PROTEOMA E PROTEOMICA

Le proteine hanno due valori intrinseci che ne determinano le caratteristiche specifiche:

1. Punto isoelettrico (pI)

2. Peso molecolare (Mw)

PRINCIPIO DELL’ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE

IEF

SDS-PA

GE

Peso molecolare

pH 10.0pH 3.0Grande

Piccolo

-ve (catodo)+ve (anodo)

+ve (anodo)

Carica

PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PROTEICO

Una efficace procedura di preparazione del campione deve includere

Solubilizzazione riproducibile di tutte le classi proteiche, incluse quelle idrofobichePrevenzione dell’aggregazione proteica e mantenimento della solubilità durante IEFPrevenzione di modificazioni chimiche ed enzimatiche dovute al processo di estrazioneLa rimozione di macromolecole che possono interferireUna resa proteica adeguata per la valutazione che potrebbe implicare la rimozione di specie proteiche molto abbondanti

PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PROTEICO

Le proteine devono essere denaturate e solubili

Questo processo si ottiene tramite trattamenti specifici con:Urea (denaturante)Tioli (riducenti)Detergenti Inibitori di proteasi

UREA

L’urea è l’agente caotropico più utilizzato, ma in casi specifici con problemi di solubilizzazione si può utilizzare la tiourea. Entrambi questi agenti rompono i ponti idrogeno intra e inter –molecolari.

Normalmente si utilizza urea 8M, ma anche miscele di tiourea 2M e urea 5-8M.

DETERGENTI

I detergenti vengono aggiunti per rompere interazioni idrofobiche e incrementare la solubilità proteica al relativo punto isolelettrico. I detergenti devono essere non ionici o zwitterionici, quindi SDS non può essere utilizzato.

Vengono utilizzati CHAPS, CHAPSO o octilglucoside 1-2%

AGENTI RIDUCENTI

Per rompere i ponti disolfuro si utilizzano o ditiotreitolo(DTT) o tributil-fosfina (TBP).Una soluzione di DTT 50mM è sufficiente per la maggior parte delle proteine, ma per casi difficili è consigliato l’uso di TBP

ANFOLITI CARRIER

Le proteine tendono a precipitare quando vicine al loro pI, soprattutto in assenza di sali, che in IEF interferirebbero con la focalizzazione. La mancanza di sali può essere sopperita dall’aggiunta di anfoliti solubili al campione.

COMPOSTI CHE INTERFERISCONO

Acidi nucleici

Lipidi

Polisaccaridi

Sali

Proteasi

Ove è possibile è preferibile eseguire un frazionamento del campione

PREFRAZIONAMENTO

Estrazione differenziale

Frazionamento subcellulare

Cromatografia

IEF preparativa

ELETTROFORESI BI-DIMENSIONALE

PRIMA DIMENSIONE

Focalizzazione isoelettrica

Focalizzazione isoelettrica

MIGRAZIONE DELLE PROTEINE IN IEF

STRISCE PER IEF (isoelectrofocusing)

Utilizzano gradienti immobilizzatiPossono avere diverse lunghezzeDevono essere reidratate e corse in ambiente oleoso

Il gradiente di pH viene creato con set di tamponi derivati dall’acrilammide. La struttura generica è

CH2=CH-CO-NH-R

R= -COOH oppure –N(CH3)2

CORSA ELETTROFORETICA

Fino a 4 mg di proteine totali per strip

Il campione viene comunemente pre-adsorbito sulle strip durante la loro reidratazione, permettendo anche alle HMW proteins di entrare nel gel. Questo processo dura almeno 11 ore, dopodichè si può passare alla focalizzazione

Durante la corsa elettroforetica la conduttività del gel cambia dipendentemente dal numero di specie cariche, diminuendo mano a mano che le varie specie si focalizzano

ELETTROFORESI BI-DIMENSIONALE

SECONDA DIMENSIONE

SDS-PAGE

SECONDA DIMENSIONE

La transizione dalla prima alla seconda dimensione coinvolge l’equilibrazione della striscia focalizzata in tampone contenente SDS, la deposizione di essa sul gel di corsa e l’inglobamento in un gel di agarosio.

Agarose

SDS-PAGE

E’ esattamente uguale all’SDS-PAGE mono-dimensionale. Per avere un quadro generale si utilizza solitamente un gradiente (es. 8-16%). Una volta individuato il PM della regione di interesse, si passa a gel a percentuale uniforme che mostra una maggiore definizione.Nel caso si debbano paragonare due campioni è opportuno utilizzare due gel identici con corsa parallela.

COLORAZIONE DELLE PROTEINE

Una volta separato il campione in elettroforesi è possibile continuare con un Western blot, nel caso si cerchi qualcosa di specifico, come modificazioni proteiche post-traduzionali. Normalmente si procede alla colorazione del gel.

CHE COLORAZIONE EFFETTUARE?

La scelta della colorazione dipenderà soprattutto dalla quantità di proteine caricate.

Le colorazioni non devono interferire con i processi successivi e, in ordine di sensibilità, sono le seguenti:

Blu CoomassieArgentoColoranti fluorescenti

CHE COLORAZIONE EFFETTUARE?

I gel sono o preparativi o analitici. Se lo scopo del gel è quello di identificare proteine poco abbondanti, si eseguirà un grosso caricamento con una colorazione finale molto sensibile

Se la procedura viene utilizzata per ottenere un antigene, le proteine non devono essere fissate al gel, quindi la colorazione con argento verrà esclusa

In ogni caso ogni colorazione ha le proprie limitazioni

CHE COLORAZIONE EFFETTUARE?

La sensibilità raggiungibile con la colorazione è determinata

dalla quantità di colorante che si lega alla proteina

dalla differenza di colorazione tra il campione e il background del gel (signal-to-noise-ratio)

Ogni colorazione interagisce diversamente con le proteine e non esiste una colorazione che sia in grado di colorare tutte le proteine allo stesso modo. Sembra però che tutti i coloranti interagiscano meglio con aminoacidi basici

CHE COLORAZIONE EFFETTUARE?

Premettendo che sia meglio effettuare colorazioni diverse dello stesso campione, il colorante che sembra riuscire a dare il più ampio spettro di colorazione è il Blu Coomassie colloidale.

E’ possibile effettuare colorazioni successive dello stesso gel (fluorescente, Coomassie e infine argento)

CHE COLORAZIONE EFFETTUARE?

Sypro Ruby

Silver staining

2D ELETTROFORESI DELLE PROTEINE DI C. elegans

3 1pI 0

kDa

43

30

20

14

COLLEGAMENTO A BANCHE DATI

COMPARAZIONE CON 2D IN BANCA DATI

ANALISI DIFFERENZIALE

Coomassie Blue Dyes- commonly used- does not interfere with subsequent protein identification- inexpensive- sensitivity well below silver and fluorescent dyes

Silver stain- sensitivity 10-50 times greater than CB- ability to detect 1 ng of protein- silver diammine/silver nitrate- relatively expensive (reagents/waste disposal)- high background

Fluorescent Stains and Dyes- accurately determine changes in protein expression- greater sensitivity than silver stain- DIGE- cost

General detection methods

1)

Proteins are extracted from the cells or tissues of interest.

2)

The protein extracts are labeled with different fluorescent dyes:

3)

The 2 extracts are mixed and then resolved by 2-D gel electrophoresis.

Extract 1

Cy5 dye

Extract 2

Cy3 dye

mix

Dual

Channel

Imaging

Technique

(DIGE)

CyDye DIGE containing NHS ester active group covalently binds to the lysine residue of a protein via an amide linkage.

H2 N-

FluorescenceFluorescence stainingstaining

The DIGE technology platform

E-Cy5 E-Cy3

Excise spots; elute; digest, extract peptides; MS analyze, Protein identification

PSHA_1_0658

IEF (pH 4-7)

PSHA_1_2360

PSHA_1_0871PSHA_1_0021

PSHA_1_0849

PSHA_2_0363PSHA_2_0259PSHA_2_0420

PSHA_1_2262

PSHA_1_0328

PSHA_1_1875

PSHA_1_0255

PSHA_1_2758

PSHA_1_1059

PSHA_2_0557

PSHA_1_1740

PSHA_2_0150 PSHA_1_2771

PSHA_1_0341PSHA_1_2145

PSHA_1_3038 PSHA_2_0144

PSHA_1_0416

PSHA_1_0689

PSHA_2_0370

PSHA_1_0119PSHA_1_3009

PSHA_1_0870

PSHA_2_0474

PSHA_1_0595

PSHA_1_3001PSHA_1_2400

SDS

PAG

E-

PSHA_1_0658

PSHA_1_2360

PSHA_1_0871PSHA_1_0021

PSHA_1_0849

PSHA_2_0363PSHA_2_0259PSHA_2_0420

PSHA_1_2262

PSHA_1_0328

PSHA_1_1875

PSHA_1_0255

PSHA_1_2758

PSHA_1_1059

PSHA_2_0557

PSHA_1_1740

PSHA_2_0150 PSHA_1_2771

PSHA_1_0341PSHA_1_2145

PSHA_1_3038 PSHA_2_0144

PSHA_1_0416

PSHA_1_0689

PSHA_2_0370

PSHA_1_0119PSHA_1_3009

PSHA_1_0870

PSHA_2_0474

PSHA_1_0595

PSHA_1_3001PSHA_1_2400

PSHA_1_0658

PSHA_1_2360

PSHA_1_0871PSHA_1_0021

PSHA_1_0849

PSHA_2_0363PSHA_2_0259PSHA_2_0420

PSHA_1_2262

PSHA_1_0328

PSHA_1_1875

PSHA_1_0255

PSHA_1_2758

PSHA_1_1059

PSHA_2_0557

PSHA_1_1740

PSHA_2_0150 PSHA_1_2771

PSHA_1_0341PSHA_1_2145

PSHA_1_3038 PSHA_2_0144

PSHA_1_0416

PSHA_1_0689

PSHA_2_0370

PSHA_1_0119PSHA_1_3009

PSHA_1_0870

PSHA_2_0474

PSHA_1_0595

PSHA_1_3001PSHA_1_2400

PSHA_1_0658

PSHA_1_2360

PSHA_1_0871PSHA_1_0021

PSHA_1_0849

PSHA_2_0363PSHA_2_0259PSHA_2_0420

PSHA_1_2262

PSHA_1_0328

PSHA_1_1875

PSHA_1_0255

PSHA_1_2758

PSHA_1_1059

PSHA_2_0557

PSHA_1_1740

PSHA_2_0150 PSHA_1_2771

PSHA_1_0341PSHA_1_2145

PSHA_1_3038 PSHA_2_0144

PSHA_1_0416

PSHA_1_0689

PSHA _2_0370

PSHA_1_0119PSHA_1_3009

PSHA_1_0870

PSHA_2_0474

PSHA_1_0595

PSHA_1_3001PSHA_1_2400

Dual

Channel

Imaging

Technique

Green label

Proteome

A; Red label

= Proteome

B

Identification of differently expressed proteins by Dual

Channel

Imaging

Technique

(DIGE)

PROTEOMA E PROTEOMICA

"The analysis of the entire PROTEin content expressed by a genOME, or by a cell or tissue type.“ Wasinger VC et al, Electrophoresis 16 (1995)

“PROTEOMICS is the systematic analysis and documentation of proteins in biological samples with focus on state-related expression of proteins.”

PROTEOMA E PROTEOMICA

L’approccio genomico non considera le possibili

modificazioni post-traduzionali

che tutte le proteine degli organismi superiori posseggono

APPROCCIO PROTEOMICO

Ricerca proteine in un lisato cellulare o in estratto tissutale la cui espressione differenziale è determinata da fattori come

1. Processi patologici2. Delezioni o over-espressioni geniche3. Trattamenti farmacologici4. Stimolazioni chimiche e fisiche5. Rimozione di nutrienti o di ossigeno

SCOPO DELL’APPROCCIO PROTEOMICO

Valutazione di marcatori diagnostici in fluidi corporei

Studi di farmacologia quali identificazione e/o validazione

di nuovi target proteici per trattamenti farmacologici e

“drug profiling”

Studi di tossicità

Glicosilazioni, fosforilazioni o processamenti proteici

Analisi tissutali in situazioni patologiche

TECNOLOGIA LEGATA ALLA PROTEOMICA

Elettroforesi bidimensionale

Rilevazione degli “spot” proteici

Analisi di immagine

Excisione degli “spot” proteici

Digestione enzimatica

Spettrometria di massa

Bioinformatica

ANALISI DEL GEL

L’acquisizione dell’immagine dipende dal sistema di colorazione

Per colorazioni in luce diretta si possono utilizzare

DensitometroTelecamera

Per colorazioni in fluorescenza o radioattive

Scanner a fluorescenzaPhosphoimagerTelecamera su transilluminatore

COME IDENTIFICARE NUOVI SPOT?

Classica degradazione di Edman

Rimozione chimica di un residuo aminoacidico alla volta e analisi dello stesso. Metodo lento che necessita di grosse quantità proteiche

Spettrometria di massa

“Fingerprint” proteico e sequenza ex novo.Metodo veloce che necessita di piccole quantità proteiche

SPETTROMETRIA DI MASSA

E’ una metodica che

Misura accuratamente la massa proteica

Attraverso sequenze peptidiche identifica proteine note e sequenzia

proteine ignote

Identifica modificazioni post-traduzionali

EXCISIONE DEGLI SPOT PROTEICI

DIGESTIONE PROTEICA

Excisione dello spot da gel

Digestione con proteasi(tripsina) per una notte

Recupero del surnatante e estrazione deipeptidi da gel con acetonitrile

Evaporazione del solvente e risospensione in opportuna matrice

PEPTIDE MASS FINGERPRINT

La tripsina digerisce la sequenza proteica dopo un residuo di lisina (K) e di arginina (R). Il peptide

YAEKGLQQPVRAYMESEKSEEIDLPK

verrà quindi digerito in corrispondenza delle frecce

I 4 peptidi derivati hanno una massa ben definita:

YAEK 609.31GLQQPVR 797.45AYMESEK 857.38SEEIDLPK 957.54

Queste 4 masse definiscono esattamente il peptide della sequenza precedente

COME RILEVARE I PEPTIDI?

Dopo la digestione il campione deve essere ionizzato tramite:

Protonazione: M + H+ = MH+

Cationizzazione: M + Cat+ = MCat+

Deprotonazione: MH = M- + H+

Rilascio di elettroni: M = M+ + e-

Cattura di elettroni: M + e- = M-

COME RILEVARE I PEPTIDI?

Dopo la ionizzazione il campione viene fatto “volare” in

condizioni opportune.

Applicando lo stesso impulso a tutti i peptidi ionizzati, questi

percorreranno uno stesso tratto con un tempo relativo alla

loro massa. Questo tempo viene definito “tempo di volo”

(Tof)

SPETTROMETRIA DI MASSA

generazione di ioni in fase gassosa:

EI - Electron impact Ionisation (1919 A.J. Dempster)

CI - Chemical Ionisation

FAB - Fast Atom Bombardment (1981 M. Barber)

MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (1988, K. Tanaka et al.)

ESI - ElectroSpray Ionisation (1985 J. Fenn)

SPETTROMETRIA DI MASSA

EI - Electron impact Ionisation

E’ la modalita’ piu’ classica.E’ una ionizzazione ‘hard’.Il campione deve essere in stato di vapore.Adatto per composti piccoli (< 800 Da), volatili, termicamente stabili.Interfaccia con GC, anche HPLC.

SPETTROMETRIA DI MASSA

FAB - Fast Atom BombardmentIl campione viene prima dissolto in una matrice liquida (es. glicerolo).

La superficie liquida viene bombardata da un fascio di atomi ad alta energia cinetica (xenon o argon).

Le molecole di campione vengono cosi’ ‘spruzzate’ via dalla superficie, entrano nella fase gassosa, e vengono ionizzate, per protonazione odeprotonazione.

L’introduzione di questa tecnica nei primi anni ‘80 ha rivoluzionato la spettrometria di massa, aprendola alla biologia e alla medicina. Adatto ad es. per peptidi, piccole proteine, altri biopolimeri (fino a ≈ 5000).Ionizzazione ‘soft’. Quantita’ minima circa 20 picomoli.

SPETTROMETRIA DI MASSA

MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation

Matrice cristallina (anziche’ liquida).Fascio di fotoni (anziche’ di atomi).

Adatto per composti simili a quelli analizzabili con FAB, ma a piu’ alta sensibilita’(100-1000 volte meglio) e con molti meno limiti nelle dimensioni dell’analita: pesi molecolari fino a 300 kD.

SPETTROMETRIA DI MASSA

ESIElectroSpray Ionisation

Il potenziale applicato alla fine dell’ ago e’ sufficientemente alto da nebulizzare la soluzione in una miriade di goccioline cariche, contenenti il campione.

ESI ElectroSpray Ionisation

Quando il solvente evapora, la concentrazione di carica alla superficie della gocciolina aumenta fino a superare la tensione superficiale →esplosione ‘coulombica’ . Si formano ioni dell’ analita privi di solvente.

Le cariche sono statisticamente distribuite tra i siti disponibili dell’analita, portando spesso alla formazione di ioni a cariche multiple.

La tecnica ESI e’ adatta per composti simili a quelli sottoponibili a MALDI, con sensibilita’ ed estensione di dimensioni molecolari un po’ minori.

ESI si adatta all’interfacciamento con HPLC e elettroforesi capillare

SPETTROMETRIA DI MASSA

748.404 920.415 1271.61 1378.78 1484.97 1502.62 1562.8 1606.82 1815.83 1853.89 1884.95 1981.97

748.404 920.415 1271.61 1378.78 1484.97 1502.62 1562.8 1606.82 1815.83 1853.89 1884.95 1981.97

Modificazioni post-trasduzionali di proteine

Nominal Mass Common Modifications and Residueschange (Da)-42 ornithine replaces Arg-30 homoserine replaces Met-18 loss of water, (crosslink, dehydration, pyroGlu, replaces Glu)- 2 disulfide formation, dehydroalanine replaces Ala- 1 amide group replaces acid1 acid group replaces amide, citrulline replaces Arg14 methylene group (methylation, homolog, etc)16 oxygen atom (hydroxylation, Met sulfoxide formation, etc.)28 formyl, 2 methyl groups, ethyl32 addition of 2 oxygen atoms (dihydroxyl addition)35 & 37 chlorine atom42 acetyl, trimethyl group44 carboxyl addition56 t-butyl64 + isotopes selenocysteine replaces serine74 glyceryl group78 & 80 bromine atom80 phosphoryl, sulfonyl groups126 iodine atom132 pentosyl176 glucuronosyl210 myristoyl226 biotinyl229 pyridoxyl454 coenzyme A541 ADP-ribosyl617 heme784 FAD

TECNICHE MS E POTENZIALITA’

MALDI-Tof