosič stacionárnej fázy -vody), môžu sa prejaviť aj iónovo-výmenné vlastnosti celulózy (obsahuje -OH skupiny), prípad-ne adsorpcia na rozhraní fáz.

Separačné metódy


Výška teoretickej priehradky v kvapalinovej kolónovej chromatografii závisí od viacerých dejov. Keďže táto veličina je aditívna, možno vplyv jednotlivých faktorov napísať v tvare:

H = H(A) + H(BBm) + H(BsB ) + H(Cs) + H(Cm) + H(C*m) (1.44)

kde H(A) je inkrement výšky, ktorý charakterizuje turbulentný tok mobilnej fázy, H(BBm) – inkrement výšky, ktorý charakterizuje pozdĺžnu difúziu látky v mobilnej fáze H(BBs) - inkrement výšky charakterizujúci pozdĺžnu difúziu látky v stacionárnej fáze, H(Cs) - inkrement výšky charakterizujúci odpor proti pohybu látky v stacionárnej fáze, H(Cm) - inkrement výšky charakterizujúci odpor proti pohybu látky v mobilnej fáze, H(C*m) - inkrement výšky charakterizujúci odpor proti pohybu látky v stagnantnej fáze.

Stagnantná fáza má rovnaké zloženie ako mobilná fáza, ale stagnuje v póroch sorbentu. Tento typ fázy sa uvažuje len pri poréznych náplniach. Člen H(Cs) možno zanedbať, pretože v kolóne je oveľa viac mobilnej fázy ako stacionárnej fázy H(Cm) > H(Cs).

V prípade nepórovitých náplní potom možno rovnicu (1.44) zjednodušiť:

H = H(A) + H(BBm) + H(Cm) (1.45)

Pre látky, ktorých hodnota kapacitného pomeru je väčšia ako 5, sa zistila závislosť výšky teoretickej priehradky od veľkosti častíc náplne (dp):

2mp

m

3 2 0,1 pD uH d du D

= + + (1.46)

kde Dm je difúzny koeficient látky v mobilnej fáze. Okrem kolónových efektov, na výšku teoretickej priehradky majú vplyv ešte mimokoló-

nové efekty, ktoré spôsobujú rozširovanie zóny nadávkovanej látky. Patrí sem predovšetkým dávkovacie zariadenie, spoje kapilár a kyveta detektora.

Stredná rýchlosť prúdenia mobilnej fázy sa vypočíta podľa rovnice:

m2

m 0

F FuA r

m

π ε= = (1.47)

kde r je polomer kolóny, ε0 pórovitosť, Am voľný prierez kolóny a Fm objemový prietok mobilnej fázy.

Z rovnice (1.47) možno vypočítať hodnotu ε0:

m m M0 2 2

t

F F tVu r L r

επ π

= = = MV (1.48)

kde VM je mŕtvy objem kolóny a Vt je celkový objem kolóny.

Rýchlosť laminárneho prúdenia kvapalín v kolónach je daná Darcyho rovnicou:

0max

0

d d

K puzε μ

= (1.49)

kde K0 je merná priepustnosť (permeabilita) chromatografickej kolóny, μ je dynamická vikozita (Pa⋅s) a dp/dz je tlakový spád po dĺžke kolóny.

Zistilo sa, že pre strednú rýchlosť ustred platí vzťah:

maxstred

2uu = (1.50)

Separačné metódy


a permeabilita náplňových kolón závisí od veľkosti priemeru častíc náplne (dp) podľa vzťahu:

2p

0 1000d

K = (1.51)

1.2.1. Rozdeľovacia chromatografia

Princípom separácie zmesi zložiek je ich rôzna rozpustnosť v dvoch vzájomne obmedzene miešateľných kvapalinách, z ktorých jedna je zakotvená na nosiči v podobe tenkého filmu (stacionárna fáza) a druhá preteká cez kolónu (mobilná fáza). Stacionárna kvapalina sa zakotví na nosiči odparením prchavého rozpúšťadla, v ktorom je rozpustená stacionárna kvapalina a pridaný nosič napr. kremelina. Distribúciu látky medzi dve fázy opisuje Nernstov rozdeľovací zákon:

o

v v

(A) [A](A) (A) [A]D

aKa

= ≈ o (1.52)

kde a(A)o je aktivita zložky A v organickej fáze, a(A)v aktivita zložky A v druhej (napr. vodnej) fáze, K(A)D distribučná (rozdeľovacia) konštanta.

Ak je stacionárna fáza nepolárna, napr. silikónový olej, ide o rozdeľovaciu chromato-grafiu na obrátených fázach (RP chromatografia). Z polárnych fáz sa najčastejšie používa voda, ktorá je zakotvená napr. na celulóze, ktorá má funkciu nosiča.

Kapacitný pomer látok v rozdeľovacej chromatografii závisí predovšetkým od ich polarity. Všeobecne možno zhrnúť, že ak stacionárna fáza je polárna, bude zadržiavať polárne látky a naopak. Vychádza sa z pravidla, že polárne látky sa dobre rozpúšťajú v polárnych rozpúšťadlách a nepolárne látky v nepolárnych rozpúšťadlách.

Medzi časté problémy v rozdeľovacej chromatografii patrí rozpúšťanie stacionárnej fázy v mobilnej fáze, čo má za následok zmenšovanie hrúbky filmu stacionárnej fázy a tým sa znižuje reprodukovateľnosť meraní. Aby sa zabránilo zmene hrúbky filmu v priebehu chromato-grafického procesu, mobilná fáza sa pred vstupom do kolóny nasýti stacionárnou fázou napr. v predkolóne, ktorá obsahuje ten istý sorbent ako chromatografická kolóna. 1.2.2. Adsorpčná chromatografia

Princíp separácie zmesi látok je založený na rôznej adsorpcii na povrchu adsorbentu. Adsorbenty sa rozdeľujú na polárne (silikagél - oxid kremičitý, florisil - oxid horečnatý, alumina - - oxid hlinitý) a nepolárne (aktívne uhlie).

Medzi základné charakteristiky adsorbentov patrí ich špecifický povrch, zrnitosť, priemerná pórovitosť a inertnosť. Pri vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii okrem uvede-ných základných charakteristík závisí kvalita adsorbentu aj od tvaru a štruktúry pórov. Pri adsorbentoch s povrchovou pórovitosťou sa hĺbka pórov môže regulovať hrúbkou napr. 1 až 2 μm naneseného adsorbentu na hladký nosič guľového tvaru (priemer napr. 10 μm). Okrem

Separačné metódy


adsorbentov s povrchovou pórovitosťou sa v adsorpčnej chromatografii používajú aj úplne pórovité adsorbenty s malými rozmermi častíc (od 5 do 30 μm).

Ďalší dôležitý parameter, ktorý charakterizuje vlastnosti adsorbentov, je aktivita. Pri polárnych adsorbentoch aktivita závisí od množstva vody, ktoré je prítomné v adsorbente hlavne na aktívnych centrách, ktoré týmto spôsobom blokuje. Odstraňovaním vody sa zvyšuje aktivita adsorbentu a tým i jeho adsorpčná schopnosť. Voda sa odstraňuje pomocou vyhrievania adsorbentu na vyššie teploty, napr. silikagél sa aktivuje pri 160 °C po dobu niekoľkých hodín, alumina pri 350 °C. Keďže obsah vody určuje i vlastnosti adsorbentu a tým ovplyvňuje i elučné charakteristiky, je nutné kontrolovať obsah vody i v mobilnej fáze. Okrem vlastností adsorbentu, má na separačnú účinnosť vplyv i zloženie mobilnej fázy. Vlastnosť mobilnej fázy v adsorpčnej chromatografii sa charakterizuje pomocou elučnej sily. Elučná sila udáva adsorpčnú energiu molekúl mobilnej kvapaliny na jednotkovej ploche polárneho adsorbentu s jednotkovou aktivitou (s najmenším obsahom vody). Elučnú silu možno použiť i na charakterizáciu organických rozpúšťadiel, ktoré sa používajú v adsorpčnej chroma-tografii. Konvenciou sa prijalo, že elučná sila pentánu ε0 = 0. V tab. 2 sú uvedené elučné sily niektorých základných rozpúšťadiel.

Tabuľka 2 Základné charakteristiky niektorých rozpúšťadiel

Rozpúšťadlo ε0 xe xd xnTeplota varu

(°C)

n-pentán 0,0 - - - 36 chlorid uhličitý 1,7 0,30 0,38 0,32 76 toluén 2,3 0,32 0,24 0,44 111 dietyléter 2,9 0,55 0,11 0,34 35 benzén 3,0 0,29 0,28 0,43 80 n-butanol 3,9 0,53 0,21 0,26 117 n-propanol 4,1 0,54 0,19 0,27 97 etylacetát 4,3 0,34 0,25 0,42 77 i-propanol 4,3 0,54 0,20 0,26 82 chloroform 4,4 0,28 0,39 0,33 61 dioxán 4,8 0,38 0,21 0,41 101 etanol 5,2 0,51 0,21 0,28 78 pyridín 5,3 0,43 0,21 0,36 115 acetón 5,4 0,36 0,24 0,40 56 acetonitril 6,2 0,33 0,26 0,41 82 metanol 6,6 0,51 0,19 0,30 65 voda 9,0 0,40 0,34 0,26 100

Elučnú silu binárnej zmesi rozpúšťadiel (ε0

AB) A a B možno vypočítať napríklad podľa vzťahu:

( ){ }0 0B B B A0 0

AB AB

log 10exp 1

X a n

a n

ε εε ε

⎡ ⎤− + −⎣= +BX ⎦ (1.53)

kde XB je molový zlomok rozpúšťadla B, a je konštanta, ktorá závisí od druhu adsorbentu a jeho B

Separačné metódy


aktivity a pohybuje sa v intervale (0,6; 1,0), nBB je konštanta, ktorá závisí od veľkosti molekúl rozpúšťadla B.

Elučnú silu rozpúšťadla možno charakterizovať i podľa protónovo - akceptorných vlast-ností (xe v tab. 2), protónovo - donorných vlasností (xd) a polarity (xn ). Hodnota xe vyjadruje interakcie medzi molekulami daného rozpúšťadla a etanolu, xd vyjadruje interakcie medzi roz-púšťadlom a dioxánom a xn vyjadruje interakcie medzi rozpúšťadlom a nitrometánom. Príspevky ďalších prípadných interakcií sa zanedbávajú a musí platiť rovnica:

xe + xd + xn = 1 (1.54)

Tabuľku 2 možno použiť pre hodnotenie vlastností rozpúšťadiel aj pri iných separačných prin-cípoch napr. v rozdeľovacej chromatografii a pri chromatografii na chemicky viazaných fázach.

Adsorpčná chromatografia sa predovšetkým používa pri separácii zmesi nepolárnych alebo stredne polárnych látok. Silne polárne a iónové zlúčeniny sa na polárnych adsorbentoch viažu veľmi pevne a nemožno ich vyeluovať ani najpolárnejšími rozpúšťadlami. Uvedený typ chromatografie je obzvlášť vhodný pri separácii polohových izomérov (cis a trans). 1.2.3. lonexová chromatografia

Princípom metódy je vratná výmena iónov medzi roztokom (mobilnou fázou) a ionexom. lonexom býva polymér, na ktorom sú naviazané funkčné skupiny, alebo kryštálová mriežka s ionizovateľnými funkčnými skupinami. V súčasnosti sa najviac používajú syntetické ionexy, ktoré sa pripravujú polymerizáciou styrénu a divinylbenzénu. Zosietenie tohto typu ionexu závisí od množstva divinylbenzénu, ktoré sa spravidla označuje v názve, napr. DOWEX X4 znamená, že pri polymerizácii sa použili 4 % divinylbenzénu z celkového množstva. Na benzénovom skelete ionexu sú naviazané funkčné skupiny, ktoré určujú jeho vlastnosti. Katexom sa nazýva ionex, ktorý je schopný vymieňať katióny a anex je schopný vymieňať anióny. Najčastejšie funkčné skupiny v katexoch sú: -SO3H (silne kyslý katex), -PO(OH)2 (stredne silný), -COOH (slabo kyslý katex). Pri anexoch sa používajú funkčné skupiny typu -NR3OH kde R je alkyl. Schému výmeny iónov možno vyjadriť rovnicami:

katex:

├SO3- H+ + K+ = ├SO3

- K+ + H+

anex:

├NR3+ OH- + Cl- = ├ -NR3

+ Cl- + OH-

Okrem katexov a anexov sa používajú aj amfotérne ionexy, ktoré obsahujú obidva typy funkčných skupín, takže môžu vymieňať katióny aj anióny súčasne. Pomocou takéhoto ionexu možno pripraviť napr. deionizovanú vodu.

Chelátotvorné ionexy obsahujú chelátotvorné funkčné skupiny napr. metylénaminodi-octovú skupinu, ktorá tvorí cheláty napr. s iónmi Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+, UO2

2+. Selektívne alebo špecifické ionexy obsahujú funkčné skupiny, ktoré selektívne zachytávajú len určitý ión. Napr. ióny draslíka možno zachytiť ionexom obsahujúcim trinitrofenyliminodinitrofenylénové skupiny.

Vplyvom polárnych funkčných skupín sa ionex snaží rozpustiť vo vode, na druhej strane tomuto bráni nepolárny skelet ionexu. Výsledkom týchto dvoch protichodných efektov je

Separačné metódy


napučiavanie ionexu. V napučanom stave sú funkčné skupiny v disociovanom stave a napr. v prípade H+ katexu sa veľmi malá časť iónov H+ vplyvom koncentračného spádu medzi ionexovou a vonkajšou fázou difúziou dostane do vonkajšej fázy. Záporne nabitý skelet cez nábojové interakcie bráni takejto difúzii a ustáli sa Donnanova rovnováha. Tieto efekty sa využívajú pri separácii založenej na iónovom vylučovaní (napr. separácia zmesi organických kyselín na katexe v H+ cykle).

Hmotnostný distribučný koeficient (DM) v ionexovej chromatografii je definovaný ako pomer rovnovážnych koncentrácií iónu v ionexe [M+]S a vo vonkajšej fáze [M+]L:

+S

+L

[M ][M ]MD = (1.55)

Rovnovážna koncentrácia iónu v ionexe sa vyjadruje látkovým množstvom iónu v 1 dm3 ionexu.

Elučný objem danej látky závisí od distribučného koeficienta podľa rovnice:

VR = V0 + DM V0 (1.56)

kde V0 je medzičasticový objem.

Selektivitu ionexov k sledovanému iónu M+ možno vyjadriť pomocou selektivitného koeficienta ( ), ktorý je charakterizovaný rovnovážnou konštantou danej výmeny:

+

+MH

K

S(H+) + L(M+B-) = S(M+) + L(H+B-) (1.58)

kde S je symbol pre ionex a L symbol pre roztok

Selektivitné koeficienty závisia od nábojového čísla, atómového čísla, elektronegativity a ďalších faktorov. Hodnoty selektivitných koeficientov dvojmocných katiónov na silne kyslom ionexe klesajú v poradí:

Ba2+ > Pb2+ >Ca2+ > Ni2+ > Cd2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mg2+ > UO22+

Selektivitné koeficienty aniónov na silne zásaditom anexe klesajú v poradí:

(COO)22- > I- > HSO4

- > NO3- > Br- > Cl- > HCOO- > CH3COO- > OH- > F-

Vo vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii sa používajú ionexy, ktoré veľmi málo napučiavajú, aby nedochádzalo k stláčaniu ionexového stĺpca v kolóne pri vysokých tlakoch. Používajú sa i pelikulárne ionexy, ktoré sa skladajú z tuhého nosiča, na ktorom je zakotvený kvapalný ionex v podobe tenkej vrstvy. Chromatografické kolóny naplnené pelikulárnym ionexom majú vysokú separačnú účinnosť a pri separácii možno použiť vysoké objemové prietoky mobilnej fázy.

Ako mobilné fázy v ionexovej chromatografii sa používajú vodné prípadne vodno-alko-holové roztoky. Selektivitu separačného systému možno meniť zmenou pH, typom tlmivého roztoku a iónovou silou. V niektorých prípadoch sa do mobilnej fázy pridáva komplexotvorné skúmadlo.

Separačné metódy


1.2.4. Gélová chromatografia

Princíp separácie v gélovej chromatografii je založený na veľkosti separovaných molekúl látok. Molekuly, ktorých rozmer je menší ako sú otvory v géli, budú v zmysle koncentračného spádu difundovať do vnútornej fázy a tým sa budú zadržiavať v kolóne a naopak ak je veľkosť molekúl väčšia ako rozmery gélu, tieto látky sa budú z kolóny vymývať bez zadržiavania.

Elučný objem látky (VR) v gélovej chromatografii možno vyjadriť vzťahom:

VR = V0 + KD Vi (1.59)

kde KD je rozdeľovacia konštanta, V0 je medzičasticový objem a Vi je objem v dutinách gélu. V prípade, ak je separačný princíp založený len na veľkosti molekúl, hodnota KD môže

byť v intervale od 0 do 1 (koncentrácia látky v stacionárnej fáze nemôže byť väčšia ako v mobil-nej fáze).

Gély možno rozdeliť do týchto skupín:

1. Xerogély - lineárne makromolekuly s určitým množstvom priestorových väzieb napr. dextrány, polyakrylamidy, aragózové gély a polystyrénové gély.

2. Aerogély - inertná matrica pevnej štruktúry, ktorá obsahuje dutiny s určitou veľ-kosťou, vyplnené vzduchom napr. pórovité sklá, silikagél a anorganické molekulové sitá, ktoré sa používajú v plynovej chromatografii.

3. Hybridné gély - pevná zosieťovaná polymérna matrica s množstvom mikropórov napr. polystyréndivinylbenzénové, polyvinylacetátové, polyetylénové alebo hydroxylalkyl-metakrylátové gély.

Každý gél je charakterizovaný jeho pracovnou oblasťou, ktorá je daná intervalom mole-kulových hmotností látok, ktoré možno separovať v danom géli. Pracovnú oblasť gélu možno zistiť zo závislosti log Mr od elučného objemu (obr. 10).

Obr. 10 Pracovná oblasť gélu; Mr molová hmotnosť

Na rozdiel od ostatných metód kvapalinovej chromatografie zloženie mobilnej fázy v

gélovej chromatografii len málo ovplyvňuje separáciu zmesi látok. Určitý vplyv môže mať

Separačné metódy


solvatácia, čím sa zväčšuje rozmer molekúl separovaných látok. Od mobilnej fázy sa vyžaduje, aby separované látky dobre rozpúšťala a mala čo najnižšiu viskozitu. Pomocou gélovej chromatografie možno zistiť molové hmotnosti polymérov na základe porovnania elučnej charakteristiky s elučnou charakteristikou referenčnej látky s presne definovanou relatívnou molovou hmotnosťou, alebo zo závislosti log Mr od VR. 1.2.5. Chromatografia na chemicky viazaných fázach

Naviazaním stacionárnej fázy na nosič pomocou chemickej väzby sa zabráni vymývaniu zakotvenej fázy mobilnou fázou. Nosičom chemicky viazanej fázy sú povrchovo pórovité nosiče, najčastejšie silikagél. Stacionárna fáza sa môže naviazať na povrch nosiča viacerými typmi chemických reakcií:

1. Kondenzáciou silanolových skupín z povrchu nosiča s alkoholmi:

nosič ≡ Si - OH + HO - R = nosič ≡ Si - O - R + H2O

Z alkoholov sa najčastejšie používa oktanol, prípadne polyetylénglykol.

2. Silanizáciou silanolových skupín na povrchu nosiča pomocou alkylchlórsilánov, pričom vznikajú trialkylsiloxány:

nosič ≡ Si - OH + Cl - SiR3 = nosič ≡ Si - O - SiR3 + HCl

Najčastejšie sa používajú trioktyl- alebo trioktadecyl- chlórsilány. Podľa počtu uhlíkov v alifatickom reťazci sa takéto kolóny nazývajú ako C8 RP alebo C18 RP, kde RP je skratka (reverse phase) pre chromatografiu na obrátených fázach. Na konci alifatického reťazca môžu byť naviazané rôzne funkčné skupiny, čím sa mení selektivita separačného systému. Okrem -CH3 skupiny, to najčastejšie bývajú -CN alebo -NH2 skupiny, podľa čoho sa nazývajú aj kolóny.

Z hľadiska princípu separácie je ťažké posúdiť, či ide o rozdeľovaciu alebo adsorpčnú chromatografiu. Predpokladá sa, že pri prakticky monomolekulovej vrstve chemicky viazanej fázy sa prejavujú oba separačné princípy súčasne. 1.2.6. Iónovo - párová chromatografia

Tento typ chromatografie sa využíva pri separácii zmesí polárnych látok, ktoré sú rozpustné vo vode a sú schopné tvoriť iónové páry. Do tejto skupiny látok predovšetkým patria organické kyseliny a organické zásady.

Princíp separácie možno vysvetliť na príklade separácie zmesi organických kyselín (B-), ktoré tvoria iónový pár s tetraalkylamóniovým katiónom (R4N+) podľa reakcie:

R4N+ + B- = R4N+B- (1.60)

Pri separácii iónových párov sa v súčasnosti najviac používa chromatografická kolóna s chemicky viazanou fázou typu C18, ktorá bude zadržiavať predovšetkým iónový pár v dôsledku interakcie alkylov s alifatickým skeletom stacionárnej fázy. Iónovo - párové skúmadlo sa pridáva priamo do mobilnej fázy, kde je jeho koncentrácia malá (napr. 0,0001 až 0,001 mol⋅dm-3).

Separačné metódy


Hodnota kapacitného pomeru sledovaných kyselín bude závisieť od rovnovážnej konštanty reakcie (1.60):

+ -4 s+ -

4 m m

[R N B ]

[R N ] [B ]K = (1.61)

Kombináciou rovníc (1.61) a (1.18) pričom cs = [R4N+B-] a cm = [B-] možno získať rovnicu, ktorá vyjadruje závislosť kapacitného pomeru od koncentrácie iónovo - párového skúmadla a rovnovážnej konštanty:

+s4 m

m

[R N ]Vk KV

= (1.62)

Z rovnice (1.62) je zrejmé, že daná organická kyselina bude viac zadržiavaná v kolóne, čím viac bude rovnovážna konštanta bude posunutá smerom k tvorbe iónového páru a čím bude väčšia koncentrácia iónovo - párového skúmadla v mobilnej fáze. Kapacitný pomer bude závisieť i od počtu atómov uhlíka v alkyle iónovo - párového skúmadla. Čím bude počet atómov uhlíka v alkyle väčší, tým budú silnejšie interakcie so stacionárnou fázou typu C18. Pri separácii zmesi organických zásad sa používa ako iónovo - párové skúmadlo napr. alkylsulfónová kyselina. Princíp separácie je rovnaký ako v prípade separácie organických kyselín.

1.2.7. Afinitná chromatografia

Princíp separácie v afinitnej chromatografii je založený na špecifickej chemisorpcii medzi separovanou látkou (E) - najčastejšie enzýmom a ligandom (L), ktorý je chemicky viazaný na nosič, pričom vzniká komplex (LE):

nosič - L + E = nosič - LE (1.63)

Rovnicu (1.63) možno charakterizovať pomocou konštanty stálosti komplexu (βLE):

LELE

[LE] 1 [L] [E] K

β = = (1.64)

kde KLE je disociačná konštanta komplexu LE. Koncentrácia viazaného ligandu co,L je oveľa väčšia ako koncentrácia analyzovaného

enzýmu co,E (co,L >> co,E) a pre disociačnú konštantu možno napísať vzťah:

( )0,E 0,LLE

[LE] [L] [E] [LE] [LE]

c cK

−= = (1.65)

pričom co,E = [E] + [LE] a co,L = [L] + [LE].

Hmotnostný distribučný koeficient (1.55) je daný pomerom koncentrácie viazaného enzýmu ku koncentrácii enzýmu v mobilnej fáze:

,E0,E

[LE] [LE]MD

c=

− (1.66)

Separačné metódy


Kombináciou rovníc (1.65) a (1.66) možno napísať vzťah:

0,L,E

LE

M

cD

K= (1.67)

Zohľadnením rovnice (1.56) a kombináciou rovníc (1.64) a (1.67) sa získa rovnica, ktorá vyjadruje závislosť elučného objemu od konštanty stálosti komplexu LE:

VR = V0(1 + βLE c0,L) (1.68)

Je zrejmé, že elučný objem bude vzrastať so zvyšovaním koncentrácie ligandu navia-zaného na nosiči a so zvyšovaním konštanty stálosti komplexu.

Vhodnou voľbou zloženia mobilnej fázy možno ovplyvňovať hodnotu konštanty stálosti komplexu. Táto možnosť sa využíva pri separácii napr. daného enzýmu od ďalších látok prítomných v extrakte: pri daných podmienkach separácie (pH, teplota, iónová sila) sa zachytí pomocou ligandu len daný enzým, pričom ostatné látky prechádzajú cez kolónu bez zadržiavania; po premytí kolóny sa zmení napr. pH mobilnej fázy a z kolóny sa vyeluuje len samotný enzým. V prípade veľmi stálych komplexov, možno použiť i vytláčaciu chromatografiu, kde funkciu vytláčadla má látka, ktorá tvorí pevnejší komplex ako sledovaný enzým.

Afinitná chromatografia sa používa v oblastiach biochémie, najmä pri analýze biologicky aktívnych látok. Používa sa tiež pri analýzach v potravinárskom a farmaceutickom priemysle.

1.3. CHROMATOGRAFIA S MOBILNOU FÁZOU V NADKRITICKOM STAVE

Pri tomto type chromatografie sa ako mobilná fáza používa plyn, ktorý má nadkritickú teplotu a nadkritický tlak. Plyny pri týchto podmienkach majú vlastnosti odlišné od kvapalín a plynov pri obyčajných podmienkach a z hľadiska hodnôt difúznych koeficientov sa zaraďuje tento typ chromatografie medzi kvapalinovú chromatografiu. Na rozdiel od predchádzajúcich typov, sa hodnoty elučných charakteristík menia i s tlakom na hlave kolóny. Zvyšovaním tlaku stúpa hustota plynu v nadkritickom stave, čím sa zvýši rozpustnosť separovaných látok. Zmenou tlaku na hlave kolóny možno meniť selektivitu separačného systému, čo je charakteris-tické len pre tento typ chromatografie. Najčastejšou mobilnou fázou býva oxid uhličitý, ktorého kritická teplota je 31 °C a kritický tlak 7,39 MPa. K mobilnej fáze sa niekedy pridávajú modifikátory (napr. metanol), keď je nutné zmeniť polaritu mobilnej fázy v širšom intervale.

Ako náplne chromatografických kolón možno použiť sorbenty z plynovej chromatografie alebo z vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie, najmä chemicky viazané fázy a adsorbenty. V prípade použitia oxidu uhličitého ako mobilnej fázy možno výhodne použiť IR detektor, pretože oxid uhličtý neabsorbuje vlnové dĺžky z IR oblasti, čo sa využíva pri identifikácii separovaných zložiek. Prístrojové vybavenie pri chromatografii s mobilnou fázou v nadkritickom stave je rovnaké ako pri vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii s tým rozdielom, že na výstupe z detektora sa použije ihlový ventil alebo kapilára (kladie odpor proti prúdeniu), aby tlak na výstupe z detektora dosahoval aspoň kritický tlak pre danú mobilnú fázu.

Separačné metódy


1.4. PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIA

V plynovej chromatografii je mobilnou fázou plyn a separované látky sa musia nachá-dzať v plynnom stave. Stacionárnou fázou je najčastejšie kvapalina s nízkym parciálnym tla-kom pri teplote separácie zakotvená na inertnom nosiči alebo adsorbent.

V plynovej chromatografii je rýchlosť mobilnej fázy v chromatografickej kolóne rozdielna, lebo plynná fáza je stlačiteľná na rozdiel od kvapalín, kde sa tento efekt zanedbával. Rýchlosť ku koncu kolóny nelineárne vzrastá a priemernú rýchlosť (u) možno vypočítať podľa rovnice:

u = u0 j (1.69)

kde u je rýchlosť plynu na výstupe z kolóny a j je kompresibilný faktor (rovnica 1.24). Priemernú rýchlosť nosného plynu možno namerať a vypočítať podľa rovnice:

m

m M

F LuA t

= = (1.70)

kde Fm je objemový prietok mobilnej fázy, L je dĺžka kolóny, tM, je elučný čas nesorbovateľnej zložky a Am je plocha voľného prierezu kolóny (prierez vyplnený len nosným plynom).

Rozširovanie zóny látky v kolóne v plynovej chromatografii možno opísať pomocou zjednodušenej Van Deemterovej rovnice:

BH A Cu

= + + u (1.71)

kde koeficient A zahŕňa príspevok turbulencie, koeficient B pozdĺžnu difúziu a koeficient C odpor proti prevodu látky z jednej fázy do druhej.

Funkcia zobrazená v súradniciach H versus u má hyperbolický tvar, z ktorého možno nájsť optimálnu rýchlosť nosného plynu.

Pre kapilárnu plynovú chromatografiu, kde stacionárna fáza je zakotvená na vnútornej stene kapiláry, možno rozširovanie zóny nadávkovanej látky vyjadriť Golayovou rovnicou:

L BH C uu

= + + GC u (1.72)

kde koeficienty CL a CG vyjadrujú vplyv stacionárnej a mobilnej fázy na rozširovanie zóny.

Zdrojom nosného plynu bývajú spravidla tlakové nádoby. Najčastejšie sa používa dusík, vodík, hélium alebo argón. Dávkovače sú umiestnené hneď pred kolónou a látky sa dávkujú pomocou mikrostriekačiek alebo dávkovacími ventilmi. Pri dávkovaní pomocou mikrostriekačiek sa prepichnutím silikónového uzáveru (septum) nadávkuje vzorka do dávkovacieho priestoru, ktorý je spravidla vyhrievaný na vyššiu teplotu ako chromatografická kolóna. Pri dávkovaní do kapilárnych kolón sa zvyčajne vzorka už v plynnom stave rozdelí na dve časti napr. v pomere 1 : 100 a do kolóny sa dávkuje len 1/100 z pôvodného množstva, pretože kapacita kapilárnych kolón je oveľa nižšia ako náplňových kolón.

Separačné metódy


Stacionárne fázy v plynovej chromatografii musia spĺňať nasledujúce požiadavky:

• musia rozpúšťať separované zložky, • rozpustnosť jednotlivých zložiek nadávkovanej zmesi musí byť rozdielna, • musia mať nízky parciálny tlak pri pracovnej teplote ( 1 až 10 Pa), • musia byť tepelne stále, • nesmú reagovať s analyzovanými látkami, • pri pracovnej teplote majú mať nízku viskozitu.

Väčšina stacionárnych fáz je zmes polymérov alebo polykondenzovaných látok a ich vlastnosti závisia od spôsobu výroby, čo môže spôsobiť problémy pri reprodukovateľnosti elučných charakteristík. Výber stacionárnych fáz sa robí na základe zloženia analyzovanej vzorky. Najjednoduchšie pravidlo je, že stacionárna fáza z hľadiska polarity sa má podobať analyzovaným zložkám.

Stacionárne fázy v plynovej chromatografii môžu mať rôznu polaritu. Ich klasifikácia sa robí na základe interakcií s testovacími látkami: benzén, n-butanol, 2-pentanón, nitropropán a pyridín. Pri rovnakej teplote sa namerajú ich Kovátsove indexy na testovanej fáze a v kolóne, v ktorej stacionárna fáza je skvalán (nasýtený C30 uhľovodík). Pre testovacie látky sa vypočítajú hodnoty ΔI:

ΔI = Istac.kvap - Iskvalan (1.73)

Rozdiel Kovátsových indexov vyjadruje interakcie testovacích látok s danom stacio-nárnou fázou a skvalánom:

Ibenzén - disperzné interakcie nenasýtených uhľovodíkov so stacionárnou kvapalinou,

Ibutanol - vodíkové väzby alkoholov a kyselín so stacionárnou fázou, ktorá je akceptorom protónov,

I2-pentanón - donorovo-akceptorové interakcie elektrónového páru aldehydov, éterov, ketó- nov a esterov so stacionárnou fázou, ktorá je akceptorom elektrónového páru,

Initropropán - dipólové interakcie,

Ipyridín - mechanizmus je zložitý a zahŕňa všetky predchádzajúce.

Súčet všetkých príspevkov sa potom využije na charakterizáciu polarity sledovanej stacionárnej fázy.

Plynová chromatografia patrí medzi najčastejšie používané separačné techniky. Jej hlavná nevýhoda je možnosť použitia len pre látky, ktoré sú tepelne stále a látky s prchavosťou zodpovedajúcou n-alkánu s počtom uhlíkových atómov približne do 120.

Separačné metódy


1.5. CHROMATOGRAFIA S PLOŠNÝM USPORIADANÍM EXPERIMENTU

Pri plošnom usporiadaní experimentu je sorbent nanesený v podobe tenkej vrstvy alebo stacionárna fáza je zakotvená na papieri (papierová chromatografia). Vzorka sa nanesie v podobe škvrny na miesto (označuje sa ako štart), ktoré sa nachádza v blízkosti spodného okraja vrstvy alebo papiera. Týmto okrajom sa ponorí do roztoku mobilnej fázy, ktorý je v uzavretom priestore napr. v kyvete a chromatogram sa začne vyvíjať. Po dosiahnutí určitej vzdialenosti od štartu sa chromatogram vyberie z kyvety, označí sa čelo rozpúšťadla (horný okraj rozpúšťadla). Separované látky sa pohybujú vo vrstve podľa ich afinít k stacionárnej fáze. Afinita závisí od druhu použitého sorbentu rovnako ako v kvapalinovej chromatografii.

Tenké vrstvy sa pripravujú v laboratóriu buď priamym nasypaním sorbentu na vhodnú podložku (sypané vrstvy) alebo sa pripraví suspenzia sorbentu so spojivom (napr. sadra), ktorá sa rovnomerne vyleje alebo nanesie pomocou vhodného zariadenia na podložku (tmelené vrstvy). V súčasnosti možno tmelené vrstvy zakúpiť u rôznych dodávateľov.

Vyvíjanie chromatogramov možno uskutočniť rôznymi spôsobmi - zostupné, vzostupné alebo kruhové vyvíjanie. Pri kruhovom vyvíjaní sa vzorky nanesú na obvod kruhu a mobilná fáza sa privádza do stredu kruhu. Pri dvojrozmernej chromatografii sa vzorka nanesie v podobe škvrny do rohu vrstvy a chromatogram sa vyvíja najprv jedným smerom, po skončení a odparení mobilnej fázy sa vyvíjanie uskutoční inou mobilnou fázou, pričom smer toku je kolmý na pôvodné vyvíjanie.

Jednotlivé látky možno dokázať alebo stanoviť ich množstvo buď priamo na chromatograme (metóda in-situ) alebo po extrakcii škvrny vhodne voleným rozpúšťadlom. Pri prvom spôsobe vyhodnocovania, farebné látky možno charakterizovať priamo, bezfarebné látky sa detegujú na základe postriekania vrstvy vhodným detekčným skúmadlom, ktoré tvorí so separovanými látkami farebné zlúčeniny. V prípade ak sú látky aktívne v UV oblasti, možno na zistenie ich polôh použiť UV lampu. Chromatogram možno kvantitatívne vyhodnotiť pomocou fotodozimetrického merania, meraním absorpcie žiarenia, ktoré prechádza cez vrstvu, alebo meraním odrazeného žiarenia.

V papierovej chromatografii je stacionárnou fázou najčastejšie voda, ktorá pochádza zo vzdušnej vlhkosti. Možno použiť i systém obrátených fáz, keď sa na suchý papier nanesie napr. parafínový olej ako stacionárna fáza. Možno to urobiť tak, že sa chromatografický papier ponorí do roztoku stacionárnej fázy v prchavom rozpúšťadle a po vytiahnutí z neho sa nechá vysušiť.

Výber mobilnej fázy sa robí rovnakým postupom ako v kolónovej kvapalinovej chromato-grafii. Ako sorbenty pri plošnom usporiadaní experimentu možno použiť všetky stacionárne fázy, ktoré sú uvedené v predchádzajúcich kapitolách o kolónovej kvapalinovej chromatografii. Možno použiť i vysokoúčinnú chromatografiu v plošnom usporiadaní, kde vrstva obsahuje presne definované častice ako v HPLC.

Hlavná výhoda použitia chromatografie s plošným usporiadaním je oveľa menšia náročnosť na prístrojové zariadenie ako je to napr. v HPLC, z čoho vyplývajú aj výhodnejšie ekonomické parametre. Použitie tohto typu chromatografie je obdobné ako pri kolónovej chromatografii. Uvedenú techniku možno použiť aj pre rýchly výber vhodnej mobilnej fázy, ktorá sa potom použije v kolónovej chromatografii s rovnakým sorbentom.

Separačné metódy


1.6. ELEKTROMIGRAČNÉ METÓDY

Do skupiny analytických separačných metód sa zaraďujú aj elektromigračné metódy. Sú založené na rozdielnej pohyblivosti nabitých častíc v jednosmernom elektrickom poli. Pohyb-livosť nabitých častíc závisí od veľkosti náboja, veľkosti a tvaru molekúl, podmienok prostredia a intenzity elektrického poľa. Veľkosť náboja ovplyvňuje stupeň ionizácie, iónová sila a pH prostredia.

Základné princípy

Každý elektromigračný systém sa skladá z dvoch elektród, ktoré sú spojené vodivým prostredím - elektrolytom. Separácia sa realizuje v kvapalnej fáze, najčastejšie vo vodnom prostredí. Na častice s nábojom Q účinkom jednosmerného elektrického poľa E pôsobí sila F1

F1 = z e E = Q E (1.74)

kde z je nábojové číslo iónu. Táto sila uvedie príslušný ión do pohybu, ktorý je brzdený odporom prostredia. Odpor prostredia reprezentuje sila F2, ktorá je úmerná rýchlosti častíc v:

F2 = - 6 π τ r v = - k v (1.75)

kde τ je dynamická viskozita roztoku, r je polomer iónu a k je konštanta. V ustálenom stave sú obidve sily v rovnováhe a pre rýchlosť častíc platí :

Qv E uk

= = E (1.76)

kde [v] = m⋅s-1, resp. cm⋅s-1, [u] = m2⋅V-1⋅s-1, resp. cm2⋅V-1⋅s-1, [E] = V⋅m-1, resp. V⋅cm-1. Na pohyblivosť častíc u vplýva viacero faktorov, z ktorých najväčší význam majú :

a) Fyzikálno chemické vlastnosti samotných častíc - ich celkový náboj, veľkosť, tvar, disociovateľnosť povrchových skupín, schopnosť adsorpcie iónov a polárnych molekúl, tvorba komplexov a pod. Väčšinu z týchto faktorov ovplyvňuje prostredie (najmä pH a iónová sila).

b) Vlastnosti prostredia. V elektromigračných metódach vo funkcii elektrolytov sa spravidla používajú tlmivé roztoky určitej koncentrácie, iónovej sily, pH, vodivosti, viskozity, permitivity a teploty. Pohyblivosť nabitých častíc môžu ovplyvniť i prítomné neelektrolyty (komplexy, asociáty a iné agregáty). Roztok elektrolytu (vodič druhej triedy) pri prechode prúdu kladie určitý odpor, ktorého veľkosť závisí od druhu, koncentrácie a konštrukcie elektroforetického zariadenia. Prechodom elektrického prúdu cez elektrolyt sa tvorí Joulove teplo Q, ktoré možno vypočítať podľa vzťahu:

22 U tQ U I t R I

R= = = t (1.77)

kde U je napätie (rozdiel potenciálov medzi elektródami), I - elektrický prúd, t - čas a R - odpor prostredia.

Vzniknuté teplo spôsobuje odparovanie rozpúšťadla v dôsledku čoho roztok vzlína z priestoru elektród (tzv. knôtový efekt) a zahrieva sa i nosič so separovanými látkami, ktoré sa môžu termicky meniť.

Separačné metódy


c) Vlastnosti nosiča. Pri jeho použití je pohyblivosť iónov spravidla menšia ako pri voľnej elektroforéze. Migráciu ovplyvňujú ďalšie faktory, ako je elektroendoosmóza, prietokový poten-ciál, priestorové vplyvy nosiča, adsorpcia a pod. Výsledný pohyb častíc je daný súčtom elektro-foretickej a elektroosmotickej pohyblivosti. Podmienky, ktoré ovplyvňujú pohyblivosť častíc na nosičoch sú zložité a dajú sa ťažko štandardizovať. Preto sa na identifikáciu separovaných zložiek na nosičoch nepoužívajú absolútne pohyblivosti, ale relatívne určené pomocou štandar-dov. V elektroforetických technikách sa vo funkcii nosiča používa špeciálny chromatografický papier, rôzne druhy gélov, prípadne sorbentov. Nosič nemá klásť odpor pri migrácii, má byť chemicky inertný voči separovaným zložkám a ostatným skúmadlám (rozpúšťadlá, detekčné skúmadlá).

d) Vlastnosti elektrického poľa. Zahŕňajú jeho silu, homogenitu, stabilitu, zmeny pH vplyvom elektrických dejov na elektródach a komplikácie s Joulovým teplom. Všetky tieto činitele ovplyvňujú rýchlosť migrácie, ostrosť a rovnomernosť rozdelených zón.

Podľa experimentálneho usporiadania možno elektroforetické metódy rozdeliť na : • elektroforézu pohyblivého rozhrania, • zónovú elektroforézu, • izoelektrickú fokusáciu, • izotachoforézu.

V rozlíšení týchto základných elektroforetických techník sa abstrahuje od konkrétneho technického riešenia separačnej časti zariadenia pre elektroforézu.

Elektroforéza s pohyblivým rozhraním sa realizuje tak, že zmes separovaných zložiek zmiešaná so základným elektrolytom je rozptýlená tak, že pri danej dĺžke kolóny nemôže dôjsť k úplnej separácii, ale pri zavedení jednosmerného prúdu dochádza len k čiastočnej separácii zložiek. Je to vlastne obdoba frontálnej analýzy v chromatografii.

Zónová elektroforéza sa realizuje tak, že katódový i anódový priestor a kolóna sú naplnené základným elektrolytom. Vzorka sa dávkuje jednorazovo do určitého miesta kolóny. Po zavedení jednosmerného prúdu nastáva pohyb nabitých častíc podľa ich efektívnych (relatívnych) pohyblivostí k príslušnej elektróde a súčasne sa separujú katióny i anióny. Základné zariadenie pre elektroforézu sa skladá zo zdroja jednosmerného prúdu a elektro-foretickej komory (kyveta, valec, trubica U, kolóna) s katódovým a anódovým priestorom, kde sú príslušné elektródy s elektrolytom a priestorom na umiestnenie nosiča. Detekcia môže byť v spojení on-line, resp. off-line. Kvalitatívna analýza sa vyhodnocuje na základe migračnej rýchlosti (efektívnej pohyblivosti), zatiaľ čo mierou kvantity je celková plocha príslušnej zóny, ktorá sa zisťuje podobne ako pri chromatografii v plošnom usporiadaní. Podľa aplikovaného napätia na konci separácie sa elektroforéza delí na :

o nízkonapäťovú (do 300 V), o strednonapäťovú (do 1500 V), o vysokonapäťovú (až do niekoľko kV).

Izoelektrická fokusácia nachádza uplatnenie pri separácii látok amfotérneho charakteru s rôznymi hodnotami izoelektrického bodu (t.j. hodnota pH, pri ktorej látka má nulový náboj).

Separačné metódy


Základom separácie je prítomnosť gradientu pH pozdĺž kolóny. Po vložení jednosmerného poľa sa začnú amfolyty pohybovať k príslušnej elektróde, dokiaľ sa nedostanú do oblasti pH, ktoré sa rovná ich izoelektrickému bodu. V tomto okamihu sa stanú elektricky neutrálne a zastavia sa.

Izotachoforéza sa zaraďuje medzi najprogresívnejšie elektromigračné separačné metó-dy. Využíva diskontinuálny gradient elektrického poľa vytvorený v diskontinuálnom systéme elektrolytov. Z analytického hľadiska je najrozšírenejšia kapilárna izotachoforéza, pri ktorej jedno elektródové oddelenie a kapilára (v ktorej sa separácia uskutočňuje) je naplnená vodiacim elektrolytom a druhé elektródové oddelenie je naplnené zakončujúcim elektrolytom. Vodiaci elektroyt sa volí tak, aby mal najvyššiu pohyblivosť zo všetkých separovaných látok a zakončujúci naopak musí byť najmenej pohyblivý. Vzorka sa dávkuje na rozhranie medzi vodiacim a zakončujúcim elektrolytom. Vo vodiacom elektrolyte sa vždy vyskytuje protiión, ktorý má určitú tlmivú kapacitu (je súčasťou tlmivého roztoku). Po zapnutí zdroja sa budú ióny účinkom elektrického poľa pohybovať k opačne nabitým elektródam a začnú sa zoraďovať podľa svojich pohyblivostí. Po dosiahnutí ustáleného stavu (v ňom sú všetky ióny zoradené podľa klesajúcich pohyblivostí) sa všetky ióny pohybujú rovnakou rýchlosťou a nasledujú jeden za druhým. Hranice medzi jednotlivými zónami sú ostré v dôsledku uplatnenia samozaostrujú-ceho efektu. Fyzikálne vlastnosti daných iónov v zóne sú konštantné, avšak na rozhraní zón sa menia skokom. Na tomto princípe je založená detekcia zón pomocou fyzikálnych metód.

Pri izotachoforetickej separácii platí tzv. Kohlrauschova regulačná funkcia nezávislého putovania iónov. Napr. pre ióny A a B v ich zónach platí :

B A QB,2 A,1

A B Q

(

( )u u u

c cu u u

+=

+) (1.78)

kde index 1, 2 vyjadruje poradové číslo zóny, u je pohyblivosť iónov, uQ je pohyblivosť protiiónu. Z rovnice vidieť, že koncentrácia separovanej zložky v zóne nezávisí od zloženia analy-zovaného roztoku, ale sa upraví na koncentráciu látky v predchádzajúcej zóne.

Každé zariadenie pre izotachoforézu musí obsahovať tieto základné časti :

1. Vysokonapäťový zdroj jednosmerného prúdu s možnosťou stabilizácie konštantného prúdu v rozsahu 20 až 500 μA (napätie 15 až 30 kV).

2. Vlastnú separačnú jednotku. V súčasnosti sa najviac používajú kapiláry priemeru 0,2 až 1 mm vhodne spojené s elektródovými oddeleniami a dávkovacím systémom.

3. Detektor, ktorý môže byť univerzálny alebo špecifický. Z hľadiska vzájomného usporiadania elektrolytu a detektora môže ísť o kontaktné alebo bezkontaktné detektory.

4. Registračné zariadenie, ktoré sa v ostatnom čase nahradzuje mikropočítačom.

Separačné metódy


Mierou kvality je poloha meraného signálu a určuje sa ako tzv. hodnota RSH

i L

T L

h hRSHh h−

=−

(1.79)

kde sú: hi - výška zóny meranej zložky, hT - výška zóny zakončujúceho elektrolytu, hL - výška zóny vodiaceho elektrolytu (obr. 11).

Obr. 11 Izotachoforeogram - závislosť meraného signálu S od času t

a - integrálny záznam, b - diferenciálny záznam, hi - výška zóny meraného iónu od línie vodiaceho elektrolytu, hT - výška zóny zakončujúceho elektrolytu od línie vodiaceho elektrolytu

Mierou kvantity je dĺžka zóny, resp. doba po ktorú daná zložka prechádza cez detektor. Teda medzi dĺžkou zóny a látkovým množstvom platí priama úmernosť. Príslušnú konštantu úmernosti treba zistiť podľa daných pracovných podmienok a zvolenej metódy.

V ostatných rokoch nachádza stále väčšie uplatnenie kapilárna zónová elektroforéza s rôznymi modifikáciami. Táto metóda okrem elektroforetickej pohyblivosti využíva i elektro-osmotický tok, ktorý je v kapilárnej izotachoforéze potlačený na minimálnu hodnotu.

1. separa ČnÉ metÓdy · separačné metódy e-analytická chémia, Ústav analytickej chémie...

Documents