1. proyectos dirigidos/coordinados
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1. PROYECTOS DIRIGIDOS/COORDINADOS Clave Institución/Clave Monto Vigencia Productos
(1) SG/I Intl.
UniKa/RFA / Clave 02-WS146
US $228,600 (Para la UNAM:
DM148,000)
1981-1987 Libro en inglés/español sobre la producción de proteína microbiana para ser diseminado en el mundo
(2) SG/I Intl.
UNEP (Kenya) / Clave FP/2104-82-01
US$69,800 (Para la UNAM:
US$22,700)
1981-1987 Construcción de un bioterio para la UNAM/FQ, realización de un
seminario internacional y publicación de sus memorias en inglés/español
(3) SG/I Nal.
CONACyT / Clave PCCBBNA-020395
$3,100,000 aumentados a $5,370,000.00
1983-1986 Contraparte mexicana de los dos anteriores con UNEP y UniKa
(4) SG/I Nal.
LANFI US$10,000 1985-1986 Secado y acondicionamiento de biomasa microbiana (Contraparte
mexicana de los dos primeros, UNEP y UniKa
(5) SP
Nal.
CONASUPO (Miconsa Guadalajara)
$37,000,000 1984-1986 Pruebas con una planta piloto de 3000 litros (Contraparte mexicana de los dos
primeros, UNEP y UniKa
(6) SG/I Intl.
OEA US$60,000 1986-1987, 1988-1989
Libro sobre la producción de harinas precocidas (extrudidas) de maíz y otros
granos para consumo humano a ser diseminado en el mundo
(7) SE Intl.
Instituciones argentinas
US$ 20,000 1984-1994 Contraparte argentina del proyecto de la OEA
(8) SG/I Nal.
CONACyT / Clave PCALBNA-022816
$9,650,000 1985-1988 Contraparte mexicana del proyecto de la OEA
(9) SE
Nal. E Intl.
IPN/MÉXICO E IIIA/CUBA
US$5,000.00 1985-1987 Contrapartes mexicana y cubana del proyecto de la OEA
(10) SE
Nal.
CIDESI US$3,000.00 1986-1987 Elaboración de planos del extrusor (Contraparte mexicana del proyecto de
la OEA) (11) SP
Nal.
AZÚCAR, S.A.-UNAM-UASLP-CINVESTAV
$700,000,000 1986-1990, 1990-1992
Informes y publicaciones técnicos sobre el diseño, la construcción,
instalación y operación de una planta piloto de tratamiento biológico de
aguas residuales de ingenios azucareros (ejemplo: vinazas)
(12) SE
Nal.
DGAPA-UNAM / Clave IN-302289
N$227,000 (Becas
$12,000)
1989-1990, 1990-1992
Informes y publicaciones técnicos sobre el tratamiento biológico de vinazas por métodos aerobios y
anaerobios (En cooperación con el Instituto de Ingeniería)
Clave Institución/Clave Monto Vigencia Productos (13) SE
Nal.
DGAPA-UNAM / Clave IN-302692
N$117,510 (Becas $9,600)
1992-1993 Contrapartes de la UNAM del proyecto anterior
(14) SG/I Nal.
IPN-CONACYT / Clave PVT-AI-NAL-87-3782
$62,200,000 1987-1990 Informes técnicos sobre propuestas de tratamiento de aguas residuales de la industria papelera que emplea papel
reciclado como materia prima (15) SG/I Nal.
CONACyT / Clave P122CCOT-894272
$40,000,000 1989-1991 Informes técnicos sobre ecología microbiana de sistemas de tratamiento de aguas residuales de la industria de
proceso (16) SG/I Nal.
ANDSA N$65,000.00 1990-1992 Informe técnico sobre propuestas analíticas para detectar aflatoxinas en
granos (17) SE
Nal.
DGAPA-UNAM / Clave IN-207389
N$14,733.00 1990-1991 Evaluación y control de riesgos tóxicos en alimentos de origen vegetal
(Contraparte de la UNAM del anterior)(18) SP
Nal.
AHMSA/Sur N$65,000.00 1990-1992 Informe técnico sobre el tratamiento y utilización para fines agrícolas del
ácido residual de la industria metal-mecánica
(19) SE
Nal.
DGAPA-UNAM / Clave IN-205289
N$27,436.00 1990-1991 Contraparte de la UNAM del proyecto anterior sobre el tratamiento y
utilización para fines agrícolas del ácido residual de la industria metal-
mecánica (20) SP
Nal.
Ingenio San José de Abajo
N$438,360 1993-1994 Informe de auditoría ambiental para la Profepa / Semarnap
(21) SE Intl.
Universidad BOKU (Viena, Austria)
N$300,000 1994-1997, 1997-2000
Formación de estudiantes de maestría austríacos y especialistas mexicanos en
proyectos ambientales (22) SE
Nal.
DGAPA-UNAM / Clave IN-505594
N$200,408 y $70,445 (Becas:
$26,200)
1994-1996 Degradación de contaminantes disueltos en aguas residuales
industriales usando matrices sólido-líquido-gas
(23) SP
Intl.
Du Pont US$12,000 1995 Informe técnico sobre la optimación del uso del agua en su planta
Tlalnepantla (24) SE
Nal.
PAPIME, UNAM / Clave RE201997, RE201998, 172019, 96/213
43,000.00 85,000.00 $21,906.00 $134,419.00 $212,000.00
1995-1996 1996-1997 1997-1998 1998-1999 1999-2000
Apoyo a la enseñanza experimental mediante el acondicionamiento de un
laboratorio de desarrollo y optimización de tecnologías más
limpias para la industria alimentaria
(25) SG/I Intl.
GTZ-RFA DM 750,000 (Becas: DM
200,000)
1995-1998 1998-2001 2001-2002
Formación de estudiantes de licenciatura, maestría, doctorado y
especialistas mexicanos en proyectos
Clave Institución/Clave Monto Vigencia Productos ambientales
(26) SG/I Nal.
DGAPA-UNAM / Clave IN-203395
N$90,100.00 (Becas:
$26,100.00)
1995-1996 Informe técnico y formación de estudiantes en el proyecto sobre síntesis y estructura (espectro y
actividades redox) del modelo de compuestos para bacterias
metanogénicas (27) SG/I Nal.
CONACYT / Clave 2406PB
$170,000.00 (Becas:
$27,000)
1996-1998 Informe técnico y formación de estudiantes del proyecto anterior sobre
síntesis y estructura (espectro y actividades redox) del modelo de
compuestos para bacterias metanogénicas
(28) SP
Intl.
Du Pont US$12,000 1996-1997 Informe técnico sobre la optimación de los sistemas de combustión en su
planta Tlalnepantla (29) SP y SG/I Nal.
IMP-FIES 95-94-II $610,000.00 (Becas hasta
octubre 1997: $81,500.00)
1996-1999 Informe técnico y formación de estudiantes en el proyecto sobre las
opciones de tratamiento, minimización de volumen, estabilización y
disposición de los lodos de desecho de la planta de tratamiento biológico de la
ciudad de Salamanca, Gto., operada por la Refinería Ing. Antonio M. Amor
(RIAMA) de Petróleos Mexicanos (30) SG/I Intl.
GEPLACEA-ONUDI / Clave US/INT/91/217 Contrato 95-249 P
US$ 8,000.00 1995-1996 Informe técnico sobre la utilización y optimación del agua en ingenios
azucareros mexicanos en Veracruz y Jalisco, México
(31) SG/I Nal.
IMP $450,000.00 1996 Informe técnico sobre el control de calidad y el aseguramiento de la
calidad en pruebas de quemado de substancias tóxicas en dos incineradores del complejo
petroquímico Pajaritos II de PEMEX-PETROQUÍMICA, Veracruz, México
(32) SG/I Nal.
INE $150,000 1997 Informe técnico sobre la estimación de la generación de óxidos de nitrógeno y azufre en zonas críticas de México en
equipos de 43,000 MJ/h o más (33) SP y SG/I Nal.
IMP, UAM-I, U de G y UANL / Clave IMP-FIES 96-48-VI
$439,800.00 (Becas
adicionales: $1,080,000)
1997-2000 Informe técnico y formación de estudiantes del proyecto sobre
opciones de tratamiento, estabilización y restauración de suelos contaminados
con hidrocarburos (especialmente mediante el empleo de la
fitorremediación) (34) SE
DGAPA-UNAM Clave IN-101397
$228,136 (Becas:
1997-1998 Formación de estudiantes del proyecto sobre desarrollo de nuevas tecnologías
Clave Institución/Clave Monto Vigencia Productos Nal. $8,136.00) para la preconcentración y el análisis
en línea de plaguicidas en muestras acuosas: aplicación al monitoreo
ambiental (35) SG/I Nal.
CONACyT / Clave3038P
$508,235 (Becas:
$11,520.00)
1997-1999 Formación de recursos humanos especializados en la determinación de
trazas de plaguicidas polares por medio de la tecnología de precolumnas
(36) SG/I Nal.
CONACyT / Clave 3302P-B
$259,000.00 (Becas:
$165,000.00)
1997-1999 Formación de recursos humanos especializados en el tratamiento de
aguas residuales usando un sistema de raíces en humedales
(37) SG/I Nal.
Pemex Gas y Petroquímica Básica
$27,000,000 1998-1999 Uso eficiente del agua en cuatro centros procesadores de gas del Estado
de Tabasco
(38) SP
Nal.
Industrias Peñoles $57,500 2000-2001 Utilización del óxido e hidróxido de magnesio en plantas de tratamiento de
aguas residuales (39) SE
Nal.
DGAPA-UNAM Clave IN-109100
$193,000 (Becas:
$26,355.00)
2000-2002 Formación de estudiantes del proyecto sobre depuración de aguas residuales
por medio de la combinación del método de Fenton y de una adsorción-
degradación sobre carbón activado (40) SG/I Nal.
CONACYT SIGOLFO / Clave 00-06-016-V
$352,664 (Becas:
$36,355.00)
2000-2002 Formación de estudiantes del proyecto sobre depuración de aguas residuales
domésticas usando humedales artificiales en cooperación con la Universidad Juárez Autónoma de
Tabasco (41) SP
Nal.
Industrias Peñoles $536,000 (anuales)
2000-2020 Tratamiento y estabilización de aguas residuales y sólidos mineros (jales) en las regiones de Guanajuato y Edo. de
México (42) SG/I Intl.
Proyecto 2+2 (CEAL+H, U Nord, PIQAyQA, Incam) (UAdY y UJAT) CONACYT apoyó con pasajes aéreos
$4,000,000 2000-2003 Eliminación de organismos patógenos en sistemas de tratamiento de aguas residuales domésticas y mixtas en
humedales artificiales
(43) SE
Nal.
DGAPA-UNAM PAPIIT Clave IN-103403
$246,136.00 (Becas:
$43,578.00)
2003-2005 Formación de estudiantes del proyecto sobre desarrollo de nuevas tecnologías para la restauración ambiental de zonas
con impactos mineros (44) SE
Nal.
PAPIME, UNAM Clave EN103704
$90,000.00 2004-2005 Apoyo a la enseñanza experimental mediante el uso de un laboratorio
interdisciplinario para las asignaturas integradoras de las cinco carreras que
se imparten en la FQ-UNAM
Clave Institución/Clave Monto Vigencia Productos (45) SE
Nal.
PAPIME, UNAM Clave EN103704
$115,000.00 2006-2007 Apoyo a la enseñanza experimental mediante el uso de un laboratorio
interdisciplinario para las asignaturas integradoras de las cinco carreras que
se imparten en la FQ-UNAM Uno de los proyectos hecho en
cooperación con colegas de la FMVyZ, el bioterio del Conjunto E de la FQ y el INNCM”SZ” involucra la
realización de pruebas biológicas para corroborar el efecto del azúcar y
edulcorantes sintéticos (fructosa de almidones, “aspartame”, “sucralosa”) que dañan potencialmente la salud de
los consumidores (46) SE
Nal.
DGAPA-UNAM PAPIIT Clave IN-105407-1
$200,000 (Becas:
$35,000)
2006-2007 Formación de estudiantes del proyecto sobre desarrollo de nuevas tecnologías para la restauración ambiental de zonas
con impactos mineros (47) SE
Nal.
DGAPA-UNAM PAPIIT Clave IN-105407-2
$125,000.00 2008-2009 Formación de estudiantes del proyecto sobre desarrollo de nuevas tecnologías para la restauración ambiental de zonas
con impactos mineros (48) SG/I Nal.
CONACYT CIENCIA BÁSICA / Clave 082788
$778,000.00 (Becas:
$100,000.00)
2008-2012 Formación de estudiantes e investigación básica a través del
proyecto sobre la evaluación del efecto del azúcar y edulcorantes sintéticos
(fructosa de almidones, “aspartame”, “sucralosa” y otros edulcorantes) que dañan potencialmente la salud de los consumidores en ratas de laboratorio en cooperación con el INCMyNSZ
(49) SG/I Nal.
CONACYT Redes Temáticas
$100,000.00 (Gastos de
intercambio)
2010-2012 Intercambio académico para la formación de redes que enriquezcan la cooperación en investigación básica y
aplicada a través de proyectos interinstitucionales y posgrados
interinstitucionales en el marco de la Red de Medio Ambiente y Sustentabilidad, ReMAS
(50) SE
Nal.
DGAPA-UNAM PAPIIT Clave IN-118111-2
$155,000.00 2011-2013 Formación de estudiantes e investigación básica y aplicada a través
del proyecto sobre la identificación de bacterias metanogénicas y sulfato-
reductoras en tres reactores de lecho de lodos de flujo ascendente (RALLFA)
operando a 45, 55 y 65°C (51) SG/I
CONACYT CIENCIA BÁSICA /
$1,025,050
2012-2015 Formación de estudiantes e investigación básica a través del proyecto sobre la evaluación del efecto del azúcar y
Clave Institución/Clave Monto Vigencia Productos Nal. Clave 178656 edulcorantes sintéticos (fructosa de
almidones, “aspartame”, “sucralosa” y otros edulcorantes) sobre la liberación de
las incretinas GLP-1 y GIP y su efecto sobre la lipogénesis y glucogénesis a corto y largo plazos usando ratas de laboratorio
en cooperación con el INCMyNSZ (52) SE
Nal.
PAPIME, UNAM Clave PE100514
$165,000.00 2014-2016 Desarrollo de material didáctico para las asignaturas Ingeniería Ambiental y Estancia Académica de la carrera de
Ingeniería Química con base en estudios de caso
(53) SE
Nal.
DGAPA-UNAM PAPIIT Clave IN-102214
$235,000.00 2013-2016 Formación de estudiantes e investigación básica y aplicada a través del proyecto sobre la determinación del efecto de un
plaguicida el ditiocarbamato de sodio para eliminar bacterias en los jugos de caña
(54) SE
Nal.
DGAPA-UNAM PAPIIT Clave IN-217619
$235,000.00 2019-2021 Formación de estudiantes e investigación básica a través del proyecto sobre la
evaluación del efecto de edulcorantes sintéticos (fructosa de almidones, “aspartame”, “sucralosa” y otros
edulcorantes) y naturales (glucosa, fructosa, sacarosa) sobre la lipogénesis y
glucogénesis a corto y largo plazos usando ratas de laboratorio
1. CONTRATO DE COOPERACIÓN UNIVERSIDAD DE KARLSRUHE (INSTITUTO DE
BIOINGENIERÍA Y BIOTECNOLOGÍA DE LAS AGUAS RESIDUALES) Y LA UNAM (DEPARTAMENTO DE ALIMENTOS, DIVISIÓN DE INGENIERÍA, FACULTAD DE QUÍMICA). Estudios sobre la producción de proteína microbiana a través del tratamiento aerobio de desagües ricos en carbohidratos (estudio específico sobre nejayote, aguas residuales de los molinos de nixtamal) Proyecto Clave 02-WS146. 1981-1987. FINANCIAMIENTO TOTAL POR PARTE DEL MINISTERIO FEDERAL DE INVESTIGACIÓN Y TECNOLOGÍA DE LA RFA (US $228,600, de los cuales se dieron para la UNAM 148,000 MARCOS ALEMANES)
2. CONVENIO UNITED NATIONS ENVIRONMENT PROGRAMME (UNEP)-BUNDESMINISTERIUM FUER FORSCHUNG UND TECHNOLOGIE (BMFT)-INSTITUT FUER INGENIEURBIOLOGIE UND BIOTECHNOLOGIE DES ABWASSERS (IIBB)-DEPARTAMENTO DE ALIMENTOS (DA)-FQ-UNAM. Programación y realización de una reunión de expertos en diciembre de 1985 para formular estrategias de aplicación inmediata y a mediano plazo, así como el diseño e impresión del informe final de proyecto para la diseminación mundial de la tecnología obtenida en inglés y español. 1981-1987. Proyecto Clave FP/2104-82-01. Apoyo financiero para el desarrollo de una planta prototipo de tratamiento de efluentes de la industria alimentaria ($22,700 US DÓLARES para la UNAM, DE UN MONTO TOTAL APROBADO DE US$69,800)
3. CONVENIO UNAM-CONACYT para co-financiar el proyecto de tratamiento de aguas residuales de la industria del maíz en méxico. DIRECCION ADJUNTA DE DESARROLLO CIENTÍFICO. Proyecto Clave PCCBBNA-020395. 1983-1986 ($3,100,000 que se incrementaron a $5,370,000.00 para substancias y materiales).
4. CONVENIO DE COLABORACION UNAM-LANFI. PROGRAMA DE TRABAJO FACULTAD DE QUÍMICA-LANFI. Acondicionamiento de la biomasa microbiana generada en sistemas biológicos de tratamiento. 1985-1986. TOTALMENTE FINANCIADO POR LOS LANFI (US$10,000.00)
5. CONVENIO UNAM-CONASUPO. PROGRAMA ESPECÍFICO DE TRABAJO FACULTAD DE QUÍMICA-MICONSA para instalar una planta piloto de tratamiento aerobio de nejayote en la planta Miconsa de Guadalajara, Jal., MÉXICO. 1984-1986. $37,000,000.00
6. CONVENIO UNAM-OEA. Proyecto presentado a la OEA en 1985 para la extrusión alcalina de maíz, sorgo y sus mezclas para producción de harinas de tortillas. Bienios 1986-1987 y 1988-1989. Financiamiento para ambos bienios por parte de la OEA ($60,000 US DLS)
7. DOCUMENTO DE INTENCIÓN DE COLABORACIÓN REPÚBLICA ARGENTINA-MÉXICO 1984 con base en el proyecto presentado a la OEA en 1985 para la extrusión alcalina de maíz, sorgo y sus mezclas para producción de harinas de tortillas, participando las UNIVERSIDADES DE BUENOS AIRES Y SALTA, EL ISETA Y EL INTA-PERGAMINO por parte de la REPÚBLICA ARGENTINA y la UNAM, EL IPN, EL INIFAP Y EL CIATECH por parte de MÉXICO para los bienios 1986-1987 Y 1988-1989. FINANCIAMIENTO POR PARTE DE LAS INSTITUCIONES ARGENTINAS ($20,000 US DLS)
8. CONVENIO UNAM-CONACYT para co-financiar el proyecto de extrusión de granos, particularmente maíz y sorgo, para la producción de harinas precocidas para tortillas. DIRECCION ADJUNTA DE DESARROLLO CIENTÍFICO. Proyecto Clave PCALBNA-022816. 1985-1988. $9,650,000.00
9. CONVENIO DE COLABORACIÓN REPÚBLICA DE CUBA-MÉXICO. Proyecto 2.1.7 sobre producción de alimentos proteínicos de bajo costo (soya extrudida), dentro del marco institucional de la ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS, I.P.N.; DEL DEPARTAMENTO DE ALIMENTOS DE LA FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM Y EL INSTITUTO DE INVESTIGACIONES PARA LA INDUSTRIA ALIMENTICIA DEL MINISTERIO DE LA INDUSTRIA ALIMENTICIA DE LA REPÚBLICA DE CUBA. 1985-1987. TOTALMENTE FINANCIADO POR LA ENCB-IPN/MÉXICO Y EL IIIA/CUBA (US$5,000.00)
10. CONVENIO DE COLABORACIÓN UNAM-CIDESI para procesamiento de granos. El CENTRO DE INGENIERÍA Y DESARROLLO INDUSTRIAL, organismo descentralizado de la SECRETARÍA DE EDUCACIÓN PÚBLICA, y el DEPARTAMENTO DE ALIMENTOS DE LA DIVISIÓN DE INGENIERÍA DE LA FACULTAD DE QUÍMICA iniciaron trabajos de desarrollo tecnológico en el marco del convenio para procesar granos para consumo humano directo. 1986-1987. TOTALMENTE FINANCIADO POR CIDESI (US$3,000.00)
11. CONVENIO DE COLABORACION AZÚCAR, S.A.-UNAM-UASLP-CINVESTAV. Este convenio se firmó para instalar y operar una planta piloto de tratamiento biológico de aguas residuales en el ingenio "ALIANZA POPULAR", ubicado en Ciudad Valles, S.L.P. Las instituciones participantes tuvieron la responsabilidad de los diferentes procesos que se estudiaron: tratamiento anaerobio con reactores de manto o lecho de lodos y de lecho empacado (INSTITUTO DE INGENIERÍA, UNAM), de lecho fluidificado (CINVESTAV-IPN) y tratamiento aerobio con un reactor de discos rotatorios (FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM), evaluación del uso energético del biogás generado en el tratamiento anaerobio (INSTITUTO DE INVESTIGACIONES ELÉCTRICAS) y supervisión analítica del comportamiento de los equipos (UASLP). El financiamiento fue obtenido de AZÚCAR, S.A., el ingenio involucrado y las instituciones participantes. 1986-1990, 1990-1992. INVERSIÓN APROXIMADA DURANTE EL PERÍODO COMPLETO DE $ 700,000,000.00
12. CONVENIO DE COLABORACIÓN QUE CELEBRAN LA DGAPA-UNAM, EL INSTITUTO DE INGENIERÍA (CON EL DR. ADALBERTO NOYOLA) Y LA FQ-UNAM (CON LA DRA. CARMEN DURÁN-DE-BAZÚA) para realizar el proyecto "Tratamiento de vinazas por metodos aerobios y anaerobios". Proyectos Clave IN-302289 y . 1989-1990, 1990-92. N$227,000 (Becas $12,000)
13. CONVENIO DE COLABORACIÓN QUE CELEBRAN LA DGAPA-UNAM, EL INSTITUTO DE INGENIERÍA (CON EL DR. ILANGOVAN KUPPUSSAMY) Y LA FQ-UNAM (CON LA DRA. CARMEN DURÁN-DE-BAZÚA) para realizar el proyecto "Tratamiento de vinazas por métodos aerobios y anaerobios". Proyecto Clave IN-302692. 1992-93. N$117,510.00 (Becas $9,600)
14. CONVENIO UNAM-IPN-CONACYT para co-financiar el proyecto de tratamiento de aguas residuales de la industria papelera que emplea papel reciclado como materia prima. dirección adjunta de desarrollo tecnológico. Proyecto Clave PVT-AI-NAL-87-3782. 1987-1990. $62,200,000.00
15. CONVENIO UNAM-CONACYT para co-financiar el proyecto de evaluación de la calidad depurativa de procesos biológicos de tratamiento de aguas residuales industriales usando microorganismos indicadores. Direccion Adjunta de Desarrollo Tecnológico. Proyecto Clave P122CCOT-894272. 1989-1991. $40,000,000.00
16. CONVENIO DE COOPERACIÓN UNAM-ANDSA (FACULTAD DE QUÍMICA-CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN, CAPACITACIÓN Y CERTIFICACIÓN DE LOS ALMACENES NACIONALES DE DEPÓSITO) para estandarizar las metodologías analíticas para determinar la concentración de aflatoxinas presentes en granos contaminados, tomando como ejemplo el efecto del tratamiento térmico alcalino del maíz sobre las aflatoxinas presentes en granos contaminados. 1990-1992. N$65,000.00
17. CONVENIO DE COLABORACIÓN QUE CELEBRAN LA DGAPA-UNAM Y LA FQ-UNAM con las Dras. Carmen Durán-de-Bazúa y Silvia Peña Betancourt para realizar el proyecto "Evaluación y control de riesgos tóxicos en alimentos de origen vegetal". Proyecto Clave IN-207389. 1990-1991. N$14,733.00
18. CONVENIO DE COLABORACIÓN CON AHMSA/SUR QUE CELEBRAN LA UNAM, LA FQ-UNAM (CON LA DRA. CARMEN DURÁN-DE-BAZÚA) Y EL INSTITUTO DE GEOGRAFÍA (CON LA MAESTRA MARGARITA E. GUTIÉRREZ) para realizar el proyecto "Tratamiento y utilización para fines agrícolas del ácido residual de la industria metal-mecánica". 1990-1992. N$65,000.00
19. CONVENIO DE COLABORACIÓN QUE CELEBRAN LA DGAPA-UNAM, LA FQ-UNAM (CON LA DRA. CARMEN DURÁN-DE-BAZÚA) Y EL INSTITUTO DE GEOGRAFÍA (CON LA MAESTRA MARGARITA E. GUTIÉRREZ) para realizar el proyecto "Tratamiento y utilización para fines agrícolas del ácido residual de la industria metal-mecánica". Proyecto Clave IN-205289. 1990-1991. N$27,436.00
20. CONVENIO DE COLABORACIÓN 3570-075-23-II-94 QUE CELEBRAN LA UNAM Y EL INGENIO SAN JOSÉ DE ABAJO para realizar estudios tendientes a implantar tecnologías más limpias (mediante una auditoría ambiental). 1993-1994. N$438,360.00
21. ACUERDO DE COOPERACIÓN ACADÉMICA 3631-136-23-III-94 ENTRE LA UNAM Y LA UNIVERSIDAD DE AGRICULTURA, RECURSOS FORESTALES Y RECURSOS NATURALES RENOVABLES DE VIENA (BOKU) para fomentar la cooperación en los campos de la docencia, la investigación y la formación de personal altamente calificado en las diferentes áreas de investigación relacionadas con la protección ambiental. 1994-1997, 1997-2000. Becas para estudiantes e intercambio de profesores (viáticos de mexicanos en Austria y pasajes aéreos de mexicanos a Austria), SOPORTE FINANCIERO A LOS PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN (MONTO APROXIMADO DE N$300,000.00)
22. CONVENIO DE COLABORACIÓN QUE CELEBRAN LA DGAPA-UNAM Y LA FQ-UNAM (CON LA DRA. CARMEN DURÁN-DE-BAZÚA, RESPONSABLE Y EL DR. VÍCTOR MANUEL LUNA-PABELLO Y LA DRA. RANJANI KRISHNAN, CORRESPONSABLES) para realizar el proyecto "Degradación de contaminantes disueltos en aguas residuales industriales usando matrices sólido-líquido-gas". Proyecto Clave IN-505594. 1994-96. (N$200,408.00 y $70,445.00)
23. CONVENIO DE COOPERACIÓN ACADÉMICA ENTRE LA UNAM Y DU-PONT DE MÉXICO S. A. DE C. V., para optimizar el uso del agua en su planta Tlalnepantla. 1995. US$12,000 (Becas: US$12,000)
24. PROGRAMA PAPIME (Primera, Segunda, Tercera, Cuarta, Quinta Convocatorias) (Con la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, como Responsable) para realizar tareas académicas de apoyo a la enseñanza experimental mediante el acondicionamiento de un laboratorio de desarrollo y optimización de tecnologías más limpias para las industrias alimentaria, biotecnológica y de proceso. UNAM, Secretaría General, Coordinación de Programas Académicos, Dirección de Programas de Apoyo a la Docencia. Proyecto Claves RE201997, RE201998, 172019. 1995-2000 (Apoyos anuales de $43,000.00, $85,000.00, $21,906.00, $134,419.00, $212,000.00)
25. CONVENIO DE COOPERACIÓN ACADÉMICA UNAM-GTZ (SOCIEDAD DE LA COOPERACIÓN TÉCNICA, DE LA RFA) para la “Instalación de un laboratorio de residuos peligrosos”. (Con la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, como Responsable). 1995-1998 y 1998-2001. Financiamiento de equipamiento y adiestramiento a través de expertos internacionales en estancias de corto plazo (750,000 marcos alemanes y, adicionalmente, pago de becas de formación de recursos humanos y contratación de expertos para apoyar esta formación)
26. CONVENIO DE COLABORACIÓN QUE CELEBRAN LA DGAPA-UNAM Y LA FQ-UNAM (CON EL DR. THANGARASU PANDIYAN, RESPONSABLE Y LA DRA. CARMEN DURÁN-DE-BAZÚA, CORRESPONSABLE) para realizar el proyecto "Síntesis y estructura (espectro y actividades redox del modelo de compuestos para bacterias metanogénicas)". Proyecto Clave IN-203395. 1995-96. N$90,100.00 (Becas: $26,100.00)
27. CONVENIO UNAM-CONACYT para co-financiar el proyecto “Estructura de modelos de compuestos para bacterias metanogénicas”. DIRECCION ADJUNTA DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA. Proyecto Clave 2406PB. 1996-1998. $170,000.00 (Becas: $27,000)
28. CONVENIO DE COOPERACIÓN ACADÉMICA ENTRE LA UNAM Y DU-PONT DE MÉXICO S. A. DE C. V. para minimizar las emisiones contaminantes de las calderas en su planta Tlalnepantla. 1996. US$ 12,000.00 (Becas: $9,000)
29. CONVENIO DE COOPERACIÓN ACADÉMICA ENTRE LA FACULTAD DE QUÍMICA DE LA UNAM Y EL IMP para estudiar las opciones de tratamiento, minimización de volumen, estabilización y disposición de los lodos de desecho de la planta de tratamiento biológico de la ciudad de Salamanca, Gto., operada por la Refinería Ing. Antonio M. Amor (RIAMA) de Petróleos Mexicanos, en el marco del FONDO
PARA LAS INSTITUCIONES DE EDUCACIÓN SUPERIOR (FIES). Proyecto IMP-FIES 95-94-II. 1996-1999. $610,000.00 (Becas hasta octubre 1997: $81,500.00)
30. CONVENIO DE COOPERACIÓN ACADÉMICA ENTRE LA FACULTAD DE QUÍMICA DE LA UNAM, EL GRUPO DE PAÍSES LATINOAMERICANOS Y DEL CARIBE EXPORTADORES DE AZÚCAR Y LA ORGANIZACIÓN DE LAS NACIONES UNIDAS PARA EL DESARROLLO INDUSTRIAL para estudiar el uso del agua en ingenios azucareros mexicanos en Veracruz y Jalisco, MÉXICO. Proyecto DEMOSTRACIÓN DE PRODUCCIÓN CON TECNOLOGÍAS MÁS LIMPIAS EN LA INDUSTRIA AZUCARERA US/INT/91/217 CONTRATO 95-249 P. 1995-1996. US$ 8,000.00
31. CONVENIO DE COOPERACIÓN ACADÉMICA ENTRE LA FACULTAD DE QUÍMICA DE LA UNAM Y EL IMP para estudiar el control de calidad y el aseguramiento de la calidad en pruebas de quemado de substancias tóxicas en dos incineradores del complejo petroquímico PAJARITOS II de PEMEX-PETROQUÍMICA. VERACRUZ, MÉXICO. 1996. $450,000.00
32. CONVENIO DE COOPERACIÓN ACADÉMICA ENTRE LA FACULTAD DE QUÍMICA DE LA UNAM Y EL INSTITUTO NACIONAL DE ECOLOGÍA para estudiar el control de la contaminación atmosférica de las zonas críticas de méxico a través de la realización de un inventario de emisiones de equipos de combustión mayores de 43,000 MJ/h que consumen gasóleo, combustóleo y gas, MÉXICO. ABRIL-DICIEMBRE 1997. $150,000.00
33. CONVENIO DE COOPERACIÓN ACADÉMICA ENTRE LA FACULTAD DE QUÍMICA DE LA UNAM, LA UAM-I, LA UANL Y EL IMP para estudiar las opciones de tratamiento, estabilización y restauración de suelos contaminados con hidrocarburos, en el marco del fondo para las instituciones de educación superior (FIES). Proyecto IMP-FIES 96-48-VI. 1997-2000. $439,800.00 (Becas, adicionales a substancias y materiales: $1,080,000)
34. CONVENIO DE COLABORACIÓN QUE CELEBRAN LA DGAPA-UNAM Y LA FQ-UNAM (Con la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, Responsable y la Dra. Martha Patricia García Camacho, Corresponsable) para realizar el proyecto "Desarrollo de nuevas tecnologías para la preconcentración y el análisis en línea de plaguicidas en muestras acuosas: aplicación al monitoreo ambiental". Proyecto Clave IN-101397. 1997-98. $246,136.00 (Becas: $10,848.00)
35. CONVENIO UNAM-CONACYT (Con la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, Responsable y la Dra. Martha Patricia García Camacho, Corresponsable) para co-financiar el proyecto “Determinación de trazas de plaguicidas polares por medio de la tecnología de precolumnas”. DIRECCIÓN ADJUNTA DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA. Proyecto Clave 3038P. 1997-1999. $508,235.00 (Becas: $11,520.00)
36. CONVENIO UNAM-CONACYT (Con la Dra. Ranjani Krishnan Padma, Responsable y la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, Corresponsable) para co-financiar el proyecto “Tratamiento de aguas residuales usando un sistema de raíces en humedales”. DIRECCION ADJUNTA DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA. Proyecto Clave 3302P-B. 1997-1999. $259,000.00 (Becas: $165,000.00)
37. CONVENIO DE COOPERACIÓN UNAM-PGPB (Con el Fis. Miguel Ángel Valdovinos Terán del PUMA, Coordinador Global y la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, Coordinadora Técnica) para realizar el proyecto “Estudios y anteproyecto para el sistema integral de manejo, tratamiento, usos y reciclaje de agua” de los Centros Procesadores de Gas en Tabasco. Dic. 16, 1998 a Septiembre 15, 1999. $27,000,000
38. CONVENIO DE COOPERACIÓN UNAM-Industrias Peñoles (Con el Ing. Alberto Ross de la División Químicos Industriales y los Dres. Carmen Durán Domínguez y Alfonso Durán Moreno) para realizar el proyecto “Utilización del óxido e hidróxido de magnesio en plantas de tratamiento de aguas residuales”. Octubre 2000-Junio 2001. $23,000
39. CONVENIO DE COLABORACIÓN QUE CELEBRAN LA DGAPA-UNAM Y LA FQ-UNAM (Con la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, Responsable y el Dr. Alfonso Durán Moreno, Corresponsable) para realizar el proyecto "Depuración de aguas residuales por medio de la combinación del método de Fenton y de una adsorción-degradación sobre carbón activado". Proyecto Clave IN-109100 2000-2002. $193,000 (Becas: $26,355.00)
40. CONVENIO UNAM-CONACYT (Con la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, Responsable y la Biol. Rosa Martha Padrón López, Corresponsable, de la Universidad Juárez Autónoma de Tabasco, UJAT-DACB) para co-financiar el proyecto “Depuración de aguas residuales domésticas usando humedales artificiales”. DIRECCIÓN ADJUNTA DE DESARROLLO REGIONAL, SISTEMA DE INVESTIGACIÓN GOLFO DE MÉXICO, SIGOLFO. Proyecto Clave 00-06-016-V. 2000-2002. $352,664 (Becas: $36,355.00)
41. CONVENIO DE COOPERACIÓN UNAM-Industrias Peñoles (Con el Ing. Ricardo Benavides del Centro de Investigación y la Dra. Carmen Durán Domínguez y la M. en C. Irma Delfín Alcalá(+)) para realizar el proyecto “Rehabilitación integral de sitios mineros en fase final de utilización”. Septiembre 2000-Junio 2020.
$536,000 (que incluye pagos en especie a través de la realización de estudios mineralógicos en los laboratorios de Industrias Peñoles)
42. PROYECTO DE COOPERACIÓN UNAM-Centro de Estudios Ambientales Leipzig-Halle (RFA) (Con los Dres. Roland Müller y Peter Kuschk y la Dra. Carmen Durán Domínguez) para realizar el proyecto “Eliminación de organismos patógenos en sistemas de tratamiento de aguas residuales domésticas y mixtas en humedales artificiales”. Mayo 2001-Diciembre 2003. $4,000,000 (que incluye pagos en especie a través de la realización de estudios microbiológicos en los laboratorios del Centro, de la Universidad Martín Lutero de Halle y de otras universidades cooperantes de la RFA). La Dirección Adjunta de Asuntos Internacionales del CONACYT apoyó con los pasajes aéreos de los pares mexicanos a Alemania. Las dos empresas cooperantes fueron Umweltschutz Nord enterprise e INCAM, empresa mexicana.
43. CONVENIO DE COLABORACIÓN QUE CELEBRAN LA DGAPA-UNAM Y LA FQ-UNAM (Con la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, Responsable y la M. en C. Irma Delfín Alcalá, Corresponsable) para realizar el proyecto "Utilización de consorcios microbianos adaptados como protosistemas de formación de suelos en áreas que contienen residuos mineros para su estabilización". Proyecto para coadyuvar a la resolución de la problemática de una de las minas con contenidos de pirita más altos de México. Proyecto Clave IN-103403. 2003-2005. $246,136.00 (Becas: $43,578.00)
44. PROGRAMA PAPIME (Convocatoria 2004) (Con la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, como Responsable) para realizar tareas académicas de apoyo a la enseñanza experimental mediante el uso de un laboratorio interdisciplinario para las asignaturas integradoras de las cinco carreras que se imparten en la FQ-UNAM. UNAM, DGAPA, Coordinación de Programas Académicos, Dirección de Programas de Apoyo a la Docencia. 2004-2005 (Apoyo anual de $90,000.00)
45. PROGRAMA PAPIME (Convocatoria 2006) (Con la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, como Responsable) para realizar tareas académicas de apoyo a la enseñanza experimental mediante el uso de un laboratorio interdisciplinario para las asignaturas integradoras de las cinco carreras que se imparten en la FQ-UNAM. UNAM, DGAPA, Coordinación de Programas Académicos, Dirección de Programas de Apoyo a la Docencia. Se incorporaron en uno de los proyectos a investigadores del Instituto Nacional de la Nutrición y Ciencias Médicas “Salvador Zubirán”, de la FMVyZ y del Bioterio del Conjunto “E” de la FQ de la UNAM para corroborar el efecto del azúcar y algunos edulcorantes sintéticos (fructosa, aspartame y sucralosa). 2006-2007 (Apoyo anual de $115,000.00)
46. CONVENIO DE COLABORACIÓN QUE CELEBRAN LA DGAPA-UNAM Y LA FQ-UNAM (Con la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, Responsable y la M. en C. Irma Delfín Alcalá, Corresponsable) para realizar el proyecto "ESTUDIO DE LOS PROCESOS DE OXIDACIÓN DE SULFUROS EN RESIDUOS MINEROS RICOS EN PIRITA". Proyecto para coadyuvar a la resolución de la problemática de una de las minas con contenidos de pirita más altos de México. PAPIIT Proyecto Clave IN-105407-1. 2006-2007. $200,000.00 (Becas: $35,000.00)
47. CONVENIO DE COLABORACIÓN QUE CELEBRAN LA DGAPA-UNAM Y LA FQ-UNAM (Con la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, Responsable y la M. en C. Irma Delfín Alcalá, Corresponsable) para realizar el proyecto "ESTUDIO DE LOS PROCESOS DE OXIDACIÓN DE SULFUROS EN RESIDUOS MINEROS RICOS EN PIRITA". Proyecto para coadyuvar a la resolución de la problemática de una de las minas con contenidos de pirita más altos de México. PAPIIT Proyecto Clave IN-105407-2. 2008-2009. $125,000.00 (Aprobado en febrero de 2008)
48. CONVENIO UNAM-CONACYT (Con la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, Responsable y la Dra. Claudia Teresa Tovar Palacio, Corresponsable) para co-financiar el proyecto “IMPACTO DE LOS EDULCORANTES NATURALES Y ARTIFICIALES EN UN MODELO ANIMAL EN EL DESARROLLO DE LA OBESIDAD Y SUS IMPLICACIONES METABÓLICAS”. Proyecto para coadyuvar a la comprensión del problema de la obesidad que actualmente enfrenta la sociedad mexicana. DIRECCION ADJUNTA DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA. Proyecto Clave 082788. 2008-2012. $778,000.00 (Becas: $100,000.00)
49. CONVENIO UNAM-CONACYT Redes Temáticas (Con la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, Responsable y la M. en C. Beatriz Espinosa Aquino, Corresponsable) para realizar intercambio académico para la formación de redes que enriquezcan la cooperación en investigación básica y aplicada a través de proyectos interinstitucionales y posgrados interinstitucionales en el marco de la Red de Medio Ambiente y Sustentabilidad, ReMAS. 2010-2011. $100,000.00
50. CONVENIO DE COLABORACIÓN QUE CELEBRAN LA DGAPA-UNAM Y LA FQ-UNAM (Con la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, Responsable y la M. en C. Irma Delfín Alcalá, Corresponsable) para realizar el proyecto "IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS METANOGÉNICAS Y SULFATO-REDUCTORAS EN TRES REACTORES DE LECHO DE LODOS DE FLUJO ASCENDENTE (RALLFA) OPERANDO A 45, 55
Y 65°C". Proyecto para coadyuvar a la resolución de la problemática de las plantas destiladoras de alcohol etílico de México. PAPIIT Proyecto Clave IN-118111-2. 2011-2013. $155,000.00 (Aprobado en febrero de 2011)
51. CONVENIO UNAM-CONACYT (Con la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, Responsable y los Dres. Nimbe Torres-y-Torres y Armando Tovar-Palacio, Co-Responsables) para co-financiar el proyecto “EFECTO DE DIFERENTES EDULCORANTES SOBRE LA LIBERACIÓN DE LAS INCRETINAS GLP-1 Y GIP Y SU EFECTO SOBRE LA LIPOGÉNESIS A CORTO Y LARGO PLAZOS”. Proyecto para coadyuvar a la comprensión del problema de la obesidad que actualmente enfrenta la sociedad mexicana. DIRECCION ADJUNTA DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA. Proyecto Clave 178656. 2012-2015. $1,025,050.00 (Aprobado en junio de 2012 y fondos liberados en 2013 entregando informe final en diciembre de 2016)
52. PROGRAMA PAPIME (Convocatoria 2013) (Con la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, como Responsable) para realizar tareas académicas de apoyo a la enseñanza teórico-experimental mediante el uso de un laboratorio interdisciplinario para las asignaturas Ingeniería Ambiental y Estancia Académica que se imparten en la carrera de Ingeniería Química de la FQ-UNAM con el proyecto “DESARROLLO DE MATERIAL DIDÁCTICO PARA LAS ASIGNATURAS INGENIERÍA AMBIENTAL Y ESTANCIA ACADÉMICA DE LA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA CON BASE EN ESTUDIOS DE CASO”. UNAM, DGAPA, Coordinación de Programas Académicos, Dirección de Programas de Apoyo a la Docencia. Proyecto Clave PE100514. 2014-2016 (Apoyo anual de $165,000.00)
53. CONVENIO DE COLABORACIÓN QUE CELEBRAN LA DGAPA-UNAM Y LA FQ-UNAM (Con la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, Responsable y la Dra. Marisela Bernal González, Corresponsable) para realizar el proyecto "DEGRADACIÓN DEL DITIOCARBAMATO DE SODIO UTILIZADO COMO AGENTE BIOCIDA CONTRA Leuconostoc mesenteroides EN LOS INGENIOS AZUCAREROS". Proyecto para coadyuvar a la resolución de la problemática de las plantas productoras de azúcar y alcohol etílico de México a partir de la caña de azúcar (Saccharum officinarum). PAPIIT Proyecto Clave IN-102214. 2013-2016 (Aprobado en diciembre de 2013)
54. CONVENIO DE COLABORACIÓN QUE CELEBRAN LA DGAPA-UNAM Y LA FQ-UNAM (Con la Dra. Carmen Durán-de-Bazúa, Responsable y el M. en C. Rolando Salvador García Gómez, Corresponsable) para realizar el proyecto "EFECTO DEL CONSUMO DE EDULCORANTES SOBRE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS REGULADORAS DE LA GLUCÓLISIS Y LIPOGÉNESIS EN EXTRACTOS DE HEPATOCITOS Y SUS IMPLICACIONES METABÓLICAS SOBRE EL EXCESO DE MASA CORPORAL Y LA OBESIDAD". Proyecto para coadyuvar a la resolución de la problemática de la obesidad y el exceso de masa corporal mediante el empleo de modelos animales (ratas Wistar). PAPIIT Proyecto Clave IN-217619. 2019-2021 (Aprobado en diciembre de 2018)
2. PROYECTOS COMO PARTICIPANTE / COORDINADOS POR PARES Con SP, Sector productivo; SG/I, Sector gubernamental y/o institucional; SS, Sector de servicios; SE, Sector educativo) Clave Institución/Clave Responsable Vigencia Título/Productos
(1) SG/I Nal.
CONACYT Proyecto 214352 DADC Problemas Nacionales
Dr. Antonio Esteban Jiménez
González, IER-UNAM
2013-2016 Estudio de procesos de remediación de efluentes industriales / Formación de
recursos humanos y difusión del conocimiento generado en foros nacionales
e internacionales (2)
SG/I Nal.
UNAM / PAPIIT Clave IT100615
Dr. Antonio Esteban Jiménez
González, IER-UNAM
2014-2017 Estudio de procesos de remediación a nivel prototipo de efluentes industriales /
Formación de recursos humanos y difusión del conocimiento generado en foros
nacionales e internacionales (3)
SG/I Nal.
UNAM / PAPIIT Clave IT101118
Dr. Antonio Esteban Jiménez
González, IER-
2017-2020 Tecnología solar para el tratamiento de aguas residuales procedentes de la
industria / Formación de recursos humanos y difusión del conocimiento generado en
Clave Institución/Clave Responsable Vigencia Título/Productos UNAM foros nacionales e internacionales
(4) SE
Nal.
DGAPA-UNAM PAPIIT Clave IN-115118
Dr. Enrique Rodolfo Bazúa
Rueda / Dr. Ángel Enrique
Chávez Castellanos, FQ-UNAM
2018-2020 Formación de estudiantes e investigación básica y aplicada a través del proyecto
sobre la reutilización de agua del proceso de flotación de una empresa minera
cooperante
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE QUÍMICA
METODOLOGÍAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS MESÓFILAS AEROBIAS, DE METAM SODIO (C2H4NS2-Na), METILAMINA
(CH3NH2) E ISOTIOCIANATO DE METILO (C2H3NS, MITC en inglés) EN INGENIOS
AZUCAREROS
Héctor Eduardo Zarco-Mercado
Norma Angélica Sampedro-Márquez
Silvia Alejo-Munguía
Tania Sofía del-Río-Nava
Marisela Bernal-González
María del Carmen Durán-Domínguez-de-Bazúa
MÉXICO, D.F. 2019
I
METODOLOGÍAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS MESÓFILAS AEROBIAS, DE METAM SODIO (C2H4NS2-Na), METILAMINA (CH3NH2) E ISOTIOCIANATO DE METILO (C2H3NS, MITC en inglés) EN INGENIOS AZUCAREROS © 2019 Universidad Nacional Autónoma de México
Red para Análisis de la Calidad Ambiental en México
ISBN Obra Independiente: 978-607-96506-1-2
Autores:
Héctor Eduardo Zarco-Mercado Norma Angélica Sampedro-Márquez Silvia Alejo-Munguía Tania Sofía del-Río-Nava Marisela Bernal-González María del Carmen Durán-Domínguez-de-Bazúa (autora responsable de la coordinación de la publicación)
Este libro electrónico es una publicación editada por la Red para Análisis de la Calidad Ambiental en México Asociación Civil,
RACAM, calle Río Churubusco 480, Col. El Retoño, Delegación Iztapalapa. 09400 México D.F., Tel. (55)27087074,
http://www.ambiental.unam.mx. Autor responsable: María del Carmen Durán Domínguez. ISBN Obra Independiente: 978‐607‐
96506‐1‐2, otorgado por el Instituto Nacional del Derecho de Autor. México D.F., fecha de última modificación, 30 de abril de
2019.
II
"Nuestra recompensa se encuentra en el
esfuerzo y no en el resultado
Un esfuerzo total es una victoria completa”
Mahatma Gandhi
Reconocimientos
III
A la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA) de la UNAM por
el decidido apoyo para que los académicos podamos realizar nuestras funciones
sustantivas: docencia, investigación y difusión del conocimiento y la cultura
Los reactivos, consumibles y materiales empleados en esta investigación fueron
adquiridos con el apoyo financiero parcial del Programa de Apoyo a Proyectos de
Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) dentro del proyecto con clave
IN102214 con título “Degradación del ditiocarbamato de sodio utilizado como agente
biocida contra Leuconostoc mesenteroides en los ingenios azucareros” y de los
proyectos del Programa de Apoyo a Proyectos para la Innovación y Mejoramiento de la
Enseñanza (PAPIME), “Apoyo a la enseñanza experimental de los laboratorios
terminales de las carreras que se imparten en la Facultad de Química de la UNAM”,
“Apoyo a la enseñanza experimental de las asignaturas terminales de las carreras que
se imparten en la Facultad de Química de la UNAM” y “Desarrollo de material didáctico
para las asignaturas ingeniería ambiental y estancia académica de la carrera de
ingeniería química con base en estudios de caso” Claves EN103704, PE101709 y PE-
100514, respectivamente, de la Dirección General de Asuntos del Personal Académico
de la UNAM, DGAPA, y del Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado de la
Facultad de Química de la UNAM, PAIP, Clave 50009067.
A los LIQAyQA ya que este trabajo no se hubiera podido realizar sin la ayuda del
personal académico y administrativo y de los estudiantes de todos los niveles.
Al Departamento de Biología de la Facultad de Química por su apoyo para la
caracterización de las bacterias de estudio, mediante el sistema automatizado con el
que se cuenta VITEK.
Reconocimientos
IV
A los y las colegas de la Cámara Nacional de las Industrias Azucarera y Alcoholera de
México, CNIIAA, así como a los y las colegas de la Comité Técnico de Normalización
Nacional de las Industrias Azucarera y Alcoholera, COTENNIAA, ya que su apoyo ha
sido fundamental para entender la problemática de esta noble agroindustria que
aprovecha un recurso natural tan valioso y tan incomprendido en los últimos años
debido a los intereses creados de las industrias transnacionales de las sustancias
químicas sintéticas usadas como aditivos para conservar, dar sabor, colorear o espesar
los alimentos y las bebidas no alcohólicas
En especial, los autores quieren reconocer la altruista y valiosa labor del Ing. Manuel
Enríquez Poy, Director General de los ingenios del Grupo Machado: Ingenio Central
Motzorongo, S.A. de C.V. e Ingenio El Refugio, S.A. de C.V., quien nos relacionó con
esta agroindustria a través del Ing. Luis Eduardo Zedillo Ponce de León (qepd) desde
1983 en la entonces industria paraestatal Azúcar, S.A. y el Comité Técnico de
Agroindustrias, Agroquímicos y Alimentos del Instituto Mexicano de Ingenieros
Químicos, A.C.
Presentación
V
Este libro electrónico es el resultado de un fructífero esfuerzo que la UNAM ha
emprendido para apoyar a uno de los sectores fundamentales de la economía pero,
sobre todo, del desarrollo armónico de la sociedad en su conjunto para proveer a los
sectores más desprotegidos y que puedan tener una fuente de energía de bajo costo
que es extraordinariamente eficiente desde el punto de vista bioquímico, ya que por
cada molécula de azúcar el organismo recibe una molécula de glucosa, elemento vital
para que el organismo humano realice todas sus funciones.
Por ello, en el marco del compromiso de la Universidad Nacional Autónoma de México, de brindar a la sociedad mexicana y del mundo entero su apoyo incondicional, a continuación me permito tomar un extracto que escribí como Resumen Ejecutivo del
libro INSTALACIÓN DE UN LABORATORIO PARA RESIDUOS PELIGROSOS
(Identificación de Residuos Industriales Peligrosos), PROYECTO BILATERAL DE
COOPERACIÓN GOBIERNOS DE LA REPÚBLICA FEDERAL DE ALEMANIA Y DE LOS
ESTADOS UNIDOS MEXICANOS (ISBN 968‐36‐9000‐9) editado por el Programa de
Ingeniería Química Ambiental y de Química Ambiental de la Facultad de Química
de la Universidad Nacional Autónoma de México en julio de 2002 (a los 13 años de
haber sido fundado por el Dr. José Sarukhán Kermez, rector de la UNAM y entregado al Dr. Juan Ramón de la Fuente Ramírez, rector de la UNAM):
“La Universidad Nacional Autónoma de México es una de las más grandes
de Latinoamérica. Cuenta con numerosos programas académicos y entre
ellos se encuentra el Programa de Ingeniería Química Ambiental y de
Química Ambiental, cuyas siglas son PIQAyQA, de la Facultad de Química,
que conjunta el quehacer eminentemente aplicado de la ingeniería y el
científico de la química en la búsqueda de soluciones a la problemática
ambiental planteada por el crecimiento de las zonas urbanas y la
industrialización de las zonas rurales y especialmente entre otras áreas, en
la de la minimización, tratamiento y disposición controlada de residuos de
origen industrial, con énfasis en aquéllos que presentan características de
peligrosidad. Este Programa fue creado con el objetivo de promover en la
Presentación
VI
UNAM la formación de personal altamente calificado en todos los niveles de
la educación superior (licenciatura, diplomado, especialización, maestría y
doctorado) que pudieran incidir en los sectores social, de servicios y
productivo, además de retroalimentar a las instituciones de educación
superior e investigación. Los promotores de la creación de este Programa
fueron, por un lado, las autoridades de la UNAM, encabezadas por su
Rector, el Dr. José Sarukhán Kermez y el Director de la Facultad de
Química, el Dr. Francisco Barnés de Castro y, por el otro, el entonces
Secretario de Desarrollo Urbano y Ecología, el Arq. Patricio Chirinos y el
Subsecretario de Ecología, el Fis. Sergio Reyes Luján, quienes contemplaron
con gran visión, la necesidad de contar con una entidad que pudiera apoyar
a la Secretaría en sus tareas sustantivas de protección del ambiente,
especialmente en el rubro de la problemática planteada por la generación
de residuos industriales peligrosos. Para ello, era necesario contar con
instalaciones que pudieran apoyar a la Secretaría a dirimir conflictos, a
estudiar problemas específicos relacionados con los residuos peligrosos, a
coadyuvar en la formación de personal altamente calificado en esta área, no
solamente para la propia Secretaría sino para todos los sectores del país,
con énfasis en el sector productivo, en el sector social y de servicios y en el
sector gubernamental. La ceremonia oficial de creación del Programa se dio
el 18 de julio de 1989 (hace 13 años) y contó con la presencia del Secretario
Chirinos, del Rector Sarukhán, del Subsecretario Reyes Luján y del Director
Barnés, además de numerosos invitados de los tres sectores. Para promover
la creación y expansión de los laboratorios que apoyaran logísticamente al
Programa, la Facultad de Química dio las instalaciones del Laboratorio 108
del Edificio D de la Facultad de Química, la Secretaría instituyó un fondo
mensual para los gastos rutinarios, ofreciendo su apoyo para lograr un apoyo
sustantivo de alguna fundación internacional para equipar este laboratorio y
la UNAM, en su conjunto, se comprometió a promover la formación de
programas de posgrado que soportaran la formación de personal altamente
calificado.
Presentación
VII
Es, en esta tesitura, que la entonces Sedue y la Dirección de la Facultad
promovieron en el marco de las reuniones anuales del Gobierno de México y
el Gobierno de la República Federal de Alemania un posible apoyo para este
Programa, el cual cristalizó en una “Carta de Intención”, firmada el 31 de
octubre de 1991, entre la Sociedad Alemana para la Cooperación Técnica
(Deutsche Gesellschaft für Technische Zusammenarbeit GmbH, GTZ) y la
Facultad de Química de la UNAM, para mejorar las condiciones tecnológicas
en la minimización, tratamiento y disposición de los residuos peligrosos de
origen industrial. Las personas que la suscribieron fueron el Dr. Jürgen
Bischoff quien era el Jefe del Grupo de la GTZ, con el apoyo de los Dres.
Peter Henschel y Hilmar Zeissig y la Lic. Ruth Erlbeck, Jefa de la Sección
División para America Latina del Norte y el Caribe y el Dr. Francisco Barnés
como Director de la Facultad de Química de la UNAM. Los objetivos
plasmados en esta Carta de Intención fueron:
El mejoramiento de la formación y entrenamiento del personal del
Programa de Ingeniería Química Ambiental y de Química Ambiental,
El mejoramiento de la formación y entrenamiento continuo de expertos
para el gobierno e instituciones privadas y compañías,
El apoyo a proyectos de investigación existentes y nuevos dentro del
contexto de los dos puntos anteriores,
El fortalecimiento de la cooperación con las entidades gubernamentales
mexicanas, especialmente la Sedue y el DDF,
El fortalecimiento de la cooperación con la industria,
El establecimiento y expansión de la cooperación formal con otras
universidades y centros de investigación para la formación de recursos
humanos para la investigación, consultoría y otros servicios,
La obtención de espacios físicos, laboratorios y equipamiento,
materiales y el apoyo logístico necesario para desarrollar el proyecto y
Presentación
VIII
La concientización y promoción de la información concerniente a la
protección ambiental y a los objetivos del proyecto plasmados en los
puntos anteriores
marcando como punto final que se trabajaría en estas intenciones y se
tendría un proyecto avalado por los gobiernos alemán y mexicano y la
UNAM. En ese contexto, la Facultad de Química construyó un piso especial
en el conjunto de edificios conocido como “E” para este Programa para, con
ese espacio, brindar el apoyo requerido a la parte mexicana para el proyecto
planteado en la Carta de Intención firmada. Este piso tiene 500 metros
cuadrados de laboratorios, cubículos para técnicos académicos y profesores
visitantes, minibiblioteca y otras facilidades. También acondicionó un antiguo
laboratorio de docencia en el ahora Edificio B de la Facultad (anteriormente
de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia) para el desarrollo de
Tecnologías más Limpias para las industrias de alimentos y biotecnológicas
(160 metros cuadrados). En diciembre de 1994, finalmente se formalizaron
las conversaciones entre funcionarios de la Cancillería de México, de la
Embajada de la RFA, del Ministerio Federal de Cooperación Económica y
Desarrollo de Alemania y de la Agencia Alemana de Cooperación Técnica y
de la UNAM para acordar sobre el proyecto originalmente denominado
“Identificación de Residuos Industriales Peligrosos”. El Acuerdo
destacaba lo siguiente:
1. El Gobierno de los Estados Unidos Mexicanos y el Gobierno de la
República Federal de Alemania fomentarán conjuntamente el Proyecto
“Identificación de Residuos Industriales Peligrosos”, con objeto de
mejorar las condiciones para la eliminación y evitación (prevención de
generación) de residuos industriales especiales.
. . . ”
Presentación
IX
“Con base en este acuerdo, cada parte se dio a la tarea de cumplir con sus
obligaciones para que el proyecto tuviera éxito. Se planteó la contratación de
un experto por parte de la GTZ para que se hiciera cargo en México del
Proyecto. El Dr. Bertram Nagel, de Leipzig, fue este experto y llegó a México
en mayo de 1995. La Facultad de Química, a nombre de la UNAM, le brindó
desde entonces para realizar sus labores un espacio académico con todas
las facilidades y nombró a su contraparte académica, la Coordinadora Global
del PIQAyQA.”
“Asimismo, la UNAM, a través de su Facultad de Química, puso a disposición
del Proyecto los laboratorios ya mencionados con toda su infraestructura. En
octubre de ese mismo año de 1995 se hizo oficial el Acuerdo sobre este
Proyecto “Identificación de Residuos Industriales Peligrosos” y se fijó
conjuntamente un plan operativo, de julio de 1995 a julio de 1998. Este
proyecto que, por su éxito, se extendió por otros tres años, de julio de 1998 a
julio de 2001, tuvo un año adicional (de julio de 2001 a julio de 2002), para
hacer entrega formal del proyecto a la contraparte mexicana (UNAM) y, en
particular, al PIQAyQA de la Facultad de Química, coordinado por la Doctora
en Ingeniería María del Carmen Durán Domínguez de Bazúa, profesora
titular de esta dependencia y Catedrática de la UNAM.”
“Como se esperaba, el PIQAyQA de la UNAM es un firme apoyo para los
sectores productivo, social, de servicios y gubernamental, además del
educativo y de investigación, que coadyuva en la resolución de problemas
ambientales que enfrentan la industria química y de proceso, tanto de México
como de otros países del mundo, a través de la formación de profesionales
comprometidos con el desarrollo sustentable. Se ha dado a la tarea de
participar en programas de licenciatura y de posgrado que permiten enlazar
proyectos de investigación básica, de desarrollo tecnológico y de asesorías
puntuales a los sectores productivo, social y de servicios, con estudiantes de
estos niveles que, al colaborar en ellos, se forman en las áreas de interés
Presentación
X
personales, coadyuvan en su formación académica y profesional y permiten
alcanzar los fines buscados.”
Es en este marco que ahora, nuevamente con el soporte de la UNAM, a través de su
Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA) con el Programa de
Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) dentro del
proyecto con clave IN102214 con título “Degradación del ditiocarbamato de sodio
utilizado como agente biocida contra Leuconostoc mesenteroides en los ingenios
azucareros” y de los proyectos del Programa de Apoyo a Proyectos para la Innovación
y Mejoramiento de la Enseñanza (PAPIME), “Apoyo a la enseñanza experimental de los
laboratorios terminales de las carreras que se imparten en la Facultad de Química de la
UNAM”, “Apoyo a la enseñanza experimental de las asignaturas terminales de las
carreras que se imparten en la Facultad de Química de la UNAM” y “Desarrollo de
material didáctico para las asignaturas ingeniería ambiental y estancia académica de la
carrera de ingeniería química con base en estudios de caso” Claves EN103704,
PE101709 y PE-100514, respectivamente, decidimos abocarnos a estudiar las
sustancias químicas que son estrictamente necesarias para mantener la eficiencia del
proceso de producción del azúcar de la caña Saccharum officinarum corroborando si su
empleo es seguro para los consumidores de este alimento tan importante,
especialmente para los sectores de menores recursos como mencioné al inicio.
Los resultados alcanzados son importantes ya que hasta lo que hemos avanzado con
este proyecto, los compuestos químicos especialmente el conocido como metam de
sodio o metam sodio (MS) adicionado en las primeras etapas de la producción del
azúcar logra descomponerse y los subproductos formados que se lograron estudiar en
esta etapa de 2014 a 2016 también se descomponen en el lapso de proceso, lo que
permite confirmar que, al menos los compuestos químicos estudiados en este proyecto,
se descomponen antes de llegar a la miel final y a los cristales de azúcar.
Faltaría hacer el seguimiento completo de los subproductos metilamina y sulfuro de
carbono para completar lo realizado y llevar a cabo un seguimiento puntual en un
Presentación
XI
ingenio cooperante a lo largo de una zafra para corroborar el destino del biocida
adicionado al inicio del tren de procesamiento de la caña hasta sus productos finales:
Miel y cristales de azúcar.
Esperamos seguir continuando con el decidido apoyo de todos los participantes de los
Laboratorios 301, 302 y 303 de Ingeniería Química Ambiental y de Química Ambiental,
quienes formábamos parte del Programa de Ingeniería Química Ambiental y de
Química Ambiental, ahora a cargo del Departamento de Ingeniería Química de la
Facultad de Química de la UNAM, para realizar este tipo de proyectos en beneficio de
la sociedad.
Deseamos que la lectura de este libro electrónico les brinde apoyo a los sectores de la
industria azucarera para la que fue originalmente realizado el proyecto aunque como
estos biocidas se emplean en otros sectores productivos podrá ser útil también para
ellos.
María del Carmen Durán Domínguez de Bazúa
Responsable del Proyecto IN102214
Profesora Titular “C” de la Facultad de Química de la UNAM
Coordinadora Global del PIQAyQA (programa vigente de 1989 a 2007)
Presidenta de la RACAM
Glosario
XII
A Absorbancia
Abs Absorbancia
ADN Ácido desoxirribonucleico
Adrenal Del latín ad- 'junto a' y el latín tardío renālis 'renal'. Adj. Biol. Situado
cerca del riñón. También glándula suprarrenal, glándula adrenal:
Anat. Cada uno de los dos órganos situados en contacto con el
riñón, compuesto de dos partes diferenciadas, la corteza, que
segrega corticoides, y la médula, que produce adrenalina
(http://dle.rae.es/?id=0pxhl6s) (http://dle.rae.es/?id=JEWdmLw)
Agua de
imbibición
Definición del diccionario de la lengua española de la Real Academia
Española: Sustantivo proveniente de Cuba. En la fabricación de
azúcar, agua que se utiliza en el último molino para extraerle más
cantidad de jugo al bagazo (http://dle.rae.es/?id=1BKpQj3)
ANOVA Análisis de varianza en inglés (analysis of variance)
APT Agar All Purpose Tween
b Ordenada al origen
B1 Tiamina
B2 Rivoflavina
B3 Niacina
B5 Ácido pantoténico
B ALO Alosa (glúcido): monosacárido de seis carbonos con un grupo
aldehído por lo que pertenece al grupo de las aldosas y dentro de
este al de las aldohexosas
BCF Factor de bioconcentración en inglés (bioconcentration factor)
B GAL Galactosa (glúcido): monosacárido formado por seis átomos de
carbono o hexosa, que se convierte en glucosa en el hígado como
aporte energético
C Concentración
Co Concentración inicial
Ca Calcio
Glosario
XIII
CB Cloruro de benzalconio
CDS Calibration dichotomous susceptibility
CG Cromatografía de gases
CG / EM Cromatografía de gases / espectrometría de masas
CENICAÑA Centro de Investigación de la Caña de Azúcar de Colombia
CFR Code of Federal Regulations (EE.UU.)
C9H13ClNR Cloruro de benzalconio
CH3NH2 Metilamina (MA)
C2H6N2S Metiltiourea (MTU)
C3H8N2S Dimetiltiourea (DMTU)
C4H8N2S4Na2 Etilen bis-ditiocarbamato de sodio
C2H3NS Metilisotiocianato (MITC)
C2H4NS2Na N-metil ditiocarbamato de sodio, metam de sodio o metam sodio
(MS)
CH2O Formaldehído
CICOPLAFEST Comisión Intersecretarial para el Control del Proceso y Uso de
Plaguicidas Fertilizantes y Sustancias Tóxicas
CL50 Concentración letal media en pruebas de toxicidad aguda
CLAR Cromatografía de líquidos de alta resolución
ClO2 Dióxido de cloro
cm Centímetros
cm3 Centímetros cúbicos
CNIAA Cámara Nacional de la Industria Azucarera y Alcoholera
(anteriormente Cámara Nacional de las Industrias Azucarera y
Alcoholera, CNIIAA)
CO2 Dióxido de carbono
CONABIO Comisión Nacional para el Conocimiento y uso de la Biodiversidad
CONADESUCA Comité Nacional para el Desarrollo Sustentable de la Caña de
Azúcar
COOH Grupo carboxilo
CS2 Disulfuro de carbono
Glosario
XIV
D MAL Maltosa (glúcido): disacárido compuesto por dos moléculas de
glucosa, que se encuentra en el almidón y el glucógeno
Dextrana Goma cuyo monómero es la glucosa o dextrosa. La regla química
para nombrar las gomas es adicionando el sufijo -ana al monómero
que la origina (igual que el sufijo -osa para los glúcidos)
Difusión Término usado en la industria azucarera para definir la extracción
por solubilización del azúcar remanente en el bagazo mediante el
uso de agua caliente proveniente de los evaporadores (conocida
como “agua verde” por ser el agua evaporada del jugo de la caña y
que se conoce también como agua de imbibición)
DL50 Dosis letal media en pruebas de toxicidad aguda
DOF Diario Oficial de la Federación
EC Comisión Europea (siglas en inglés)
EDTA Ácido etilen-diamin-tetra-acético (siglas en inglés)
EM Espectrometría de masas
Estructura
anfipática
Se trata de una molécula que posee dos propiedades una hidrofílica
y otra hidrofóbica
ETU Etilen-tiourea (subproducto de los ditiocarbamatos)
FAO Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentación por sus siglas en inglés
Fe Hierro
Ferbam Dimetil ditiocarbamato de hierro
Fermentación Según Louis Pasteur, quien creó este término, la fermentación es un
fenómeno que ocurre cuando se ponen en contacto la levadura
Saccharomyces cerevisiae y la glucosa en condiciones anaerobias y
se produce alcohol etílico y dióxido de carbono. Por ello, cualquier
otra reacción bioquímica NO es una fermentación es una
BIORREACCIÓN. En esta investigación se usará fermentación
justamente para esta reacción bioquímica y a las demás se les
denominará biorreacciones
g Gramos
Glosario
XV
GL Grados de libertad
H, h Hora(s)
ha Hectárea
HCl Ácido clorhídrico
H2O Agua
H2O2 Peróxido de hidrógeno
hPa Hectopascales
H3PO4 Ácido fosfórico
Hz Hertzios
HPLC Cromatografía liquida de alta presión (siglas en inglés)
I.A. Ingrediente activo
IARC Siglas en inglés de la International Agency of Research on Cancer
INAZUCAR Instituto Azucarero Dominicano
Inversión Término dado para definir el fenómeno de ruptura de la molécula de
sacarosa o azúcar en sus dos componentes: glucosa o dextrosa y
fructosa o levulosa. Es el cambio del poder rotatorio que se observa
durante esta hidrólisis, la sacarosa (+66°), al dividirse en glucosa
(+52°) y fructosa (-92°), desarrolla dicho poder rotatorio sobre la luz
polarizada por la fuerte influencia de la fructosa, lo que conlleva a
dificultades para la cristalización del azúcar, característica
indeseable en los ingenios azucareros ya que reduce el rendimiento
de cristales de azúcar (Baduí-Dergal,1999)
K Potasio
K Kelvin
k Constante de degradación
kcal Kilocaloría
kg Kilogramos
Koc Coeficiente de adsorción
ko Rapidez de degradación de orden cero
Ko/w Coeficiente de partición octanol-agua
kPa Kilopascales
Glosario
XVI
L Litros
lb Libras
LD50 Dosis letal media por sus siglas en inglés
LLE-LC-MS-MS Extracción líquido-líquido-cromatografía líquida-espectrometría de
masas/tandem espectrometría de masas
LMPE-PPT Límite máximo permisible de exposición promedio ponderado en el
tiempo. Es la concentración promedio ponderada en tiempo de un
contaminante en el ambiente laboral para una jornada de ocho horas
diarias y una semana laboral de cuarenta horas a la cual se pueden
exponer la mayoría de los trabajadores sin sufrir daños a la salud
LMR Límite máximo residual
LOEL Nivel mínimo de efecto observable (siglas en inglés)
M Molar
M Pendiente de una recta
M17 Agar según Terzaghi
m3 Metro cúbico
MAK Sensibilización cutánea por sus siglas en inglés
Maneb Etilen bis-ditiocarbamato de manganeso
Metam N-metil ditiocarbamato de sodio
MetOH Metanol
mg Miligramos
min Minutos
MITC Isotiocianato de metilo (siglas en inglés)
mL Mililitro
MM Masa molecular
mm Milímetros
mmHg Milímetros de mercurio
MRS Agar De Man, Rogosa y Sharpe, siglas para este medio de cultivo
MS Metam sodio o metam-sodio, siglas para este biocida
MS Espectrometría de masas (siglas en inglés)
n.d. No determinado
Glosario
XVII
NH3 Amoniaco
NH4+ Ion amonio
NH4OH Hidróxido de amonio
nm Nanómetros
NTP National Toxicology Program
O2 Oxígeno molecular
OMS Organización Mundial de la Salud
PIB Producto interno bruto (México)
ppm Partes por millón, mg/kg
pka Constante de disociación ácida
Precipitación Meteor. Agua procedente de la atmósfera, y que en forma sólida o
líquida se deposita sobre la superficie de la tierra
psi Unidad inglesa de presión: Pounds-force per square inch, (libra-
fuerza por pulgada cuadrada)
QACs Sales cuaternarias de amonio
QZ Nombre comercial de la mezcla de etilen-bis-ditiocarbamato de sodio
con N-metil ditiocarbamato de potasio
R2 Coeficiente de correlación
RP-LC Cromatografía líquida en fase reversa
rpm Revoluciones por minuto
s Segundos
SAGARPA Secretaria de Agricultura Ganadería Desarrollo Rural Pesca y
Alimentación de los Estados Unidos Mexicanos
SIAP Servicio de Información Agroalimentaria y Pesca de los Estados
Unidos Mexicanos
SiO2 Sílice
SSI Solución salina isotónica
T Transmitancia
T, t Tiempo
t1/2 Tiempo de vida media
tr, R Tiempo de retención (cromatografía)
Glosario
XVIII
Thiram Etilen-bis-ditiocarbamato disulfuro de tetrametil tiuran
TLCAN Tratado de Libre Comercio de América del Norte
TLV Concentración máxima permisible (valor techo) con respecto al aire,
siglas en inglés para este término
Ton, ton Toneladas
Turbidez
McFarland
Se trata de una escala de turbidez que indica el número de bacterias
(UFC) por mililitro, la escala va de 0.5 (106UFC/mL) a 10
(30x108UFC/mL)
UFC Unidades formadoras de colonias
US-FDA Siglas en inglés para United States Food and Drug Administration
UV Luz ultravioleta
v/v Volumen a volumen
VITEK 2 Nombre comercial del sistema de identificación microbiana
Biomerieux
W Watts
WHO Siglas en inglés para World Health Organization
Zineb Etilen-bis-ditiocarbamato de zinc
Ziram Dimetil-ditiocarbamato de zinc
Letras griegas, fórmulas y otros símbolos
є Absortividad molar
λ Longitud de onda
Frecuencia ע
µg Microgramos
µL Microlitros
$ Pesos mexicanos
% Porcentajes
°Brix Grados Brix
°F Grados Fahrenheit
ºC Grados Celsius
Glosario
XIX
% m/m Porcentaje masa/masa
% m/v Porcentaje masa/volumen
% v/m Porcentaje volumen/masa
% v/v Porcentaje volumen/ volumen
Nota: Este libro usa el punto decimal (DOF, 2009)
En este libro se usa la palabra masa y no peso:
La masa y el peso son diferentes propiedades que se definen en el ámbito de la física.
La masa es una medida de la cantidad de materia que posee un cuerpo (kg) mientras
que el peso es una medida de la fuerza que es causada sobre el cuerpo por el campo
gravitatorio (N)
Diferencias entre masa y peso (http://cienciasprimeroeso.blogspot.mx/2015/04/masa‐versus‐peso.html):
Características de masa Características de peso
1. Es la cantidad de materia que tiene un cuerpo. 2. Es una magnitud escalar. 3. Se mide con la balanza. 4. Su valor es constante, es decir, independiente
de la altitud y latitud. 5. Sus unidades de medida son el gramo (g) y el
kilogramo (kg). 6. Sufre aceleraciones
1. Es la fuerza que ocasiona la caída de los cuerpos. 2. Es una magnitud vectorial. 3. Se mide con el dinamómetro. 4. Varía según su posición, es decir, depende de la
altitud y latitud. 5. Sus unidades de medida en el Sistema Internacional
son la dina y el Newton. 6. Produce aceleraciones.
Índice general
XX
Pág. Reconocimientos III Presentación V Glosario XII
PRIMERA PARTE 1 I-1
METODOLOGÍAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS MESÓFILAS AEROBIAS PREDOMINANTES EN EL JUGO DE CAÑA DE UN INGENIO Y SU
SUSCEPTIBILIDAD A TRES BIOCIDAS
Índices 2 Resumen 8 1. Problemática 9 1.1. Planteamiento 9 1.2. Objetivos 9 1.3. Hipótesis 10 1.4. Justificación 10
2. Fundamento teórico y antecedentes 11 2.1. La caña azucarera 11 2.1.1. Características de la caña de azucarera 11 2.1.2. Composición de la caña de azúcar 12 2.1.3. Composición nutricional del juego de caña de azúcar 12 2.1.4. La industria azucarera en México 13 2.2. Microorganismos en la caña azucarera 14 2.2.1. El género Leuconostoc 15 2.3. Formación de dextranas 16 2.3.1. Azúcar invertido 17 2.4. Los biocidas 17 2.4.1. Mecanismo de acción de los biocidas 17 2.4.2. Condiciones de un buen biocida (European Commission, 2014) 18 3. Biocidas utilizados 19 3.1. Los ditiocarbamatos como biocidas 19 3.2. Etilen bis-ditiocartbamato de sodio (Nabam) C4H8N2S4Na2 20 3.2.1. Función tecnológica 20 3.2.2. Estudios de toxicidad del etilen bis-ditiocarbamato de sodio
(Nabam) 21
3.2.3. Los métodos analíticos de identificación (Nabam) 23 3.2.4. Aplicación del Nabam en la industria azucarera 23
Índice general
XXI
Pág.
3.3. N-metil ditiocabamato de sodio, metam de sodio (MS) C2H8NS2Na 24 3.3.1. Función tecnológica 25 3.3.2. Estudios toxicológicos 25 3.3.3. Aplicación en la industria azucarera 27 3.4. Cloruro de benzalconio (CB) C9H13ClNR 27 3.4.1. Función tecnológica 27 3.4.2. Estudios toxicológicos 30 3.4.3. Aplicación del cloruro de benzalconio en la industria azucarera 32 3.5. Formaldehído, formol o metanal CH2O 34 3.5.1. Mecanismos de acción del formaldehído 34 3.5.2. Toxicidad del formaldehído 34
4. Metodología 37 4.1. Diagrama de flujo 37 4.2. Material y reactivos 38 4.3. Desarrollo experimental 39 4.3.1. Diseño experimental 39 4.3.2. Toma de muestra 40 4.3.3. Inoculación 41 4.3.4. Lectura 41 4.3.5. Selección y aislamiento de colonias bacterianas para
identificación 41
4.3.6. Pruebas preliminares (características morfológicas y bioquímicas) para identificación del género Leuconostoc
41
4.3.7. Confirmación de la identificación 42 4.3.8. Selección de medio de cultivo 42 4.3.9. Diseño experimental 2 43 4.3.10. Prueba de eficiencia de los biocidas 43 4.3.11. Cálculo del porcentaje de efecto inhibitorio 44 4.3.12. Análisis estadístico final 44
5. Resultados y discusión 45 5.1. Pruebas presuntivas (características morfológicas y bioquímicas)
para identificación del genero Leuconostoc 45
5.2. Confirmación de la identificación 46 5.3. Análisis estadístico del experimento 1 47 5.3.1. Selección del medio de cultivo 49 5.3.2. Selección la temperatura de trabajo 49 5.3.3. Selección del tiempo de trabajo 50 5.4. Diseño experimental 2 (optimización de las dosis) 51 5.4.1. Análisis del biocida metam (MS) 51 5.4.2. Análisis de la mezcla de etilen bis-ditiocarbamato de sodio y N-
metil ditiocarbamato de potasio (QZ) 53
5.4.3. Análisis del formaldehído (FA) 54
Índice general
XXII
Pág.
5.5. Efecto inhibitorio del experimento 2 54 5.6 Diseño experimental 3 (metam versus mezcla de ditiocarbamatos
versus cloruro de benzalconio) 58
5.6.1. Análisis estadístico del metam en el diseño experimental 3 59 5.6.2. Análisis estadístico de la mezcla de ditiocarbamatos etilen bis-
ditiocarbamato de sodio y N-metil ditiocarbamato de potasio en el diseño experimental 3
61
5.6.3. Análisis estadístico del cloruro de benzalconio en el diseño experimental 3
62
5.7. Efecto inhibitorio en el diseño experimental 3 (Discusión final) 65 6. Conclusiones y recomendaciones 68 6.1. Conclusiones 68 6.2. Perspectivas 69 Anexos 70 Anexo I. Datos experimentales 70 Anexo II. Análisis estadísticos 71 Anexo III. Disposición controlada de los residuos producidos en la
investigación 83
Bibliografía 85
PRIMERA PARTE I-2
METODOLOGÍAS PARA EL AISLAMIENTO DE LAS BACTERIAS Weissella confusa Y Leuconostoc mesenteroides EN JUGOS DE CAÑA
96
Resumen 105
1. Problemática 107 1.1. Introducción 107 1.2. Justificación 108 1.3. Objetivos 108 1.3.1. Objetivo general 108 1.3.2. Objetivo particular 108 1.4. Hipótesis 109
2. Antecedentes 110 2.1. Caña de azúcar 110 2.2. Industria azucarera en México 110 2.3. Proceso de obtención de azúcar 111 2.3.1. Cultivo de la caña de azúcar 111 2.3.2. Quema 112
Índice general
XXIII
Pág.
2.3.3. Corte de la caña 113 2.3.4. Transporte a la fábrica 113 2.3.5. Picado de la caña 113 2.3.6. Molienda 113 2.3.7. Clarificación 114 2.3.8. Evaporación 114 2.3.9. Cristalización y centrifugación 115 2.3.10. Secado y enfriado 115 2.4. Microorganismos en la industria azucarera 116 2.4.1. Leuconostoc mesenteroides 117 2.4.2. Weissella confusa 118 2.5. Pruebas bioquímicas 119 2.5.1. Catalasa 119 2.5.2. Descarboxilación de arginina 120 2.5.3. Biodegradación de arabinosa 121 2.6. Biocidas en la industria azucarera 122 2.6.1. Cloruro de benzalconio (CB) 122 2.6.2. Metam-sodio (MS) 123 2.6.3. Formaldehído 124
3. Metodologías para para el aislamiento de las bacterias Weissella
confusa y Leuconostoc mesenteroides en jugos de caña 128
3.1. Equipo y reactivos 128 3.2. Diseño experimental 129 3.3. Procedimiento 129 3.3.1. Preparación del medio de cultivo agar MRS 129 3.3.2. Preparación de agua peptonada 129 3.3.3. Lavado y pelado de caña 129 3.3.4. Toma de la muestra 130 3.3.5. Inoculación y lectura 130 3.3.6. Pruebas primarias 130 3.3.6.1. Tinción de Gram (Ramírez et al., 2008) 130 3.3.6.2. Tinción de cápsula (Ramírez et al., 2008) 131 3.3.7. Pruebas bioquímicas 131 3.3.7.1. Catalasa 131 3.3.7.2. Descarboxilación de arginina 131 3.3.7.3. Biodegradación de arabinosa 132 3.3.8. Prueba automatizada en el equipo VITEK 2 133 3.3.9. Preparación de los biocidas de estudio 133 3.3.9.1. Cloruro de benzalconio (CB) 133 3.3.9.2. Metam-sodio (MS) 133 3.3.9.3. Formaldehído 134 3.3.10. Pruebas de resistencia a biocidas 134 3.4. Análisis estadístico 135
Índice general
XXIV
Pág.
4. Resultados y discusión 136 4.1. Inoculación y lectura 136 4.2. Pruebas primarias 137 4.3. Pruebas bioquímicas 139 4.3.1. Catalasa 139 4.3.2. Descarboxilación de arginina 139 4.3.3. Biodegradación de arabinosa 140 4.4. Prueba automatizada en el equipo VITEK 2 140 4.5. Pruebas de resistencia a biocidas 140 4.6. Cloruro de benzalconio (CB) 140 4.7. Metam-sodio (MS) 141 4.8. Formaldehído 142 4.9. Pruebas de antagonismo 143 4.10. Análisis estadístico 144 4.10.1. Tiempo de incubación 144 4.10.2. Prueba de resistencia a biocidas 145 4.10.2.1. Análisis estadístico para cloruro de benzalconio 145 4.10.2.2. Análisis estadístico para metam sodio 148 4.10.2.3. Análisis estadístico para formaldehído 150 4.11. Efecto inhibitorio del segundo experimento 152 5. Conclusiones y perspectivas 156 5.1. Conclusiones 156 5.2. Perspectivas 157 Bibliografía 159 Anexos 163 Anexo I. Aislamiento de bacterias 163 Anexo II. Prueba de VITEK 165 Anexo III. Análisis estadístico de los resultados 168 Anexo IV. Disposición controlada de los residuos producidos 176
SEGUNDA PARTE 179 II-1
METODOLOGÍAS PARA LA DETERMINACIÓN DE METAM SODIO POR CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
Resumen 182 1. Problemática 184 1.1. Planteamiento 184
Índice general
XXV
Pág.
1.2. Objetivos 185 1.3. Objetivos particulares 185 1.4. Hipótesis 185
2. Marco teórico 186 2.1. Importancia del tema 186 2.2. Justificación 186 2.3. Microorganismos importantes en la caña de azúcar 187 2.4. Plaguicidas 187 24.1 Carbamatos 188 2.4.1.1. Ditiocarbamatos 189 2.4.1.2. Ditiocarbamato de sodio 189 3. Metodología 191 3.1. Diagrama de bloques 191 3.2. Procedimiento 192 3.2.1. Lavado y preparación del material 192 3.2.2. Preparación de la solución madre y fase móvi 192 3.2.3. Establecimiento de las condiciones para determinar el Metam
Sodio (MS) 192
3.2.4. Determinación del tiempo de retención (tr) 193 3.2.5. Elaboración del diseño experimental 193 3.2.6. Elaboración de curvas de calibración en agua y jugo de caña 193 3.2.7. Cuantificación metam-sodio 194 3.2.8. Determinación del tiempo de vida media del metam-sodio en
agua y jugo de caña 195
3.3. Análisis estadístico 195 4. Resultados y discusión 196 4.1. Identificación y cuantificación del plaguicida 196 4.2. Curvas de calibración 197 4.2.1. Precisión 197 4.3. Determinación de la velocidad de degradación del MS 199 4.4. Análisis estadístico 204 5. Conclusiones y perspectivas 206 5.1. Conclusiones 206 5.2. Perspectivas 207 Anexos 208 Anexo I. Curvas de calibración en agua y jugo de caña 208 Anexo II. Datos de las curvas de calibración 210 Anexo III. Curvas de cinética de degradación del diseño experimental 211
Índice general
XXVI
Pág.
Anexo IV. Datos cinéticos 213 Anexo V. Disposición controlada de los residuos producidos 215
Bibliografía 217
SEGUNDA PARTE 219 II-2
METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DEL METAM DE SODIO USANDO EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA
Resumen 223 1. Problemática 224 1.1. Planteamiento 224 1.3. Hipótesis 225 1.4. Objetivos 225 2. Fundamento teórico y antecedentes 226 2.1. Justificación e importancia del tema 226 2.2. Antecedentes 226 2.2.1. Quitina 226 2.2.2. Quitosana 227 2.3. Extracción en fase sólida 228 2.4. Adsorbentes 228 3. Metodología 229 3.1. Desarrollo experimental 229 3.2. Obtención de la harina de camarón 229 3.3. Caracterización de la harina del camarón 230 3.4. Cartuchos de extracción en fase sólida 230 3.5. Preparación de los estándares 231 3.6. Extracción del jugo de caña 231 3.7. Extracción en fase sólida (EFS) 231 3.8. Cuantificación por cromatografía de líquidos de alta resolución
(CLAR, HPLC) 232
3.8.1. Límite máximo de detección del ditiocarbamato en el equipo 233 3.8.2. Curva de calibración de ditiocarbamato 234 3.9. Análisis estadísticos 234 4. Resultados y discusión 235 4.1. Obtención de la harina de camarón 235 4.2. Desmineralización de la harina de camarón 235 4.3. Caracterización de la harina 236
Índice general
XXVII
Pág.
4.4. Extracción del jugo de caña 237 4.5. Cuantificación de MS por CLAR (HPLC) 237 4.5.1. Límite máximo de detección del ditiocarbamato en el equipo 237 4.5.2. Curva de calibración de ditiocarbamato 238 4.5.3. Porcentaje de recobro de ditiocarbamato 238 5. Conclusiones y recomendaciones 242 5.1. Conclusiones 242 5.2. Recomendaciones 243 Anexos 244 Anexo I. Disposición controlada de los residuos producidos en la
investigación 244
Bibliografía 246
SEGUNDA PARTE 250 II-3
METODOLOGÍAS PARA ESTUDIAR LOS PRODUCTOS DE FOTODESCOMPOSICIÓN DE BIOCIDAS UTILIZADOS EN LA INDUSTRIA
AZUCARERA – CASO: METAM SODIO A SUS SUBPRODUCTOS METILAMINA (CH3NH2) E ISOTIOCIANATO DE METILO (MITC) Y
DETERMINACIÓN DE LA DIMETILTIOUREA (C3H8N2S) Y METILTIOUREA (C2H6N2S) DERIVADOS DEL MITC EN INGENIOS AZUCAREROS
Resumen 260 1. Problemática 261 1.1. Planteamiento 261 1.2. Justificación 262 1.3. Objetivos 262 1.3.1. Objetivo general 262 1.3.2. Objetivos particulares 263 1.4. Hipótesis 263 2. Antecedentes 264 2.1. Antecedentes históricos de la producción de azúcar en México 264 2.1.1. Historia y evolución 264 2.1.2. Época colonial de la caña en México 265 2.1.3. La industria de la caña en el México independiente 266 2.1.4. La industria azucarera antes y después de la Revolución
Mexicana 267
2.1.5. Tiempos de recuperación de la industria azucarera 268
Índice general
XXVIII
Pág.
2.2. Producción de azúcar en México 269 2.2.1. Participación de la industria azucarera mexicana en el mundo 272 2.2.2. Visión y expectativa futura de la producción de azúcar nacional y
mundial 274
2.3. Proceso de elaboración de la caña de azúcar 276 2.3.1. Operaciones unitarias de la extracción de azúcar de caña 276 2.3.2. Microorganismos presentes en la caña de azúcar 282 2.3.3. Biocidas utilizados en la industria azucarera 284 2.3.4. Metam sodio (MS) y sus productos de descomposición 286 2.3.4.1. Metilamina (MA) 288 2.3.4.2. Metilisotiocianato (MITC) 290 2.3.4.2.1. Dimetiltiourea (DMTU) y metiltiourea (MTU) 291 2.4. Normatividad 294 2.4.1. Normatividad en México 294 2.4.2. FAO-OMS 295 2.4.3. Normatividad de la Unión Europea 297 3. Fundamentos analíticos 298 3.1. Cinética química 298 3.2. Velocidad de reacción 298 3.3. Orden de reacción 300 3.3.1. Métodos gráficos para determinar el orden de reacción 300 3.4. Tiempo de vida media 302 3.5. Fundamentos de espectrofotometría 302 3.5.1. Propiedades de la luz 303 3.5.2. Absorción de la luz 303 3.6. El espectrofotómetro 306 3.6.1. Lámparas 307 3.6.2. Monocromadores 308 3.6.3. Celdas y cubetas 308 3.6.4. Detectores 309 3.7. Errores en la espectrofotometría 310 4. Metodología 311 4.1. Parámetros de operación 311 4.2. Diseño experimental 311 4.3. Material y equipo 312 4.4. Reactivos 312 4.4.1. Preparación de reactivos 314 4.4.2. Tratamiento de caña de azúcar 315 4.5. Curvas de calibración de MS, MA, MITC, DMTU y MTU 315 4.6. Fotodescomposición de MS, MA, MITC, DMTU y MTU 316 4.7. Análisis estadísticos 317
Índice general
XXIX
Pág.
5. Resultados y discusión 318 5.1. Identificación y cuantificación del plaguicida 318 5.2. Curvas de calibración 318 5.3. Fotodescomposición 321 5.3.1. Fotodescomposición en agua 322 5.3.2. Fotodescomposición en jugo de caña 327 5.4. Análisis estadístico 330 6. Conclusiones y recomendaciones 337 6.1. Conclusiones 337 6.2. Recomendaciones 340 Anexos 341 Anexo I. Lavado de material de vidrio 341 Anexo II. Espectros de absorción UV-Visible 342 Anexo III. Curvas de calibración 347 Anexo IV. Curvas de fotodegradación 352 Anexo V. Disposición controlada de los residuos producidos en la
investigación 359
Bibliografía 361
SEGUNDA PARTE 371 II-4
METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DEL SUBPRODUCTO DEL METAM SODIO: DISULFURO DE CARBONO (CS2) EN INGENIOS
AZUCAREROS
Resumen 374 1. Problemática 375 1.1. Planteamiento 375 1.2. Objetivos 376 1.3. Hipótesis 376 2. Marco teórico 377 2.1. La caña 377 2.2. Glúcidos (“Azúcares”) y no glúcidos (“No azúcares”)1 377
1 El uso de la palabra azúcares ha llevado a múltiples confusiones entre la población no experta en química ya
que asocian esta palabra con el azúcar. Hay incluso libros que la emplean por glúcidos o hidratos de carbono.
Por ello, es importante emplear el término glúcidos que involucra a cualquier compuesto formado por
carbono, hidrógeno y oxígeno, incluída el azúcar, pero también monoglúcidos y di‐ y poliglúcidos (en vez de
Índice general
XXX
Pág.
2.3. Proceso de la elaboración del azúcar: Microflora inicial 378 2.4. Biocidas utilizados en la industria azucarera 379 2.5. Justificación 380 3. Metodología 381 3.1. Esquema de bloques 381 3.2. Materiales 381 3.2.1. Equipo 381 3.2.2. Reactivos utilizados 382 3.3. Procedimiento 383 3.4. Análisis estadístico 386 4. Resultados y discusión 387 4.1. Identificación y cuantificación del CS2 por CG-EM 387 4.2. Tiempo de retención del CS2 387 4.3. Límites de detección 388 4.4. Curvas de calibración 389 4.5. Precisión 390 5. Conclusiones y recomendaciones 392 5.1. Conclusiones 392 5.2. Recomendaciones 393 Anexos 394 Anexo I. Disulfuro o bisulfuro de carbono 394 Anexo II. Proceso de elaboración del azúcar 398 Anexo III. Estructura del metam-sodio 405 Anexo IV. Disposición controlada de los residuos producidos en la
investigación
Bibliografía 409
sacáridos, también derivada del nombre científico del azúcar, sacarosa), como la glucosa (o dextrosa), la
fructosa (o levulosa), la maltosa, la lactosa, la galactosa, etc., etc.
1
Primera Parte
I-1
METODOLOGÍAS PARA LA IDENTIFICACIÓN
DE BACTERIAS MESÓFILAS AEROBIAS
PREDOMINANTES EN EL JUGO DE CAÑA DE
UN INGENIO Y SU SUSCEPTIBILIDAD A TRES
BIOCIDAS
Primera Parte I-1: Índice
2
Pág. PRIMERA PARTE
I-1 METODOLOGÍAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS MESÓFILAS
AEROBIAS PREDOMINANTES EN EL JUGO DE CAÑA DE UN INGENIO Y SU SUSCEPTIBILIDAD A TRES BIOCIDAS
Resumen 8 1. Problemática 9 1.1. Planteamiento 9 1.2. Objetivos 9 1.3. Hipótesis 10 1.4. Justificación 10
2. Fundamento teórico y antecedentes 11 2.1. La caña azucarera 11 2.1.1. Características de la caña de azucarera 11 2.1.2. Composición de la caña de azúcar 12 2.1.3. Composición nutricional del juego de caña de azúcar 12 2.1.4. La industria azucarera en México 13 2.2. Microorganismos en la caña azucarera 14 2.2.1. El género Leuconostoc 15 2.3. Formación de dextranas 16 2.3.1. Azúcar invertido 17 2.4. Los biocidas 17 2.4.1. Mecanismo de acción de los biocidas 17 2.4.2. Condiciones de un buen biocida (European Commission, 2014) 18 3. Biocidas utilizados 19 3.1. Los ditiocarbamatos como biocidas 19 3.2. Etilen bis-ditiocartbamato de sodio (Nabam) C4H8N2S4Na2 20 3.2.1. Función tecnológica 20 3.2.2. Estudios de toxicidad del etilen bis-ditiocarbamato de sodio
(Nabam) 21
3.2.3. Los métodos analíticos de identificación (Nabam) 23 3.2.4. Aplicación del Nabam en la industria azucarera 23 3.3. N-metil ditiocabamato de sodio, metam de sodio (MS) C2H8NS2Na 24 3.3.1. Función tecnológica 25 3.3.2. Estudios toxicológicos 25 3.3.3. Aplicación en la industria azucarera 27 3.4. Cloruro de benzalconio (CB) C9H13ClNR 27 3.4.1. Función tecnológica 27 3.4.2. Estudios toxicológicos 30
Primera Parte I-1: Índice
3
Pág.
3.4.3. Aplicación del cloruro de benzalconio en la industria azucarera 32 3.5. Formaldehído, formol o metanal CH2O 34 3.5.1. Mecanismos de acción del formaldehído 34 3.5.2. Toxicidad del formaldehído 34
4. Metodología 37 4.1. Diagrama de flujo 37 4.2. Material y reactivos 38 4.3. Desarrollo experimental 39 4.3.1. Diseño experimental 39 4.3.2. Toma de muestra 40 4.3.3. Inoculación 41 4.3.4. Lectura 41 4.3.5. Selección y aislamiento de colonias bacterianas para
identificación 41
4.3.6. Pruebas preliminares (características morfológicas y bioquímicas) para identificación del género Leuconostoc
41
4.3.7. Confirmación de la identificación 42 4.3.8. Selección de medio de cultivo 42 4.3.9. Diseño experimental 2 43 4.3.10. Prueba de eficiencia de los biocidas 43 4.3.11. Cálculo del porcentaje de efecto inhibitorio 44 4.3.12. Análisis estadístico final 44
5. Resultados y discusión 45 5.1. Pruebas presuntivas (características morfológicas y bioquímicas)
para identificación del genero Leuconostoc 45
5.2. Confirmación de la identificación 46 5.3. Análisis estadístico del experimento 1 47 5.3.1. Selección del medio de cultivo 49 5.3.2. Selección la temperatura de trabajo 49 5.3.3. Selección del tiempo de trabajo 50 5.4. Diseño experimental 2 (optimización de las dosis) 51 5.4.1. Análisis del biocida metam (MS) 51 5.4.2. Análisis de la mezcla de etilen bis-ditiocarbamato de sodio y N-
metil ditiocarbamato de potasio (QZ) 53
5.4.3. Análisis del formaldehído (FA) 54 5.5. Efecto inhibitorio del experimento 2 54 5.6 Diseño experimental 3 (metam versus mezcla de ditiocarbamatos
versus cloruro de benzalconio) 58
5.6.1. Análisis estadístico del metam en el diseño experimental 3 59 5.6.2. Análisis estadístico de la mezcla de ditiocarbamatos etilen bis-
ditiocarbamato de sodio y N-metil ditiocarbamato de potasio en el diseño experimental 3
61
Primera Parte I-1: Índice
4
Pág.
5.6.3. Análisis estadístico del cloruro de benzalconio en el diseño
experimental 3 62
5.7. Efecto inhibitorio en el diseño experimental 3 (Discusión final) 65 6. Conclusiones y recomendaciones 68 6.1. Conclusiones 68 6.2. Perspectivas 69 Anexos 70 Anexo I. Datos experimentales 70 Anexo II. Análisis estadísticos 71 Anexo III. Disposición controlada de los residuos producidos en la
investigación 83
Bibliografía 85
Primera Parte I-1: Índice de tablas
5
Pág. Tabla 1. Composición del jugo de caña de azúcar por cada 100 g (Correa
et al , 2004) 13
Tabla 2. Estados productores e ingenios azucareros (SIAP, 2013) 13 Tabla 3. Principales microorganismos presentes en la caña de azúcar
(Serrano, 2006) 15
Tabla 4. Efectos del etilen bis-ditiocarbamato de sodio en el ser humano (International Programme Chemical Safety, 1988)
21
Tabla 5. Bioacomulación de ditiocarbamatos 22 Tabla 6. Métodos de determinación empleados en el análisis de
ditiocarbamatos 23
Tabla 7. Uso y dosificación del “Nabam” (International Programme Chemical Safety, 1988)
24
Tabla 8. Toxicidad (DL50 y CL50) del metam en animales de experimentación
25
Tabla 9. Uso y cantidades del metam (International Programme Chemical Safety, 1988)
27
Tabla 10. Funciones tecnológicas del cloruro de benzalconio 30 Tabla 11. Estudios toxicológicos del cloruro de benzalconio (CB) 31 Tabla 12. Resumen de métodos analíticos para determinar cloruro de
benzalconio 32
Tabla 13. Aplicación del cloruro de banzalconio en la industria azucarera (CFR, 2012)
33
Tabla 14. Resumen de biocidas en estudio 35 Tabla 15. Reactivos y materiales utilizados 38 Tabla 16. Diseño experimental 1: Selección del medio de cultivo 39 Tabla 17. Diseño experimental 2: Selección de dosis óptima 39 Tabla 18. Biocidas utilizados comúnmente en la industria azucarera 40 Tabla 19. Selección del medio de cultivo para el aislamiento de
Leuconostoc mesenteroides 42
Tabla 20. Observaciones para identificación presuntiva de Leuconostoc mesenteroides
45
Tabla 21. Resultados del análisis automatizado de identificación microbiológica VITEK-2
47
Tabla 22. Análisis de varianza (ANOVA) para el número de colonias 48 Tabla 23. Efecto del medio de cultivo 49 Tabla 24. Efecto de la temperatura 49 Tabla 25. Efecto del tiempo 50 Tabla 26. Efecto inhibitorio del metam y mezcla de ditiocarbamatos (QZ) en
porcentaje 56
Tabla 27. Diseño experimental 3: Metam vs. mezcla de ditiocarbamatos vs. cloruro de benzalconio
58
Tabla 28. Dosis de los biocidas para el diseño experimental 3 59 Tabla 29. Efecto inhibitorio en el diseño experimental 3 del metam mezcla
QZ y cloruro de benzalconio en porcentajes 65
Primera Parte I-1: Índice de figuras
6
Pág. Fig. 1. Desarrollo experimental 37 Fig. 2. Ingenio azucarero 40 Fig. 3. Caña lavada 40 Fig. 4. Molienda de la caña 40 Fig. 5a,b. Técnica de estriado en cuadrante radial 41 Fig. 6. Tinción de Gram y agrupación 46 Fig. 7. Tinción de cápsula 46 Fig. 8. Prueba de catalasa 46 Fig. 9. Equipo VITEK 2 47 Fig. 10. Tarjetas de reactivos colorimétricos 47 Fig. 11. Diagrama de Pareto estandarizada: efecto de los parámetros en
estudio 49
Fig. 12. Gráfica de cajas y bigotes número de colonias vs. medio 50 Fig. 13. Gráfica de cajas y bigotes número de colonias vs. temperatura 50 Fig. 14. Gráfica de cajas y bigotes número de colonias vs. tiempo 50 Fig. 15. Resultados de los parámetros de diseño 51 Fig. 16. Promedio de los resultados de la inhibición a diferentes dosis de
metam 52
Fig. 17. Gráfica de cajas y bigotes halo de inhibición vs. dosis del metam 52 Fig. 18. Gráfica de cajas y bigotes halo de inhibición vs. tiempo del
metam 52
Fig. 19. Gráfica de cajas y bigotes halo de inhibición vs. temperatura del metam
52
Fig. 20. Promedio de los resultados de la inhibición a diferentes dosis de la mezcla de ditiocarbamato
53
Fig. 21. Gráfica de cajas y bigotes halo de inhibición vs. dosis de la mezcla de ditiocarbamatos
54
Fig. 22. Gráfica de cajas y bigotes halo de inhibición vs. tiempo de la mezcla de ditiocarbamatos
54
Fig. 23. Gráfica de cajas y bigotes halo de inhibición vs. temperatura de la mezcla de ditiocarbamatos
54
Fig. 24. Promedio de la inhibición a diferentes dosis de formaldehído 55 Fig. 25. Gráfica de cajas y bigotes halo de inhibición vs. dosis
formaldehído 55
Fig. 26. Gráfica de cajas y bigotes halo de inhibición vs. tiempo formaldehído
55
Fig. 27. Gráfica de cajas y bigotes halo de inhibición vs. temperatura formaldehído
55
Fig. 28. Porcentaje del efecto inhibitorio de metam y mezcla de ditiocarbamatos
57
Fig. 29. Gráfica de cajas y bigotes % efecto inhibitorio vs. biocidas (metam vs. mezcla de ditiocarbamatos)
57
Fig. 30. Promedio de la inhibición a diferentes dosis de metam 60
Primera Parte I-1: Índice de figuras
7
Pág.
Fig. 31. Gráfica de cajas y bigotes halo de inhibición versus dosis del
metam para el experimento 3 60
Fig. 32. Gráfica de cajas y bigotes halo de inhibición versus temperatura del metam para el experimento 3
60
Fig. 33. Halo de inhibición del metam 61 Fig. 34. Promedio de la inhibición a diferentes dosis de la mezcla de
ditiocarbamatos 61
Fig. 35. Gráfica de cajas y bigotes halo de inhibición versus dosis de la mezcla de ditiocarbamatos para el experimento 3
62
Fig. 36. Gráfica de cajas y bigotes halo de inhibición versus temperatura de la mezcla de ditiocarbamatos para el diseño experimental 3
62
Fig. 37. Halo de inhibición de la mezcla de ditiocabamatos (QZ) 63 Fig. 38. Promedio de la inhibición a diferentes dosis del cloruro de
benzalconio 63
Fig. 39. Gráfica de cajas y bigotes halo de inhibición versus dosis del CB en el diseño experimental 3
64
Fig. 40. Grafica de cajas y bigotes halo de inhibición versus dosis del metam en el diseño experimental 3
64
Fig. 41. Halo de inhibición del cloruro de benzalconio 64 Fig. 42. Porcentaje del efecto inhibitorio del metam, mezcla de
ditiocarbamatos y cloruro de benzalconio 66
Fig. 43. Gráfica de cajas y bigotes del porcentaje del efecto inhibitorio versus biocidas metam versus mezcla de ditiocarbamatos versus cloruro de benzalconio
67
Fig. III.1. Disposición controlada de los residuos producidos en esta
investigación
83
Primera Parte I-1: R e s u m e n
8
El jugo de la caña debe recibir un tratamiento desinfectante ya que entra en contacto
directo con grandes cantidades de microorganismos que consumen la sacarosa
provocando su inversión y transformación química. Se reportan a las bacterias del
género Leuconostoc como principal consumidor de sacarosa. Por tanto, existen
productos para la desinfección y/o sanitización de la caña de azúcar como son:
ditiocarbamatos, sales cuaternarias de amonio y formaldehído entre otros. Por lo cual
el objetivo de esta investigación es aislar a la bacteria mesófila aerobia o facultativa
(Leuconostoc mesenteroides), y comprobar su susceptibilidad a los tres biocidas más
usados en la industria azucarera. Esto se realizó mediante la toma de muestra,
inoculación y lectura de las bacterias presentes en el jugo de caña. Se seleccionaron
y aislaron colonias para su identificación. Dicha selección se sometió a la prueba de
difusión de agar para determinar su susceptibilidad. Cada placa se incubó a 25, 35 y
45°C por 72 h y luego se midieron los diámetros de los halos de inhibición. Se realizó
un análisis estadístico para determinar si hubo diferencia significativa entre el efecto
inhibidor de cada biocida. Con ayuda de los resultados y de sus características
toxicológicas se determinó la mejor opción según esta investigación. Los resultados
demostraron que el medio MRS adicionado con vancomicina es el ideal para el
aislamiento de Leuconostoc mesenteroides. Se confirmó la obtención de la bacteria
Leuconostoc mesenteroides mediante la prueba automatizada de identificación
VITEK 2 con un 95% de confiabilidad. El halo de inhibición promedio del
formaldehído es de 10.85 mm, siendo utilizado como referencia por su conocido
poder biocida. El porcentaje del efecto inhibitorio respecto del formaldehído del
metam fue de 85, 107 y 172%, utilizando dosis de 30, 40 y 50 mg L-1
respectivamente. Para la mezcla de ditiocabamatos fue de 97, 112 y 179% utilizando
dosis de 30, 40 y 50 mg L-1, respectivamente. Finalmente, con el cloruro de
benzalconio se obtuvieron porcentajes de 192, 266 y 329% utilizando dosis de 10,
15, 20 mg L-1, respectivamente, siendo este último biocida el de mayor eficiencia.
Palabras clave: Aislamiento, Leuconostoc mesenteroides, biocida, halo de
inhibición
Primera Parte I-1: Capítulo 1
9
1. Problemática
1.1. Planteamiento
La caña de azúcar es uno de los cultivos más eficientes desde el punto de vista
fotosintético. Una hectárea de caña de azúcar puede producir hasta 100 toneladas
de caña por año, la cual es más del doble de la producción agrícola de otros cultivos
(Arvizu-Bernal y Ramos Medina, 2010; Bonilla-Vidal, 2013).
Uno de los inconvenientes en la industria azucarera en general es la inversión de la
sacarosa en el jugo de caña que va desde el momento de su extracción en los
molinos hasta que llega a la sala de cocimiento. El jugo de la caña no tratado
químicamente, al pasar por las canaletas y cañerías, entra en contacto directo con
una gran cantidad de microorganismos que están adheridos a las superficies del
metal, provocando pérdidas que pueden alcanzar hasta el 1.0% de la sacarosa.
Algunos autores reportan a las bacterias del género Leuconostoc y al grupo de
coliformes como los principales microorganismos consumidores de sacarosa (Egan y
Rehbein, 1963; Hernández et al., 1978). Estas bacterias pueden causar pérdidas del
3-5% en masa, debido a la multiplicación continua a pesar de que se realice una
limpieza frecuente en molinos. Además, los lodos o fangos que se acumulan en los
molinos constituyen la fuente más importante de contaminación microbiana y con ello
la producción de invertasa, ocasionando el desdoblamiento de la sacarosa y la
formación de las gomas dextranas. Por tanto, el efecto perjudicial de las dextranas
comienza desde el momento en que estas se forman, consumiendo 0.2 kg ton-1 de
azúcar o 0.02 kg ton-1 de caña procesada (Flores-Santillán y Pérez-Cordero, 2013).
1.2. Objetivos
Aislamiento e identificación de una de las bacterias mesófilas aerobias o facultativas
predominantes en el jugo de caña de un ingenio, Leuconostoc mesenteroides, y su
susceptibilidad a tres biocidas (cloruro de benzalconio, N-metil-ditiocarbamato de
Primera Parte I-1: Capítulo 1
10
sodio y una mezcla comercial de etilen bis-ditiocarbamato de sodio y N-metil
ditiocarbamato de potasio).
1.3. Hipótesis
Hipótesis Nula Ho = La aplicación de biocidas no produce efectos inhibitorios a las
bacterias del género Leuconostoc.
Hipótesis Alternativa Ha = La aplicación del biocidas produce efectos inhibitorios a
las bacterias del género Leuconostoc.
1.4. Justificación
Los productos que se han utilizado para la desinfección y/o sanitización de la caña
de azúcar son: ditiocarbamatos, cloruro de benzalconio y otras sales cuaternarias de
amonio como bifluoruro de amonio y formaldehído (Kochergin, 2002). Sin embargo,
el uso de reactivos químicos para el control de microorganismos en la industria
alimentaria se ve confrontado con el hecho de que pueden ser tóxicos al humano o
dañar al ambiente (Cuervo et al., 2010).
Primera Parte I-1: Capítulo 2
11
2. Fundamentos teóricos y antecedentes
2.1. La caña azucarera
La caña de azúcar es una gramínea gigante perenne del género Saccharum que
crece en los climas tropicales y subtropicales, con temperaturas promedio de 20 a
30°C (Carmona, 1997). Durante la temporada del año en que prevalecen
temperaturas altas y es máxima la actividad pluvial, la caña de azúcar alcanza un
gran crecimiento. Bajo estas condiciones la fotosíntesis se desplaza hacia la
producción de carbohidratos de alta masa molecular como la celulosa y otros
compuestos que constituyen el follaje y el soporte fibroso del tallo que es donde se
acumula sacarosa en el periodo de maduración (GEPLACEA, 1988). La caña florece
luego de estar completamente madura por lo que el corte para su uso industrial se
produce antes de la floración.
2.1.1. Características de la caña azucarera
La caña de azúcar tiene el tallo macizo, que puede llegar a medir hasta 6 metros de
altura y de 2 a 8 centímetros de diámetro. Este tallo está lleno por dos partes
diferenciadas: un tejido esponjoso y dulce en la parte central (médula o meollo), del
que se extrae un jugo rico en sacarosa; y una parte periférica, rica en fibra, que en el
proceso de extracción del azúcar constituirá el “bagazo”.
El número de tallos de la planta, el color y el hábito de crecimiento dependen de la
variedad de la planta. En general, puede tener de uno hasta tres tallos. Típicamente
se conoce que el tallo de las cañas es liso con “anillos” fibrosos, que se denominan
nudos. Las partes que se encuentran entre nudo y nudo del tallo se denominan
entrenudos. Sus hojas se originan de los nudos del tallo, son largas y linguadas.
La flor es una inflorescencia en forma de panícula de pequeñas espigas: sedosas,
largas y vellosas. Cada inflorescencia suele tener un tallo principal o raquis que
Primera Parte I-1: Capítulo 2
12
contiene una flor hermafrodita con tres anteras y un ovario con dos estigmas. Florece
según los países donde crezca.
Su raíz es un sistema radicular, es decir, pueden diferenciarse dos tipos de raíces:
las primordiales, delgadas y muy ramificadas, que pueden vivir hasta 3 meses y las
raíces permanentes que brotan de los nuevos tallos de la caña. Estas segundas son
más numerosas, gruesas y de rápido crecimiento (CONABIO, 2009).
La caña de azúcar puede multiplicarse mediante acodos, plantando un tallo que
tenga un nudo y una yema incipiente. Existen alrededor de 25 especies en el mundo
reconocidas como cañas de azúcar (CONABIO, 2009).
2.1.2. Composición de la caña de azúcar
El tallo de la caña contiene agua entre 73 a 76%, sacarosa de un 8 a un15% y fibra
entre 11 a 16%. Estas proporciones pueden variar según el tipo de cultivo y variedad
de la planta (Davidse et al., 1994).
La importancia de la composición nutricional de la planta recae en el jugo de su tallo,
del que se extrae el azúcar. El jugo de la caña equivale al 70 a 80% de la masa del
tallo y el 15 al 30% restante constituye el bagazo (Davidse et al., 1994).
2.1.3. Composición nutricional del jugo de caña de azúcar
En la Tabla 1 se muestra la información nutrimental del jugo de caña de azúcar
mostrando que los carbohidratos simples como la sacarosa constituyen entre un 40-
60%, la glucosa 6-9% y la fructosa de un 5-10%.
En variedades silvestres (salvajes) el porcentaje de sacarosa puede ser solamente
del 12% y aún menor para los demás glúcidos. En cuanto a las vitaminas contiene
tiamina (B1), rivoflavina (B2), niacina (B3) y ácido pantoténico (B5). Los minerales
presentes en el jugo son potasio (K), calcio (Ca) y hierro (Fe) y, finalmente, los
ácidos que contiene son el aconítico, málico y cítrico (Correa et al., 2004).
Primera Parte I-1: Capítulo 2
13
Tabla 1. Composición del jugo de caña de azúcar por cada 100 g
(Correa et al., 2004) Calorías 62 kcal Glúcidos 16.5 g Proteínas 0.6 g Grasas 0.1 g Fibra 3.1 g Calcio 8.0 mg Hierro 1.4 mg
Tiamina 0.02 mg Rivoflavina 0.01 mg
Niacina 0.10 mg Vitamina C 3 mg kcal, kilocalorías; g, gramos; mg, miligramos
2.1.4. La industria azucarera en México
De acuerdo con la Cámara Nacional de la Industria Azucarera y Alcoholera (CNIAA),
la producción de caña de azúcar se registra en 15 estados del país y 57 ingenios
azucareros. Veracruz es el estado con mayor número de ingenios azucareros con 22,
seguido por Jalisco con 6 y San Luis Potosí con 4. En la Tabla 2 se presentan los
nombres de los ingenios azucareros de todos los estados productores de caña de
azúcar del país (SIAP, 2013).
Tabla 2. Estados productores e ingenios azucareros (SIAP, 2013) Estado Ingenio azucarero Número
Campeche La Joya 1 Colima Quesería 1 Chiapas Huixtla
Pujiltic (Cía. La Fe) 2
Jalisco Bellavista, José María Martínez (Tala), José María Morelos, Melchor Ocampo, San Francisco Ameca, Tamazula
6
Michoacán Lázaro Cárdenas, Pedernales, Santa Clara 3 Morelos Casasano (La Abeja), Emiliano Zapata 2 Nayarit El Molino, Puga 2 Oaxaca Adolfo López Mateos, El Refugio, Pablo Machado (La Margarita) 3 Puebla Atencingo, Calipam 2 Quintana Roo San Rafael de Pucté 1 San Luis Potosí Alianza Popular, Plan de Ayala, Plan de San Luis, San Miguel del Naranjo 4 Sinaloa El Dorado, La Primavera, Los Mochis 3 Tabasco Azsuremex-Tenosique, Presidente Benito Juárez, Santa Rosalía 3 Tamaulipas Aarón Sáenz Garza, El Mante 2 Veracruz Central Motzorongo, Central Progreso, Constancia, Cuatotolapam, El
Carmen, El Higo, El Modelo, El Potrero, Independencia, La Concepción, La Gloria, La Providencia, Mahuixtlán, Nueva San Francisco (Naranjal), San Cristóbal, San Gabriel, San José de Abajo, San Miguelito, San Nicolás, San Pedro, Tres Valles, Zapoapita-Pánuco
22
Total 57
Primera Parte I-1: Capítulo 2
14
En el país, se benefician 227 municipios de la caña de azúcar. La agroindustria de la
caña de azúcar tiene un efecto socioeconómico en 12 millones de personas
(SAGARPA, 2009-2013).
Como se señaló arriba, en México operan 57 ingenios azucareros. La Unión Nacional
de Cañeros participa con el 43% de la producción total de caña. El cultivo de la caña
se obtiene en una superficie de 680,000 hectáreas a nivel nacional. La superficie
cosechada en el ciclo 2003-2004 fue de 610,000 hectáreas, lo cual representó en un
0.6% en el producto interno bruto, PIB nacional, ocupando el cuarto lugar en la
relación producción de caña de azúcar por hectárea a nivel mundial (CNIAA, 2010).
México también es reconocido en el contexto mundial de azúcar con los siguientes
lugares: séptimo lugar en producción y consumo de azúcar, cuarto lugar en
producción de azúcar por hectárea y quinto lugar en la producción de campo de caña
de azúcar. Esta industria de producción de caña de azúcar genera 440,000 empleos
directos y millones de empleos indirectos. El consumo per cápita oscila alrededor de
44 kg anualmente (CNIAA, 2010).
2.2. Microorganismos en la industria azucarera
Los microorganismos presentes en la caña de azúcar proceden del suelo y de las
estructuras vegetales en putrefacción. La rizosfera (suelo en interacción con la raíz)
contiene una amplia gama de microorganismos, aunque no se sabe si la rizosfera de
la caña de azúcar, está asociada de manera constante con microorganismos
específicos. En un estudio (Mayeux y Colmer, 1960) se encontró un elevado número
de Enterobacter (105 UFC g-1) en el suelo próximo a la caña y en menor cuantía a
medida que aumenta la distancia desde el tallo. Aunque no de forma constante, la
bacteria Leuconostoc mesenteroides también puede encontrarse en la rizosfera en
un número superior a 5x103 UFC g-1. Con el clima húmedo y caluroso el jugo que
exuda de la caña, contiene un elevado número de microorganismos,
aproximadamente 109 UFC de bacterias y 106 UFC de levaduras y mohos por gramo,
los cuales pueden contaminar la caña al ser cortada (Mayeux y Colmer, 1960; Silliker
Primera Parte I-1: Capítulo 2
15
et al., 1980). La infección de la caña por el insecto Diatraea saccharalis, conocido
como “borer” y el ataque de roedores favorecen la contaminación microbiana de la
gramínea en el campo. Durante la investigación bibliográfica se encontró información
acerca de la microbiota acompañante de la caña de azúcar (Tabla 3), en donde cabe
destacar que se encontró que la bacteria Leuconostoc mesenteroides es la que más
problemas da a la industria azucarera debido a su producción de la enzima invertasa,
la cual es utilizada para consumir la sacarosa presente en la caña.
Tabla 3. Principales microorganismos presentes en la caña de azúcar (Rodríguez-
Berthely, 2014; Serrano, 2006)
Tipo microorganismo
Especies
Bacterias Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis. Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc destranicum, Escherichia coli, Enterobacter aerógenes, Citrobacter freudii, Pseudomonas sp, Klebsiella sp, Corynebacteirum sp, Micrococcus luteus, Staphilococcus fragilis y Clostridium sp.
Levaduras Saccharomyces cerevisiae, S. rouxii, Saccharomyces pombe, Candida tropicalis, Candida micoderma, Candida intermedia, Pichia farinosa, P. membranofaciens y Hansenula anómala
Mohos Penicillum citrovorus, Penicillum funiculosum, Aspergillus variatum, Aspergillus niger, Trichoderma viride y Monilia sitiophila
Este gran número de especies demuestra la diversidad de la microbiota presente en
los jugos de caña; sin embargo, hay algunas especies que se desarrollan en el jugo
con más frecuencia que otras y que, por lo tanto, adquieren una gran importancia
económica al consumir la sacarosa y formar polisacáridos como en el caso particular
del género Leuconostoc (Cuddihi et al., 1998; Serrano, 2006).
2.2.1. El género Leuconostoc
Leuconostoc es un género de bacterias del ácido láctico Gram positivas de la familia
Leuconostocaceae. Las especies de Leuconostoc tienen generalmente forma de
cocoide ovoide y a menudo forman cadenas. Son resistentes intrínsecamente a la
vancomicina y catalasa negativos (lo cual los distingue de Staphylococcus). Son
heterodegradativas, capaces de producir dextrana a partir de la sacarosa (Anónimo,
2014a; Björkroth y Holzapfel, 2006).
Primera Parte I-1: Capítulo 2
16
Aunque inicialmente se consideraban comensales no patógenos en humanos, desde
la descripción en 1985 del primer caso de bacteremia por Leuconostoc spp., algunas
especies son también capaces de producir infecciones a los seres humanos (Cuervo-
M. et al., 2008). Se consideran patógenas oportunistas, aunque en muy baja
frecuencia, que se pueden encontrar en pacientes críticamente enfermos,
inmunocomprometidos y con infecciones intrahospitalarias. Generalmente, se
asocian a bacteremia por dispositivos intra-vasculares y al uso de nutrición parenteral
total. Sin embargo, también se han descrito otras infecciones asociadas, dentro de
las que se encuentran meningitis, osteomielitis, infección del torrente sanguíneo, de
vías urinarias y peritonitis (Vagiakou-Voudris et al., 2002). Debido a que estas
enfermedades son raras, los kits de identificación comerciales estándar a menudo no
identifican estos organismos (Kulwichit, 2007).
2.3. Formación de dextranas
Las dextranas no son compuestos propios de la caña, el contenido de estos
polisacáridos en la caña es mínimo o nulo. Su formación ocurre por la acción de la
enzima dextranasacarasa de microorganismos contaminantes que la atacan
posteriormente al ser dañada su corteza. La bacteria Leuconostoc mesenteroides es
el principal microorganismo productor de dextranas. Esta bacteria da origen a las
dextranas utilizando la sacarosa contribuyendo así a la pérdida del disacárido
glucosa-fructosa (sacarosa o azúcar). Las dextranas son polisacáridos constituidos
por unidades de glucosa unidas en forma de cadena recta mediante enlaces α 1-6. Al
menos entre 50 y 60% de las uniones deben ser α 1-6 para que el polímero se defina
como dextrana, existiendo un amplio intervalo de masas moleculares entre ellos, ya
que oscilan desde unos miles hasta millones de unidades de masa molecular
(Rodríguez, 2005).
Bajo condiciones favorables de temperatura y humedad la dextranasacarasa
hidroliza la sacarosa y forma dextranas. Además de las pérdidas de sacarosa a
consecuencia de la formación de dextranas, estos polímeros incrementan la
Primera Parte I-1: Capítulo 2
17
viscosidad de los jugos, creando problemas en los evaporadores y tachos
(Larrahondo, 1995; Rodríguez, 2005; Villa, 2008).
2.3.1. Azúcar invertido
Se conoce con este nombre a la mezcla de glúcidos producida cuando la sacarosa
se hidroliza, química o enzimáticamente. El nombre de inversión se refiere al cambio
del poder rotatorio que se observa durante dicha hidrólisis, la sacarosa (+66°), al
dividirse en glucosa (+52°) y fructosa (-92°), desarrolla dicho poder rotatorio sobre la
luz polarizada por la fuerte influencia de la fructosa, lo que conlleva a dificultades
para la cristalización del azúcar, característica indeseable en algunos casos (Badui-
Dergal,1999).
2.4. Los biocidas
Los biocidas pueden ser sustancias químicas sintéticas o de origen natural o
microorganismos que están destinados a destruir, contrarrestar, neutralizar, impedir
la acción o ejercer un control de otro tipo sobre cualquier organismo considerado
nocivo para el hombre (European Commission, 2014).
2.4.1. Mecanismos de acción de los biocidas
Las sustancias biocidas por lo general actúan a nivel de la membrana celular del
microorganismo, penetrándola y destruyendo los sistemas que permiten vivir al
microorganismo. El biocida provoca la lisis de la pared proteica o lipoproteíca del
organismo y penetra en su interior interrumpiendo las reacciones bioquímicas que
sustentan la vida en el organismo.
Existen diferentes tipos de biocidas que se pueden presentar de tres formas: (1)
Físico: Fuentes de radiación de alta energía (luz UV) que oxidan la pared proteica y
prácticamente queman el microorganismo. (2) Biológicos: Sustancias creadas por
organismos superiores para autodefensa, generalmente son de tipo proteico y se
denominan enzimas, por ejemplo lisozimas y (3) Químicos: Pueden ser a su vez,
inorgánicos o de síntesis orgánica, por ejemplo el dióxido de cloro (ClO2),
Primera Parte I-1: Capítulo 2
18
isotiazolinas, cloraminas, bromuros de alquilo, cloruros de alquilo o arilo, etc.
(Eurepean Commission, 2014).
2.4.2. Condiciones de un buen biocida (European Commission, 2014)
Debe tener un amplio espectro de actividad, es decir, debe cubrir una amplia
gama de microorganismos (bacterias, virus y hongos)
Debe ser efectivo a baja concentración: Mientras más baja es la dosis, más
económico resulta el tratamiento
Debe ser efectivo en un amplio rango de pH
Debe ser soluble en agua
Debe ser compatible con otras especies químicas en el medio
Debe tener alta persistencia: Debe ser efectivo a través del tiempo
Debe ser fácil de neutralizar: Debe poseer mecanismos desactivadores para
su posterior neutralización
Debe tener baja toxicidad humana: No debe ser perjudicial en su manipulación
segura por parte del operador.
Primera Parte I-1: Capítulo 3
19
3. Biocidas utilizados
El método de control empleado habitualmente en la industria contra los
microorganismos y en especial contra las bacterias acido lácticas como Leuconostoc
sp., es el uso de productos químicos; sin embargo, la industria alimentaria o aquella
industria que elabora productos de consumo humano se ve en dificultad para el
control de microorganismos por compuestos químicos, dado que estos generalmente
pueden ser tóxicos al humano o acarrear graves consecuencias al ambiente. Existen
productos que se han utilizados para su uso en desinfección y/o sanitización de la
caña de azúcar y los más comunes son: ditiocarbamatos y otros carbamatos, cloruro
de benzalconio y otras sales cuaternarias de amonio como bifluoruro de amonio y
formaldehído. El ditiocarbamato de sodio es ampliamente utilizado en la industria
azucarera durante la extracción del jugo de caña debido a su acción inhibitoria de
Leuconostoc mesenteroides, principal responsable de la formación de dextranas
(Hernández et al., 1978).
3.1. Los ditiocarbamatos como biocidas
Los ditiocarbamatos son compuestos derivados del ácido carbámico que poseen una
ligera actividad anticolinesterásica y presentan una gran capacidad para la captación
de metales e interacción con radicales sulfhidrilo. Existen diferentes tipos de biocidas
a base de ditiocarbamatos como los que se presentan a continuación, con sus
nombres comerciales en paréntesis (International Programme Chemical Safety,
1988):
Bis-ditiocarbamatos (Thiram) (Disulfuro de tetrametiltiuran)
Etilen-bis-ditiocarbamatos (Maneb, Zineb y Nabam) (Etilen-bis-ditiocarbamato
de manganeso, zinc y sodio). Su biodegradación provoca que se degraden a
etilen-tiourea (ETU) que tiene efecto bociógeno y cancerígeno
Dimetil-ditiocarbamatos (Ziram y Ferbam) (zinc y hierro). Su biodegradación se
convierten en disulfuro de carbono que tiene efectos neurotóxicos
Primera Parte I-1: Capítulo 3
20
Metil-ditiocarbamatos (sodio y potasio) comúnmente conocidos como Metam de
sodio o Metam-Sodio (MS) y Metam de potasio
El mecanismo de acción y efectos generales de los ditiocarbamatos son:
Altamente sensibilizantes
No inhiben las colinesterasas
El thiram daña los microsomas y el citocromo P-450
Inhibe la deshidrogenasa alcohólica y produce reacciones similares al
medicamento denominado antabus o disulfiram, fármaco usado para ayudar
en el tratamiento del alcoholismo crónico, produciendo una reacción aguda al
consumo de etanol (Anónimo, 2014b)
Se absorben a través del sistema digestivo y respiratorio y, además, irritan piel
y mucosas, su vía de eliminación es la orina.
3.2. Etilen-bis-ditiocarbamato de sodio (Nabam) C4H8N2S4Na2
Entre los biocidas utilizados en la industria alimentaria se encuentra el Nabam, que
es un sólido incoloro soluble en agua. Se descompone en agua a 50°C para dar el
sulfuro de hidrógeno y disulfuro de carbono venenoso inflamable (International
Programme Chemical Safety, 1988).
3.2.1. Función tecnológica
Tiene una amplia gama biocida entre los microorganismos (bacterias, algas y
hongos) encontrados normalmente en molinos y torres de enfriamiento (International
Programme Chemical Safety, 1988).
Durante el proceso de la caña de azúcar se utilizan en los molinos (mill grinding),
estrujadores (crushers) y en los sistemas de difusión en las cantidades indicadas.
Las cantidades de cada aditivo individual están expresadas en términos de caña
Primera Parte I-1: Capítulo 3
21
cruda o de remolacha cruda. Las concentraciones utilizadas en molinos que
procesan caña de azúcar son de N-metil ditiocarbamato de potasio: 3.5 mg L-1,
dimetil ditiocarbamato de sodio: 3.0 mg L-1 y de etilen-bis-ditiocarbamato de sodio:
3.0 mg L-1 (CFR, 2012).
3.2.2. Estudios de toxicidad del etilen-bis-ditiocarbamato de sodio (Nabam)
En la Tabla 4 se dan resultados sobre pruebas de toxicidad aguda (DL50 y CL50) de
ditiocarbamatos en animales de experimentación. Además de la toxicidad aguda es
importante considerar otros efectos que se pueden presentar como resultado de la
exposición laboral al etilen-bis-ditiocarbamato de sodio los cuales se describen en la
Tabla 4.
Tabla 4. Efectos del etilen bis-diotiocarbamato de sodio en el ser humano (International Programme Chemical Safety, 1988)
Efectos Descripción Reversibilidad Cambios funcionales
El contacto regular con ditiocarbamatos puede ocasionar cambios funcionales en los sistemas nervioso y hepatobiliar
SD
Sensibilización e irritación
El contacto con la piel puede inducir dermatitis y algunos ditiocarbamatos inducen sensibilización
SD
Aberraciones cromosomales
La incidencia media de aberraciones cromosomales en linfositos se incrementa en los trabajadores expuestos profesionalmente a ciertos ditiocarbamatos
SD
Tumores y carcinogenicidad
Trabajadores profesionalmente expuestos a ditiocarbamatos no mostraron incremento en la incidencia de tumores en la tiroides
SD
SD: sin dato
En la Tabla 5 se mencionan los resultados de algunos estudios de bioacumulación
de ditiocarbamatos en animales de laboratorio, los cuales muestran que las
sustancias de este grupo son metabolizadas y/o excretadas con rapidez por los
mamíferos, lo cual disminuye el riesgo de daño a la salud cuando sucede la
exposición a pequeñas dosis de la sustancia.
Primera Parte I-1: Capítulo 3
22
Tabla 5. Bioacumulación de ditiocarbamatos
Órganos afectados
Descripción Reversibilidad Referencias
Sangre, hígado, riñones, intestinos
Ziram: concentración máxima en el hígado (26.6 mg kg-1 de tejido). Al final del primer día, la concentración en los intestinos alcanza un máximo y decrece abruptamente, detectándose 5% del compuesto inalterado en las heces. Glándulas adrenales: 2.4 mg kg-1
Sangre: 2 días Glándulas adrenales: 3 días Bazo: 6 días
International Programme Chemical Safety, 1988; Vekshtein y Khitsenko,1971
El etilen-bis-ditiocarbamato no es inhibidor de la colinesterasa y de la acetaldehído-
deshidrogenasa (Morgan, 1989). La principal vía de exposición del etilen-bis-
ditiocarbamato de sodio es la exposición ocupacional por contacto dérmico en los
lugares donde se utiliza o fabrica la sustancia. Durante el proceso de fabricación se
puede presentar la liberación del compuesto al ambiente. También se puede liberar
esta sustancia en las labores de aplicación cuando se utiliza como fungicida. En un
estudio sobre irritación y sensibilización en humanos se utilizó la prueba
convencional de parche o cojincillo. La prueba consistió en humedecer un cuadro de
algodón con una solución de NABAM (etilen-bis-ditiocarbamato de sodio), colocarlos
a una población de 25 personas sobre la piel del antebrazo para exponerlos a la
solución, 14 días después se repitió el procedimiento en el antebrazo opuesto. En
una segunda prueba el cojincillo permaneció en contacto con la piel durante 48 h. De
los 25 sujetos que recibieron el tratamiento 13 mostraron irritación (eritema leve y
prurito). Cuando se aplicó por segunda ocasión, 18 de los 25 reaccionaron con
eritemas leve a severo, edema y vesiculación, lo cual se interpreta como
sensibilización (WHO, 2012).
El etilen-bis-ditiocabamato se degrada por la luz ya que absorbe luz en la región
ultravioleta del espectro y, por lo tanto, es susceptible a la fotólisis directa de los
rayos del sol (Toxicology Data Network, 2012). También se puede degradar por
humedad y el calor y su principal producto de degradación es el etilen-tiourea (ETU).
Cuando alcanza la atmosfera o atmósfera se presenta en fase particulada pudiendo
ser removido de ella por procesos de depósito o precipitación húmeda o seca
Primera Parte I-1: Capítulo 3
23
(Sanborn, 1977; Tomlin, 2004; WHO, 2012). Por su factor de bioconcentración
(BCF=3) y su valor de partición octanol-agua, que es de log Kow= 4.24, se sugiere
que tiene un bajo potencial de bioacumulación en organismos acuáticos (Meylan y
Howard, 1995).
En un reactor de lodos activados a escala del laboratorio se observó que su
degradación ocurre a una velocidad de 96% por día, lo cual indica que la
biodegradación es un proceso importante de su movimiento en el ambiente
(Toxicology Data Network, 2012).
3.2.3. Los métodos analíticos para su identificación (Nabam)
Se dispone de varios métodos de determinación que permiten la cuantificación de
etilen-bis-ditiocarbamato de sodio en muestras de alimentos y en muestras de agua
(Tabla 6). Algunos de ellos son generales (para el grupo de ditiocarbamatos),
mientras que otros son específicos para algunos de ellos.
Tabla 6. Métodos empleados en el análisis de ditiocarbamatos Técnica Límite de detección / %
de recuperación. Cantidad de muestra
Referencia bibliográfica
Espectrofotométrico 0.1 mg kg-1 /74 a 100% 500 g Crnogorac y Schwack, 2007, 2009
Cromatografía de gases 0.001 mg kg-1 / SD 20 g Crnogorac y Schwack, 2007, 2009
Cromatografía liquida con fotometría para ditiocarbamatos intactos
49 µg L-1 / 90 a 99% SD Crnogorac y Schwack, 2007, 2009
Cromatografía liquida con espectrometría de masas LC- MS2
0.01 mg kg-1 / 79 a 100%
SD Brewin et al., 2008
Método polarográfico 0.02 mg kg-1 / SD SD Brewin et al., 2008 Cromatografía líquida de alta presión (HPLC)
0.01 mg kg-1 / SD SD Gustafsson y Thompson, 1981
SD – sin dato 3.2.4. Aplicación de Nabam en la industria azucarera
En la Tabla 7 se describe la dosificación y la función tecnológica del nabam. La dosis
máxima permisible es 3.0 mg L-1 como sustancia pura, registrada por la FDA en
FDA21CFR173.320(b)2. Si se utilizan en molinos (mil grinding), estrujadores
(crushers) y en los sistemas de difusión en las cantidades indicadas (CFR, 2012).
Primera Parte I-1: Capítulo 3
24
Las cantidades de cada aditivo individual están expresadas en términos de masa de
caña cruda.
Tabla 7. Uso y dosificación del nabam (International Programme Chemical Safety, 1988) Ingrediente activo Función
tecnológica Objetivo de la
aplicación Dosis recomendada
Etilén-bis-ditiocarbamato de
sodio
Plaguicida en alimentos
procesados
Eliminar o reducir la carga microbiana
contaminante
10 a 15 g ton-1 caña molida (10-15 mg L-1)
El producto comercial aplicado en la dosis recomendada en la ficha técnica del
producto, 10 a 15 g ton-1 caña molida (10-15 mg L-1). De acuerdo con el límite
establecido por la US-FDA, 3.0 mg L-1 de nabam con base en caña molida, la
recomendación técnica excede dicho límite. La regulación correspondiente de la US-
FDA (CFR, 2012) indica que el límite se establece para la aplicación de un aditivo
individual. De esta manera, la concentración recomendada por la ficha técnica
rebasaría en cualquier caso (intervalos alto y bajo) para dicho límite. La Comisión
Europea establece límites máximos permisibles para diferentes productos de origen
agrícola; sin embargo, no se contempla el azúcar entre ellos. En la regulación de la
Comunidad Europea (European Commission Regulation No 839, 2008) se
encuentran estos límites pero, específicamente, para caña de azúcar y para miel de
abeja no hay un límite marcado.
3.3. N–metilditiocarbamato de sodio C2H6NS2Na o metam sodio (MS)
Es otro biocida de la familia de los ditiocarbamatos es una sal de sodio de metil-
ditiocarbamato, también conocida como metam sodio (MS). El metam sodio es un
producto químico en estado líquido para la fumigación preventiva de suelos, que se
convierte en el gas isotiocianato de metilo (MITC, por sus siglas en inglés). Este
compuesto en el suelo tiene una movilidad muy alta y es degradado por acción de los
microorganismos (vida media estimada de 0.5 a 50 días). En el agua es eliminado
por hidrólisis, mostrando una vida media de 65 a 178 días a un pH = 7, de 7 a 10
Primera Parte I-1: Capítulo 3
25
días a pH = 10 y de 15 a 67 días a pH = 5. Su potencial de bioconcentración en
organismos acuáticos es bajo (Van Leeuwen et al., 1985).
3.3.1. Función tecnológica
Tiene una amplia gama biocida entre los microorganismos (bacterias, algas, hongos)
encontrados normalmente en molinos y torres de enfriamiento en la industria
azucarera. Por ello es que funciona como sanitizante y controlador de la inversión del
azúcar. Se dosifica en los molinos dependiendo del sistema de imbibición (agua
caliente adicionada al bagazo para disolver el azúcar residual), buscando que el jugo
ya tratado circule por todas las partes de la batería de molinos y sistemas coladores,
si se utiliza en los molinos (mill grinding) y estrujadores (crushers) y en los sistemas
de difusión en concentraciones de 3.5 mg L-1, expresada en términos de masa de
caña cruda o de remolacha cruda (CFR, 2012). Otro de los usos del metam es como
desinfectante, inhibidor de la corrosión, coagulante, agente vulcanizante y fungicida.
Es utilizado en el tratamiento de agua, para la industria del caucho o hule y está
registrado como biocida para aceites de cortes y sistemas acuosos en industrias
como la curtiduría y la fabricación de papel. También se utiliza como microbicida en
pinturas y recubrimientos (Toxicology Data Network, 2012). En todas estas
aplicaciones existe el riesgo de liberación de la sustancia hacia el ambiente a través
de distintas corrientes de desechos.
3.3.2. Estudios toxicológicos
La Tabla 8 muestra los diferentes estudios realizados al metam para determinar su
grado de toxicidad en mamíferos y ambientes acuáticos.
Tabla. 8. Toxicidad (DL50 y CL50) de metam en animales de experimentación Compuesto Especie Dosis Referencia
Rata de experimentación
DL50= 1000 mg kg-1 Lewis (1996)
Ratón de experimentación
DL50= 1500 mg kg-1 Lewis (1996)
Poesilia reticulata CL50= 2.6 mg L-1/ 96 h Verschueren (2001)
Metam
Salmo gairdneri CL50= 6.4 mg L-1/ 60 días Verschueren (2001)
Primera Parte I-1: Capítulo 3
26
En el trabajo de Moriya et al. (1983), se reporta que el metam resultó positivo en los
estudios de mutagenicidad realizados utilizando el ensayo de reversión en sistemas
bacterianos (Bacterial reversion-assay systems) con 5 cepas de Salmonella
typhimurium y una de Escherichia coli.
Cuando ocurre su liberación hacia la atmosfera o atmósfera permanece en fase
particulada en su forma salina y no es volátil. En su fase particulada puede ser
removido de la atmosfera por deposición húmeda o seca. Cuando el metam se libera
en el suelo tiene una gran movilidad debido a que su coeficiente de partición es Koc=
2.2. Su pKa= estimado es de 5.4, lo que indica que este compuesto permanece
principalmente en su forma disociada a los valores de pH normales en los
componentes del ambiente. Su volatilización en los suelos húmedos o secos no es
un destino importante (Toxicology Data Network, 2012).
En un ensayo de biodegradación anaerobia del metam se formaron como producto
de descomposición disulfuro-tetrametil-thiuram y monosulfuro-tetrametil-thiuram
(Toxicology Data Network, 2012).
Bajo los valores normales de pH en el ambiente, el metam permanece en su forma
disociada y, por lo tanto, su movilidad no es un proceso importante por su
volatilización desde el ambiente acuático. La bioconcentración tampoco es un
proceso importante ya que se hidroliza rápidamente bajo condiciones de pH ácido y
también como resultado de su carácter iónico. La vida media del metam por hidrólisis
a pH de 5.0, 7.0 y 9.0 fue de 18 min, 25.9 h y 433.3 h, respectivamente (Toxicology
Data Network, 2012).
Se ha demostrado que la fotólisis en soluciones acuosas y en el suelo es un proceso
de degradación importante para el compuesto relacionado. La exposición
ocupacional a esta sustancia puede ocurrir por inhalación y por contacto dérmico en
los puestos de trabajo donde se fabrica o se manipula. Su manejo es extenso para el
Primera Parte I-1: Capítulo 3
27
tratamiento de agua a escala industrial, para lo cual existen equipos de manejo
mecanizados que minimizan la exposición de los trabajadores a esta sustancia.
3.3.3. Aplicación del metam en la industria azucarera
En la Tabla 9 se detallan la función tecnológica y las cantidades recomendadas.
Tabla 9. Uso y cantidades del metam (International Programme Chemical Safety, 1988) Ingrediente activo Función tecnológica Objetivo de la aplicación Dosis
recomendada Metam Biocida en molinos y
estrujadores Eliminar o reducir la
carga microbiana contaminante
8 a 12 g/L ton de caña molida
3.4. Cloruro de benzalconio (CB) C9H13ClNR
El cloruro de benzalconio es un surfactante catiónico cuya acción biocida se da por la
modificación en la tensión superficial en las superficies que contacta. Este producto
posee un excelente poder tensoactivo, es decir, que al disolverlo en agua se
acumulan en las interfaces superficiales, dando lugar a la característica orientación
del grupo polar. Derivada de esta propiedad hay que resaltar su capacidad para
adherirse a materias sólidas, como el cabello; características que tendrá su
aplicación en la elaboración de productos para el cuidado capilar (Koyama y
Shimazu, 2005).
3.4.1. Función tecnológica
El cloruro de benzalconio y la mayoría de las sustancias cuaternarias son solubles en
agua sin importar su dureza (contenido de sales disueltas). Es incompatible con
jabones y humectantes aniónicos y perfectamente compatible con anfóteros,
detergentes no iónicos y otros tensoactivos catiónicos.
Los componentes de las sales cuaternarias de amonio (QAC, por sus siglas en
inglés) son usados como biocidas, con un amplio espectro antimicrobiano. Son
usados ampliamente en la industria alimentaria, en la textil y en hospitales. Se han
realizado numerosos estudios sobre la síntesis y características antimicrobianas de
Primera Parte I-1: Capítulo 3
28
varias de estas sales cuaternarias y se ha revelado que su acción antimicrobiana en
la pared celular tiene un efecto letal directo o indirecto sobre las células microbianas.
Por lo tanto, se utiliza el CB para la síntesis de nuevos biocidas con características
similares mejoradas, con dobles sales de amonio (bis-QAC) (Maeda et al., 1999).
Dentro de los desinfectantes químicos se encuentran los compuestos de amonio
cuaternario (cloruro de benzalconio, cloruro de alquildimetilbenzilamonio y cloruro de
dodecildimetilamonio), los cuales son ampliamente utilizados como desinfectantes.
Son compuestos que no manchan, son inodoros, no corrosivos y relativamente no
tóxicos. Su acción se atribuye a la inactivación de las enzimas productoras de
energía, desnaturalización de las proteínas celulares esenciales y principalmente por
la ruptura de la membrana celular (Villa, 2008).
El mecanismo de acción germicida se basa en sus propiedades tensoactivas. La
molécula se va uniendo a la pared celular hasta cubrirla por completo, impidiendo el
tránsito de nutrientes entre el microorganismo y el medio hasta el punto de
provocarle la muerte. El sitio principal de acción de estos compuestos parece ser la
membrana celular, donde se absorben y causan cambios en la permeabilidad. Es un
antiséptico eficaz que destruye en pocos minutos a muchas bacterias, hongos
(incluso levaduras) y protozoarios pero no actúa contra virus y esporas (Villa, 2008).
También es usado en investigaciones farmacéuticas donde este surfactante catiónico
se emplea como potenciador o mejorador de permeación para la administración de
fármacos por vía oral, contribuyendo al transporte a través de la membrana con un
comportamiento transcelular (Whitehead y Mitragotri, 2008).
Es utilizado en estudios microbiológicos como agente bactericida catiónico contra
biopelículas bacterianas (Pseudomonas aureoginosas y Staphylococcus aureus) que
son patógenos oportunistas en los seres humanos, especialmente de aquellas
correlacionadas con el uso de dispositivos médicos como catéteres (Campanac et
al., 2002).
Primera Parte I-1: Capítulo 3
29
El efecto de inhibición del cloruro de benzalconio en la proliferación y desarrollo de
especies de hongos contaminantes en alimentos, Aspergillus spp., Penicillum spp.,
Alternaria alternate, también ha sido estudiado in vitro, ya que los microorganismos
pueden formar una biopelícula invisible sobre la superficie de alimentos duros. Por
ello se requiere de un agente desinfectante y esterilizante efectivo, persistente y
durable en la industria alimentaria para todos los productos que están en contacto
con la superficie de los alimentos, incluyendo equipo, utensilios, unidades de
refrigeración, aparatos para empaquetado y distribución de alimentos entre otros
(Basaran, 2011). El cloruro de benzalconio es un desinfectante incoloro e inodoro
comúnmente usado por la industria alimentaria para desinfectar superficies contra un
gran número de microorganismos. El CB es activo a bajas concentraciones,
considerado rápido y de ligera toxicidad en mamíferos (Basaran, 2011). Los
componentes de sales cuaternarias de amonio mostraron la mayor eficacia contra la
infección de Fusarium sp de plantas de plátano que estuvieron expuestas durante 30
segundos. Con una concentración de 0.005 mg mL-1 inhibe in vitro significativamente
el crecimiento de los micelios de A. parasiticus, causante de la contaminación por
aflatoxinas (compuestos cancerígenos probados). Las combinaciones CB+EDTA y
CB+Na2EDTA son más efectivas que el CB (Bazaran, 2011), aunque no es
conveniente usar el EDTA porque se desconoce todavía su posible efecto en los
seres humanos.
Es usado en el aseguramiento de la calidad microbiológica de los vegetales frescos
empleando soluciones del lavado que contienen 0.1 mg mL-1 del cloruro de
benzalconio. Se evaluó para Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, en lechugas y
jitomates contaminados. De la misma forma, se hizo para ácido láctico al 0.2% y para
soluciones acuosas de cloro a 200 mg L-1. Las alteraciones de la apariencia de los
productos fueron evidentes después de 7 días de almacenamiento. Las hojas de
lechuga y los jitomates almacenados a 4°C mostraron características organolépticas
aceptables, excepto para el CB y grupos tratados con acido láctico, que presentan
pequeñas manchas amarillentas en la superficie. Aún así, el CB es uno de los
Primera Parte I-1: Capítulo 3
30
desinfectantes con 4.21 log UFC (unidades formadoras de colonias). Para Yersinia
enterocolitica (Velázquez et al., 2009), su capacidad surfactante le permite penetrar y
adherirse a superficies porosas lo que lo hace eficaz contra organismos Gram
positivo y negativos.
El CB es el preservativo más comúnmente usado para fórmulas oftálmicas en varias
formas y dosificaciones. El nivel de CB utilizado en las preparaciones farmacéuticas
está generalmente en un intervalo de 0.002-0.02%, pero podría ser mayor de 0.2%
en algunos casos, dependiendo de los variados atributos de la formulación oftálmica
(Liu et al., 2009). Como se observa en la Tabla 10 existen varios usos para las
soluciones de cloruros de benzalconio, como desinfectante tópico preoperatorio,
como esterilizante de guantes e instrumentos quirúrgicos, para antisépticos usados
de lentes de contacto y para conservadores de fármacos (Xue et al., 2004).
Tabla 10. Funciones tecnológicas del cloruro de benzalconio (CB) Función tecnológica Cantidad Referencia
Desinfección de la caña de azúcar
Concentración minima inhibitoria = 40 mg L-1
Villa (2008)
Surfactante catiónico para administración de fármacos vía
oral
No aplica
Whitehead y Mitragotri (2008)
Agente bactericida contra biopelículas bacterianas
0.1-5.0/10 mL L-1 Campanac et al. (2002)
Para síntesis de nuevos biocidas
Varias
Maeda et al. (1999)
Desinfectante de alimentos y equipo para su manejo
0.005 mg mL-1 Bazaran (2011) Kröckel et al. (2003)
Velázquez et al. (2009)
3.4.2. Estudios toxicológicos
Se realizó un estudio en ratas macho tipo Wistar para evaluar el efecto irritante del
CB, específicamente posibles lesiones como dermatitis y conjuntivitis como resultado
de la irritación inducida por el cloruro de benzalconio. Se detectó que, a
concentraciones de 0.05-0.10% m/v, induce lesiones en la mucosa de la cavidad
nasal de las ratas. Los resultados se muestran en la Tabla 11 (Kuboyama et al.,
1997).
Primera Parte I-1: Capítulo 3
31
Tabla 11. Estudios toxicológicos del cloruro de benzalconio (CB) Especie Vía de administración Dosis Referencia
Oral DL50: 234 mg kg-1 Xue et al. (2004) Ratas Intravenosa DL50: 14 mg kg-1 Xue et al. (2004)
Citotoxicidad aguda en células
DL50: 6.5x10-5 mg kg-1 Maeda et al. (1999)
Oral Fatal: 100-400 mg kg-1 Xue et al. (2004)
Humano
Intravenosa Fatal: 5-15 mg kg-1 Xue et al. (2004)
Estudios in vitro de genotoxicidad y citotoxicidad de CB en células respiratorias
epiteliales indicaron que causa cambios relevantes en las células respiratorias en las
concentraciones comúnmente empleadas en preparaciones nasales comercialmente
disponibles. El momento de la muerte microbiana cambió dependiendo de la dosis,
con el valor máximo de 0.02% y disminuyó a concentraciones más altas (Deutschle
et al., 2006).
El CB a bajas concentraciones, que son las normalmente utilizadas en productos
conservantes o estabilizantes en la medicina (0.007-0.01%), no se han reportado
casos de intoxicación o envenenamiento. Se han presentado algunas respuestas
alérgicas en soluciones tópicas y locales de la mucosa, causadas por gotas oculares
o aerosoles nasales. La mayoría de los casos de las intoxicaciones ha sido resultado
de la ingesta accidental de productos como detergentes o desinfectantes que
contienen cantidades significativas de CB menores al 10% (Xue et al., 2004). Se han
reportado casos fatales de envenenamiento por cloruro de benzalconio en los cuales
la solución ingerida tenía una concentración de 10%. Como síntomas de intoxicación
pueden mencionarse una sensación punzante o de picor de las membranas mucosas
orales, dolor de garganta, cianosis, convulsiones y, en caso más graves, el coma
(Koyama y Shimazu, 2005).
Existe un caso de envenenamiento reportado, de un hombre de 22 años que tomó
20-100 mL de una solución al 10% de CB mezclado con café. Los síntomas
presentados fueron: presión sanguínea 120/60 mm Hg, 94 pulsaciones por minuto,
temperatura corporal de 36.4°C, 16 respiraciones/minuto, consciente, reacción a la
Primera Parte I-1: Capítulo 3
32
luz. Las concentraciones en suero sanguíneo eran de 52 mg mL-1 en total,
concentraciones en los jugos gástricos de 54.4 µg mL-1 (Koyama y Shimazu, 2005).
Los métodos analíticos para determinar su identidad, pureza y contaminantes se
muestran en la Tabla 12. Una de las razones por las que los datos analíticos del CB
son limitados es su dificultad de ser analizado en material biológico. Existen varios
métodos reportados para determinar CB, por ejemplo: extracción de CB formando
complejos con tintes, pirólisis y subsecuente cromatografía de gases, valoración de
componentes de sales cuaternarias de amonio, espectrometría de masas con
entrada directa y varias técnicas de cromatografía de líquidos de alta resolución
(HPLC, en inglés) para soluciones acuosas no biológicas (Xue et al., 2004).
Tabla 12. Resumen de métodos analíticos para determinar cloruro de benzalconio Técnica Limite de detección Cantidad
de muestra
Referencia
Análisis CG/EM
Para método de exploración: 1-2 ng mL-1
Obtenido por cuantificación de cromatografía de masas: 10ng mL-1
10 µL Koyama y Shimazu (2005)
HPLC La detección fue a longitud de onda de 209 nm
50 µL Liu et al. (2009) Kröckel et al. (2003)
RP-LC 50-150 µg mL-1, longitud de onda 215 nm 50 µL Trivedi y Patel (2010)
LLE-LC-MS/MS
0.6 ng mL-1 para valoración, 4/19 ng L-1 para muestra de agua
10 µL Martinez-Carballo et al. (2007)
Celda de difusión
Longitud de onda, 214 nm Detecta concentraciones entre 1-400 mg L-1
0.1 mL Smith et al. (2002)
Cromatografía de gases (CG)/espectrometría de masas(EM), cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), cromatografía líquida en fase reversa (RP-LC), extracción líquido-líquido (LLE)-cromatografía líquida(LC)-espectrometría de masas(MS)/tandem espectrometría de masas(MS)
3.4.3. Aplicación del cloruro de benzalconio en la industria azucarera
El cloruro de benzalconio es regulado por la Food and Drug Administration, FDA, de
los EEUU y formulado para la industria azucarera en el registro de la FDA y es el 21
CFR Ch Sec. 172.165 (USFDA, 2011). De acuerdo con esta formulación, el aditivo
puede ser agregado en el jugo de caña de azúcar, antes de la clarificación y el
tratamiento del zumo de caña de azúcar debe tratarse como se detalla en la Tabla 13
(CRF, 2012).
Primera Parte I-1: Capítulo 3
33
Tabla 13. Aplicación de cloruro de benzalconio en la industria azucarera (CRF, 2012) Ingrediente
activo Función
tecnológica Operación unitaria en
que se aplica
Objetivo de la aplicación
Dosis recomendada
Cloruro de
benzalconio
Sanitizante y controlador de
la inversión
Molinos
Evitar la formación de residuos gelatinosos
10 a 20 kg por cada 1000 ton de
caña molida
Los productos químicos más comúnmente usados aprobados por la Food and Drug
Administration (FDA) para uso como desinfectante en contacto con la superficie de la
comida, es el cloro, el peróxido de hidrógeno y los componentes de sales
cuaternarias de amonio (Bazaran, 2011).
Utilizado en los molinos (70% dosificación y 30% inicial) se aplica en el proceso de
extracción del jugo, en una dosis de 10-20 mg L-1 / ton de caña molida como
sanitizante y controlador de la inversión límite permitido por la FDA (CFR, 2012)
Es utilizado en la industria azucarera en el área de trituración de la materia prima y
obtención del extracto debido a las ventajas que presenta:
Evita la formación de residuos gelatinosos, que dan lugar a la proliferación de
bacterias en puntos localizados.
Por sus propiedades humectantes y dispersantes, penetra rápidamente
evitando la adherencia de microorganismos al sistema, reduciendo el tiempo
de limpieza en los molinos.
Por su carácter catiónico tiene un poder bactericida mayor que otros productos
similares, dando por resultado una dosificación menor manteniendo más
tiempo su actividad.
De acuerdo con los proveedores, el cloruro de benzalconio puede agregarse al jugo
de forma continua o por choque, en una proporción de 10 a 20 mg L-1 con relación a
la masa de la caña (10-20 kg por cada 1000 ton de caña molida), concentraciones
dentro de lo permitido por la FDA.
Primera Parte I-1: Capítulo 3
34
3.5. Formaldehído, formol o metanal (CH2O)
El formaldehído, por su parte, se utiliza ampliamente como bactericida o
conservador, en la fabricación de ropa, plásticos, papel y tableros. La industria
azucarera lo utiliza para el control de microorganismos contaminantes.
3.5.1. Mecanismo de acción del formaldehído
Su capacidad bactericida se da por su efecto alquilante de los grupos sulfhidrilo,
hidroxilo, carboxilo o amina. Produce hidroximetilaciones o condensaciones
(entrecruzamientos) en las proteínas y en los nitrógenos de los anillos de las bases
púricas, por lo que su espectro es muy amplio (OMS, 1982).
3.5.2. Toxicidad del formaldehído
Es importante destacar que la Agencia Internacional para la Investigación sobre el
Cáncer en sus últimos reportes lo ha clasificado en el grupo 1, carcinógeno
confirmado para humanos. Aún que todavía se utiliza como conservador en la
formulación de algunos cosméticos y productos de higiene personal como champúes,
cremas para baño y sales de yodo para la higiene íntima femenina.
Se está utilizando también en los alisados permanentes del cabello, pero su uso en
estos productos se ha prohibido ya en algunos países debido al alto riesgo para la
salud de quien trabaja con ellos habitualmente (OMS, 1982).
En la Tabla 14 se muestra el resumen de los biocidas en estudio con algunos de sus estudios de toxicidad, fórmula condensada, estructura y No. CAS.
Primera Parte I-1: Capítulo 3
35
Tabla 14. Resumen de los biocidas en estudio
N-metil ditiocarbamato de sodio QZ-881 Mezcla de Etilén-bis-ditiocarbamato de sodio y N-metil ditiocarbamato de potasio
Fórmula condensada: C2H6NS2Na Número CAS: 137-42-8
Fórmula condensada: C4H8N2S4Na2 y C2H6NS2K Número CAS: 142-59-6 y 128-03-0
Nombre del estudio
Animal del estudio
Dosis Referencia Nombre del estudio Animal del estu-dio
Dosis Referencia
Examen patológico
Conejo 0.5-1.5 g/kg
Sheftel (2000) DL50 rata (Etilén bis-ditiocarbamato de sodio)
Rata 210 mg/kg WHO (2012)
Exposición subcrónica o precrónica
Conejo 100 mg/kg
Sheftel (2000) CL50 (Etilén bis-ditiocarbamato de sodio)
Trucha 11ppm EPA-RED (2010)
Efectos tóxicos in vivo
Ratas 2.5 m l/ kg
Dailey (1969) NOEL (N-metil ditiocarbamato de potasio)
Rata 12.5 mg/kg Rodwell (1988)
Neurotoxi- cidad
Conejo 100mg/kg
Stack y Rodricks (1971)
LOEL (N-metil ditiocarbamato de potasio)
Ánade real
12.5 mg/kg Rodwell (1988)
DL50 rata Rata DL50=1000mg/ kg
Lewis (1996)
Primera Parte I-1: Capítulo 3
36
Tabla 14. Resumen de biocidas en estudio (cont.)
Cloruro de benzalconio (CB) Formaldehído ó formina (FA) Fórmula condensada: [C6H5 - CH2N(CH3)2R]+Cl-
Número CAS: 8001-54-5
Fórmula condensada: CH2O Número CAS: 50-00-0
Nombre del estudio
Animal del estudio
Dosis Referencia Nombre del estudio
Animal del estudio
Dosis Referencia
Toxicidad en especies acuáticas
Carpa y pez cebra
500 mg/L Rieger et al. (1980) Exposición aguda
Ratas wistar macho
30 mg/L /6h
Castleman y Ziem (1994)
Toxicidad oral exposición aguda
Ratas 7 mL (al 0.1%) /kg
Walker (2003) Exposición subcrónica
Ratón 40 mg/L /5h
Zhang et al. (2013)
Toxicidad oral exposición aguda
Ratas 5 mL (al 0.13%) /kg
Ferk et al. (2006) Carcinogenicidad ó exposición crónica
Ratón Sol. 10% en agua
IARC (2004)
DL50 oral en ratas
Ratas 400 mg/kg Walker, 2003 Carcinogenicidad ó exposición crónica
Ratas Wistar hem-bra
15 o 82 mg/kg
Til et al., 1989
Toxicidad ocular exposición aguda
Conejos albinos
0.1 mL(al 0.65%) / c/ojo
Walker, 2003 Carcinogenicidad ó exposición
Embriones de ratas
1500 o 1000 mg/L
Soffritti et al., 2002
Primera Parte I-1: Capítulo 4
37
4. Metodología
4.1. Diagrama de flujo
En la Fig. 1 se presenta la estrategia experimental que se siguió para el desarrollo de
esta investigación.
Fig. 1. Desarrollo experimental
Investigación
(Antecedentes) Principales biocidas
en la industria azucarera
Microorganismos en la caña de azúcar
a. Desarrollo del diseño experimental
1
Experimento 1
b. Toma de muestra
c. Inoculación
d. Lectura
e. Selección de colonias y aislamiento
Experimento 2
f. Pruebas preliminares para la identificación
g. Confirmación de
la identificación
i. Pruebas de
eficiencia de los
biocidas
j. Cálculo del % de efecto inhibitorio
k. Análisis estadístico (Statgraphics)
h. Desarrollo del diseño
experimental 2
Primera Parte I-1: Capítulo 4
38
4.2. Material y reactivos
El material y reactivos empleados se presentan en la Tabla 15.
Tabla 15. Reactivos y materiales utilizados
Reactivos y equipo Marca - proveedor-modelo
Agar MRS (De Man, Rogosa y Sharpe) Dibico
Agar M17 (Seg. Terzaghi) Dibico
Agar APT (All Purpose Tween) Dibico
Agua estéril al 0.9% de NaCl PiSA S.A. de C.V.
Cajas Petri de 100 x 15 mm SyM Laboratorios
Asa bacteriológica Veravitrum
Formaldehído (FA) (biocida) J.T. Baker
N-metilditiocarbamato de sodio (MS)
(biocida)
Chem Service S.A. de C.V.
Mezcla QZ-881 (biocida) Zuker S.A. de C.V.
Incubadora a 35°C SEV-BIGM48S
Incubadora a 45°C LUZEREN mod: DHP-9052
Campana de flujo laminar SEV-CFL102
Autoclave AESA mod: CV-250
Equipo de análisis automatizado MS-bioMérieux VITEK 2.0 systems
06.01
Hisopos estériles Industrias Ruisánchez S.A de C.V.
Extractor casero Oster mod. 333-08
Colorante cristal violeta HYCEL de México S.A de C.V.
Safranina HYCEL de México S.A de C.V.
Solución alcohol-cetona al 20% J.T. Baker
Lugol HYCEL de México S.A de C.V.
Tinta china Pelikan
Primera Parte I-1: Capítulo 4
39
4.3. Desarrollo experimental
4.3.1. Diseño experimental
Se inició planteando el diseño experimental, es de tipo factorial considerando tres
factores (a) medio; (b) temperatura y (c) tiempo y tres niveles dando como resultado 33
es decir 27 pruebas las cuales se realizaran por triplicado con un total de
81experimentos
El diseño experimental para determinar el medio de cultivo óptimo para el aislamiento
de Leuconostoc se presenta en la Tabla 16. Los tres factores (a) medio; (b)
temperatura y (c) tiempo y tres niveles dando como resultado un diseño de 33 igual a 27
experimentos que serán repetidos tres veces dando un total de 81 experimentos.
Tabla 16. Diseño experimental 1. Selección del medio de cultivo Niveles
Factores 1 2 3 (a) Medio MRS M17 APT (b)Temperatura (˚C) Ambiente 35 45 (c) Tiempo (horas) 24 48 72
MRS (De Man, Rogosa y Sharpe), M17 (Seg. Terzaghi), APT (All Purpose Tween)
Una vez seleccionado el medio de cultivo se procede a seleccionar la dosis óptima de
inhibición mediante el diseño experimental presentado en la Tabla 17 con 4 factores (a)
biocida, (b) dosis, (c) temperatura y (d) tiempo y tres niveles en cada uno de los
factores dando como resultado un diseño de 34 igual a 81 experimentos con 3
repeticiones dando un total de 243 experimentos.
Tabla 17. Diseño experimental 2. Selección de la dosis óptima
Niveles Factores 1 2 3 (a) Biocida MS QZ FA (b) Dosis A B C (c)Temperatura(˚C) Ambiente 35 45 (d) Tiempo (horas) 24 48 72
MS: ditiocarbamato de sodio; QZ: mezcla QZ-881; FA: Formaldehído; A, B y C son dosis descritas en la Tabla 18
Primera Parte I-1: Capítulo 4
40
Teniendo como base la información bibliografía presentada en la Tabla 18, con los
biocidas más usados en la industria azucarera, así como los intervalos de las dosis
empleadas de cada uno de ellos, se pudieron establecer las dosis de trabajo (A,B,C).
Tabla 18. Biocidas utilizados comúnmente en la industria azucarera
Nombre del biocida Dosis empleada DL50 Referencias Metam (ditiocarbamato de sodio) (MS)
(A) 15-20 mg kg-1 1000 mg kg-1 oral en ratas
Bonilla-Vidal (2013)
Mezcla QZ o QZ-881 (Etilénbisditiocarbamato de sodio y N-metil ditiocarbamato de potasio)
(B) 15-20 mg kg-1 210 mg/kg oral en ratas
Villa (2008)
Formaldehído (FA) (C) 2-5mg kg-1 100 mg kg-1, oral en ratas
OMS (1982)
4.3.2. Toma de muestra
Para la obtención de la muestra se molió caña de azúcar proveniente de un ingenio
azucarero cooperante del Estado de Veracruz, México (Fig. 2). La caña se lavó y secó
envolviéndola en papel periódico para su conservación en un cuarto frío a 4°C hasta su
uso (Fig. 3). Posteriormente, se llevó a cabo la molienda (Fig. 4), para la extracción del
jugo de la caña con ayuda de un extractor casero (Oster mod. 333-08). El jugo fue
colectado en un recipiente estéril de 250 cm3 obteniendo aproximadamente 300 mL de
jugo de caña a partir de 1 kg de caña de azúcar.
Fig. 2. Ingenio azucarero Fig. 3. Caña lavada Fig. 4. Molienda de la caña
Primera Parte I-1: Capítulo 4
41
4.3.3. Inoculación
La inoculación se hizo mediante el método de siembra en superficie en placas Petri,
para lo cual cada muestra de jugo fue diluida en agua peptonada al 0.1% (Merck) hasta
una dilución de10-4. Se inocularon 0.1 cm³ en tres diferentes medios: el MRS (De Man,
Rogosa y Sharpe), el M17 (Seg. Terzaghi) y el APT (All Purpose Tween). Se optó por
usar la técnica de estriado en cuadrante radial (Figs. 5a y b) debido a que dicha técnica
ayuda a generar colonias aisladas y así poder facilitar el estudio de las características
morfológicas para la identificación una posterior (Ramírez-Gama et al., 2008).
a b Figs. 5 a y b. Técnica de estriado en cuadrante radial
4.3.4. Lectura
Posterior a la incubación, se realizaron las observaciones de cada placa a las 24, 48 y
72 horas. Las incubadoras utilizadas fueron la SEV-BIGM48S a temperatura de 35°C y
la LUZEREN mod: DHP-9052 a una temperatura de 45°C.
4.3.5. Selección y aislamiento de colonias bacterianas para la identificación
Se llevó a cabo una selección preliminar de patrones de colonias según sus
características morfológicas, eligiéndose el medio en el cual la bacteria se encuentre en
mayor abundancia.
4.3.6. Pruebas preliminares (características morfológicas y bioquímicas) para identificación del género Leuconostoc
Dicha preselección se sometió a una serie de pruebas afines a la identificación del
género Leuconostoc como son: Tinción de Gram, tinción de cápsula, características
macroscópicas de colonia agrupación y prueba de catalasa.
Primera Parte I-1: Capítulo 4
42
4.3.7. Confirmación de la identificación
A partir de las colonias que coincidan con el perfil bioquímico se analizaron las
muestras de colonias para su identificación mediante el sistema de microbiología
automatizada VITEK 2.
4.3.8. Selección del medio de cultivo
Fue realizada una revisión de la bibliografía en la cual se obtuvo información para el
aislamiento de Leuconostoc mesenteroides, las técnicas que se emplean y los múltiples
medios utilizados para su crecimiento (Cuervo-Mulet et al., 2010; Erten, 1998; Hemme
y Foucaud-Scheunemann, 2004). En la Tabla 19 se muestran los medios de cultivo
seleccionados para la realización de las pruebas.
Tabla 19. Selección de medios de cultivos para el aislamiento de
Leuconostoc mesenteroides Medio de
cultivo Características Imagen
MRS*
El polisorbato 80, el magnesio y manganeso actúan favoreciendo el crecimiento óptimo de los lactobacilos y biodegradadores de lactosa. La dextrosa es la fuente de energía. El fosfato de sodio ayuda a controlar el pH. El acetato de sodio junto con el valor del pH del medio de cultivo inhibe considerablemente la flora acompañante
APT*
Para cultivo, aislamiento y cuenta de organismos lactobacilos “heterofermentativos”2 y otros microorganismos exigentes que requieren de un alto contenido de tiamina, a partir de diversas muestras
M17*
El glicerofosfato de sodio aumenta la capacidad de mantener el equilibrio de los iones hidrógeno, favoreciendo el crecimiento de organismos “heterofermentativos” lácticos. La lactosa es la fuente de energía
* Medios adicionados con vancomicina para una mayor selectividad del género Leuconostoc mesenteroides
2 La fermentación fue estudiada por Pasteur, quien le dio este nombre a la bioconversión anaerobia de glucosa a
alcohol etílico y dióxido de carbono por Saccharomyces cerevisiae. Por ello, cualquier otra bioconversión NO es una fermentación sino una biorreacción
Primera Parte I-1: Capítulo 4
43
4.3.9. Diseño experimental 2
Como se mencionó antes (Tablas 17,18), este diseño es de tipo factorial considerando
cuatro factores (a) biocida; (b) temperatura, (c) tiempo y (d) dosis, con tres niveles
dando como resultado 34 es decir 81 pruebas las cuales se realizaron por triplicado con
un total de 243 experimentos.
4.3.10. Prueba de eficiencia de los biocidas
Para determinar la susceptibilidad de cada cepa a los biocidas seleccionados (Tabla
14), se utiliza como guía el “Método estandarizado de prueba de susceptibilidad por
disco, versión 8” de la Sociedad Británica de Quimioterapia Antimicrobiana (Bell et al.,
2009) con algunas modificaciones y variando la dosis según la revisión bibliográfica. El
método se denominaba originalmente CDS por sus siglas en inglés (Calibration
Dichotomous Susceptibility). El método propuesto consiste en lo siguiente:
(1). Distribuir 20 mL de agar en placas de Petri de 90 mm de diámetro
(2). Almacenar placas de agar a una temperatura de 2 a 8°C durante un máximo de 4
semanas en recipientes sellados, bolsas de plástico o celofán. Las placas deben
estar completamente secas y, en caso contrario, esperar que se sequen antes de
ser usadas
(3). Utilizando un espectrofotómetro preparar una suspensión en solución salina 0.9%
para alcanzar una turbidez cuyos valores de absorbancia se encuentren entre una
longitud de onda de 0.15 a 640 nm, correspondiente a una curva estándar de 0.5
McFarland, para ello fue necesario seguir el procedimiento propuesto por Bell et al.
(2009):
(a). Diluir la suspensión 1:5 (1 parte de suspensión y 4 partes de solución salina)
en solución salina normal para obtener la suspensión de CDS
(b). Con un asa recta tomar una colonia cuyo diámetro se encuentre entre 1 y
2mm, la masa bacteriano debe ser visible en la punta del alambre recto
(c). Inocular el material bacteriano en 15 mL de solución salina contenida en un
tubo de cultivo, haciendo girar el alambre recto al menos 10 veces con la punta en
contacto con la parte inferior del tubo
Primera Parte I-1: Capítulo 4
44
(d). Mezclar la solución salina mediante agitación al menos 10 veces
(e). Una vez que se tenga la suspensión de bacterias al 0.5 McFarland con ayuda
de una pipeta Pasteur distribuir la suspensión en la placa Petri y retirar el exceso
con la misma pipeta Pasteur
(4). Esterilizar las pinzas de punta roma con alcohol y a la flama del mechero y en
condiciones de asepsia (cámara de flujo laminar), tomar un disco de papel filtro e
impregnarlo con el agente químico a probar: Metam sodio, MS, mezcla de etilén
bis-ditiocarbamato de sodio con N-metil ditiocarbamato de potasio, QZ,
formaldehído, FA, cloruro de benzalconio, CB, a diferentes dosis, eliminando el
exceso por escurrimiento. Depositar el disco sobre el agar presionando ligeramente
sobre la superficie. Repetir este paso para cada uno de los agentes químicos a
evaluar.
4.3.11. Cálculo del porcentaje de efecto inhibitorio
El porcentaje de efecto inhibitorio es el resultado de un halo de inhibición de un agente
químico de prueba comparado con otro agente químico o control, cuyo poder biocida es
conocido. La ecuación (1) que se utiliza para calcular el % de efecto inhibitorio fue
propuesta por Gamazo et al. (2010):
(1)
4.3.12. Análisis estadístico final
Con los resultados del primero, segundo y tercer diseño experimental se utilizará un
programa estadístico llamado STATGRAPHICS CENTURION XV.II para facilitar el
tratamiento de los datos y determinar si existe diferencia entre los factores utilizados en
los diseños experimentales.
Primera Parte I-1: Capítulo 5
45
5. Resultados y discusión
5.1. Pruebas presuntivas (características morfológicas y bioquímicas) para la identificación del organismo Leuconostoc mesenteroides
En la Tabla 20 se muestran las características de las colonias que se desarrollaron en
los medios seleccionados.
Tabla 20. Observaciones para la identificación presuntiva de Leuconostoc mesenteroides
Medio de
cultivo
No. colonia
Características macroscópicas de colonia
Gram
Cápsula
Agrupación
Catalasa
MRS
1
Forma circular, superficie lisa, traslucida, color crema, consistencia viscosa, elevación convexa y borde entero
+
+
Cocobacilos agrupadas en
pares
-
MRS
2
Forma puntiforme, superficie lisa, color blanco, consistencia viscosa, elevación convexa y borde entero
+
-
Bacilos agrupadas en
cadenas cortas
-
M17
3
Forma circular, superficie lisa, traslucida, color gris, consistencia viscosa, elevación convexa y borde entero
+
+
Cocobacilos agrupadas en
cadenas cortas
-
M17
4
Forma irregular, superficie lisa, traslúcida, color amarilla, consistencia viscosa, elevación convexa y borde ondulado
+
-
Cocos agrupadas
+
APT
5
Forma circular, superficie lisa, traslúcida, color crema, consistencia viscosa, elevación convexa y borde entero
+
+
Cocobacilos agrupadas en
pares y cadena corta
-
Las pruebas se realizaron a temperatura ambiente y destacan las colonias número 1, 3
y 5 mostrando características típicas de Leuconostoc mesenteroides sp como la
agrupación en cocobacilos en cadenas cortas, gram (+), formación de cápsula y la
prueba de catalasa (-) debido a que no puede degradar el peróxido de hidrógeno por la
falta de la enzima catalasa (Erten, 1998; Hemme y Foucaud-Scheunemann, 2004). Las
imágenes de las pruebas presuntivas se observan en la Figs. 6 a 8.
Estas pruebas son presuntivas debido a la complejidad del microorganismo, por lo cual
se necesitaron más pruebas bioquímicas para tener una mayor certeza. Para ello se
Primera Parte I-1: Capítulo 5
46
realizaron pruebas con el sistema de identificación de microbiología automatizado
VITEK 2.
Fig. 6. Tinción de Gram y agrupación
Fig. 7. Tinción de cápsula Fig. 8. Prueba de catalasa
5.2. Confirmación de la identificación
El sistema VITEK 2 es un sistema de microbiología automatizada utilizando la
tecnología basada en los requerimientos para el desarrollo que tiene cada
microorganismo.
Dicho sistema se ayuda acomodando y depositando simultáneamente un inóculo en
tarjetas de reactivo colorimétrico que se incuban y se leen de forma automática.
Esto provoca una serie de resultados que son comparados con la base de datos del
sistema VITEK 2 (Figs. 9, 10) para arrojar un dictamen de identificación y probabilidad
de un microorganismo (Pincus, 1998).
En la Tabla 21 se muestran los resultados de las pruebas.
Puede verse que son bastante concluyentes por el alto porcentaje de confiabilidad que
muestra el estudio con la confirmación de la obtención del aislamiento de Leuconostoc
mesenteroides ssp.
Primera Parte I-1: Capítulo 5
47
Fig. 9. Equipo VITEK 2 Fig. 10. Tarjetas de reactivo colorimétrico
Tabla 21. Resultados del análisis automatizado de identificación microbiológica VITEK 2
Información de
identificación
Tipo de tarjeta:
GP
Fecha de análisis:
04-Abr-2014
Tiempo de
análisis:
6 horas
Organismo
seleccionado
Leuconostoc
mesenteroides ssp
cremoris
Nivel de confianza:
Identificación muy
buena
Probabilidad:
95%
Perfil típico
contraindicante
B GAL(76) D MAL(20) B ALO(76)
Donde: B GAL = galactosa, D MAL = maltosa y B ALO = alosa
5.3. Análisis estadístico del diseño experimental 1
Una vez realizados todas las pruebas del diseño experimental 1 con las características
mostradas en la Tabla 16. Los resultados obtenidos fueron tratados mediante el
programa estadístico Statgraphics Centurion XV.II. En primer término el factor de
mayor influencia en el experimento es el medio de cultivo>el tiempo>combinación
tiempo-medio y finalmente la temperatura como se muestra en la Fig.11. En la Tabla 22
el análisis de varianza, ANDEVA (ANDEVA, en inglés) reparte la variabilidad de
número de colonias en piezas separadas para cada uno de los efectos. Se prueba la
significancia estadística de cada efecto comparando su cuadrado medio contra un
Primera Parte I-1: Capítulo 5
48
estimado del error experimental. En este caso, tres efectos el medio, el tiempo y el
medio-tiempo (variables) tienen una valor-P menor que 0.05, indicando que son
significativamente diferentes de cero con un nivel de confianza del 95.0% y por lo tanto
afectan significativamente la respuesta (número de colonias).
0 2 4 6 8 10
Efecto estandarizado
BC
AB
B:Temperatura
AC
C:Tiempo
A:Medio +-
Fig.11. Diagrama de Pareto estandarizado: Efecto de los parámetros en estudio
Tabla 22. Análisis de varianza, ANDEVA, para el número de colonias
Fuente Suma de cuadrados
Gl Cuadrado medio
Razón-F
Valor-P
A:Medio 3634.24 1 3634.24 283.59 0.00 B:Temperatura 48.1667 1 48.17 3.76 0.06
C:Tiempo 1688.96 1 1688.96 131.79 0.00
AB: Medio-Temperatura 36.0 1 36.0 2.81 0.10
AC: Medio-Tiempo 312.11 1 312.11 24.35 0.00
BC: Temperatura-Tiempo
2.78 1 2.78 0.22 0.64
Error total 909.88 71 12.82
Total (corr.) 10449.80 80 Gl: Grados de libertad
Primera Parte I-1: Capítulo 5
49
5.3.1. Selección del medio de cultivo
Se llevó a cabo el análisis de los datos para la obtención del medio óptimo para el
crecimiento de Leuconostoc mesenteroides bajo las condiciones establecidas. Los
resultados muestran que el medio de cultivo sí tiene un efecto significativo en el
número de colonias (Tabla 23, Fig. 12), los resultados muestran que estadísticamente
el agar M17 es menos efectivo para el aislamiento de Leuconostoc mesenteroides por
lo cual los medios MRS (Man Rogosa y Sharpe) y APT son las opciones adecuadas ya
que no existe diferencia significativa entre ellos.
Tabla 23. Efecto del medio de cultivo
Medio Recuento Prome-dio
Desviaciónestándar
Coeficien-te de
variación %
Mínimo Máximo Rango Sesgo estándar
1(MRS) 27 26.30 10.45 39.73 11.0 44.0 33.0 0.69 2 (APT) 27 23.96 9.88 41.19 11.0 43.0 32.0 1.51 3 (M17) 27 9.89 5.63 56.95 2.0 22.0 20.0 1.49 Total 81 20.05 11.43 57.01 2.0 44.0 42.0 2.08
5.3.2. Selección la temperatura de trabajo
Según el análisis estadístico no existe diferencia significativa en las temperaturas
propuestas de ambiente (20±5°C), 35°C y 45°C (Tabla 24, Fig. 13,) por lo cual se
puede trabajar en cualquiera de ellas sin afectar el desarrollo de las colonias.
Tabla 24. Efecto de la temperatura
Temperatu-ra
Recuen-to
Prome-dio
Desvia-ción
estándar
Coeficien-te de
variación
Mínimo Máximo Rango Sesgo estándar
20±5°C 27 16.59 9.27 55.92% 4.0 35.0 31.0 0.97 35°C 27 28.85 11.72 40.63% 10.0 44.0 34.0 -0.16 45°C 27 14.70 7.47 50.81% 2.0 27.0 25.0 -0.15 Total 81 20.04 11.42 57.44% 2.0 44.0 42.0 2.08
Primera Parte I-1: Capítulo 5
50
5.3.3. Selección del tiempo de análisis
Los resultados muestras que el tiempo sí tiene un efecto significativo en el número de
colonias (Tabla 25 y Fig. 14).
Tabla 25. Efecto del tiempo
Tiempo Recuento Promedio Desviación estándar
Coeficien-te de
variación %
Mínimo Máximo Rango Sesgo estándar
24 h 27 13.85 6.98 50.40 3.0 30.0 27.0 1.55 48 h 27 21.25 12.10 56.95 2.0 42.0 40.0 0.47 72 h 27 25.03 11.80 47.14 7.0 44.0 37.0 0.49 Total 81 20.04 11.42 57.00 2.0 44.0 42.0 2.08
1
2
3
0 10 20 30 40 50
Número de Colonias
Med
io
25
35
45
0 10 20 30 40 50
Número de Colonias
Tem
pera
tura
24
48
72
0 10 20 30 40 50
Número de Colonias
Tie
mp
o
Fig. 12. Gráfica de cajas y bigotes para el número de
colonias versus medio
Fig. 13. Gráfica de cajas y bigotes para el número de
colonias versus temperatura
Fig. 14. Gráfica de cajas y bigotes para el número de
colonias versus tiempo
Como se observa en la Fig. 15, para el factor del medio de cultivo, el medio MRS (1) es
el que da mejores resultados debido a un mayor desarrollo de colonias, seguido muy
de cerca del medio APT (2), pero no existe diferencia significativa entre ellos (p<0.05),
es decir, que se puede emplear cualquiera de los dos medios.
Para el factor temperatura es claramente favorecedora la opción de los 35°C lo cual es
adecuado ya que al ser un microorganismo mesófilo, esta temperatura está muy
cercana a la óptima de proliferación (Cuervo-Mulet et al., 2010). El factor tiempo tiene
un comportamiento exponencial por lo que la mayor respuesta se da en un tiempo de
Primera Parte I-1: Capítulo 5
51
72 horas, existiendo diferencia significativa con respecto al de 24 horas (p<0.05). El
caso contrario ocurre con el tiempo a 48 horas ya que no hay diferencia significativa.
Donde: 1=MRS; 2=APT; 3=M17
Fig. 15. Resultados de los parámetros de diseño
5.4. Diseño experimental 2 (optimización de las dosis)
Los resultados obtenidos de dicho experimento se basaron en las características ya
establecidas en la Tabla 17 que contiene el diseño experimental 2 para selección de la
dosis óptima de biocida.
5.4.1. Análisis del biocida metam sodio (MS)
En la Fig. 16 se muestran los promedios de los resultados de cada una de las dosis
para el metam sodio (MS). Los halos de inhibición que manifestaron con el metam
fueron similares en sus 3 dosis. Se debe tomar en cuenta que la dosis más baja
presenta un halo de inhibición mínimo ya que el promedio de sus resultados fueron de
6 mm de inhibición, misma longitud que el diámetro de los discos utilizados para el
experimento.
Primera Parte I-1: Capítulo 5
52
Fig. 16. Promedio de los resultados de la inhibición a diferentes dosis de metam sodio (MS)
En el análisis estadístico con la gráficas de cajas y bigotes en la Fig. 17 se observó que
la dosis a 20 mg L-1 da la mayor respuesta a diferencia de las de 10 y 15 mg L-1 que no
tienen diferencia significativa entre ellas (p<0.05).
En el factor del tiempo, en la Fig. 18 se mostró que, a 24 horas, tiene un efecto mayor
ya que a 48 y 72 horas no existe diferencia significativa. Para el factor temperatura, se
manifestó un mayor efecto a 25°C mientras que a las temperaturas de 35 y 45°C no se
observaron diferencias significativas (Fig. 19).
10
15
20
6 6.4 6.8 7.2 7.6 8
Halo inhibición
dosi
s
24
48
72
6 6.4 6.8 7.2 7.6 8
Halo inhibición
Tie
mpo
25
35
45
6 6.4 6.8 7.2 7.6 8
Halo inhibición
Tem
pera
tura
Fig. 17. Gráfica de cajas y bigotes para el halo de inhibición versus dosis del metam sodio
Fig. 18. Gráfica de cajas y bigotes para el halo de inhibición versus tiempo del metam sodio
Fig. 19. Gráfica de cajas y bigotes para el halo de inhibición versus la temperatura del metam sodio
Primera Parte I-1: Capítulo 5
53
5.4.2. Análisis de la mezcla de etilén bis-ditiocarbamato de sodio y de N-metil
ditiocarbamato de potasio (QZ)
Para el QZ, que es una mezcla de ditiocarbamatos, los resultados se muestran en la
Fig. 20. Se utilizaron las dosis recomendadas por el fabricante del producto.
Respecto del análisis estadístico, las dosis de 20 y 15 mg L-1 (Fig. 21) no muestran
diferencia significativa. Sin embargo, la dosis de 10 mg L-1 sí muestra diferencia
estadística (p<0.05), ya que efecto es mucho menor con respecto a las otras dosis
manejadas.
En la Fig. 22 se observa el factor del tiempo sobre el QZ y se observó un
comportamiento similar al del metam sodio (Fig. 18) ya que el tiempo con mayor efecto
fue de 24 horas mostrando diferencia significativa con 48 y 72 horas que no son
distintos estadísticamente. En la temperatura, el último factor sobre la mezcla QZ, se
observó que a 45°C tiene un efecto menor y que a temperatura ambiente (20±5°C) y
35°C no existe diferencia significativa (p<0.05) por lo que es indistinto usarlo a esas
temperaturas (Fig. 23).
Fig. 20. Promedio de los resultados de la inhibición a diferentes dosis de la
mezcla QZ
Primera Parte I-1: Capítulo 5
54
10
15
20
6 7 8 9 10
Halo inhibición
dosi
s
24
48
72
6 7 8 9 10
Halo inhibición
Tie
mpo
25
35
45
6 7 8 9 10
Halo inhibición
Tem
pera
tura
Fig. 21. Gráfica de cajas y bigotes para el halo de inhibición versus la dosis de la mezcla QZ
Fig. 22. Gráfica de cajas y bigotes para el halo de inhibición versus tiempo de la mezcla QZ
Fig. 23. Gráfica de cajas y bigotes para el halo de inhibición versus la temperatura de la mezcla QZ
5.4.3. Análisis del formaldehído (FA)
El formaldehído (FA) mostró un comportamiento diferente debido a que sus resultados
fueron más eficientes, como puede observarse en la Fig. 24. En las tres dosis supera
por mucho el poder inhibitorio de los 2 anteriores (metam sodio y la mezcla de
ditiocarbamatos). A pesar de utilizar una dosis menor, su potencia y eficiencia como
biocida es muy evidente, mostrando el más alto efecto inhibitorio la dosis de 5 mg L-1
que resultó con un promedio de 10.85 mm de halo de inhibición. Respecto del análisis
estadístico para el factor de la dosis sobre el formaldehído sí existe diferencia
significativa entre las dosis empleadas por lo que no son indistintas las dosis para la
inhibición de Leuconostoc mesenteroides (Fig. 25). El tiempo es un factor que según el
análisis estadístico (Fig. 26) no muestra diferencia significativa en sus 3 niveles (24, 48
y 72 horas). El factor de la temperatura sobre el formaldehído se observó en la Fig. 27
que no existe diferencia significativa, por lo que su uso como biocida es similar a
temperatura ambiente (20±5°C), 35° y 45°C.
5.5. Efecto inhibitorio del diseño experimental 2
Se tomó en cuenta como referencia o biocida control al formaldehído, ya que es el más
eficiente de los tres biocidas probados hasta el momento además de que su efecto
inhibitorio está demostrado, pero debido a sus efectos adversos al ambiente y su
Primera Parte I-1: Capítulo 5
55
toxicidad hacia los humanos no puede ser utilizado como biocida en alimentos para
humanos, (OMS, 1982).
Fig. 24. Promedio de la inhibición a diferentes dosis de formaldehído
2
3
5
6 7 8 9 10 11
Halo inhibición
Dos
is
24
48
72
6 7 8 9 10 11
Halo inhibición
Tie
mpo
25
35
45
6 7 8 9 10 11
Halo inhibición
Tem
pera
tura
Fig. 25. Gráfica de cajas y bigotes para el halo de inhibición versus la dosis para el formaldehído
Fig. 26. Gráfica de cajas y bigotes para el halo de inhibición versus el tiempo para el formaldehído
Fig.27. Gráfica de cajas y bigotes para el halo de
inhibición versus la temperatura para el
formaldehido
La exposición frecuente a este compuesto puede provocar una verdadera reacción
alérgica cutánea e incluso en exposiciones crónicas provoca sensibilización inmuno-
mediada y efectos cancerígenos (Castleman y Ziem, 1994; IARC, 2004; Soffritti et al.,
2002; Til et al., 1989; Zhang et al., 2013).
Primera Parte I-1: Capítulo 5
56
La dosis de 5 mg L-1 del formaldehído manifestó el mejor promedio inhibitorio por lo que
se optó para que fuera utilizada como la dosis control de biocida para el cálculo del
porcentaje de efecto inhibitorio de los biocidas en estudio (Tabla 26 y Fig. 28). Un
ejemplo de cálculo se muestra a continuación:
= 55.30% respecto del formaldehído (5 ppm)
Los porcentajes entre las dosis del metam sodio y la mezcla de ditiocarbamatos (QZ)
son muy similares, con una leve tendencia de superioridad por parte de la mezcla de
diotiocarbamatos (Fig. 28), aunque al hacer el análisis estadístico como se muestra en
la Fig. 29 no se observa una diferencia estadísticamente significativa (p<0.05) entre la
mezcla y el metam sodio para inhibir a Leuconostoc mesenteroides.
Los resultados en la Tabla 26 indican que la mezcla de ditiocarbamatos y el metam
sodio a estas dosis no son efectivos como biocidas si se les compara con el
formaldehído debido a que no superan o igualan el 100% del efecto inhibitorio. Sus
valores son menores a dicha cantidad por lo que es necesario aumentar las dosis para
obtener una inhibición efectiva similar a la del mejor parámetro (formaldehído).
Tabla 26. Efecto inhibitorio del metam sodio y la mezcla de ditiocarbamatos (QZ) en porcentaje
Biocida/ dosis
Diámetro promedio del halo de inhibición (mm)
Efecto inhibitorio (%)
METAM 10 ppm 6 55.30 METAM 15 ppm 6.18 56.96 METAM 20 ppm 6.47 59.63
QZ 10 ppm 6.25 57.60 QZ 15 ppm 6.37 58.71 QZ 20 ppm 7.25 66.82
Primera Parte I-1: Capítulo 5
57
Fig. 28. Efecto inhibitorio del metam sodio y la mezcla de ditiocarbamatos en %
Fig. 29. Gráfica de cajas y bigotes para el % del efecto inhibitorio versus biocidas (metam sodio versus mezcla de ditiocarbamatos)
METAM
Mezcla QZ
Gráfico de Caja y Bigotes
55 65 75 85 95 % efecto inhibitorio
Biocida
Primera Parte I-1: Capítulo 5
58
5.6. Último diseño experimental (metam sodio versus mezcla de
ditiocarbamatos versus cloruro de benzalconio)
En un último diseño de experimentos similar a los anteriores (Tablas 16, 17), como se
muestra en la Tabla 27, se utilizaron nuevas variables, adicionando al cloruro de
benzalconio como biocida control, ya que según lo encontrado en la literatura ha
mostrado un excelente efecto biocida y su baja toxicidad en humanos está
comprobada. Esto podría hacer de él una opción a tomar en cuenta para esta
investigación.
Se demostró en los apartados anteriores que el factor de la temperatura de
experimentación sí afecta significativamente por lo que se optó por aumentar las
temperaturas de trabajo para simular un ambiente real de trabajo en un ingenio
azucarero del estado de Veracruz que maneja alrededor de 50°a 60°C al interior del
ingenio en las etapas de proceso mencionadas.
Finalmente, el tiempo según los análisis estadisticos realizados no es un factor que
afecte significativamente debido a la rápida degradación de los biocidas, por lo que se
optó por utilizar 24 h para este último experimento.
Tabla 27. Último diseño experimental con metam sodio versus la mezcla de ditiocarbamatos versus el cloruro de benzalcanio
Niveles
Factores 1 2 3
(a) Biocida MS QZ CB
(b) Dosis A B C
(c)Temperatura(˚C) 35 45 55
MS: metil-ditiocarbamato de sodio o metam sodio; QZ: Q-881(Mezcla); CB: cloruro de benzalconio; A, B y C representan las dosis descritas en la Tabla 28
Las dosis del metam sodio y de la mezcla de ditiocarbamatos que se muestran en la
Tabla 28 son dosis mayores que las del experimento 1 (Tabla 18) debido a que los
resultados reportados en la Tabla 26, no fueron satisfactorios para la obtención del
100% de efecto inhibitorio. Se destaca que las dosis empleadas en este tercer y último
experimento son superiores a los limites reportados por la US-FDA (CFR, 2012) para el
Primera Parte I-1: Capítulo 5
59
caso del metam sodio, de 3.5 mg kg-1, y de la mezcla de etilén bis-ditiocarbamato de
sodio y N-metil ditiocarbamato de potasio, de 3.0 mg kg-1 y 3.5 mg kg-1,
respectivamente.
Las dosis del cloruro de benzalconio están dentro de los límites permitidos por la Food
and Drug Administration de los EEUU (USFDA, 2011) que, para su uso en jugo de caña
azucarera, son de 10-20 mg kg-1.
Tabla 28. Dosis de los biocidas para el último diseño experimental
Nombre del biocida Dosis a emplear
DL50 Referencias
Metam (ditiocarbamato de sodio) (MS)
(A) 30-50 mg/kg 1000 mg kg-1 oral en ratas
Bonilla-Vidal (2013)
Mezcla QZ-881 (etilénbisditiocarbamato de sodio y N-metil ditiocarbamato de potasio)
(B) 30-50 mg/kg 210 mg kg-1 oral en ratas
Villa (2008)
Cloruro de benzalconio (CB)
(C) 10-20 mg/kg 234 mg kg-1 oral en ratas
Xue et al. (2004)
5.6.1. Análisis estadístico del metam sodio para el último diseño experimental
En la Fig. 30 se muestra el promedio de la inhibición de las 3 dosis de metam sodio
utilizadas en el último experimento (Tabla 28). La imagen de los halos producidos por el
efecto inhibitorio se observan en la Fig. 33.
Los halos que se encontraron como respuesta inhibitoria (Fig. 31) demuestran que las
dosis de 30 y 40 mg L-1 no muestran diferencia significativa comparadas con la dosis
más alta (50 mg L-1) que sí indica una diferencia estadisticamente significativa.
En cuanto a la variable de la temperatura, el metam sodio se vio afectado
significativamente ya que mostró un mayor efecto biocida a la temperatura de 35°C
seguida de los 45°C para dejar en último lugar con un menor efecto a la temperatura de
55°C, lo que demuestra que a temperaturas altas se degrada el metam sodio y tiene
menor efecto sobre los microorganismos (Fig. 32).
Primera Parte I-1: Capítulo 5
60
Fig. 30. Promedio de la inhibición a diferentes dosis de metam sodio
30
40
50
0 10 20 30 40
Halo de inhibición
Met
am
35
45
55
0 10 20 30 40
Halo de inhibición
Tem
pera
tura
Fig 31. Gráfica de cajas y bigotes para el halo de inhibición versus la dosis del metam sodio en el último experimento
Fig. 32. Gráfica de cajas y bigotes para el halo de inhibición versus la temperatura del metam sodio en el último experimento
Primera Parte I-1: Capítulo 5
61
Fig. 33. Halo de inhibición del metam sodio
5.6.2. Análisis estadístico de la mezcla del etilén bis-ditiocarbamato de sodio y del N-metil ditiocarbamato de potasio en el último diseño experimental
Para el caso de la mezcla de ditiocarbamatos (QZ) la Fig. 34 muestra los promedios
que resultaron de las 3 diferentes dosis que se emplearon en el último diseño
experimental.
Fig. 34. Promedio de la inhibición a diferentes dosis de la mezcla de ditiocarbamatos
Primera Parte I-1: Capítulo 5
62
El análisis estadistico de la dosis se representa con la gráfica de cajas y bigotes (Fig.
35) en la que se muestra un comportamiento similar a los resultados del análisis del
metam sodio ya que las dos primeras dosis (30 y 40 mg L-1) no presentan diferencia
significativa (p0.05) y la dosis de 50 mg L-1 es la que tiene un mayor efecto biocida y
muestra diferencia significativa.
El QZ, al ser una mezcla de ditiocarbamatos, tiene un comportamiento similar al metam
sodio, incluso frente a altas temperaturas, ya que según la Fig. 36, la gráfica de cajas y
bigotes del halo de inhibición contra la temperatura, la mezcla de ditiocarbamatos
también se degrada y tiene un menor efecto a la temperatura de 55°C, dando una
mejor respuesta inhibitoria a las temperaturas de 35°C y 45°C. La imagen de los halos
producidos por el efecto inhibitorio se observan en la Fig. 37.
30
40
50
0 10 20 30 40
Halo de inhibición
Zuk
er
35
45
55
0 10 20 30 40
Halo de inhibición
Tem
pera
tura
Fig. 35. Gráfica de cajas y bigotes para el halo de inhibición versus la dosis de la mezcla QZ para el último experimento
Fig. 36. Gráfica de cajas y bigotes para el halo de inhibición versus la temperatura de la mezcla QZ para el último experimento
5.6.3. Análisis estadistico del cloruro de benzalconio en el último diseño
experimental
Por último, para el cloruro de benzalconio se manejaron 3 concentraciones para las
dosis (Tabla 28), diferentes a las de los otros biocidas (metam sodio y mezcla QZ). La
Fig. 38 muestra los promedios del halo de inhibición de las 3 dosis empleadas en las
Primera Parte I-1: Capítulo 5
63
que se puede observar un resultado superior a lo obtenido con el metam sodio (Fig. 30)
y la mezcla de ditiocarbamatos (Fig. 34).
Fig 37. Halo de inhibición de la mezcla QZ
Fig. 38. Promedio de la inhibición a diferentes dosis del cloruro de benzalconio
En el análisis estadistico (Fig. 39) de las dosis muestra que las 3 dosis de cloruro de
benzalconio son estadisticamente diferentes entre si, por lo tanto la dosis sí afecta el
resultado de inhibición al emplear el CB como biocida. En cuanto a la temperatura
Primera Parte I-1: Capítulo 5
64
según la Fig. 40 no representa problema alguno para su utilización ya que las 3
temperaturas (35°, 45° y 55°C) no muetran diferencia significativa alguna son
estadisticamente iguales, dicho resultado manifiesta un importante punto a favor del CB
ya que la temperatura es un factor que limita la efectividad del metam y de la mezcla de
ditiocarbamatos. La Fig. 41 muestra el efecto biocida manifestado con un halo de
inhibición al utilizar el cloruro de benzalconio.
10
15
20
19 23 27 31 35 39
Halo de inhibición
CB
35
45
55
19 23 27 31 35 39
Halo de inhibición
Tem
pera
tura
Fig. 39. Gráfica de cajas y bigotes para el halo de inhibición versus la dosis del CB en el último experimento
Fig. 40. Gráfica de cajas y bigotes para el halo de inhibición versus la temperatura del CB en el último experimento
Fig. 41. Halo de inhibición del cloruro de benzalconio
Primera Parte I-1: Capítulo 5
65
5.7. Efecto inhibitorio para el último diseño experimental (discusión
final)
Para el cálculo del porcentaje del efecto inhibitorio a partir de los resultados del último
experimento se usó la ecuación (1) previamente utilizada para el segundo experimento
(Tabla 26) y el patrón de referencia del formaldehído a 5 ppm, con un promedio de
10.85 mm de halo de inhibición.
La Tabla 29 y la Fig. 42 muestran las tres dosis de los tres diferentes biocidas utilizados
en el último experimento donde cabe destacar que solamente las dosis de 30 mg L-1
del metam sodio y de la mezcla de ditiocarbamatos no son superiores al 100% de
efecto inhibitorio, por lo que no son tan eficaces para inhibir a Leuconostoc
mesenteroides a diferencia de las tres dosis del CB que superaron por mucho a sus
similares metam sodio y la mezcla de ditiocarbamatos e, incluso, las dosis más altas de
los biocidas con ditiocarbamatos no son tan efectivos como la dosis más baja del
cloruro de benzalconio.
Tabla 29. Efecto inhibitorio del metam sodio, la mezcla QZ y el cloruro de benzalconio para el último diseño experimental, en porcentaje
Biocida-dosis (mg L-1)
Promedio de halo de inhibición (mm) Efecto Inhibitorio (%)
Metam 30 9.22 85.00 Metam 40 11.67 107.53 Metam 50 18.67 172.04
Mezcla QZ 30 10.56 97.29 Mezcla QZ 40 12.22 112.65 Mezcla QZ 50 19.44 179.21
CB 10 20.89 192.52 CB 15 28.89 266.26 CB 20 35.78 329.75
Nota: se subrayan las dosis que superan el 100% de efecto inhibitorio respecto al formaldehído
En la Fig. 43 se ve la gráfica de cajas y bigotes en la que se muestra que entre el
metam sodio y la mezcla de ditiocarbamatos no existe una diferencia significativa en
sus dosis de 30, 40 y 50 mg L-1 a diferencia de las dosis del cloruro de benzalconio que
Primera Parte I-1: Capítulo 5
66
muestra una diferencia estadisticamente significativa desde su dosis mas baja (10 mg
L-1) por lo que su superioridad es clara.
Fig. 42. Efecto inhibitorio de metam, mezcla de ditiocarbamatos y cloruro de benzalconio, %
La opción de usar al cloruro de benzalconio como biocida desde esta óptica es buena
ya que su efectividad es comparable con el resultado obtenido en el estudio del efecto
inhibitorio de algunos antibióticos sobre Leuconostoc mesenteroides como la
amoxiciclina a una concentración de 10 µg mL-1 provocando un halo de inhibición de 15
mm o la clindamicina a una concentración de 100 µg/mL que dio un halo de inhibición
de 13.5 mm (Mora-Peñaflor y García-Guerrero, 2007). Estos resultados son menores a
la mitad del halo inhibitorio promedio del cloruro de benzalconio para 10 mg L-1, que es
de 20.89 mm, por lo que el alcance de este estudio puede ser aún mayor, ya que si el
cloruro de benzalconio es un biocida efectivo, puede ser mejor que algunos antibióticos
ya que este biocida no genera resistencia y según esta investigación es superior a
otros biocidas con base en ditiocarbamatos y el formaldehído.
Primera Parte I-1: Capítulo 5
67
Fig. 43. Gráfica de cajas y bigotes para el % del efecto inhibitorio versus los biocidas metam
sodio versus la mezcla de ditiocarbamatos versus el cloruro de benzalconio
Se debe tomar en cuenta que a pesar de no ser aparentemente tóxico para el humano
y esté avalado por la US-FDA como sustancia que puede ser utilizada por industrias de
alimentos no sobrepasando los límites establecidos, el CB es ecotóxico sobre todo para
los ecosistemas acuáticos (Rieger et al., 1980). Por tanto, su uso tampoco es del todo
viable y amerita ser investigado.
El metam sodio y la mezcla de ditiocarbamatos (QZ) superaron el 100% de efecto
inhibitorio en sus dosis de 40 y 50 mg L-1, aunque desafortunadamente sobrepasan
ampliamente los límites establecidos por la USFDA (2011).
Primera Parte I-1: Capítulo 6
68
6. Conclusiones y perspectivas
6.1. Conclusiones
De acuerdo con el objetivo de esta investigación que era el de identificar una de las
bacterias mesófilas aerobias o facultativas predominantes en el jugo de caña de un
ingenio, Leuconostoc mesenteroides sp, y su susceptibilidad a tres biocidas (mezcla de
ditiocarbamatos, cloruro de benzalconio y ditiocarbamato de sodio) y a las hipótesis
consideradas: Nula Ho = La aplicación de biocidas no produce efectos inhibitorios a las
bacterias del género Leuconostoc y alternativa Ha = La aplicación del biocidas produce
efectos inhibitorios a las bacterias del género Leuconostoc, puede concluirse lo
siguiente:
Se logró la proliferación de las bacterias presentes en el jugo de caña,
destacando la presencia y aislamiento de Leuconostoc mesenteroides en los
medios seleccionados comprobando que los medios de cultivo MRS y el M17
son los más adecuados para su aislamiento
Se identificó a Leuconostoc mesenteroides mediante una prueba confirmativa
utilizando el sistema VITEK 2 que permite obtener datos concluyentes en
microbiología con un alto porcentaje de confiabilidad que, para este caso, fue del
95%
Mediante la experimentación se llegó a la conclusión de que los factor de mayor
influencia en el experimento en orden decreciente fueron el medio de cultivo>el
tiempo>combinación tiempo-medio y que la temperatura no tiene un efecto
estadísticamente significativo
Se dio la confirmación de la hipótesis de que Leuconostoc mesenteroides sp es
susceptible a los tres agentes biocidas más utilizados en la industria azucarera,
la mezcla de ditiocarbamatos (QZ), metam (MS) y cloruro de benzalconio (CB)
El cloruro de benzalconio resultó ser el más eficiente de los biocidas en la
inhibición del Leuconostoc mesenteroides sp, pero se debe tomar en cuenta que
Primera Parte I-1: Capítulo 6
69
dicho biocida es tóxico para ecosistemas acuáticos por lo cual no es
recomendable su uso hasta no ser investigado y certificado.
6.2. Perspectivas
Con base en los resultados obtenidos, en las siguientes etapas de la investigación será
importante investigar, dado que se observa que para una eficiente inhibición en el caso
de los ditiocarbamatos se debe de rebasar los límites establecidos por la FDA y debido
a la falta de normativas respecto a los límites máximos permisibles de ditiocarbamatos
en el jugo de caña en México, los compuestos en los que se degradan esta clase de
biocidas para determinar si existe algún riesgo para la salud al corto, mediano y largo
plazo por la ingesta de los residuos de degradación que pudieran estar presentes en
los productos intermedios antes de obtener el azúcar de caña.
Es necesario implementar una normativa en México aplicada al uso y manejo de estos
biocidas en productos de consumo humano, con la finalidad de controlar y reducir los
posibles riesgos que pudieran presentarse por un mal manejo de estos productos o de
alguno de sus productos de degradación.
Con respecto a la falta de normativas aplicables, cabría investigar el manejo de
residuos que tiene implementado la industria azucarera ya que algunos biocidas
usados como el formaldehído y el cloruro de benzalconio son ecotóxicos y podrían
llegar a causar daños a los ecosistemas del país.
Primera Parte I-1: Anexos
70
ANEXOS
Anexo I
Datos experimentales
Archivos tipo Excel:
Resultados selección de medio
Resultados biocidas
Se encuentran adjuntos en el disco compacto.
Primera Parte I-1: Anexos
71
Anexo II
Análisis estadísticos
Tablas y gráficos de análisis estadístico
Análisis del metam halo de inhibición versus dosis en subgrupos
Resumen Estadístico Datos/Variable: Halo de inhibición Desviación Coeficiente Sesgo Curtosis Metam Recuento Promedio Estándar de Variación Mínimo Máximo Rango Estandarizado Estandarizada 30 9 9.22222 2.10819 22.8598% 6.0 12.0 6.0 -0.458015 -0.832854 40 9 11.6667 3.90512 33.4725% 7.0 18.0 11.0 -0.0220345 -0.56735 50 9 18.6667 9.97497 53.4373% 8.0 32.0 24.0 0.459572 -1.04234 Total 27 13.1852 7.30141 55.3758% 6.0 32.0 26.0 3.46152 2.19501 El StatAdvisor Esta tabla presenta las estadísticas muestrales para los 3 niveles de Metam.
30
40
50
Gráfico de Caja y Bigotes
0 10 20 30 40
Halo de inhibición
Met
am
Primera Parte I-1: Anexos
72
Análisis del metam halo de inhibición versus dosis ANDEVA multifactorial
Análisis de Varianza para Halo de inhibición - Suma de Cuadrados Tipo III Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P EFECTOS PRINCIPALES A:Metam 432.519 2 216.259 5.44 0.0112 RESIDUOS 953.556 24 39.7315 TOTAL (CORREGIDO) 1386.07 26 Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual El StatAdvisor La tabla ANDEVA descompone la variabilidad de Halo de inhibición en contribuciones debidas a varios factores. Puesto que se ha escogido la suma de cuadrados Tipo III (por omisión), la contribución de cada factor se mide eliminando los efectos de los demás factores. Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto que un valor-P es menor que 0.05, este factor tiene un efecto estadísticamente significativo sobre Halo de inhibición con un 95.0% de nivel de confianza. Pruebas de Múltiple Rangos para Halo de inhibición por Metam Método: 95.0 porcentaje LSD Metam Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos 30 9 9.22222 2.1011 X 40 9 11.6667 2.1011 X 50 9 18.6667 2.1011 X Contraste Sig. Diferencia +/- Límites 30 – 40 -2.44444 6.13268 30 – 50 * -9.44444 6.13268 40 – 50 * -7.0 6.13268 * indica una diferencia significativa. El StatAdvisor Esta tabla aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles medias son significativamente diferentes de otras. La mitad inferior de la salida muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias. El asterisco que se encuentra al lado de los 2 pares indica que estos pares muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95.0% de confianza. En la parte superior de la página, se han identificado 2 grupos homogéneos según la alineación de las X en columnas. No existen diferencias estadísticamente significativas entre aquellos niveles que compartan una misma columna de X. El método empleado actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD, en inglés) de Fisher. Con este método hay un riesgo del 5.0% al decir que cada par de medias es significativamente diferente, cuando la diferencia real es igual a 0.
30 40 50
Medias y 95.0% de Fisher LSD
Metam
6
10
14
18
22
Hal
o de
inhi
bici
ón
Primera Parte I-1: Anexos
73
Análisis del metam halo de inhibición versus temperatura en subgrupos.
Datos/Variable: Halo de inhibición
Desviación Coeficiente Sesgo Temperatura Recuento Promedio Estándar de Variación Mínimo Máximo Rango Estandarizado 35 9 19.2222 9.10738 47.3795% 11.0 32.0 21.0 0.824832 45 9 13.0 3.16228 24.3252% 9.0 18.0 9.0 0.485506 55 9 7.33333 0.866025 11.8094% 6.0 9.0 3.0 0.808122 Total 27 13.1852 7.30141 55.3758% 6.0 32.0 26.0 3.46152 Curtosis Temperatura Estandarizada 35 -1.05719 45 -0.640804 55 0.50545 Total 2.19501 El StatAdvisor Esta tabla presenta las estadísticas muestrales para los 3 niveles de Temperatura.
35
45
55
Gráfico de Caja y Bigotes
0 10 20 30 40
Halo de inhibición
Tem
pera
tura
Primera Parte I-1: Anexos
74
Análisis del metam halo de inhibición versus temperatura ANDEVA multifactorial.
Análisis de Varianza para Halo de inhibición - Suma de Cuadrados Tipo III Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P EFECTOS PRINCIPALES A:Temperatura 636.519 2 318.259 10.19 0.0006 RESIDUOS 749.556 24 31.2315 TOTAL (CORREGIDO) 1386.07 26 Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual El StatAdvisor La tabla ANDEVA descompone la variabilidad de Halo de inhibición en contribuciones debidas a varios factores. Puesto que se ha escogido la suma de cuadrados Tipo III (por omisión), la contribución de cada factor se mide eliminando los efectos de los demás factores. Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto que un valor-P es menor que 0.05, este factor tiene un efecto estadísticamente significativo sobre Halo de inhibición con un 95.0% de nivel de confianza.
Pruebas de Múltiple Rangos para Halo de inhibición por Temperatura Método: 95.0 porcentaje LSD Temperatura Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos 55 9 7.33333 1.86284 X 45 9 13.0 1.86284 X 35 9 19.2222 1.86284 X Contraste Sig. Diferencia +/- Límites 35 - 45 * 6.22222 5.43725 35 - 55 * 11.8889 5.43725 45 - 55 * 5.66667 5.43725 * indica una diferencia significativa. El StatAdvisor Esta tabla aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles medias son significativamente diferentes de otras. La mitad inferior de la salida muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias. El asterisco que se encuentra al lado de los 3 pares indica que estos pares muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95.0% de confianza. En la parte superior de la página, se han identificado 3 grupos homogéneos según la alineación de las X en columnas. No existen diferencias estadísticamente significativas entre aquellos niveles que compartan una misma columna de X. El método empleado actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD, en inglés) de Fisher. Con este método hay un riesgo del 5.0% al decir que cada par de medias es significativamente diferente, cuando la diferencia real es igual a 0.
35 45 55
Medias y 95.0% de Fisher LSD
Temperatura
0
4
8
12
16
20
24
Hal
o de
inhi
bici
ón
Primera Parte I-1: Anexos
75
Análisis del QZ halo de inhibición versus dosis en subgrupos.
Resumen Estadístico Datos/Variable: Halo de inhibición Desviación Coeficiente Sesgo Curtosis QZ Recuento Promedio Estándar de Variación Mínimo Máximo Rango Estandarizado Estandarizada 30 9 10.5556 2.29734 21.7643% 7.0 13.0 6.0 -0.696656 -0.883736 40 9 12.2222 3.59784 29.4369% 7.0 17.0 10.0 -0.258387 -0.877151 50 9 19.4444 8.44262 43.4192% 9.0 31.0 22.0 0.148798 -0.976207 Total 27 14.0741 6.557 46.5892% 7.0 31.0 24.0 2.95736 1.48977 El StatAdvisor Esta tabla presenta las estadísticas muestrales para los 3 niveles de QZ.
30
40
50
Gráfico de Caja y Bigotes
0 10 20 30 40
Halo de inhibición
Zuk
er
Primera Parte I-1: Anexos
76
Análisis del QZ halo de inhibición versus dosis ANDEVA multifactorial.
Análisis de Varianza para Halo de inhibición - Suma de Cuadrados Tipo III Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P EFECTOS PRINCIPALES A:QZ 401.852 2 200.926 6.73 0.0048 RESIDUOS 716.0 24 29.8333 TOTAL (CORREGIDO) 1117.85 26 Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual El StatAdvisor La tabla ANDEVA descompone la variabilidad de Halo de inhibición en contribuciones debidas a varios factores. Puesto que se ha escogido la suma de cuadrados Tipo III (por omisión), la contribución de cada factor se mide eliminando los efectos de los demás factores. Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto que un valor-P es menor que 0.05, este factor tiene un efecto estadísticamente significativo sobre Halo de inhibición con un 95.0% de nivel de confianza.
Pruebas de Múltiple Rangos para Halo de inhibición por QZ Método: 95.0 porcentaje LSD QZ Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos 30 9 10.5556 1.82066 X 40 9 12.2222 1.82066 X 50 9 19.4444 1.82066 X Contraste Sig. Diferencia +/- Límites 30 - 40 -1.66667 5.31415 30 - 50 * -8.88889 5.31415 40 - 50 * -7.22222 5.31415 * indica una diferencia significativa. El StatAdvisor Esta tabla aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles medias son significativamente diferentes de otras. La mitad inferior de la salida muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias. El asterisco que se encuentra al lado de los 2 pares indica que estos pares muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95.0% de confianza. En la parte superior de la página, se han identificado 2 grupos homogéneos según la alineación de las X en columnas. No existen diferencias estadísticamente significativas entre aquellos niveles que compartan una misma columna de X. El método empleado actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD, en inglés) de Fisher. Con este método hay un riesgo del 5.0% al decir que cada par de medias es significativamente diferente, cuando la diferencia real es igual a 0.
30 40 50
Medias y 95.0% de Fisher LSD
Zuker
7
11
15
19
23
Hal
o de
inhi
bici
ón
Primera Parte I-1: Anexos
77
Análisis del QZ halo de inhibición versus temperatura subgrupos Resumen Estadístico Datos/Variable: Halo de inhibición Desviación Coeficiente Sesgo Temperatura Recuento Promedio Estándar de Variación Mínimo Máximo Rango Estandarizado 35 9 19.2222 7.80669 40.6129% 12.0 31.0 19.0 0.881566 45 9 14.4444 3.5746 24.7472% 11.0 20.0 9.0 0.84858 55 9 8.55556 1.33333 15.5844% 7.0 11.0 4.0 0.80989 Total 27 14.0741 6.557 46.5892% 7.0 31.0 24.0 2.95736 Curtosis Temperatura Estandarizada 35 -0.957438 45 -0.890181 55 -0.0938037 Total 1.48977 El StatAdvisor Esta tabla presenta las estadísticas muestrales para los 3 niveles de Temperatura.
35
45
55
Gráfico de Caja y Bigotes
0 10 20 30 40
Halo de inhibición
Tem
pera
tura
Primera Parte I-1: Anexos
78
Análisis del QZ halo de inhibición versus temperatura ANDEVA multifactorial
Análisis de Varianza para Halo de inhibición - Suma de Cuadrados Tipo III Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P EFECTOS PRINCIPALES A:Temperatura 513.852 2 256.926 10.21 0.0006 RESIDUOS 604.0 24 25.1667 TOTAL (CORREGIDO) 1117.85 26 Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual El StatAdvisor La tabla ANDEVA descompone la variabilidad de Halo de inhibición en contribuciones debidas a varios factores. Puesto que se ha escogido la suma de cuadrados Tipo III (por omisión), la contribución de cada factor se mide eliminando los efectos de los demás factores. Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto que un valor-P es menor que 0.05, este factor tiene un efecto estadísticamente significativo sobre Halo de inhibición con un 95.0% de nivel de confianza. Pruebas de Múltiple Rangos para Halo de inhibición por Temperatura Método: 95.0 porcentaje LSD Temperatura Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos 55 9 8.55556 1.67221 X 45 9 14.4444 1.67221 X 35 9 19.2222 1.67221 X Contraste Sig. Diferencia +/- Límites 35 - 45 4.77778 4.88085 35 - 55 * 10.6667 4.88085 45 - 55 * 5.88889 4.88085 * indica una diferencia significativa. El StatAdvisor Esta tabla aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles medias son significativamente diferentes de otras. La mitad inferior de la salida muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias. El asterisco que se encuentra al lado de los 2 pares indica que estos pares muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95.0% de confianza. En la parte superior de la página, se han identificado 2 grupos homogéneos según la alineación de las X en columnas. No existen diferencias estadísticamente significativas entre aquellos niveles que compartan una misma columna de X. El método empleado actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD, en inglés) de Fisher. Con este método hay un riesgo del 5.0% al decir que cada par de medias es significativamente diferente, cuando la diferencia real es igual a 0.
35 45 55
Medias y 95.0% de Fisher LSD
Temperatura
6
10
14
18
22
Hal
o de
inhi
bici
ón
Primera Parte I-1: Anexos
79
Análisis del CB halo de inhibición versus dosis subgrupos
Resumen Estadístico Datos/Variable: Halo de inhibición Desviación Coeficiente Sesgo Curtosis CB Recuento Promedio Estándar de Variación Mínimo Máximo Rango Estandarizado Estandarizada 10 9 20.8889 1.16667 5.58511% 19.0 23.0 4.0 0.327483 0.331855 15 9 28.8889 1.16667 4.03846% 27.0 30.0 3.0 -0.41624 -0.966708 20 9 35.7778 1.56347 4.36995% 34.0 38.0 4.0 0.573524 -0.820684 Total 27 28.5185 6.32681 22.1849% 19.0 38.0 19.0 -0.123412 -1.47253 El StatAdvisor Esta tabla presenta las estadísticas muestrales para los 3 niveles de CB.
10
15
20
Gráfico de Caja y Bigotes
19 23 27 31 35 39
Halo de inhibición
CB
Primera Parte I-1: Anexos
80
Análisis del CB halo de inhibición versus dosis ANDEVA multifactorial
Análisis de Varianza para Halo de inhibición - Suma de Cuadrados Tipo III Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P EFECTOS PRINCIPALES A:CB 999.407 2 499.704 290.15 0.0000 RESIDUOS 41.3333 24 1.72222 TOTAL (CORREGIDO) 1040.74 26 Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual El StatAdvisor La tabla ANDEVA descompone la variabilidad de Halo de inhibición en contribuciones debidas a varios factores. Puesto que se ha escogido la suma de cuadrados Tipo III (por omisión), la contribución de cada factor se mide eliminando los efectos de los demás factores. Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto que un valor-P es menor que 0.05, este factor tiene un efecto estadísticamente significativo sobre Halo de inhibición con un 95.0% de nivel de confianza.
Pruebas de Múltiple Rangos para Halo de inhibición por CB Método: 95.0 porcentaje LSD CB Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos 10 9 20.8889 0.437445 X 15 9 28.8889 0.437445 X 20 9 35.7778 0.437445 X Contraste Sig. Diferencia +/- Límites 10 - 15 * -8.0 1.27681 10 - 20 * -14.8889 1.27681 15 - 20 * -6.88889 1.27681 * indica una diferencia significativa. El StatAdvisor Esta tabla aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles medias son significativamente diferentes de otras. La mitad inferior de la salida muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias. El asterisco que se encuentra al lado de los 3 pares indica que estos pares muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95.0% de confianza. En la parte superior de la página, se han identificado 3 grupos homogéneos según la alineación de las X en columnas. No existen diferencias estadísticamente significativas entre aquellos niveles que compartan una misma columna de X. El método empleado actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD, en inglés) de Fisher. Con este método hay un riesgo del 5.0% al decir que cada par de medias es significativamente diferente, cuando la diferencia real es igual a 0.
10 15 20
Medias y 95.0% de Fisher LSD
CB
20
23
26
29
32
35
38
Hal
o de
inhi
bici
ón
Primera Parte I-1: Anexos
81
Análisis del CB halo de inhibición versus temperatura Subgrupos
Resumen Estadístico Datos/Variable: Halo de inhibición Desviación Coeficiente Sesgo Temperatura Recuento Promedio Estándar de Variación Mínimo Máximo Rango Estandarizado 35 9 27.7778 6.28048 22.6097% 20.0 35.0 15.0 -0.196676 45 9 29.7778 6.81502 22.8862% 21.0 38.0 17.0 0.0185333 55 9 28.0 6.44205 23.0073% 19.0 36.0 17.0 -0.247382 Total 27 28.5185 6.32681 22.1849% 19.0 38.0 19.0 -0.123412 Curtosis Temperatura Estandarizada 35 -1.07102 45 -1.00724 55 -0.973462 Total -1.47253 El StatAdvisor Esta tabla presenta las estadísticas muestrales para los 3 niveles de Temperatura.
35
45
55
Gráfico de Caja y Bigotes
19 23 27 31 35 39
Halo de inhibición
Tem
pera
tura
Primera Parte I-1: Anexos
82
Análisis del CB halo de inhibición versus temperatura ANDEVA multifactorial
Análisis de Varianza para Halo de inhibición - Suma de Cuadrados Tipo III Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P EFECTOS PRINCIPALES A:Temperatura 21.6296 2 10.8148 0.25 0.7772 RESIDUOS 1019.11 24 42.463 TOTAL (CORREGIDO) 1040.74 26 Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual El StatAdvisor La tabla ANDEVA descompone la variabilidad de Halo de inhibición en contribuciones debidas a varios factores. Puesto que se ha escogido la suma de cuadrados Tipo III (por omisión), la contribución de cada factor se mide eliminando los efectos de los demás factores. Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto que ningún valor-P es menor que 0.05, ninguno de los factores tiene un efecto estadísticamente significativo sobre Halo de inhibición con un 95.0% de nivel de confianza. Pruebas de Múltiple Rangos para Halo de inhibición por Temperatura Método: 95.0 porcentaje LSD Temperatura Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos 35 9 27.7778 2.17212 X 55 9 28.0 2.17212 X 45 9 29.7778 2.17212 X Contraste Sig. Diferencia +/- Límites 35 - 45 -2.0 6.33998 35 - 55 -0.222222 6.33998 45 - 55 1.77778 6.33998 * indica una diferencia significativa El StatAdvisor Esta tabla aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles medias son significativamente diferentes de otras. La mitad inferior de la salida muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias. El asterisco que se encuentra al lado de los 3 pares indica que estos pares muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95.0% de confianza. En la parte superior de la página, se han identificado 3 grupos homogéneos según la alineación de las X en columnas. No existen diferencias estadísticamente significativas entre aquellos niveles que compartan una misma columna de X. El método empleado actualmente para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD, en inglés) de Fisher. Con este método hay un riesgo del 5.0% al decir que cada par de medias es significativamente diferente, cuando la diferencia real es igual a 0.
Primera Parte I-1: Anexos
83
Anexo III
Disposición controlada de los residuos producidos en la
investigación
Residuo Corresponde a Tratamiento
R1 Desechos orgánicos de la extracción
del jugo (cáscara, bagazo)
Se desecha con los residuos orgánicos
R2 Cajas de Petri, medio de cultivo
contaminado
Se recolectan en un contenedor especial
para su futura incineración. Se entregan a
la UGA
Fig. III.1. Disposición controlada de los residuos producidos en esta investigación
Obtención de cañas
Aislamiento de bacterias
Preparación de medios de cultivo
Inoculación
Efecto de inhibición
Obtención de biocidas
Pruebas de inhibición
Dosificación de biocidas
Extracción del jugo de caña
R1
R2
R3
Primera Parte I-1: Anexos
84
R3 Restantes de biocida (metam, mezcla
de ditiocarbamatos, cloruro de
benzalconio
Se recolectan individualmente y pueden ser
eliminados por temperatura, fotólisis, ácidos
o bases fuertes. Se entregan a la UGA
Fig. III.1. Disposición controlada de los residuos producidos en esta investigación
Primera Parte I-1: Bibliografía
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Modificación del inciso 0, el encabezado de la Tabla 13, el último párrafo del
Anexo B y el apartado Signo decimal de la Tabla 21 de la Norma Oficial
Mexicana NOM-008-SCFI-2002, Sistema general de unidades de medida.
CUARTO.- Se modifica el encabezado de la tabla 13 para quedar como
sigue: Tabla 21 - Reglas para la escritura de los números y su signo decimal.
Signo decimal El signo decimal debe ser una coma sobre la línea (,) o un
punto sobre la línea (.). Si la magnitud de un número es menor que la
unidad, el signo decimal debe ser precedido por un cero. Diario Oficial de la
Federación: Jueves 24 de septiembre de 2009. Poder Ejecutivo Federal.
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Primera Parte
I-2
METODOLOGÍAS PARA EL AISLAMIENTO DE
LAS BACTERIAS Weissella confusa Y
Leuconostoc mesenteroides EN JUGOS DE
CAÑA
Primera Parte I-2: Índice
97
Pág.
PRIMERA PARTE
I-2 METODOLOGÍAS PARA EL AISLAMIENTO DE LAS BACTERIAS
WEISSELLA CONFUSA Y LEUCONOSTOC MESENTEROIDES EN JUGOS DE CAÑA
96
Resumen 105
1. Problemática 107 1.1. Introducción 107 1.2. Justificación 108 1.3. Objetivos 108 1.3.1. Objetivo general 108 1.3.2. Objetivo particular 108 1.4. Hipótesis 109
2. Antecedentes 110 2.1. Caña de azúcar 110 2.2. Industria azucarera en México 110 2.3. Proceso de obtención de azúcar 111 2.3.1. Cultivo de la caña de azúcar 111 2.3.2. Quema 112 2.3.3. Corte de la caña 113 2.3.4. Transporte a la fábrica 113 2.3.5. Picado de la caña 113 2.3.6. Molienda 113 2.3.7. Clarificación 114 2.3.8. Evaporación 114 2.3.9. Cristalización y centrifugación 115 2.3.10. Secado y enfriado 115 2.4. Microorganismos en la industria azucarera 116 2.4.1. Leuconostoc mesenteroides 117 2.4.2. Weissella confusa 118 2.5. Pruebas bioquímicas 119 2.5.1. Catalasa 119 2.5.2. Descarboxilación de arginina 120 2.5.3. Biodegradación de arabinosa 121 2.6. Biocidas en la industria azucarera 122 2.6.1. Cloruro de benzalconio (CB) 122 2.6.2. Metam-sodio (MS) 123 2.6.3. Formaldehído 124
Primera Parte I-2: Índice
98
Pág.
3. Metodologías para para el aislamiento de las bacterias Weissella
confusa y Leuconostoc mesenteroides en jugos de caña 128
3.1. Equipo y reactivos 128 3.2. Diseño experimental 129 3.3. Procedimiento 129 3.3.1. Preparación del medio de cultivo agar MRS 129 3.3.2. Preparación de agua peptonada 129 3.3.3. Lavado y pelado de caña 129 3.3.4. Toma de la muestra 130 3.3.5. Inoculación y lectura 130 3.3.6. Pruebas primarias 130 3.3.6.1. Tinción de Gram (Ramírez et al., 2008) 130 3.3.6.2. Tinción de cápsula (Ramírez et al., 2008) 131 3.3.7. Pruebas bioquímicas 131 3.3.7.1. Catalasa 131 3.3.7.2. Descarboxilación de arginina 131 3.3.7.3. Biodegradación de arabinosa 132 3.3.8. Prueba automatizada en el equipo VITEK 2 133 3.3.9. Preparación de los biocidas de estudio 133 3.3.9.1. Cloruro de benzalconio (CB) 133 3.3.9.2. Metam-sodio (MS) 133 3.3.9.3. Formaldehído 134 3.3.10. Pruebas de resistencia a biocidas 134 3.4. Análisis estadístico 135
4. Resultados y discusión 136 4.1. Inoculación y lectura 136 4.2. Pruebas primarias 137 4.3. Pruebas bioquímicas 139 4.3.1. Catalasa 139 4.3.2. Descarboxilación de arginina 139 4.3.3. Biodegradación de arabinosa 140 4.4. Prueba automatizada en el equipo VITEK 2 140 4.5. Pruebas de resistencia a biocidas 140 4.6. Cloruro de benzalconio (CB) 140 4.7. Metam-sodio (MS) 141 4.8. Formaldehído 142 4.9. Pruebas de antagonismo 143 4.10. Análisis estadístico 144 4.10.1. Tiempo de incubación 144 4.10.2. Prueba de resistencia a biocidas 145 4.10.2.1. Análisis estadístico para cloruro de benzalconio 145 4.10.2.2. Análisis estadístico para metam sodio 148 4.10.2.3. Análisis estadístico para formaldehído 150
Primera Parte I-2: Índice
99
Pág.
4.11. Efecto inhibitorio del segundo experimento 152 5. Conclusiones y perspectivas 156 5.1. Conclusiones 156 5.2. Perspectivas 157 Bibliografía 159 Anexos 163 Anexo I. Aislamiento de bactérias 163 Anexo II. Prueba de VITEK 165 Anexo III. Análisis estadístico de los resultados 168 Anexo IV. Disposición controlada de los residuos producidos 176
Primera Parte I-2: Índice de tablas
100
Pág.Tabla 1. Biocidas utilizados en la industria azucarera y sus características 122 Tabla 2. Ficha técnica del cloruro de benzalconio (MAPFRE, 2015, con
algunas modificaciones) 125
Tabla 3. Ficha técnica del metam-sodio (Arvizu-Ramos 2010, con modificaciones)
126
Tabla 4. Ficha técnica del formaldehído (MAPFRE, 2015) 127 Tabla 5. Reactivos y equipo con distribuidor y especificaciones 128 Tabla 6. Diseño experimental para seleccionar de la dosis óptima 135 Tabla 7. Unidades formadoras de colonias, UFC, a diferentes temperaturas
para Weissella confusa 136
Tabla 8. Unidades formadoras de colonias, UFC, a diferentes temperaturas para Leuconostoc mesenteroides
136
Tabla 9. Halos de inhibición de Weissella confusa, utilizando CB 141 Tabla 10. Halos de inhibición de Leuconostoc mesenteroides, utilizando CB 141 Tabla 11. Halos de inhibición de Weissella confusa, utilizando MS 142 Tabla 12. Halos de inhibición de Leuconostoc mesenteroides, utilizando MS 142 Tabla 13. Halos de inhibición de Weissella confusa, utilizando formaldehído 143 Tabla 14. Halos de inhibición de Leuconostoc mesenteroides, utilizando
formaldehído 143
Tabla 15. Análisis de varianza (ANOVA, en inglés) para Weissella confusa 144 Tabla 16. Análisis de varianza (ANOVA, en inglés) para Leuconostoc
mesenteroides 145
Tabla 17. Efecto inhibitorio del cloruro de benzalconio (CB) y metam sodio (MS) en porcentaje para la bacteria Weissella confusa
153
Tabla 18. Efecto inhibitorio del cloruro de benzalconio (CB) y metam sodio (MS) en porcentaje para la bacteria Leuconostoc mesenteroides
154
Tabla 19. Comparación del % de efecto inhibitorio para las bacterias de estudio ante los biocidas de estudio (cloruro de benzalconio y metam sodio)
155
Anexos Tabla A1. Comparación de los resultados teóricos presentados por Serna et al.
(2010) con los obtenidos en la prueba de VITEK 167
Tabla A2. Análisis de varianza (ANOVA, en inglés) para halos de inhibición de Weissella confusa ante CB
168
Tabla A3. Pruebas de rangos múltiples para halos de inhibición de Weissella confusa ante las dosis de CB
168
Tabla A4. Análisis de varianza (ANOVA, en inglés) para halos de inhibición de Weissella confusa ante MS
169
Tabla A5. Pruebas de rangos múltiples para halos de inhibición de Weissella confusa ante las dosis de MS
170
Tabla A6. Análisis de varianza (ANOVA, en inglés) para halos de inhibición de Weissella confusa ante formaldehído
170
Tabla A7. Pruebas de rangos múltiples para halos de inhibición de Weissella confusa ante las dosis de formaldehído
171
Primera Parte I-2: Índice de tablas
101
Pág.
Tabla A8. Análisis de varianza (ANOVA, en inglés) para halos de inhibición de Leuconostoc mesenteroides ante CB
172
Tabla A9. Pruebas de rangos múltiples para halos de inhibición de Leuconostoc mesenteroides ante las dosis de CB
172
Tabla A10. Análisis de varianza (ANOVA, en inglés) para halos de inhibición de Leuconostoc mesenteroides ante MS
173
Tabla A11. Pruebas de rangos múltiples para halos de inhibición de Leuconostoc mesenteroides ante las dosis de MS
174
Tabla A12. Análisis de varianza (ANOVA, en inglés) para halos de inhibición de Leuconostoc mesenteroides ante formaldehído
174
Tabla A13. Pruebas de rangos múltiples para halos de inhibición de Leuconostoc mesenteroides ante las dosis de CB
175
Primera Parte I-2: Índice de figuras
102
Pág.Figura 1. Participación estatal de caña de azúcar molida 2012/2013
(CONADESUCA, 2015) 111
Figura 2. Proceso de obtención de azúcar (CENICAÑA, 2010) 112 Figura 3. Etapa de cristalización y centrifugación (CENICAÑA, 2010) 116 Figura 4. Síntesis de dextrana a partir de Sacarosa (Larrahondo, 1995) 118 Figura 5. Reacción del peróxido de hidrogeno y la enzima catalasa,
(MacFaddin, 2003) 119
Figura 6. Sistema de arginina dihidrolasa, (MacFaddin, 2003) 120 Figura 7. Descarboxilación de la arginina, (MacFaddin, 2003) 121 Figura 8. Estructura del cloruro de benzalconio (Shandong IRO, 2016) 123 Figura 9. Estructura del metam-sodio (Bonilla-Vidal, 2013) 123 Figura 10. Estructura del formaldehído (McMurry, 2008) 124 Figura 11. Colonias en agar MRS de Weissella confusa 137 Figura 12. Tinción de Gram y agrupación para Weissella confusa 137 Figura 13. Tinción de cápsula para Weissella confusa 137 Figura 14. Colonias en agar MRS de Leuconostoc mesenteroides 138 Figura 15. Tinción de Gram y agrupación para Leuconostoc mesenteroides 138 Figura 16. Tinción de cápsula para Leuconostoc mesenteroides 138 Figura 17. Prueba negativa de catalasa para Weissella confusa 139 Figura 18. Prueba negativa de catalasa para Leuconostoc mesenteroides 139 Figura 19. Tubo de referencia de la prueba descarboxilación de arginina 139 Figura 20. Prueba (+) de descarboxilación de arginina para Weissella confusa 139 Figura 21. Prueba (-) de descarboxilación de arginina para Leuconostoc
mesenteroides 139
Figura 22. Tubo de referencia de la prueba biodegradación de arabinosa 140 Figura 23. Prueba (-) de biodegradación de arabinosa para Weissella confusa 140 Figura 24. Prueba (+) de biodegradación de arabinosa para Leuconostoc
mesenteroides 140
Figura 25. Prueba de antagonismo para Weissella confusa y Leuconostoc mesenteroides
144
Figura 26. Prueba de antagonismo para Weissella confusa y Leuconostoc mesenteroides
144
Figura 27. Promedio de inhibición para Weissella confusa a diferentes dosis de CB
146
Figura 28. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Weissella confusa a diferentes dosis de CB
146
Figura 29. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Weissella confusa a diferentes tiempos
146
Figura 30. Promedio de inhibición para Leuconostoc mesenteroides a diferentes dosis de CB
147
Figura 31. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Leuconostoc mesenteroides a diferentes dosis de CB
147
Primera Parte I-2: Índice de figuras
103
Pág.Figura 32. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Leuconostoc
mesenteroides a diferentes tiempos 147
Figura 33. Promedio de inhibición para Weissella confusa a diferentes dosis de MS
148
Figura 34. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Weissella confusa a diferentes dosis de MS
148
Figura 35. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Weissella confusa a diferentes tiempos
148
Figura 36. Promedio de inhibición para Leuconostoc mesenteroides a diferentes dosis de MS
149
Figura 37. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Leuconostoc mesenteroides a diferentes dosis de MS
149
Figura 38. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Leuconostoc mesenteroides a diferentes tiempos
149
Figura 39. Promedio de inhibición para Weissella confusa a diferentes dosis de formaldehído
150
Figura 40. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Weissella confusa a diferentes dosis de formaldehído
151
Figura 41. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Weissella confusa a diferentes tiempos
151
Figura 42. Promedio de inhibición para Leuconostoc mesenteroides a diferentes dosis de formaldehído
151
Figura 43. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Leuconostoc mesenteroides a diferentes dosis de formaldehído
152
Figura 44. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Leuconostoc mesenteroides a diferentes tiempos
152
Figura 45. Gráfico de cajas y bigotes para el % de efecto inhibitorio para Weissella confusa vs biocida (cloruro de benzalconio y metam sodio)
153
Figura 46. Gráfico de cajas y bigotes para el % de efecto inhibitorio para Leuconostoc mesenteroides vs biocida (cloruro de benzalconio y metam sodio)
154
Figura 47. Gráfico de la comparación del % de efecto inhibitorio de Weissella confusa y Leuconostoc mesenteroides vs biocida (cloruro de benzalconio y metam sodio
155
Figura 48. Gráfico de cajas y bigotes para el % de efecto inhibitorio vs bacteria de estudio (Weissella confusa y Leuconostoc mesenteroides)
155
ANEXOS Figura A1. Aislamiento masivo de Leuconostoc mesenteroides a las 24 horas 163 Figura A2. Aislamiento masivo de Weissella confusa a las 24 horas 163 Figura A3. Aislamiento de Leuconostoc mesenteroides a las 72horas 163 Figura A4. Aislamiento de Weissella confusa a las 72 horas 163 Figura A5. Aislamiento por agotamiento de Leuconostoc mesenteroides 163 Figura A6. Aislamiento por agotamiento de Weissella confusa 163 Figura A7. Cocos Gram negativos y cocobacilos Gram positivos obtenidos del
aislamiento 163
Primera Parte I-2: Índice de figuras
104
Pág.Figura A8. Cocos Gram negativos obtenidos del aislamiento 163 Figura A9. Cocobacilos Gram positivos con ausencia de cápsula obtenidos del
aislamiento 164
Figura A10. Micrococos Gram positivos agrupados en cadenas cortas o pares 164 Figura A11. Cocos Gram positivos agrupados en tétradas 164 Figura A12. Cocobacilos Gram positivos agrupados en cadenas cortas 164 Figura A13. Formato de Registro de la prueba de VITEK para Leuconostoc
mesenteroides 165
Figura A14. Formato de Registro de la prueba de VITEK para Weissella confusa 166
Primera Parte I-2: Resumen
105
La industria azucarera es de gran relevancia económica y social en México y en
prácticamente todos los países ubicados entre el Trópico de Cáncer y el de Capricornio
cuando el azúcar proviene de la caña (Saccharum officinarum). Uno de los mayores
problemas durante el procesamiento está representado por la obtención del jugo. En
este punto del proceso existen pérdidas de sacarosa del 3-5% debido a la presencia de
microorganismos que la consumen como fuente de carbono. Leuconostoc
mesenteroides, una bacteria ácido láctica que, a partir de sacarosa, produce dextranas,
es la más importante. Por ello, se utilizan productos para la desinfección y/o
sanitización de la caña de azúcar durante esta primera operación unitaria de
separación. Destacan los ditiocarbamatos, el cloruro de benzalconio y otras sales
cuaternarias de amonio como bicloruro de amonio y el formaldehído. El uso de
reactivos químicos para el control de microorganismos en la industria alimentaria se ve
confrontado con el hecho de que pueden ser tóxicos al humano y/o dañar al ambiente.
Por ello, se plantea como una opción la aplicación de la biotecnología: utilizar a la
especie Weissella confusa, la cual es una bacteria ácido láctica heterofermentativa,
utilizada por su actividad bactericida, que podría reducir la cantidad de biocida sintético
utilizado actualmente en la industria de extracción del jugo de caña. Es esta última una
de las razones por las que se realizó esta fase de la investigación. Los objetivos fueron
aislar e identificar las bacterias predominantes en el jugo de caña, particularmente
Weissella confusa, comprobar su susceptibilidad a dos biocidas, cloruro de benzalconio
y metam-sodio, comparando las dosis empleadas para inhibir a Leuconostoc
mesenteroides y determinar si Weissella confusa puede actuar de forma antagónica o
como bacteriocida ante Leuconostoc mesenteroides. Para ello se realizó una toma de
muestra, inoculación y lectura para determinar a las bacterias presentes en el jugo de
caña. Las colonias características fueron seleccionadas y aisladas para su posterior
identificación. Una vez identificadas las bacterias de estudio fueron sometidas a una
prueba de difusión en disco para evaluar su susceptibilidad. En esta etapa se usó un
tercer biocida como control, el formaldehído. Esta prueba fue realizada para ambas
bacterias utilizando las mismas concentraciones de los biocidas de prueba e incubando
las placas a 35°C por 24, 48 y 72 horas. Se midió el diámetro del halo de inhibición y,
Primera Parte I-2: Resumen
106
por último, se realizó un análisis estadístico para conocer si existía diferencia
significativa entre el efecto inhibidor de cada biocida para las bacterias de estudio. Los
resultados obtenidos muestran que se aisló del jugo de caña a Weissella confusa y
Leuconostoc mesenteroides. El halo de inhibición promedio para el formaldehído es de
11.78 mm para Weissella confusa mientras que para Leuconostoc mesenteroides es de
10.3 mm, los cuales fueron tomados como referencia debido a que se conoce su poder
biocida. Los porcentajes de efecto inhibitorio tomando como referencia al formaldehído
fueron, para el cloruro de benzalconio, una inhibición de 93.80, 102.21 y 117.15% con
Weissella confusa, mientras que para Leuconostoc mesenteroides fueron de 103.88,
113.59 y 122.33% utilizando concentraciones de 10, 15 y 20 mg L-1, respectivamente,
el metam sodio presentó para Weissella confusa 0, 67.32 y 87.69% y Leuconostoc
mesenteroides 0, 74.76 y 80.58% utilizando concentraciones de 30, 40 y 45 mg L-1. El
porcentaje de eficiencia de cada uno de los biocidas es mayor para inhibir el desarrollo
de Leuconostoc mesenteroides que para el de Weissella confusa. Finalmente, esta
última no presentó un efecto antagónico hacia Leuconostoc mesenteroides por lo que
no puede actuar como un biocida natural.
Palabras clave: Weissella confusa, Leuconostoc mesenteroides, biocidas, cloruro de
benzalconio, metan sodio, formaldehído
Primera Parte I-2: Capítulo 1
107
1. Problemática
1.1. Planteamiento
En México la industria azucarera es una de las actividades con mayor tradición y
trascendencia en el desarrollo histórico (Crespo, 1988), teniendo también una gran
relevancia económica y social en el campo; genera más de dos millones de empleos,
tanto en forma directa como indirecta y generando un valor de producción primaria
alrededor de 30 mil millones de pesos (SAGARPA, 2012). Durante la producción de
azúcar uno de los compuestos indeseables son las dextranas, las cuales son
sintetizadas a partir de sacarosa por microorganismos contaminantes, que provocan
pérdidas significativamente al incrementar la viscosidad en los fluidos y reducir el
recobrado industrial (Jiménez, 2005). Uno de los principales microorganismos
contaminantes y productora de dextrana3 es la bacteria Leuconostoc mesenteroides, la
cual puede causar pérdidas del 3-5 % en masa debido a su multiplicación continua.
Uno de los puntos críticos del proceso de la caña es la extracción del jugo, pues
representa pérdidas de azúcar de un 13% por inversión química; un 25% por efecto
enzimático y un 62% por inversión microbiológica, debido a que se presentan
condiciones favorables para el desarrollo de microorganismos, como es el caso de
Leuconostoc mesenteroides, que a partir de la sacarosa produce cantidades
apreciables de dextrana (Arvizu-Bernal y Ramos-Medina, 2010). Es esta la razón por la
que se lleva un control de dichos microorganismos contaminantes mediante el uso de
biocidas tales como: ditiocarbanatos, cloruro de benzalconio, y otras sales cuaternarias
de amonio como bifluoruro de amonio y formaldehído (Kochergin, 2002). Sin embargo,
de acuerdo con Cuervo-Mulet et al. (2010), el uso de reactivos químicos para el control
de microorganismos en la industria alimentaria pueden ser tóxicos al humano o dañar
al ambiente. Existen reportes científicos de la producción de bacteriocidas por el
género Weissella.
3 Las gomas tienen la terminación -ana después del nombre abreviado del glúcido de origen. Por tanto,
debe decirse dextrana (proveniente de la dextrosa o glucosa) (Nota de la asesora)
Primera Parte I-2: Capítulo 1
108
1.2. Justificación
Los productos que se han utilizado para la desinfección y/o sanitización de la caña de
azúcar son: ditiocarbamatos, cloruro de benzalconio y otras sales cuaternarias de
amonio como bifluoruro de amonio y formaldehído (Kochergin, 2002). Sin embargo, el
uso de reactivos químicos para el control de microorganismos en la industria
alimentaria se ve confrontado con el hecho de que pueden ser tóxicos al humano o
dañar al ambiente (Cuervo-Mulet et al., 2010). Por ello, una alternativa es utilizar la
especie Weissella confusa, la cual es una bacteria ácido láctica heterofermentativa,
utilizada por su actividad bactericida que puede reducir la cantidad de biocida sintético
utilizado actualmente en la industria de extracción del jugo de caña, ya que se ha
estudiado el efecto antagónico de Weissella confusa contra Streptecoccus dysgalactiae
ATCC27957 y Escherichia coli (Espeche et al., 2009) y contra especies de
Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae, principales patógenos causales de
mastitis bovina (Serna-Cock et al., 2010).
1.3. Objetivos
1.3.1. Objetivo general
Identificar dos bacterias predominantes en jugo de caña de azúcar, Weissella confusa y
Leuconostoc mesenteroides) evaluando la susceptibilidad a dos biocidas comerciales
(cloruro de benzalconio y metam de sodio) y comparando las dosis empleadas para
cada una de ellas.
1.3.2. Objetivos particulares
Revisar las características que presenta la bacteria Weissella confusa, así como
las aplicaciones que éstas tienen en los diferentes campos de la ciencia
Aislar a Leuconostoc mesenteroides y Weissella confusa en el jugo de caña de
un ingenio azucarero
Primera Parte I-2: Capítulo 1
109
Identificar a Leuconostoc mesenteroides y Weissella confusa en el jugo de caña
de un ingenio azucarero
Evaluar la susceptibilidad de Weissella confusa y Leuconostoc mesenteroides en
presencia de dos biocidas comercial y comparar la dosis empleada
Usar al formaldehído como biocida de referencia en la comparación de los dos
biocidas en esta investigación
Determinar si Weissella confusa puede actuar de forma antagónica o como
bacteriocida ante Leuconostoc mesenteroides
1.4. Hipótesis
Hipótesis Nula Ho = La dosis aplicada de biocidas no produce efectos inhibitorios a las
bacterias del género Weissella
Hipótesis Alternativa Ha = La aplicación de los biocidas produce efectos inhibitorios a
las bacterias del género Weissella
Primera Parte I-2: Capítulo 2
110
2. Antecedentes
2.1. Caña de azúcar
La caña de azúcar (Saccharum officinarum) es originaria de Nueva Guinea, se trata de
una gramínea tropical. Es un pasto gigantesco que posee un tallo macizo que puede
tener de dos a cinco metros de altura. Su diámetro puede ser de cinco a seis
centímetros. En su tallo se forma y acumula jugo, el cual es rico en sacarosa,
compuesto que al ser extraído y cristalizado industrialmente forma el azúcar. Su cultivo
se desarrolla en zonas tropicales, durante la siembra se requiere una gran cantidad de
agua para permitir la absorción, transporte y asimilación de nutrientes. Su periodo de
crecimiento varía entre 11 y 17 meses dependiendo de la zona donde es cultivada
(SIAP, 2015). En el mundo existen alrededor de 25 especies reconocidas como caña
de azúcar (Zarco-Mercado, 2014).
Su composición depende de la variedad, edad, madurez, clima, suelo y forma de ser
cultivada, el tronco de la caña se encuentra compuesto por fibra en un 11 a 16%, de
agua en un 73 a 76%, y de sacarosa de un 8 a 15%, siendo esta ultima la más
importante ya que al ser cristalizada se forma azúcar el cual es uno de los productos
básicos (Zarco-Mercado, 2014).
2.2. Industria azucarera en México
En México el cultivo de caña de azúcar dio origen a un sistema agroindustrial después
de ser introducida por Cortés a Veracruz durante la conquista española. Por ello, esta
actividad económica tuvo sus orígenes desde la conquista y hoy en día es una de las
actividades con mayor tradición y trascendencia en el desarrollo histórico (Crespo,
1988). En México es considerada una de las actividades más importantes teniendo un
área cultivada de 708.3 mil hectáreas (ha), generando más de 440 mil empleos directos
y beneficios indirectos a más de 2.2 millones de personas (DOF, 2015), se cuenta con
62 ingenios, pero solamente 58 de ellos se encuentran activos. Esta actividad ha
representado el 4.7% del Producto Interno Bruto (PIB) del sector primario y el 2.3% del
PIB manufacturero.
Primera Parte I-2: Capítulo 2
111
En México los mayores estados con números de hectáreas cultivadas son Veracruz
que representa un 36.7% del total nacional, Jalisco un 11.4%, San Luis Potosí un
10.3% y el resto lo representan doce estados más.
Fig. 1. Participación estatal de caña de azúcar molida 2012/2013 (CONADESUCA, 2015)
2.3. Proceso de obtención de azúcar
El azúcar es un producto básico para la sociedad ya que es esencial y necesario para
la dieta alimenticia. Esta característica no es la única que le da la importancia que
representa, puesto que también es de una materia prima esencial para diversas
industrias, confitería, panificación, bebidas, productos químicos de sus subproductos
como la celulosa, el etanol, etc., etc. Son estas algunas de las razones por las que el
cultivo y proceso de obtención de la azúcar se ha vuelto un tema de estudio para
muchos investigadores (Fig. 2).
2.3.1. Cultivo de la caña de azúcar
Se prepara el terreno para su cultivo, posteriormente se selecciona una buena semilla,
la cual debe de estar libre de plagas y enfermedades, para ser sembrada, se trata de
un cultivo poco exigente pues no suele soportar temperaturas inferiores a los 0°C y su
Primera Parte I-2: Capítulo 2
112
temperatura optima de crecimiento suele ser de 30°C, requiere de abundante agua
(Zepeda-Guardado, 2012).
Fig. 2. Proceso de obtención de azúcar (CENICAÑA, 2010)
2.3.2. Quema
Esta operación en campo, que actualmente se considera muy contaminante por la
producción de hollín, se debe hacer cuando no es posible técnicamente la cosecha con
las plantas verdes. En la quema se eliminan las hojas y se logra la pérdida de turgencia
de las hojas que son muy filosas y dañan la piel de los cortadores de caña, ayudando
además a ahuyentar a los animales dañinos como las víboras de cascabel.
Desafortunadamente, la quema aumenta la temperatura del tallo de 55°C hasta 85°C y
no destruye a microorganismos termófilos, ya que se han encontrado posteriormente a
esta operación. Además, se ha observado el incremento de dextranas a casi diez veces
desde las 12 a las 48 horas (h) de la quema (Bonilla-Vidal, 2013).
Primera Parte I-2: Capítulo 2
113
2.3.3. Corte de la caña
El corte de la caña puede ser manual o mecánico: para el corte manual se utilizan
machetes y los cortadores se agrupan en parejas, cada pareja corta seis surcos que
forman una manga. Ésta es ubicada en el centro de los surcos para después ser
levantada por las llenadoras y colocada en los camiones.
Por otro lado, el corte mecánico se realiza con máquinas (cosechadoras), las cuales
cortan, pican y limpian y envían la caña directamente en el camión. Durante esta
operación Leuconostoc mesenteroides puede agredir a la caña debido a que hay una
exposición del tejido interno de la caña (Zepeda-Guardado, 2012).
2.3.4. Transporte a la fábrica
Una vez cortada la caña, es transportada hacia los ingenios, esperando que el tiempo
de traslado no sea mayor a 36 h. Ahí es llevada a las básculas para pesarla.
Posteriormente se distribuye en los tándem de molinos. Cada tándem de molido, posee
dos vibradoras de caña, una vez que son viradas las cargas de caña, se lavan para
quitar la tierra y suciedad que traen del campo (ZAFRANET, 2015).
2.3.5. Picado de la caña
Las picadoras son unos ejes colocados sobre conductores, provistas de dos cuchillas
giratorias las cuales cortan los tallos para darles un tamaño uniforme y desmenuzar la
caña (CENICAÑA, 2010).
2.3.6. Molienda
La caña preparada por las picadoras es llevada hasta los molinos, los cuales por
medio de una compresión extrae el jugo, durante esta etapa se agrega un poco de
agua caliente con la finalidad de extraer la mayor cantidad de sacarosa. Esta agua es
conocida como de imbibición. El jugo que se extrae en esta etapa se conoce como jugo
mixto, el cual tiene un pH de 5.0 a 5.6. Es abundante en sales orgánicas e inorgánicas,
y tiene una cantidad de sólidos totales de 10 a 18°Bx. Se considera un medio ideal para
la proliferación de microorganismos. La cantidad de microorganismos presentes en
jugos obtenidos puede variar dependiendo de la caña, pues para cañas normales el
Primera Parte I-2: Capítulo 2
114
recuento es de 105 a 107 UFC/mL, mientras que para cañas ácidas es de 108 UFC/mL
(Bonilla-Vidal, 2013). Esta operación es un punto crítico en la obtención de azúcar
puesto que las condiciones de operación de los molinos y la calidad de la caña,
contribuyen a la pérdida de sacarosa de un 13% por inversión química; un 25% por
efecto enzimático y un 62% por inversión microbiológica, debido a que se presentan
condiciones favorables para el desarrollo de microorganismos, como es el caso de
Leuconostoc mesenteroides, que a partir de la sacarosa produce cantidades
apreciables de dextranas (Arvizu-Bernal y Ramos-Medina, 2010).
2.3.7. Clarificación
En esta operación el jugo que es obtenido de la molienda, que es ácido ya que posee
un pH aproximado de 5.0 a 5.6, es opaco y turbio, por lo que es tratado con una
lechada de cal mediante un tratamiento térmico a 105°C aproximadamente. Este
procedimiento se realiza con la finalidad de elevar el pH para disminuir las pérdidas de
sacarosa. También se logra la precipitación de las impurezas orgánicas e inorgánicas
formándose un lodo llamado cachaza los cuales son sólidos que no son considerados
glúcidos. Por el fondo del clarificador sale la cachaza y por la parte superior el jugo
clarificado. La cachaza es filtrada y lavada para recuperar la mayor cantidad posible de
jugo y de sacarosa. Posteriormente, es enviada al campo donde se usa como
mejorador de los suelos. De esta manera el jugo clarificado se manda a los tanques
evaporadores (Bonilla-Vidal, 2013).
2.3.8. Evaporación
Este proceso es llevado a cabo en evaporadores al vacío de efecto múltiple, conocidos
coloquialmente como “tachos” en la industria azucarera. En esta operación unitaria se
elimina la mayor cantidad de agua posible en el jugo, con la finalidad de obtener la
meladura (jarabe). En esta etapa es importante la ausencia de dextranas, ya que estas
pueden provocar un mayor gasto energético por el aumento de la viscosidad, además
de aumentar el tiempo de cocción de las masas, provocando el agotamiento de las
mismas (INAZUCAR, 2015).
Primera Parte I-2: Capítulo 2
115
2.3.9. Cristalización y centrifugación
Una vez concentradas las meladuras se lleva a cabo la cristalización del azúcar en
“tachos” al vacío de simple efecto, donde el jarabe se sigue evaporando para formar
soluciones saturadas de sacarosa denominadas templas. Por lo general, en la industria
se utilizan tres tachos (Fig. 3), de los cuales se obtienen tres tipos de "masas cocidas".
La masa A obtenida del tacho A es una mezcla de cristales de sacarosa y miel, la cual
al pasar por una de las centrifugas da como resultado el azúcar que se comercializa.
La miel A, la cual alimenta al segundo tacho, da la masa B de cristales, que al ser
centrifugados producen el magma B, utilizado como semilla en la cristalización del
tacho A. La miel B que se obtiene de esta segunda separación se alimenta al “tacho” C,
en el cual se pasa por un equipo de cristalización en frío llevando a cabo un
agotamiento de la masa C por disminución de la solubilidad ante una caída de la
temperatura. Estos pequeños cristales también son usados como semilla de
cristalización.
Las llamadas mieles finales o melazas de la salida del “tacho” C ya tienen muy poca
sacarosa por lo que son enviadas a tanques de almacenamiento para su uso, sobre
todo, como fuente de carbono para la industria biotecnológica (producción de
antibióticos, vacunas, aminoácidos esenciales, etanol, etc.) (CENICAÑA, 2010).
2.3.10. Secado y enfriado
El azúcar húmeda es transportada por elevadores y bandas para alimentar las
secadoras que son elevadores rotatorios en los cuales el azúcar se coloca en contacto
con el aire caliente que circula en contracorriente, se debe de tener una humedad
aproximada de 0.05% con la finalidad de evitar la formación de terrones. El proceso de
enfriado se lleva a cabo a 60°C empleando enfriadores rotatorios inclinados en los que
fluye aire frío en contracorriente que disminuye su temperatura hasta un 40-45°C, el
azúcar enfriado se empaca en sacos de diferente peso (INAZUCAR, 2015).
Primera Parte I-2: Capítulo 2
116
Fig. 3. Etapa de cristalización y centrifugación (CENICAÑA, 2010)
2.4. Microorganismos en la industria azucarera
La presencia de microorganismos en la industria azucarera comienza desde el campo,
ya que estos pueden provenir del suelo o de estructuras vegetales en putrefacción, los
tres principales grupos de microorganismos que causan deterioro son: mohos,
levaduras y bacterias, los cuales en la etapa de extracción del jugo (molienda),
representan pérdidas de azúcar en un 62%, debido a la inversión del azúcar por los
microorganismos que proliferan en condiciones favorables (Arvizu-Bernal y Ramos-
Medina, 2010).
Los principales géneros de mohos que se pueden encontrar presentes son, Penicillum,
Asperguillus, Asoperguillus, Trichoderma, Monilia, de levaduras Saccharomyces,
Candida, Kloeckera, Pichia, Kluyvoromyces, Hansenula y de bacterias Bacillus,
Leuconostoc, Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Pseudomonas, Klebsiella,
Cytobacterium, Micrococcus, Staphilicoccus y Clostridium. Algunos estudios recientes
muestran que Leuconostoc mesenteroides, en las primeras 6 horas de su crecimiento a
30°C, puede consumir hasta 8.6 g L-1/h (Bonilla-Vidal, 2013), provocando la producción
Primera Parte I-2: Capítulo 2
117
de dextranas y causando grandes pérdidas en los rendimientos de obtención de
azúcar.
2.4.1. Leuconostoc mesenteroides
El género Leuconostoc pertenece a la familia Leuconostocacea, se trata de una
bacteria ácido láctica heterofermentativas, con morfología de cocoide ovoide Gram
positivo, agrupados en pares o cadenas cortas, son anaerobias facultativas, con
ausencia de esporas pero presencia de cápsula, son catalasa negativa, productores de
ácido láctico y CO2, además de ser resistentes a la vancomicina, en agar MRS
presenta colonias de forma circular con superficie lisa, traslucidas, color crema, con
consistencia viscosa, elevación convexa y borde entero, son responsables de la
biosíntesis de dextranas y levano extracelular en presencia de sacarosa (Mendoza-
Hernández, 2010).
La bacteria Leuconostoc mesenteroides, tiene diversas subespecies tales como:
Leuconostoc mesenteroides subespecies mesenteroides, Leuconostoc mesenteroides
subespecies dextranicum, y Leuconostoc mesenteroides subespecies cremoris. El
género Leuconostoc no crece a 45°C, son arginina descarboxilasa negativa y algunas
de las subespecies no biodegradan la arabinosa.
Durante la obtención de azúcar una de las operaciones criticas del proceso es la
extracción del jugo (molienda), ya que el jugo extraído posee una cantidad de sólidos
totales de 10 a 18°Bx, un pH de 5.0 a 5.6, abundantes sales orgánicas e inorgánicas y
una temperatura de 25 a 30°C (Bonilla-Vidal, 2013), lo que lo hace un medio ideal para
la proliferación de ciertos microorganismos. El género Leuconostoc juega un importante
papel en la producción de azúcar, ya que su presencia durante el proceso puede
ocasionar grandes pérdidas, cercanas al 20% del total, debido a que utiliza a la
sacarosa para la producción de dextranas (Fig. 4). Estas dextranas no solamente
reducen el contenido de azúcar en los jugos sino que aumentan su viscosidad haciendo
su manejo mucho más difícil desde el punto de vista tecnológico.
Las dextranas son polisacáridos constituidos por unidades de glucosa en forma de
cadena recta mediante enlaces α 1-6. Pueden presentar diferentes ramificaciones en
su estructura molecular, dependiendo de la clase de bacteria que las produzca, lo cual
Primera Parte I-2: Capítulo 2
118
causa diferencia estructural en el polímero (Flores-Santillán y Pérez-Cordero, 2013),
para que se considere una dextrana por lo menos entre en 50-60% de la uniones
deben ser α 1-6. En la industria azucarera estos compuestos son indeseables debido a
que aumentan la viscosidad de los jugos extraídos, obstruye tuberías, y bombas, crean
problemas en los elevadores y tachos, además de que prolongan la formación de
cristales debido a que se forman cristales en forma de aguja. El agotamiento de las
masas es menor y dificulta la eliminación de las mieles en las centrifugas por lo que
requiere de un mayor lavado y una mayor circulación de las mieles
Fig. 4. Síntesis de dextrana a partir de sacarosa (Larrahondo, 1995)
2.4.2. Weissella confusa
El género Weissella incluye a las especies previamente asignadas a Lactobacillus y
Leuconostoc (Collins et al., 1993). Es una bacteria ácido láctica heterofermentativa,
aerobia facultativa, cuya morfología pueden ser cocobacilos cortos, Gram positivos,
agrupados en pares o cadenas cortas. Forman colonias pequeñas con elevación
convexa, con borde entero, viscosas suaves y, en ocasiones, pueden ser traslúcidas u
opacas, color crema y, en algunos casos, amarillas muy parecidas a Leuconostoc
mesenteroides e incluso pueden llegar a confundirse, ya que también son catalasa
negativa. Algunas especies del género Weissella pueden descarboxilar la arginina y
biodegradar la arabinosa.
Primera Parte I-2: Capítulo 2
119
Hoy en día es una bacteria muy estudiada y esto se debe a su actividad bacteriocida.
Existen diversos estudios científicos que muestran la producción de bacteriocinas del
género Weissella. Espeche et al. (2009) aislaron de muestras de leche de bovinos
sanos especies de Weissella paramesenteroides con efecto antagónico contra
Streptecoccus dysgalactiae ATCC27957 y Escherichia coli, Serna-Cock et al. (2010)
reportaron la actividad antimicrobiana de Weissella confusa aislada de líquido rumial
bovino contra especies de Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae
principales patógenos causales de mastitis bovina, Cock et al. (2012) evaluaron la
actividad antimicrobiana de Weissella confusa contra Escherichia coli ATCC 25922 y
Klebsiella pneumoniae los cuales son patógenos causales de enfermedades
producidas por alimentos. Por otro lado, Nam et al. (2002) encontraron que Weissella
confusa puede actuar como probiótico que puede reducir la capacidad de infección por
Helicobacter pylori.
2.5. Pruebas bioquímicas (MacFaddin, 2003)
Las pruebas bioquímicas permiten determinar características metabólicas. Algunas de
estas pruebas son rápidas y su lectura puede ser en cuestión de segundos hasta pocas
horas, debido a que se evalúa una enzima preformada. Sin embargo, la mayoría de las
pruebas detectan componentes metabólicos o la sensibilidad de los microorganismos
ante algunas sustancias, por lo que en este caso se requiere el crecimiento del
microorganismo con una incubación previa de 18 a 48 h.
2.5.1. Catalasa
Es una prueba para determinar la presencia de la enzima catalasa. Dicha enzima
descompone el peróxido de hidrógeno, el cual es el producto final oxidativo de la
degradación aerobia de los glúcidos. La catalasa elimina en forma catalítica los
intermediarios de la reducción del oxígeno (Fig. 5).
Fig. 5. Reacción del peróxido de hidrógeno y la enzima catalasa (MacFaddin, 2003)
Primera Parte I-2: Capítulo 2
120
Dicha prueba es llevada a cabo utilizando como reactivo peróxido de hidrógeno al 30%
y un cultivo puro de 24 h. El burbujeo inmediato indica la liberación de O2, por lo que la
prueba se considera positiva; es decir, que existiendo la presencia de la enzima
catalasa, la prueba se considera negativa al no existir burbujeo.
2.5.2. Descarboxilación de arginina
La descarboxilación es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas
descarboxilasas específicas atacan los aminoácidos en su carboxilo terminal (-COOH)
para formar una amina o una diamina y dióxido de carbono. La descarboxilación está
restringida a aminoácidos que poseen por lo menos un grupo químicamente activo
distinto de una amina (-NH2) o un grupo -COOH y la degradación de los aminoácidos
ocurre en anaerobiosis.
La L-arginina es catabolizado por medio de dos sistemas que pueden ocurrir de
manera simultánea o separada. Estas dos vías metabólicas son el sistema de la
arginina hidrolasa y arginina descarboxilasa. La primera se realiza en dos pasos, la
degradación de L-arginina a L-citrulina, seguida por un sistema que fracciona la
citrulina en L-ornitina hasta llegar a putrescina (Fig. 6).
Fig. 6. Sistema de arginina dihidrolasa (MacFaddin, 2003)
En la descarboxilación, antes de llegar al producto final, se produce agmatina la cual es
una molécula más grande que la putrescina. Esta última no es considerada como
Primera Parte I-2: Capítulo 2
121
producto final en el catabolismo, por lo que es degradada mediante dos vías, por la
acción de las enzimas agmatinasa y agmatina dihidrolasa, hasta llegar a su producto
final (Fig. 7).
Fig. 7. Descarboxilación de la arginina (MacFaddin, 2003)
2.5.3. Biodegradación de arabinosa
Esta biorreacción (mal llamada “fermentación”4) es una prueba en donde se observa la
capacidad de un microorganismo para fermentar un hidrato de carbono específico. Las
bacterias que biodegradan un hidrato de carbono por lo común son aerobios
facultativos. Un hidrato de carbono se degrada y fracciona en dos triosas que
posteriormente se degradan a una cantidad de compuestos de 1, 2, 3 y 4 carbonos.
4 El término fermentación fue acuñado por Louis Pasteur para nombrar la reacción anaerobia realizada
por Saccharomyces cerevisiae sobre la glucosa para producir alcohol etílico y bióxido de carbono. Por tanto, cualquier otra biorreacción NO es una fermentación. En este libro se les denomina biorreacciones (Nota de la asesora)
Primera Parte I-2: Capítulo 2
122
2.6. Biocidas en la industria azucarera
En la industria azucarera se usan los biocidas habitualmente para el control de
microorganismos tales como Leuconostoc spp. Estos métodos químicos generan
ciertas dificultades, especialmente para la industria alimentaria, puesto que pueden ser
tóxicos al humano o acarrear graves consecuencias al ambiente. Es por esta razón que
la industria ha buscado el uso de microorganismos antagonistas, inocuos y que no
tengan repercusión en el proceso. Los biocidas más utilizados para la desinfección y/o
sanitización de la caña de azúcar son: ditiocarbamatos y otros carbamatos, cloruro de
benzalconio y otras sales cuaternarias de amonio como bifluoruro de amonio y
formaldehído (Tabla 1).
Tabla 1. Biocidas utilizados en la industria azucarera y sus características Nombre del biocida Dosis empleada DL50 Referencias
Dimetil ditiocarbamato de sodio 15-20 mg kg-1 1000 mg kg-1 oral en
ratas Bonilla-Vidal (2013)
Cloruro de benzalconio 50-100 mg kg-1 400 mg kg-1 oral en ratas
Villa (2008)
Formaldehído 0.2-0.5mg kg-1 100 mg kg-1, oral en ratas
OMS (1982)
2.6.1. Cloruro de benzalconio (CB)
Es una sal de amonio (Fig. 8), ya que es una mezcla sinérgica de constituyentes
cuaternarios de tetra-alquil y tri-alquil amonio. En la industria azucarera es utilizado en
los molinos debido a sus propiedades bactericidas, bacteriostáticas y fungicidas
derivadas de su superficie catiónica activa. Su aplicación asegura una rápida
eliminación de todo tipo de microorganismos, cubriendo un amplio espectro de las
bacterias Gram positivas, Gram negativas y levaduras (Villa, 2008).
También es empleado como antiséptico y desinfectante de la piel, de materiales de
industrias alimentarias y en algunos compuestos cosméticos, incluso para lentes de
contacto.
Primera Parte I-2: Capítulo 2
123
Fig. 8. Estructura del cloruro de benzalconio (Shandong IRO, 2016)
Su mecanismo de acción bactericida es a través de tres niveles, alteración de la
membrana celular, desnaturalización de proteínas e inactivación enzimática. Estos
mecanismos se deben a su estructura anfipática, debido a las cadenas carbonatadas
(hidrófobas) las cuales penetra en las membranas, mientras que el nitrógeno catiónico
(hidrófilo) interacciona con los fosfatos de los fosfolípidos, lo que provoca que haya una
salida del material citoplasmático hacia el exterior y la alteración celular. Esta familia de
biocidas son considerados desinfectantes de bajo nivel. La ficha técnica que describe al
compuesto se muestra en la Tabla 2.
2.6.2. Metam-sodio (MS)
Es un derivado del ácido carbámico (Fig. 9), el cual se ha empleado como
desinfectante de suelo, reduciendo sustancialmente las poblaciones de nemátodos y
hongos. La mayoría de los ditiocarbamatos son usados como herbicidas y su
clasificación depende de la característica de la sustitución de uno o ambos hidrógenos
en cada nitrógeno. Es conocido también como metilditiocarbamato de sodio,
ditiocarbamato (Flores-Santillán y Pérez-Cordero, 2013).
Fig. 9. Estructura del metam-sodio (Bonilla-Vidal, 2013)
Primera Parte I-2: Capítulo 2
124
Permite controlar las malezas y sus semillas en proceso de germinación. Es
ampliamente utilizado en la industria de alimentos pero, principalmente, en la
extracción de jugo de caña de azúcar. Su acción radica en la inhibición de Leuconostoc
mesenteroides ya que posee una ligera actividad anticolinesterásica y presenta una
gran capacidad para la captación de metales en su interacción con radicales sulfhidrilo.
La ficha técnica que describe al compuesto se muestra en la Tabla 3.
2.6.3. Formaldehído
El formaldehído, también conocido como metanal, es un compuesto de carbono,
hidrógeno y oxígeno (Fig. 10). Es un gas incoloro y de olor sofocante, considerado
como un eficaz biocida y utilizado también como conservador en la fabricación de ropa,
plásticos, papel y tableros. En la industria azucarera se le utiliza para el control de
microorganismos contaminantes debido a que su capacidad bactericida radica en su
efecto alquilante de los grupos sulfhidrilo, hidroxilo, carboxilo o amina. Produce
hidroximetilaciones o condensaciones (entrecruzamientos) en las proteínas y en los
nitrógenos de los anillos de las bases púricas, por lo que su espectro es muy amplio
(OMS, 1982).
Se comercializa principalmente en forma de solución acuosa del 37-50% v/v y son
conocidas como formol, formalina, aldehído fórmico o metanal. Por lo general estas
soluciones son utilizadas como conservadores. Es soluble en agua y en disolventes
orgánicos; pero insoluble en éter de petróleo. La ficha técnica que describe al
compuesto se muestra en la Tabla 4.
Fig. 10. Estructura del formaldehído (McMurry, 2008)
Primera Parte I-2: Capítulo 2
125
Tabla 2. Ficha técnica del cloruro de benzalconio (MAPFRE, 2015, con algunas modificaciones)
Cloruro de benzalconio CAS: 63449-41-2
ICSC: 1584
Propiedades físicas Punto de sublimación: 350°C Punto de fusión: 29-34°C Densidad relativa(agua=1):1.5
Solubilidad en agua, g/100mL a 25°C: 28 Presión de vapor, kPa a 160°C: 0.13
Datos importantes Estado físico; aspecto: Polvo higroscópico blanco a amarillo, de olor característico. Peligros químicos: La sustancia se descompone al calentarla intensamente, produciendo humos tóxicos y corrosivos incluyendo vapores amoniacales, vapores de cloro y óxidos de nitrógeno. Límites de exposición: TLV (valor techo) no establecido. MAK (sensibilización cutánea) no establecido.
Vías de exposición: La sustancia se puede absorber por inhalación. Riesgos de inhalación: Al producirse una pérdida de gas, se alcanza muy rápidamente una concentración nociva de éste en el aire. Efectos de exposición de corta duración: La sustancia irrita gravemente los ojos e irrita el tracto respiratorio. La inhalación puede originar edema pulmonar Efectos de exposición prolongada o repetida:Esta sustancia es carcinógena para los seres humanos.
Datos ambientales Sustancia muy tóxica para los organismos acuáticos. Evítese de forma efectiva que el producto químico se incorpore al ambiente. Toxicidad Animal Dosis
En especies acuáticas Carpa y pez zebra 500 mg/L
Oral exposición aguda Ratas 7 mL (al 0.1%) /kg
Oral exposición aguda Ratas 5mL (al 0.13%) kg
DL50 oral en ratas Ratas 400 mg/kg
Toxicidad ocular exposición aguda
Conejos albinos 0.1 mL (al 0.65% c/ojo)
Primera Parte I-2: Capítulo 2
126
Tabla 3. Ficha técnica del metam-sodio (Arvizu-Bernal y Ramos-Medina (2010), con modificaciones)
Metam-sodio CAS: 137-42-8
Peso molecular: 129.17
Propiedades físicas Punto de ebullición: 97 a 102 °C Punto de fusión: -5 a 0 °C Densidad relativa(agua=1):1.250 Presión de vapor: 0.0575 Pa a 20 °C Solubilidad en agua: 722 g/L aproximadamente
pH solución al 42 % (a 20 °C): 7.5-10.5 Presión de vapor, kPa a 160 °C: 0.13 Temperatura de autoignición: No determinada Punto de inflamación: 66 °C
Datos importantes Estado físico; aspecto: A 20 °C es líquido, de color amarillo-verde de olor azufrado. Peligros químicos: Se descompone cuando se diluye con agua en metil-isotiocianato (gas lacrimógeno y moderadamente venenoso) y en sulfuro de hidrógeno (gas altamente venenoso). En contacto con ácidos fuertes y se descompone en sulfuro de carbono y monometilamina (gases altamente inflamables).
Degradabilidad: Se degrada rápidamente en el ambiente por contacto con la humedad del suelo. Medio ambiente acuático. De acuerdo con los resultados de los ensayos de biodegradabilidad biodegradable. Estabilidad: El producto es estable si es almacenado y manipulado según las recomendaciones dadas.
Toxicidad Animal Dosis
Toxicidad aguda oral Ratas 820 mg /kg
Toxicidad aguda oral Conejos 825 mg/kg
Toxicidad aguda cutánea Ratas 800 mg/kg
Toxicidad aguda cutánea Conejos 2020 mg/kg
Dosis letal hombre Hombre 600 mg/L 30 min; 800 mg/L inmediatamente/ letalmente
Primera Parte I-2: Capítulo 2
127
Tabla 4. Ficha técnica del formaldehído (MAPFRE, 2015, con modificaciones) Formaldehído CAS: 50-00-0
ICSC: 0275 Masa molecular: 30.0
Propiedades físicas Punto de ebullición: -20 °C Punto de fusión: -92 °C Densidad relativa(agua=1):1.08
Punto de inflamación: gas inflamable Temperatura de autoignición: 430 °C Limites de explosividad, % en volumen en el aire: 7-73
Datos importantes Estado físico; aspecto: Gas, de olor característico. Peligros físicos: Se puede mezclar con el aire, formándose fácilmente mezclas explosivas. Peligros químicos: La sustancia polimeriza debido al calentamiento suave. Reacción con oxidantes. Límites de exposición: TLV: 0,3 ppm (valor techo), A2 (sospechoso de ser cancerígeno humano); SEN (ACGIH 2004). MAK: 0,3 ppm; 0,37 mg/m3; Sh (sensibilización cutánea); Categoría de limitación de pico: I(2); Cancerígeno categoría: 4; Mutágeno categoría: 5; Riesgo para el embarazo: Grupo C ; (DFG 2004).
Vías de exposición: La sustancia se puede absorber por inhalación. Riesgo de inhalación : Al producirse una pérdida de gas, se alcanza muy rápidamente una concentración nociva de éste en el aire. Efectos de exposición de corta duración: La sustancia irrita gravemente los ojos e irrita el tracto respiratorio. La inhalación puede originar edema pulmonar Efectos de exposición prolongada o repetida:Esta sustancia es carcinógena para los seres humanos.
Toxicidad Animal Dosis Exposición aguda Ratas wistar macho 30 ppm/6h
Exposición subcrónica Ratones 40 ppm/5h
Carcinogenicidad o exposición crónica
Ratones Sol. 10 % en agua
Carcinogenicidad o exposición crónica
Ratas wistar hembra 15 o 82mg/kg
Carcinogenicidad o exposición crónica
Embriones de ratas 1500 o 100 ppm
Primera Parte I-2: Capítulo 3
128
3. Metodología
3.1. Equipo y reactivos
Los reactivos y equipo que se utilizaron para el desarrollo de esta investigación, se
muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. Reactivos y equipo con distribuidor y especificaciones Reactivos y equipo Distribuidor y especificaciones
Agar MRS (De Man, Rogosa y Sharpe) Dibico Caldo rojo de fenol con arabinosa Dibico Caldo base descarboxilasa de moeller Dibico L-Arginina CIVEQ Agua peptonada Marca Solución salina isotónica (SSI) 0.9% NaCL J.T.Baker Formaldehído (biocida) J.T. Baker, al 37% Agar nutritivo Dibico Solución salina Sol. acuosa de NaCl 0.45% a 0.5%, pH
4.5 a 7.0. Dibico N-metilditiocarbamato de sodio (MS) (biocida)
Chem Service S.A. de C.V.
Cloruro de benzalconio (biocida) CIVEQ, al 90% Colorante cristal violeta HYCEL de México S.A de C.V. Safranina HYCEL de México S.A de C.V. Solución alcohol-cetona Preparada en el laboratorio, con acetona
J.T Baker y etanol al 95%. Lugol HYCEL de México S.A de C.V. Tinta china Pelikan Cajas Petri de 100 x 15 mm SyM Laboratorios Tubo de ensaye de poliestireno claro de 12x75 mm
Dilabr
Asa bacteriológica Veravitrum Incubadora a 35°C SEV-BIGM48S Incubadora a 45°C LUZEREN mod: DHP-9052 Campana de flujo laminar SEV-CFL102 Autoclave TUTTNAUER modelo 2340M Equipo de análisis automatizado MS-bioMérieux VITEK 2.0 systems 06.01 Hisopos estériles Industrias Ruisánchez S.A de C.V. Extractor casero Oster mod. 333-08
Primera Parte I-2: Capítulo 3
129
3.2. Diseño experimental
Experimento 1. Es un diseño experimental unifactorial, debido a que se debe aislar y
contabilizar las colonias existentes de los microorganismos de estudio Weissella
confusa y Leuconostoc mesenteroides a diferentes tiempos y a una misma temperatura
de 37°C, el medio de cultivo utilizado es agar MRS realizando tres repeticiones.
Experimento 2. El diseño experimental es tipo factorial considerando dos factores (a)
dosis; (b) tiempo y tres niveles dando como resultado 33, es decir, 27 pruebas
realizadas por triplicado, con un total de 81.
3.3. Procedimiento
3.3.1. Preparación del medio de cultivo agar MRS
Se rehidrataron 67g del medio en un litro de agua destilada durante 15 minutos (min),
se calentó con agitación constante 1 min a ebullición para su disolución completa, se
esterilizo a 121°C, 103.42 kPa (15 lbf/in2) de presión 15 min, una vez estéril se dejo
enfriar a 45°C, se vació en cajas petri estériles, las placas se conservaron en
refrigeración de 2 a 8°C (DIBICO, 2015)
3.3.2. Preparación de agua peptonada
Se disuelve en un litro de agua destilada 10 g de peptona y 5 g de cloruro de sodio, se
deja reposar de 10-15 min, se agita para disolver completamente y se esteriliza a
121°C, 103.42 kPa (15 lbf/in2) de presión 15 min, se deja enfriar y se colocan 90 mL de
agua peptonada en un matraz estéril, y 9 mL en tres tubos de ensayo estéril, se guarda
en refrigeración para su conservación.
3.3.3. Lavado y pelado de caña
Se lleva a cabo un lavado de la caña utilizando agua solamente, con la finalidad de
eliminar el exceso de tierra que posea, una vez que se lava se deja secar, para
después pelar, quitando la corteza que posee.
Primera Parte I-2: Capítulo 3
130
3.3.4. Toma de la muestra
Se pesaron 344 g de caña de azúcar y mediante la utilización de un extractor casero se
obtuvieron en un recipiente estéril, 61 mL del jugo de la caña.
3.3.5. Inoculación y lectura
Con una pipeta estéril se tomaron 10 mL del jugo de caña extraído y se colocaron en el
matraz que contiene 90 mL de agua peptonada, de la solución anterior se toma 1 mL y
se coloca en uno de los tubos que contiene 9 mL de agua peptonada, se realizó el paso
anterior hasta conseguir una disolución de 10 -4, de esta ultima disolución se tomo 0.1
mL con una pipeta estéril, se colocó en una de las placas de agar MRS y con una
varilla de vidrio en L se extendieron sobre la placa. Cada placa inoculada se incuba a
37°C, por 24, 48 y 72 h. Después de la incubación se seleccionaron las colonias típicas
de Weissella confusa y Leuconostoc mesenteroides, las colonias seleccionadas se
resembraron en placas de agar MRS por agotamiento en placa y se incubaron a 37°C
por 24 h.
3.3.6. Pruebas primarias
3.3.6.1. Tinción de Gram (Ramírez et al., 2008)
Para la caracterización morfológica de las colonias resembradas se realizó una tinción
selectiva de Gram.
a) A partir de una colonia pura de 24 h se colocó en los portaobjetos previamente
desengrasados y rotulados, una asa de los microorganismos de estudio
b) Se dejó secar y fijó pasándolo por la flama del mechero
c) Se agregó a la muestra dos gotas de cristal violeta, dejar actuar por 1 min, para
eliminar el exceso de colorante se lavó con agua destilada
d) Se añadieron dos gotas de lugol (mordente), deja actuar por 1 min, para eliminar
el exceso de mordente se lavó con agua
Primera Parte I-2: Capítulo 3
131
e) La muestra se decoloró con alcohol-cetona hasta que el efluente salga incoloro
para retirar el exceso de solvente se lavó con agua
f) Por último se agregaron dos gotas de safranina se dejó actuar 1 min y se lavó
con agua para retirar el exceso de colorante
g) Se dejó secar la muestra a temperatura ambiente y se observó al microscopio
con objetivo de inmersión.
3.3.6.2. Tinción de cápsula (Ramírez et al., 2008)
Para observar la presencia de cápsula se realizó una tinción diferencial (Anexo I)
a) En el extremo del portaobjetos colocar una gota de agua destilada y suspender
una asada del cultivo puro de 24 h de los microorganismos de estudio
b) Agregar una gota de tinta china sobre la muestra y mezclar perfectamente
c) Colocar el borde de otro portaobjetos limpio sobre la gota y deslizar éste sobre el
portaobjetos que contiene la muestra formando una película delgada
d) Dejar secar al aire, cubrir el frote con cristal violeta y dejar actuar 1 min
e) Secar al aire y observar al microscopio con objetivo de inmersión.
3.3.7. Pruebas bioquímicas
Para la realización de dichas pruebas se resembró una de las colonias aisladas por
agotamiento en placa, para obtener un cultivo puro de 24 h.
3.3.7.1 Catalasa
En un portaobjetos desengrasado se colocó una gota de agua, se suspendió una asa
del microorganismo de estudio y se agregó una gota de peróxido de hidrógeno (H2O2)
al 30 %, se observó el burbujeo inmediato.
3.3.7.2. Descarboxilación de arginina
a) Se rehidrató 1.0504 g de caldo descarboxilasa de Moeller en un 100 mL de agua
destilada y se agregó 1% del aminoácido de estudio, se dejó reposar de 10-15 min,
calentando con agitación constante hasta ebullición 1 min, se distribuyó en tubos
Primera Parte I-2: Capítulo 3
132
de ensayo cada uno con 4 mL del medio y se esterilizó a 121°C, 103.42 kPa (15
lbf/in2) de presión 15 min (NO SOBREESTERILIZAR) (DIBICO 2015).
b) Se rotularon dos tubos con SSI para las bacterias en estudio Weissella confusa y
Leuconostoc mesenteroides
c) Se suspendió una asada del cultivo bacteriano en un tubo con 5 mL de SSI hasta
obtener una suspensión ligeramente turbia
d) A partir de la suspensión anterior se inocularon mediante una asada los tubos que
contenían el caldo descarboxilasa de Moeller, por triplicado para cada una de las
bacterias
e) Se dejó un tubo sin inocular para poder tener un control sobre la prueba. A cada
tubo inoculado junto con el control se le agregaron 2 mL de aceite mineral
f) Se incubaron a 35 °C por 4 días, con una revisión constante de la prueba.
3.3.7.3. Biodegradación de arabinosa
a) Se rehidrataron 2.0020 g de caldo rojo de fenol con arabinosa 100 mL de agua
destilada se dejaron reposar de 10-15 min, calentando con agitación constante
hasta completa disolución.
b) Se distribuyeron en tubos de ensayo con campana de Durham cada uno con 4mL
del medio y se esterilizaron a 121°C, 103.42 kPa (15 lbf/in2) de presión por 15 min
(DIBICO, 2015).
c) Se rotularon dos tubos con SSI para las bacterias en estudio Weissella confusa y
Leuconostoc mesenteroides
d) Se suspendió una asada del cultivo bacteriano en un tubo con 5 mL de SSI hasta
obtener una suspensión ligeramente turbia
e) A partir de la suspensión anterior se inocularon mediante una asada los tubos que
contenían el caldo rojo de fenol con arabinosa, por triplicado para cada una de las
bacterias
f) Se dejó un tubo sin inocular para poder tener un control sobre la prueba y se
incubaron todos los tubos con las tapas ligeramente abiertas a 35°C por 24 h.
Primera Parte I-2: Capítulo 3
133
3.3.8. Prueba automatizada en el equipo VITEK 2
a) Se resembraron cada una de bacterias Weissella confusa y Leuconostoc
mesenteroides por agotamiento en placa en agar nutritivo y se incubaron a 37°C,
24 h
b) A partir del cultivo anterior se inoculó un tubo de ensayo con 3 mL de SSI (con
NaCl 0.45-0.5 %), ajustando una turbidez de 0.5 McFarland
c) Se colocaron, primero el tubo de ensayo en el cassette junto con la tarjeta de
identificación, y después insertando el tubo de trasferencia dentro del tubo con la
suspensión
d) Se instaló el cassette con las muestras en el sistema VITEK 2. Una vez dentro, las
tarjetas se sometieron a inoculación, sellado e incubación (Anexo II).
3.3.9. Preparación de los biocidas de estudio
3.3.9.1. Cloruro de benzalconio (CB)
Se prepararon 25 mL de una solución madre de CB a una concentración de 50 mg L-1.
Para ello se pesaron 1.389 mg de CB con una pureza de 90%, los cuales se disolvieron
en 10 mL de metanol grado cromatográfico (HPLC, en inglés), para después llevar a un
aforo de 25 mL. De la solución anterior se realizaron tres disoluciones, tomando
alícuotas de 1,1.5 y 2 mL y aforando a 5 mL con agua desionizada estéril, para obtener
las concentraciones de estudio 10,15 y 20 mg L-1.
3.3.9.2. Metam-sodio (MS)
Se prepararon 25 mL de una solución madre de MS a una concentración de 50 mg L-1.
Para ello se pesaron 1.274 mg de MS con una pureza de 99%, los cuales se
disolvieron en 10 mL de metanol grado cromatográfico, para después llevar a un aforo
de 25 mL. De la solución anterior se realizaron tres disoluciones, tomando alícuotas de
3, 4 y 4.5 mL y aforando a 5 mL con agua desionizada estéril, para obtener las
concentraciones de estudio 30, 40 y 50 mg L-1.
Primera Parte I-2: Capítulo 3
134
3.3.9.3. Formaldehído
Se prepararon 50 mL de una solución madre de formaldehído a una concentración de
300 mg L-1. Se tomaron 45 μL de una solución de formaldehído al 37% y se llevó a un
aforo de 50 mL con metanol grado cromatográfico. De la solución anterior se tomaron
alícuotas de 35, 50 y 85 μL, las cuales se aforaron a 5 mL con agua desionizada estéril,
para obtener concentraciones de 2, 3 y 5 mg L-1.
3.3.10. Pruebas de resistencia a biocidas
Las pruebas con biocida se realizaron tomando como referencia el documento "A
concise laboratory manual. Arthur Productions Pty Ltd, Sydney. NSW: The antibiotic
reference laboratory, South Eastern Area Laboratory Services", de Bell et al. (1999),
con algunas modificaciones.
a) Para determinar la susceptibilidad de cada uno de los biocidas seleccionados, se
distribuyeron 20 mL de agar en placas de Petri, las cuales se pusieron a secar boca
abajo sin tapa en la incubadora a 35°C durante dos horas
b) Se preparó una suspensión de SSI al 0.9% distribuida en tubos de ensaye cada
uno con 4 mL
c) Con una asa recta fue tomada una colonia (cultivo puro de 24 h) cuyo diámetro sea
de entre 1 y 2 milímetros (mm). La masa bacteriana debe ser visible en la punta del
alambre. Una vez que se tomó parte de la colonia, se inoculó la SSI girando el
alambre recto al menos 10 veces con la punta en contacto con la parte inferior,
hasta obtener una turbidez de 0.5 McFarland
d) Con una micro pipeta se colocaron 100 μL de la suspensión bacteriana en cada
una de las placas Petri y mediante un hisopo estéril se distribuyó el inóculo en la
placa dejando secar de 5 a 10 min
e) Esterilizar las pinzas de punta roma con alcohol y a la flama del mechero y en
condiciones de asepsia, tomar un disco de papel filtro e impregnarlo con el agente
químico a probar, eliminando el exceso por escurrimiento
f) Depositar el disco sobre el agar presionando ligeramente sobre la superficie y
repetir este paso para cada uno de los agentes químicos a evaluar
Primera Parte I-2: Capítulo 3
135
g) Se incubaron a 35°C por 24, 48 y 72 h, se revisaron y midieron cada halo de
inhibición después de la incubación.
3.4. Análisis estadístico
Se realizó un análisis de varianza de un factor para determinar el tiempo óptimo de
crecimiento de las bacterias de estudio. Para la prueba de inhibición de los biocidas se
determinó si los factores que pudieran afectar, mostrados en la Tabla 6, teniendo como
base la información bibliográfica presentada en la Tabla 1, fueron analizados con una
prueba de rango múltiple (Anexo III).
Tabla 6. Diseño experimental para seleccionar de la dosis óptima Niveles Factores 1 2 3 (a) Dosis A B C (b) Tiempo (h) 24 48 72 (c) Biocida MS CB FA MS: ditiocarbamato de sodio; CB: cloruro de benzalconio; A, B y C: 10, 15 y 20 mg L-1; FA: Formaldehído, ; A, B y C: 2, 3 y 5 mg L-1
Primera Parte I-2: Capítulo 4
136
4. Resultados y discusión
4.1. Inoculación y lectura
En la primera parte del experimento se determinó el tiempo óptimo de incubación para
la bacteria de estudio Weissella confusa por lo que se realizaron 5 repeticiones para
cada uno de los tiempos de estudio. Los resultados se presentan en la Tabla 7.
Tabla 7. Unidades formadoras de colonias, UFC, a diferentes temperaturas para Weissella confusa
Tiempo (h) Placas de agar inoculadas
24 48 72
1 20x104 11x105 Incontables 2 0* 17x105 Incontables 3 22x104 13x105 27x105 4 0* 24 x105 Incontables
Unidades formadoras de colonias (UFC)
5 ** ** ** * Las colonias presentes se consideraron como cero ya que el conteo de éstas es menor al intervalo de 30 a
300 **Las colonias presentes en estas placas no se consideraron ya que el agar en el que se inoculó sufrió
fracturas
Para determinar el tiempo óptimo de incubación de Leuconostoc mesenteroides se
presenta la información en la Tabla 8. El factor de estudio es el tiempo de incubación
utilizando 5 repeticiones para cada uno de los tiempos de estudio.
Tabla 8. Unidades formadoras de colonias, UFC, a diferentes temperaturas para Leuconostoc mesenteroides
Tiempo (h) Placas de agar inoculadas 24 48 72
1 0* 14x105 30x105 2 0* 11x105 29x105 3 17x104 14x105 Incontables 4 0* 13x105 Incontables
Unidades formadoras de colonias (UFC)
5 ** ** ** * Las colonias presentes se consideraron como cero ya que el conteo de éstas es menor al intervalo de 30 a
300 **Las colonias presentes en estas placas no se consideraron ya que el agar en el que se inoculó sufrió
fracturas
Primera Parte I-2: Capítulo 4
137
4.2. Pruebas primarias
Las placas de agar MRS fueron incubadas a 37°C durante 24 h, después del tiempo de
incubación se revisaron cada una de las placas encontrando que para Weissella
confusa las colonias características son de color blancas, superficie lisa, opacas,
consistencia viscosa suave de elevación convexa y borde entero (Fig. 11), las pruebas
primarias que se realizaron como tinción de Gram y tinción de cápsula, muestran que
se trata de un cocobacilo Gram positivo, agrupado en cadenas cortas o pares (Fig. 12),
con presencia de cápsula (Fig. 13).
Fig. 11. Colonias en agar MRS de Weissella confusa
Fig. 12. Tinción de Gram y agrupación para
Weissella confusa
Fig. 13. Tinción de cápsula para Weissella
confusa
Primera Parte I-2: Capítulo 4
138
En cuanto a Leuconostoc mesenteroides en el mismo agar presenta colonias de forma
circular, superficie lisa, translúcida, color crema, consistencia viscosa, elevación
convexa y borde entero (Fig. 14).
Las pruebas primarias mostraron que se trata de un cocobacilo Gram positivo,
agrupado en cadenas cortas (Fig. 15), con presencia de cápsula (Fig. 16).
Fig. 14. Colonias en agar MRS de Leuconostoc mesenteroides
Fig. 15. Tinción de Gram y agrupación para
Leuconostoc mesenteroides
Fig. 16. Tinción de cápsula para Leuconostoc
mesenteroides
Primera Parte I-2: Capítulo 4
139
4.3. Pruebas bioquímicas
4.3.1 Catalasa
En las Figs. 17 y 18 se muestran los resultados de la prueba de catalasa que se
realizaron después de 24 h de incubación de las bacterias. Estas muestran que para
ambas bacterias la prueba es negativa.
Fig. 17. Prueba negativa de catalasa para
Weissella confusa
Fig. 18. Prueba negativa de catalasa para
Leuconostoc mesenteroides
4.3.2. Descarboxilación de arginina
Los resultados de la prueba fueron revisados después de la incubación diariamente. La
Fig. 19 muestra el tubo que se tomó como referencia de la prueba. En la Fig. 20 se
observó un resultado positivo para Weissella confusa, mientras que para Leuconostoc
mesenteroides el resultado fue negativo (Fig. 21).
Fig. 19. Tubo de referencia de la prueba descarboxilación de arginina
Fig. 20. Prueba (+) de descarboxilación de
arginina para Weissella confusa
Fig. 21. Prueba (-) de descarboxilación de arginina para Leuconostoc mesenteroides
Primera Parte I-2: Capítulo 4
140
4.3.3. Biodegradación de arabinosa
Para la prueba de biodegradación los resultados fueron revisados a las 24 h de su
incubación, tomando como referencia el tubo de la Fig. 22, mostrando que para
Weissella confusa el resultado fue positivo (Fig. 23), mientras que para Leuconostoc
mesenteroides el resultado fue negativo (Fig. 24).
Fig. 22. Tubo de referencia de la prueba biodegradación de arabinosa
Fig. 23. Prueba (+) de biodegradación de
arabinosa para Weissella confusa
Fig. 24. Prueba (-) de biodegradación de
arabinosa para Leuconostoc mesenteroides
4.4. Prueba automatizada en el equipo VITEK 2
Para confirmar la presencia de las bacterias Weissella confusa y Leuconostoc
mesenteroides, se utilizo el equipo VITEK 2, de acuerdo con los resultados se encontró
que se aisló del jugo de caña a la bacteria Leuconostoc mesenteroides ssp
mesenteroides, y a Weissella confusa con un 96% de confianza.
4.5. Pruebas de resistencia a biocidas
4.6. Cloruro de benzalconio (CB)
Para determinar la resistencia de Weissella confusa y Leuconostoc mesenteroides a los
biocidas de estudio se les midieron los halos de inhibición después de su aplicación a
Primera Parte I-2: Capítulo 4
141
diferentes condiciones (dosis del biocida y tiempo de incubación). En las Tablas 9 y 10
se muestran los resultados obtenidos para cloruro de benzalconio frente a cada una de
las bacterias de estudio.
Tabla 9. Halos de inhibición de Weissella confusa, utilizando CB Temperatura 35°C
Tiempo (h) 24 48 72 Dosis (mg/L) Halo (mm) Halo (mm) Halo (mm)
11 10 11 12.5 12 12.2 10 10 9.8 11 12 10.3 11
13.5 13 13.2 15 12.4 11 12 14.4 12.6 13.2 15.7 14 14.5 20 13.5 13 13
Tabla 10. Halos de inhibición de Leuconostoc mesenteroides, utilizando CB Temperatura 35 °C
Tiempo (h) 24 48 72 Dosis (mg/L) Halo (mm) Halo (mm) Halo (mm)
10.9 10.9 10 10.5 10.3 10 10 11.4 11.4 11 11.1 11 11.2 12 12 11 15 12 11.8 13
12.9 12.5 12 13 12.9 12.3 20
13.5 12.6 12
4.7. Metam-sodio (MS)
Para determinar la susceptibilidad de Weissella confusa y Leuconostoc mesenteroides
en presencia del metam sodio, los resultados obtenidos se muestran en las Tablas 11 y
12 respectivamente.
Primera Parte I-2: Capítulo 4
142
Tabla 11. Halos de inhibición de Weissella confusa, utilizando MS Temperatura 35 °C
Tiempo (h) 24 48 72 Dosis (mg/L) Halo (mm) Halo (mm) Halo (mm)
0 0 0 0 0 0 30 0 0 0
7.8 7.8 7.8 7.8 7.8 7.8 40 8.2 8.2 8.2 10 10 10 11 11 11 45 10 10 10
Tabla 12. Halos de inhibición de Leuconostoc mesenteroides, utilizando MS Temperatura 35 °C
Tiempo (h) 24 48 72 Dosis (mg/L) Halo (mm) Halo (mm) Halo (mm)
0 0 0 0 0 0 30 0 0 0
7.5 7.5 7.5 7.6 7.6 7.6 40 8 8 8
8.3 8.3 8.3 8.3 8.3 8.3 45 8.2 8.2 8.2
4.8. Formaldehído
Los resultados de susceptibilidad para Weissella confusa y Leuconostoc mesenteroides
en presencia de formaldehído, los resultados obtenidos se muestran en las Tablas 13 y
14 respectivamente.
Primera Parte I-2: Capítulo 4
143
Tabla 13. Halos de inhibición de Weissella confusa, utilizando formaldehído Temperatura 35 °C
Tiempo (horas) 24 48 72 Dosis (mg/L) Halo (mm) Halo (mm) Halo (mm)
7 6 8 7 6 10 2 5 9 9 7 9 11 5 8 12 3 6 7 10
10 11 14 8 12 16 5 9 9 17
Tabla 14. Halos de inhibición de Leuconostoc mesenteroides, utilizando formaldehído Temperatura 35 °C
Tiempo (horas) 24 48 72 Dosis (mg/L) Halo (mm) Halo (mm) Halo (mm)
6 6 9 7 7 5 2 8 10 9 7 9 9 7 7 11 3 5 8 10 5 9 11 8 13 15 5 6 12 14
4.9. Pruebas de antagonismo
Se realizó una prueba de antagonismo, para ver si Weissella confusa podía actuar
como antagónico de Leuconostoc mesenteroides los resultados obtenidos muestran
que Weissella confusa no puede actuar como antagónico de Leuconostoc
mesenteroides puesto que ambas pueden desarrollarse en la placa de agar MRS sin
ningún inconveniente (Figs. 25 y 26), esto puede deberse a que ambas bacterias
provienen del mismo género.
Primera Parte I-2: Capítulo 4
144
Figura 25. Prueba de antagonismo para Weissella confusa y Leuconostoc
mesenteroides
Figura 26. Prueba de antagonismo para Weissella confusa y Leuconostoc
mesenteroides
4.10. Análisis estadístico
4.10.1. Tiempos de incubación
En las Tablas 15 y 16 se muestran los resultados de los análisis de varianza realizados
para cada uno de los experimentos de desarrollo de los microorganismos a diferentes
tiempos. Se consideró un diseño unifactorial, por lo que se plantean las hipótesis:
H0: No hay diferencia significativa entre los tiempos de incubación para el desarrollo de
los microorganismos
H1: Hay diferencia significativa en por lo menos uno de los tiempo de incubación para el
desarrollo de los microorganismos
Tabla 15. Análisis de varianza (ANOVA, en inglés) para Weissella confusa Fuente de variación
Suma de cuadrados Grados de libertad
Medias de cuadrados
Estadístico de prueba
Entre tratamientos
4.68x1012 3 1.56x1012
Del error 6.42x1012 8 7.13x1011
Total 1.11x1013 11
2.19
F 0.05, 2, 13Tablas= 4.07
Primera Parte I-2: Capítulo 4
145
Tabla 16. Análisis de varianza (ANOVA, en inglés) para Leuconostoc mesenteroides Fuente de variación
Suma de cuadrados
Grados de libertad
Medias de cuadrados
Estadístico de prueba
Entre tratamientos
4.9x1012 3 1.63x1012
Del error 5.7x1012 8 7.12x1011 Total 1.36x1013 11
2.29
F 0.05, 2, 13Tablas= 4.07
De acuerdo con los resultados obtenidos no existe diferencia significativa entre los
tiempos de incubación para el desarrollo de los microorganismos de estudio, mostrando
que las condiciones óptimas para su desarrollo es el medio de cultivo agar MRS a 37°C
por 24 horas.
4.10.2. Prueba de resistencia a biocidas
Los resultados obtenidos para esta prueba fueron analizados mediante el programa
Startgraphics Centurion XVI. El análisis de varianza que se realizó para Weissella
confusa y Leuconostoc mesenteroides sobre los halos de inhibición frente a las
diferentes condiciones muestran que para el cloruro de benzalconio y metam sodio.
Existe una diferencia significativa entre la dosis empleada para poder inhibir el
crecimiento de las bacterias de estudio; sin embargo, no existe diferencia alguna entre
los tiempos que se utilizaron.
En cuanto al formaldehído, el análisis de varianza que se realizó indica que existe
diferencia significativa en cuanto a la dosis y tiempo que se emplee para inhibir el
crecimiento de Weissella confusa y Leuconostoc mesenteroides.
4.10.2.1. Análisis estadístico para cloruro de benzalconio
En la Fig. 27 se muestran los promedios de los halos de inhibición para Weissella
confusa a las diferentes dosis empleadas de CB. Los gráficos de cajas y bigotes
muestran el análisis estadístico de las dosis y tiempos empleados en el experimento.
Este gráfico de cajas y bigotes (Fig. 28) muestra que la dosis a 20 mg L-1 es la que
presenta mayor respuesta para inhibir el crecimiento de dicha bacteria pues el halo de
inhibición que se muestra es de 13.77 mm, a diferencia de las concentraciones de 10 y
15 mg/L las cuales no muestran diferencia significativa entre ellas. En cuanto al tiempo
Primera Parte I-2: Capítulo 4
146
el gráfico indica que no existe diferencia significativa para la inhibición del
microorganismo (Fig. 29).
Fig. 27. Promedio de inhibición para Weissella confusa a diferentes dosis de CB
Fig. 28. Gráfico de caja y bigotes de halos de
inhibición para Weissella confusa a diferentes dosis de CB
Fig. 29. Gráfico de caja y bigotes de halos de
inhibición para Weissella confusa a diferentes tiempos
Los promedios de los halos de inhibición para Leuconostoc mesenteroides frente a las
dosis empleadas de CB, se muestran en la Fig. 30. Los gráficos de cajas y bigotes
muestran que, para todas las concentraciones empleadas de 10, 15 y 20 mg L-1, existe
una diferencia significativa entre ellas (Fig. 31). El mayor halo de inhibición que se
presenta es de 12.63 mm, el cual corresponde a la dosis empleada de 20 mg L-1, con
Primera Parte I-2: Capítulo 4
147
respecto al tiempo. El gráfico de cajas y bigotes indica que no existe una diferencia
significativa (Fig. 32).
De acuerdo con los resultados que se obtuvieron puede observarse que Weissella
confusa ante las diferentes concentraciones de CB mostró los mayores halos de
inhibición con respecto a los de Leuconostoc mesenteroides frente al mismo biocida de
estudio.
Fig. 30. Promedio de inhibición para Leuconostoc mesenteroides a diferentes dosis de CB
Fig. 31. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Leuconostoc mesenteroides a
diferentes dosis de CB
Fig. 32. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Leuconostoc mesenteroides a
diferentes tiempos
Primera Parte I-2: Capítulo 4
148
4.10.2.2. Análisis estadístico para metam sodio
En la Fig. 33 se muestran los promedios de los halos de inhibición para Weissella
confusa ante las diferentes dosis empleadas de MS. Al igual que con el CB, los gráficos
de cajas y bigotes muestran el análisis estadístico de las dosis y tiempos empleados
para el estudio del biocida. De acuerdo con el gráfico de cajas y bigotes existe una
diferencia significativa entre las tres concentraciones de estudio (Fig. 34), mostrando
que a 45 mg L-1 se presenta el mayor halo de inhibición 10.33 mm. Por otro lado, a una
concentración de 30 mg L-1 la bacteria no presenta inhibición alguna.
Fig. 33. Promedio de inhibición para Weissella confusa a diferentes dosis de MS
Fig. 34. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Weissella confusa a diferentes dosis de MS
Fig. 35. Gráfico de caja y bigotes de halos de
inhibición para Weissella confusa a diferentes tiempos
Primera Parte I-2: Capítulo 4
149
En cuanto a Leuconostoc mesenteroides los promedios de los halos de inhibición ante
las diferentes dosis empleadas de MS se muestran en la Fig. 36. El análisis estadístico
de la dosis (Figura 37) indica que existe una diferencia significativa entre las
concentraciones de estudio mostrando que a una concentración de 30 mg L-1 la
bacteria no presenta inhibición alguna ante el MS, mientras que a 45 mg L-1 se
presenta un halo de 8.3 mm.
Fig. 36. Promedio de inhibición para Leuconostoc mesenteroides a diferentes dosis de MS
Fig. 37. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Leuconostoc mesenteroides a
diferentes dosis de MS
Fig. 38. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Leuconostoc mesenteroides a
diferentes tiempos
Primera Parte I-2: Capítulo 4
150
En cuanto al tiempo los gráficos de cajas y bigotes para Weissella confusa y
Leuconostoc mesenteroides (Figura 35 y 38), muestran que para ambas bacterias no
existe diferencia significativa para la inhibición de los microorganismos. De los
resultados que se obtuvieron puede observarse que Weissella confusa muestra mayor
resistencia a metam sodio que Leuconostoc mesenteroides de acuerdo con los
promedios de los halos de inhibición que se tienen.
4.10.2.3. Análisis estadístico para formaldehído
Para el caso del formaldehído, la Fig. 39 muestra los promedios de los halos de
inhibición para Weissella confusa. De acuerdo con el análisis estadístico de las dosis
empleadas, los gráficos de cajas y bigotes (Fig. 40) indican que entre las
concentraciones de 2 y 3 mg L-1 no existe diferencia significativa alguna. Sin embargo,
la concentración de 5 mg L-1 muestra una diferencia significativa con respecto a las
otras dos concentraciones. En cuanto al tiempo, el análisis estadístico indica que existe
una diferencia significativa (Fig. 41), mostrando que los mayores halos de inhibición se
presentan a las 72 h de incubación. De acuerdo con el análisis realizado puede decirse
que las condiciones óptimas para obtener una mayor inhibición del microorganismo es
utilizando una concentración de 5 mg L-1 con un tiempo de incubación de 72 h.
Fig. 39. Promedio de inhibición para Weissella confusa a diferentes dosis de formaldehído
Primera Parte I-2: Capítulo 4
151
Fig. 40. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Weissella confusa a diferentes
dosis de formaldehído
Fig. 41. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Weissella confusa a diferentes
tiempos
En cuanto a los resultados para Leuconostoc mesenteroides, los promedios de los
halos de inhibición a las diferentes dosis empleadas de formaldehído se muestran en la
Fig. 42. El análisis estadístico de las dosis en gráficos de cajas y bigotes (Fig. 43)
indican que existe diferencia significativa entre la dosis empleada, de 5 mg L-1, con
respecto a las dosis de 2 y 3 mg L-1. En cuanto al tiempo, en el gráfico de cajas y
bigotes se observa que existen diferencias significativas entre los tres tiempos de
estudio (Fig.44), mostrando que las condiciones óptimas para inhibir el crecimiento de
la bacteria son utilizando una concentración de 5 mg L-1 incubándola por 72 h.
Fig. 42. Promedio de inhibición para Leuconostoc mesenteroides a diferentes dosis de
formaldehído
Primera Parte I-2: Capítulo 4
152
Fig. 43. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Leuconostoc mesenteroides a
diferentes dosis de formaldehído
Fig. 44. Gráfico de caja y bigotes de halos de inhibición para Leuconostoc mesenteroides a
diferentes tiempos
4.11. Efecto inhibitorio del segundo experimento
Para poder conocer el efecto inhibitorio de los biocidas de estudio se tomó como
referencia o biocida control al formaldehído, debido a que su efecto inhibitorio está
demostrado (Zarco-Mercado, 2015). Sin embargo, debido a sus efectos adversos al
ambiente y su toxicidad hacia los humanos no puede ser utilizado como biocida en
alimentos para humanos (OMS, 1982). Para poder obtener el porcentaje de efecto
inhibitorio, se utilizó el mejor promedio de inhibición proveniente de la concentración de
5 mg L-1. De esta manera se calcularon los porcentajes de efecto inhibitorio para los
dos biocidas de estudio probados en Weissella confusa y Leuconostoc mesenteroides
(Tablas 17 y 18). Para el cálculo del porcentaje inhibitorio se tomaron en cuenta las
ecuaciones 1 y 2:
Halo promedio de inhibición de CB 10 mg L-1
% Efecto inhibitorio= Halo de inhibición del formaldehído 5 mg L-1
X100 (1)
11.06 mm % Efecto inhibitorio=
11.78 mm X100 = 93.89% respecto al formaldehído (5 mgL-1) (2)
Los porcentajes que se obtuvieron de cloruro de benzalconio (CB) y metam sodio (MS)
para Weissella confusa muestran que los porcentajes de efecto inhibitorio de CB son
Primera Parte I-2: Capítulo 4
153
mayores que los del MS. Al realizar el análisis estadístico se observa que existe una
diferencia significativa en el uso de los biocidas (Fig. 45), mostrando que el cloruro de
benzalconio tiene una mayor respuesta de inhibición ante el microorganismo de estudio
en este caso sobre Weissella confusa. Además, las dosis utilizadas para inhibir su
crecimiento son menores.
Tabla 17. Efecto inhibitorio del cloruro de benzalconio (CB) y metam sodio (MS) en porcentaje para la bacteria Weissella confusa
Biocida Dosis Promedio del halo de inhibición (mm) % Efecto inhibitorio CB 10 11.06 93.89 CB 15 12.04 102.21 CB 20 13.77 116.89 MS 30 0 0 MS 40 7.93 67.32 MS 45 10.33 87.69
Cloruro de benzalconio CB
Metam sodio MS
Gráfico Caja y Bigotes
0 20 40 60 80 100 120
% Efecto inhibitorio
Bio
cid
a
Fig. 45. Gráfico de cajas y bigotes para el % de efecto inhibitorio para Weissella confusa versus
biocida (cloruro de benzalconio y metam sodio)
En cuanto a los resultados obtenidos para Leuconostoc mesenteroides con respecto de
los porcentajes que se obtuvieron de cloruro de benzalconio y metam sodio se puede
decir que los porcentajes de efecto inhibitorio del CB superan el 100%, por lo que son
eficaces para inhibir el crecimiento de Leuconostoc mesenteroides, mientras que los de
MS son menores que el 100%. De acuerdo con el análisis estadístico existe una
Primera Parte I-2: Capítulo 4
154
diferencia significativa entre los biocidas de estudio para inhibir el crecimiento de
Leuconostoc mesenteroides (Fig. 46), indicando que el cloruro de benzalconio tiene un
mayor porcentaje de efecto inhibitorio utilizando concentraciones más bajas que el
metam sodio.
Tabla 18. Efecto inhibitorio del cloruro de benzalconio (CB) y metam sodio (MS) en porcentaje para la bacteria Leuconostoc mesenteroides
Biocida Dosis Promedio del halo de inhibición (mm) % Efecto inhibitorio CB 10 10.71 103.68 CB 15 11.68 113.07 CB 20 12.63 122.27 MS 30 0 0 MS 40 7.70 74.54 MS 45 8.27 80.06
Cloruro de benzalconio CB
Metam sodio MS
Gráfico Caja y Bigotes
0 30 60 90 120 150
% Efecto inhibitorio
Bio
cida
Fig. 46. Gráfico de cajas y bigotes para el % de efecto inhibitorio para Leuconostoc
mesenteroides versus biocida (cloruro de benzalconio y metam sodio)
La Tabla 19 presenta la comparación de los porcentajes de efecto inhibitorio del
cloruro de benzalconio y metam sodio ante las dos bacterias de estudio, Weissella
confusa y Leuconostoc mesenteroides. Los resultados muestran que los porcentajes de
efecto inhibitorio son muy similares para ambas bacterias; sin embargo, puede verse
una leve superioridad de los porcentajes para Leuconostoc mesenteroides (Fig. 47). De
acuerdo con el análisis estadístico que se realizó no existe diferencia alguna entre los
porcentajes de efecto inhibitorio para las bacterias de estudio (Fig. 48).
Primera Parte I-2: Capítulo 4
155
Tabla 19. Comparación del % de efecto inhibitorio para las bacterias de estudio ante los biocidas de estudio (cloruro de benzalconio y metam sodio)
Weissella confusa Leuconostoc mesenteroides Biocida Dosis % Efecto inhibitorio % Efecto inhibitorio
CB 10 93.89 103.68 CB 15 102.21 113.07 CB 20 116.89 122.27 MS 30 0 0 MS 40 67.32 74.54 MS 45 87.69 80.06
Fig. 47. Gráfico de la comparación del % de efecto inhibitorio de Weissella confusa y Leuconostoc
mesenteroides versus biocida (cloruro de benzalconio y metam sodio)
Leuconostoc mesenteroides
Weissella confusa
Gráfico Caja y Bigotes
0 30 60 90 120 150
% Efecto inhibitorio
Bacte
ria de e
stu
dio
Fig. 48. Gráfico de cajas y bigotes para el % de efecto inhibitorio versus bacteria de estudio
(Weissella confusa y Leuconostoc mesenteroides)
Primera Parte I-2: Capítulo 5. Conclusiones y perspectivas
156
5.1. Conclusiones
Considerando que el objetivo general era identificar a dos bacterias predominantes del
jugo de caña Weissella confusa y Leuconostoc mesenteroides evaluando su
susceptibilidad a dos biocidas comerciales (cloruro de benzalconio y metam sodio) y
comparando las dosis empleadas para cada una de ellas y que los objetivos
particulares fueron revisar las características que presenta la bacteria Weissella
confusa, así como las aplicaciones que tiene en los diferentes campos de la ciencia, de
aislar e identificar de jugo de caña de un ingenio azucarero a Weissella confusa y
Leuconostoc mesenteroides, de evaluar la susceptibilidad de ambas bacterias ante dos
biocidas comerciales comparando las dosis y determinar si Weissella confusa puede
actuar de forma antagónica o como bacteriocida ante Leuconostoc mesenteroides y,
finalmente, comparar ambos biocidas con el formaldehído, considerándolo como
referencia, a continuación se presentan las conclusiones alcanzadas.
Se alcanzó el objetivo general, ya que se identificaron con un 96% de confianza
a Weissella confusa y a Leuconostoc mesenteroides, aisladas del jugo de caña y
se logró comparar su efecto inhibitorio ante los dos biocidas comerciales
empleados, cloruro de benzalconio y metam sodio, usando 10, 15 y 20 mg L-1 y
40 y 45 mg L-1, respectivamente, para inhibir el crecimiento de ambas bacterias
Se revisaron las características típicas de Weissella confusa, mostrando que se
trata de una bacteria ácido láctica, Gram positiva, que puede actuar como
antagónica de algunas bacterias patógenas
Se logró aislar de jugo de caña de un ingenio azucarero cooperante (acuerdo de
confidencialidad), tanto a Leuconostoc mesenteroides como a Weissella
confusa, identificándolas mediante su caracterización morfológica y pruebas
bioquímicas
Las bacterias en estudio Weissella confusa y Leuconostoc mesenteroides
presentan características morfológicas muy similares, ya que Weissella confusa
proviene de la familia de Leuconostoc, por lo que existen pocas pruebas
bioquímicas que las diferencien
Primera Parte I-2: Capítulo 5. Conclusiones y perspectivas
157
El diseño de experimento unifactorial que se efectuó permitió conocer las
condiciones óptimas para el desarrollo de los microorganismos en estudio,
destacando el medio de Agar MRS, a 37°C durante 24 horas
Mediante el segundo experimento se logró determinar la susceptibilidad de
Weissella confusa y de Leuconostoc mesenteroides ante los agentes biocidas en
estudio, cloruro de benzalconio y metam sodio
La bacteria Weissella confusa presentó los mayores halos de inhibición ante los
biocidas como el cloruro de benzalconio y metam sodio; sin embargo, al calcular
el % de efecto inhibitorio usando al formaldehído como control, Leuconostoc
mesenteroides tiene una superioridad de los porcentajes, por lo que Weissella
confusa no puede ser utilizado como bactericida para inhibir el crecimiento de
Leuconostoc mesenteroides
Se corroboró que el biocida usado como referencia, el formaldehído, es el más
eficaz de la experimentación. Sin embargo, también es un biocida poco
convencional para ser utilizado en la industria alimentaria debido a su toxicidad
(Anexo IV, Anexos 4a, b). En esta investigación con su referencia se calcularon
los % de efecto inhibitorio de los otros dos
Se comprobó que Weissella confusa no actúa como organismo antagónico de
Leuconostoc mesenteroides debido a que ambas pueden proliferar sin ningún
inconveniente en el medio de cultivo empleado
5.2. Perspectivas
Con base en esta experimentación y los resultados y conclusiones alcanzados se
esbozan a continuación las perspectivas para la continuación de estas investigaciones.
Realizar una búsqueda más detallada de por qué Weissella confusa no puede
actuar como bactericida de Leuconostoc mesenteroides, a pesar de que posee
efectos inhibitorios ante algunos patógenos causantes de enfermedades en
alimentos (Serna-Cock et al., 2010)
Primera Parte I-2: Capítulo 5. Conclusiones y perspectivas
158
Se debe continuar con la investigación para encontrar una bacteria que actúe
como bactericida ante Leuconostoc mesenteroides y de esta manera poder ser
usada en la industria azucarera para coadyuvar en la resolución de los
problemas que esta última genera en la industria.
Nota: Los residuos producidos en esta investigación experimental fueron estabilizados
antes de disponer de ellos (Anexo IV, Anexo 4b)
Primera Parte I-2: Bibliografía
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Camacho-Cruz, A. Urzúa-Hernández, M. del C., (2008). Manual de prácticas de
microbiología general. México D.F.: Facultad de Química, UNAM.
SAGARPA. (2012). Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y
Alimentación. Importancia de la agroindustria de la caña de azúcar. Disponible en
http://www.sagarpa.gob.mx/agricultura/Documents/Cultivos%20Agroindustriales/I
mpactos%20Ca%C3%B1a.pdf
Serna-Cock, L., Valencia-Hernández, L. y Campos-Gaona, R. (2010). Kinetic of
fermentation and antimicrobial activity of Weissella confusa against
Primera Parte I-2: Bibliografía
162
Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae. Revista Facultad de
Ingeniería Universidad de Antioquia, (55), 55-65.
Shandong IRO. (2016). Dirección electrónica (consultada el 05 febrero 2016)
http://www.irowater.com/span/index.htm
SIAP. (2015). Dirección electrónica (consultada el 26 mayo 2015).
http://www.siap.gob.mx/siaprendes/contenidos/3/03-cana-azucar/contexto-3.html
Villa, M.D. (2008). Efectos de microbiocidas y antagonistas microbianos sobre
microorganismos causales del deterioro poscosecha de caña y su impacto en las
pérdidas de sacarosa en el ingenio. Tesis de Maestría en Tecnología Avanzada,
Instituto Politécnico Nacional. Tlaxcala, México. Disponible en:
web.med.unsw.edu.au/cdstest/GTF_CDS_site/Files/manuals/EarlierVersions/CDS
_Manual_5_Simplex.pdf. 25 de noviembre de 2014.
ZAFRANET. (2015). Dirección electronica (consultada el 5 octubre 2015)
http://www.zafranet.com/productores-caneros/
Zarco-Mercado, E. (2014). Identificación de bacterias mesófilas aerobias
predominantes en el jugo de caña de un ingenio y su susceptibilidad a tres
biocidas. Tesis de Licenciatura, Facultad de Química, Universidad Nacional
Autónoma de México. México D.F. México.
Zepeda-Guardado, E. R. (2012). Propuesta de alternativas para la reducción de
pérdidas de sacarosa en un ingenio azucarero. (Doctoral dissertation, Universidad
de El Salvador). San Salvador, El Salvador. Disponible en:
http://ri.ues.edu.sv/1647/1/TESIS-
PROPUESTA_DE_ALTERNATIVAS_DE_REDUCCI%C3%93N_DE_P%C3%89R
DIDAS_DE_SACAROSA.pdf
Primera Parte I-2: Anexo I. Aislamiento de bacterias
163
Fig. A1. Aislamiento masivo de Leuconostoc
mesenteroides a las 24 horas
Fig. A2. Aislamiento masivo de Weissella
confusa a las 24 horas
Fig. A3. Aislamiento de Leuconostoc
mesenteroides a las 72horas
Fig. A4. Aislamiento de Weissella confusa a las
72 horas
Fig. A5. Aislamiento por agotamiento de
Leuconostoc mesenteroides
Fig. A6. Aislamiento por agotamiento de
Weissella confusa
Fig. A7. Cocos Gram negativos y cocobacilos
Gram positivos obtenidos del aislamiento
Fig. A8. Cocos Gram negativos obtenidos del
aislamiento
Primera Parte I-2: Anexo I. Aislamiento de bacterias
164
Fig. A9. Cocobacilos Gram positivos con
ausencia de cápsula obtenidos del aislamiento
Fig. A10. Micrococos Gram positivos agrupados en cadenas cortas o pares
Fig. A11. Cocos Gram positivos agrupados en
tétradas
Fig. A12. Cocobacilos Gram positivos
agrupados en cadenas cortas
Primera Parte I-2: Anexo II. Pruebas de VITEK 2
165
Resultado de VITEK. Para Leuconostoc mesenteroides
Fig. A13. Formato de Registro de la prueba de VITEK para Leuconostoc mesenteroides
Primera Parte I-2: Anexo II. Pruebas de VITEK 2
166
Resultado de VITEK. Para Weissella confusa
Fig. A14. Formato de Registro de la prueba de VITEK para Weissella confusa
Primera Parte I-2: Anexo II. Pruebas de VITEK 2
167
Debido a que el VITEK, no detecta a Weissella confusa de los resultados que se obtuvieron se compararon con los datos bibliográficos de Serna et al. (2010). La mayoría de los resultados comparados fueron similares Tabla A1.-Comparación de los resultados teóricos presentados por Serna et al., 2010 con
los obtenidos en la prueba de VITEK # Prueba Nombre de la prueba Resultado experimental Resultado teórico
2 AMY D‐AMYGDALINA ‐ +
5 dXYL D‐XILOSA + +
8 ADH1 ARGININA DIHIDROLASA + +
9 BGAL BETA‐ GALACTOSIDASA + +
11 AGLU ALFA‐ GLUCOSIDASA + +
25 AGAL ALFA‐GALACTOSIDASA + +
30 dSOR D‐SORBITOL ‐ ‐
31 URE UREASA ‐ ‐
37 dGAL D‐GALACTOSA + +
38 dRIB D‐RIBOSA ‐ ‐
42 LAC LACTOSA ‐ ‐
44 NAG N‐ACETIL‐ D‐GLUCOSAMINA ‐ +
45 dMAL D‐MALTOSA + +
46 BACI Resistencia BACITRACINA + +
47 NOVO Resistencia NOVOBIOCINA + +
50 NC6.5 Crecimiento en 6.5% NaCl + +
52 dMAN D‐MANITOL + ‐
54 MBdG METHIL‐B‐D‐GLUCOPIRANOSIDASA ‐ ‐
57 dRAF D‐RAFINOSA ‐ ‐
58 O129R O129 RESISTENCIA (com vibrio) + +
59 SAL SALICINA + +
60 SAC SACAROSA + +
62 dTRE D‐TREALOSA ‐ ‐
63 ADH2s ARGININA DIHIDROLASA 2 + +
Primera Parte I-2: Anexo III. Análisis estadístico de los resultados
168
Tabla A2. Análisis de varianza (ANOVA, en inglés) para halos de inhibición de Weissella confusa ante CB
Fuente Suma de cuadrados
Gl Cuadrado medio Razón-F Valor-P
EFECTOS PRINCIPALES A:Dosis 33.8822 2 16.9411 15.67 0.0001 B:tiempo 4.84667 2 2.42333 2.24 0.1351 INTERACCIONES AB 1.17778 4 0.294444 0.27 0.8919 RESIDUOS 19.46 18 1.08111 TOTAL (CORREGIDO) 59.3667 26 Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual
El StatAdvisor
La tabla de análisis de varianza, ANOVA en inglés, descompone la variabilidad de
halos de inhibición en contribuciones debidas a varios factores. Puesto que se ha
escogido la suma de cuadrados Tipo III (por omisión), la contribución de cada factor se
mide eliminando los efectos de los demás factores. Los valores-P prueban la
significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto que un valor-P es menor
que 0.05, este factor tiene un efecto estadísticamente significativo sobre halos de
inhibición con un 95.0% de nivel de confianza.
Tabla A3. Pruebas de rangos múltiples para halos de inhibición de Weissella confusa ante las dosis de CB
Método: 95.0 porcentaje LSD
Dosis Casos Media LS Sigma LS Grupos homogéneos 10 9 11.0556 0.346588 X 15 9 12.0444 0.346588 X 20 9 13.7667 0.346588 X
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites 10 - 15 -0.988889 1.02977 10 - 20 * -2.71111 1.02977 15 - 20 * -1.72222 1.02977 * indica una diferencia significativa
El StatAdvisor
Esta tabla aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles
medias son significativamente diferentes de otras. La mitad inferior de la salida muestra
Primera Parte I-2: Anexo III. Análisis estadístico de los resultados
169
las diferencias estimadas entre cada par de medias. El asterisco que se encuentra al
lado de los 2 pares indica que estos pares muestran diferencias estadísticamente
significativas con un nivel del 95% de confianza. En la parte superior de la página, se
han identificado 2 grupos homogéneos según la alineación de las X en columnas. No
existen diferencias estadísticamente significativas entre aquellos niveles que compartan
una misma columna de X. El método empleado actualmente para discriminar entre las
medias es el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher. Con
este método hay un riesgo del 5.0% al decir que cada par de medias es
significativamente diferente, cuando la diferencia real es igual a cero.
Tabla A4. Análisis de varianza (ANOVA, en inglés) para halos de inhibición de Weissella confusa ante MS
Fuente Suma de cuadrados
Gl Cuadrado medio
Razón-F Valor-P
EFECTOS PRINCIPALES A:Dosis 526.427 2 263.213 2042.17 0.0000 B:tiempo 0 2 0 0.00 1.0000 INTERACCIONES AB 0 4 0 0.00 1.0000 RESIDUOS 2.32 18 0.128889 TOTAL (CORREGIDO) 528.747 26 Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual
El StatAdvisor
La tabla de análisis de varianza, ANOVA en inglés, descompone la variabilidad de
halos de inhibición en contribuciones debidas a varios factores. Puesto que se ha
escogido la suma de cuadrados Tipo III (por omisión), la contribución de cada factor se
mide eliminando los efectos de los demás factores. Los valores-P prueban la
significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto que un valor-P es menor
que 0.05, este factor tiene un efecto estadísticamente significativo sobre halos de
inhibición con un 95.0% de nivel de confianza.
Primera Parte I-2: Anexo III. Análisis estadístico de los resultados
170
Tabla A5. Pruebas de rangos múltiples para halos de inhibición de Weissella confusa
ante las dosis de MS
Método: 95.0 porcentaje LSD
Dosis Casos Media LS Sigma LS Grupos homogéneos 30 9 0 0.11967 X 40 9 7.93333 0.11967 X 45 9 10.3333 0.11967 X Contraste Sig. Diferencia +/- Límites 30 - 40 * -7.93333 0.35556 30 - 45 * -10.3333 0.35556 40 - 45 * -2.4 0.35556 * indica una diferencia significativa
El StatAdvisor
Esta tabla aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles
medias son significativamente diferentes de otras. La mitad inferior de la salida muestra
las diferencias estimadas entre cada par de medias. El asterisco que se encuentra al
lado de los 3 pares indica que estos pares muestran diferencias estadísticamente
significativas con un nivel del 95.0% de confianza. En la parte superior de la página, se
han identificado 3 grupos homogéneos según la alineación de las X en columnas. No
existen diferencias estadísticamente significativas entre aquellos niveles que compartan
una misma columna de X. El método empleado actualmente para discriminar entre las
medias es el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher. Con
este método hay un riesgo del 5.0% al decir que cada par de medias es
significativamente diferente, cuando la diferencia real es igual a cero.
Tabla A6. Análisis de varianza (ANOVA, en inglés) para halos de inhibición de Weissella confusa ante formaldehído
Fuente Suma de cuadrados
Gl Cuadrado medio
Razón-F Valor-P
EFECTOS PRINCIPALES A:Dosis 94.2963 2 47.1481 30.31 0.0000 B:tiempo 108.074 2 54.037 34.74 0.0000 INTERACCIONES AB 13.7037 4 3.42593 2.20 0.1097 RESIDUOS 28.0 18 1.55556 TOTAL (CORREGIDO) 244.074 26 Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual
Primera Parte I-2: Anexo III. Análisis estadístico de los resultados
171
El StatAdvisor
La tabla de análisis de varianza, ANOVA en inglés, descompone la variabilidad de
halos de inhibición en contribuciones debidas a varios factores. Puesto que se ha
escogido la suma de cuadrados Tipo III (por omisión), la contribución de cada factor se
mide eliminando los efectos de los demás factores. Los valores-P prueban la
significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto que 2 valores-P son
menores que 0.05, estos factores tienen un efecto estadísticamente significativo sobre
halos de inhibición con un 95.0% de nivel de confianza.
Tabla A7. Pruebas de rangos múltiples para halos de inhibición de Weissella confusa ante las dosis de formaldehído
Método: 95.0 porcentaje LSD
Dosis Casos Media LS Sigma LS Grupos homogéneos 2 9 7.44444 0.41574 X 3 9 8.33333 0.41574 X 5 9 11.7778 0.41574 X
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites2 - 3 -0.888889 1.23523 2 - 5 * -4.33333 1.23523 3 - 5 * -3.44444 1.23523 * indica una diferencia significativa
El StatAdvisor
Esta tabla aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles
medias son significativamente diferentes de otras. La mitad inferior de la salida muestra
las diferencias estimadas entre cada par de medias. El asterisco que se encuentra al
lado de los 2 pares indica que estos pares muestran diferencias estadísticamente
significativas con un nivel del 95.0% de confianza. En la parte superior de la página, se
han identificado 2 grupos homogéneos según la alineación de las X en columnas. No
existen diferencias estadísticamente significativas entre aquellos niveles que compartan
una misma columna de X. El método empleado actualmente para discriminar entre las
medias es el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher. Con
este método hay un riesgo del 5.0% al decir que cada par de medias es
significativamente diferente, cuando la diferencia real es igual a cero.
Primera Parte I-2: Anexo III. Análisis estadístico de los resultados
172
Tabla A8. Análisis de varianza (ANOVA, en inglés) para halos de inhibición de Leuconostoc mesenteroides ante CB
Fuente Suma de cuadrados
Gl Cuadrado medio
Razón-F Valor-P
EFECTOS PRINCIPALES A:Dosis 16.6274 2 8.3137 26.91 0.0000 B:tiempo 1.29852 2 0.649259 2.10 0.1512 INTERACCIONES AB 0.985926 4 0.246481 0.80 0.5420 RESIDUOS 5.56 18 0.308889 TOTAL (CORREGIDO) 24.4719 26 Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual
El StatAdvisor
La tabla de análisis de varianza, ANOVA en inglés, descompone la variabilidad de
halos de inhibición en contribuciones debidas a varios factores. Puesto que se ha
escogido la suma de cuadrados Tipo III (por omisión), la contribución de cada factor se
mide eliminando los efectos de los demás factores. Los valores-P prueban la
significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto que un valor-P es menor
que 0.05, este factor tiene un efecto estadísticamente significativo sobre halos de
inhibición con un 95.0% de nivel de confianza.
Tabla A9. Pruebas de rangos múltiples para halos de inhibición de Leuconostoc mesenteroides ante las dosis de CB
Método: 95.0 porcentaje LSD
Dosis Casos Media LS Sigma LS Grupos homogéneos 10 9 10.7111 0.185259 X 15 9 11.6778 0.185259 X 20 9 12.6333 0.185259 X
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites 10 - 15 * -0.966667 0.550435 10 - 20 * -1.92222 0.550435 15 - 20 * -0.955556 0.550435 * indica una diferencia significativa
Primera Parte I-2: Anexo III. Análisis estadístico de los resultados
173
El StatAdvisor
Esta tabla aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles
medias son significativamente diferentes de otras. La mitad inferior de la salida muestra
las diferencias estimadas entre cada par de medias. El asterisco que se encuentra al
lado de los 3 pares indica que estos pares muestran diferencias estadísticamente
significativas con un nivel del 95.0% de confianza. En la parte superior de la página, se
han identificado 3 grupos homogéneos según la alineación de las X en columnas. No
existen diferencias estadísticamente significativas entre aquellos niveles que compartan
una misma columna de X. El método empleado actualmente para discriminar entre las
medias es el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher. Con
este método hay un riesgo del 5.0% al decir que cada par de medias es
significativamente diferente, cuando la diferencia real es igual a cero.
Tabla A10. Análisis de varianza (ANOVA, en inglés) para halos de inhibición de Leuconostoc mesenteroides ante MS
Fuente Suma de cuadrados
Gl Cuadrado medio
Razón-F Valor-P
EFECTOS PRINCIPALES A:Dosis 383.847 2 191.923 7851.41 0.0000 B:tiempo 0 2 0 0.00 1.0000 INTERACCIONES AB 0 4 0 0.00 1.0000 RESIDUOS 0.44 18 0.0244444 TOTAL (CORREGIDO) 384.287 26 Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual
El StatAdvisor
La tabla de análisis de varianza, ANOVA en inglés, descompone la variabilidad de
halos de inhibición en contribuciones debidas a varios factores. Puesto que se ha
escogido la suma de cuadrados Tipo III (por omisión), la contribución de cada factor se
mide eliminando los efectos de los demás factores. Los valores-P prueban la
significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto que un valor-P es menor
que 0.05, este factor tiene un efecto estadísticamente significativo sobre halos de
inhibición con un 95.0% de nivel de confianza.
Primera Parte I-2: Anexo III. Análisis estadístico de los resultados
174
Tabla A11. Pruebas de rangos múltiples para halos de inhibición de Leuconostoc mesenteroides ante las dosis de MS
Método: 95.0 porcentaje LSD
Dosis Casos Media LS Sigma LS Grupos homogéneos 30 9 0 0.0521157 X 40 9 7.7 0.0521157 X 45 9 8.26667 0.0521157 X
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites30 - 40 * -7.7 0.154844 30 - 45 * -8.26667 0.154844 40 - 45 * -0.566667 0.154844 * indica una diferencia significativa
El StatAdvisor
Esta tabla aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles
medias son significativamente diferentes de otras. La mitad inferior de la salida muestra
las diferencias estimadas entre cada par de medias. El asterisco que se encuentra al
lado de los 3 pares indica que estos pares muestran diferencias estadísticamente
significativas con un nivel del 95.0% de confianza. En la parte superior de la página, se
han identificado 3 grupos homogéneos según la alineación de las X en columnas. No
existen diferencias estadísticamente significativas entre aquellos niveles que compartan
una misma columna de X. El método empleado actualmente para discriminar entre las
medias es el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher. Con
este método hay un riesgo del 5.0% al decir que cada par de medias es
significativamente diferente, cuando la diferencia real es igual a cero.
Tabla A12. Análisis de varianza (ANOVA, en inglés) para halos de inhibición de Leuconostoc mesenteroides ante formaldehído
Fuente Suma de cuadrados
Gl Cuadrado medio
Razón-F Valor-P
EFECTOS PRINCIPALES A:Dosis 41.1852 2 20.5926 7.41 0.0045 B:tiempo 66.0741 2 33.037 11.89 0.0005 INTERACCIONES AB 33.037 4 8.25926 2.97 0.0477 RESIDUOS 50.0 18 2.77778 TOTAL (CORREGIDO) 190.296 26 Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual
Primera Parte I-2: Anexo III. Análisis estadístico de los resultados
175
El StatAdvisor
La tabla de análisis de varianza, ANOVA en inglés, descompone la variabilidad de
halos de inhibición en contribuciones debidas a varios factores. Puesto que se ha
escogido la suma de cuadrados Tipo III (por omisión), la contribución de cada factor se
mide eliminando los efectos de los demás factores. Los valores-P prueban la
significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto que 3 valores-P son
menores que 0.05, estos factores tienen un efecto estadísticamente significativo sobre
halos de inhibición con un 95.0% de nivel de confianza.
Tabla A13. Pruebas de rangos múltiples para halos de inhibición de Leuconostoc mesenteroides ante las dosis de CB
Método: 95.0 porcentaje LSD
Dosis Casos Media LS Sigma LS Grupos homogéneos 2 9 7.44444 0.555556 X 3 9 8.11111 0.555556 X 5 9 10.3333 0.555556 X
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites 2 - 3 -0.666667 1.65064 2 - 5 * -2.88889 1.65064 3 - 5 * -2.22222 1.65064 * indica una diferencia significativa
El StatAdvisor
Esta tabla aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles
medias son significativamente diferentes de otras. La mitad inferior de la salida muestra
las diferencias estimadas entre cada par de medias. El asterisco que se encuentra al
lado de los 2 pares indica que estos pares muestran diferencias estadísticamente
significativas con un nivel del 95.0% de confianza. En la parte superior de la página, se
han identificado 2 grupos homogéneos según la alineación de las X en columnas. No
existen diferencias estadísticamente significativas entre aquellos niveles que compartan
una misma columna de X. El método empleado actualmente para discriminar entre las
medias es el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher. Con
este método hay un riesgo del 5.0% al decir que cada par de medias es
significativamente diferente, cuando la diferencia real es igual a cero.
Primera Parte I-2: Anexo IV. Disposición controlada de los residuos producidos
176
Anexo 4a. Referencia sobre la toxicidad del formaldehído (Venezuela)
Russo-de-Méndez, T. 2000. Efectos tóxicos crónicos del formaldehído. MedULA. 9(1-4):45-57. Dirección electrónica: http://www.imbiomed.com.mx/1/1/articulos.php?method=showDetail&id_articulo=36667&id_seccion=2437&id_ejemplar=3790&id_revista=147
Resumen
Se describen los efectos tóxicos de la exposición ocupacional crónica al formaldehído. Se estudiaron 66 personas, adultas, hombres y mujeres, expuestos en forma crónica al formaldehído. Se utilizó un cuestionario como instrumento de medición. Los resultados son: 31 Estudiantes (47%), 11 Profesores (17%), 4 Obreros (6%) de la Cátedra de Anatomía Humana de la Facultad de Medicina, de la Universidad de Los Andes; 16 Empleados de los Servicios Funerarios de la ciudad de Mérida (24%) y 4 Empleados (6%) de la morgue del Cuerpo de Policía Científica (Región Mérida). Edad entre 18 y 56 años (media: 37 años). Sexo: predominio del sexo masculino, 44 personas (66.6%). Tiempo de Trabajo: de 1 a 30 años (media: 15 años). Tiempo de Exposición de 8 a 72 h/semana (media: 28 h/sem). Alteraciones respiratorias: representaron un 30% (6) de las patologías observadas: irritación nasal, obstrucción nasal, ardor de garganta, y tos seca, se presentaron en los cinco grupos de estudio con frecuencia de una vez al día; epistaxis y disnea se presentaron en los cinco grupos de estudio, con frecuencia de cada 30 días. Alteraciones neurológicas, representaron un 30% (6) de las patologías observadas: dolor de cabeza, una vez al día en estudiantes; cada 7 días en los obreros, funerarios y empleados CPTJ y cada 15 días en profesores y obreros; mareos, una vez al día en estudiantes y cada 7 días en los grupos restantes; fatiga, se presentó una vez al día en los cinco grupos de estudio; somnolencia, una vez al día en cuatro de los grupos y cada siete días en los profesores; irritabilidad, una vez al día en estudiantes y empleados funerarios, disminución de la memoria reciente, una vez al día en los profesores, obreros y empleados funerarios. Alteraciones dermatológicas, representaron un 25% (5) de las patologías observadas: urticaria, en los cinco grupos con una frecuencia de vez al día; ampollas, en cuatro de los grupos menos los profesores cada 15 días; daños en las uñas, cada 30 días en estudiantes, obreros y empleados funerarios y dermatitis en los estudiantes, obreros y empleados funerarios cada 30 días; prurito, en los estudiantes, empleados funerarios y empleados PTJ, una vez al día. Alteraciones oculares, representaron un 15% (3) de las patologías observadas: lagrimeo, irritación ocular una vez al día en los cinco grupos estudiados; la conjuntivitis, se presentó solamente en los empleados funerarios, cada 30 días. Los resultados revelaron que la toxicidad del formaldehído sobre las personas expuestas o en contacto con él generan como patologías más frecuentes las respiratorias, neurológicas, dermatológicas y oculares; se encontró como coadyuvantes la ausencia de medidas de higiene y seguridad en el medio laboral y el desconocimiento del marco jurídico laboral y de seguridad e higiene por parte de los trabajadores.
Palabras clave: Formaldehído, toxicidad, riesgo laboral, exposición laboral, enfermedad profesional, cáncer
Primera Parte I-2: Anexo IV. Disposición controlada de los residuos producidos
177
4b. Diagrama de flujo de los residuos generados durante la investigación
Experimento 1. Aislamiento bacteriano Siembra de bacterias Tinción de Gram Tinción de cápsula
Experimento 1. Identificación bacteriana Siembra de bacterias Pruebas bioquímicas Prueba en equipo de VITEK
Matraz y tubos de ensayo con agua peptonada Tubos de solución salina isotónica Tubos con caldo rojo de fenol con arabinosa Tubos con caldo base descarboxilada de Moeller
Experimento 2. Pruebas con biocidas Siembra de bacterias Pruebas de resistencia de biocidas
Agar MRS Formaldehído Cloruro de benzalconio Metam sodio
R1
R5
R2
R3
Agar MRS
Colorantes de la tinción de Gram (cristal violeta, safranina, lugol, alcohol-cetona)
Portaobjetos con inóculo
R6
Fase experimental Residuos generados
Agar MRS Agar nutritivo Cassette y tarjeta de identificación
R4
Primera Parte I-2: Anexo IV. Disposición controlada de los residuos producidos
178
R1 y R4. Las cajas de agar (MRS y nutritivo), cassette y la tarjeta de identificación fueron incinerados. Para ello fueron
colocados en bolsas rojas (color asignado a residuos peligrosos) y etiquetados bajo los lineamientos de la Unidad de
Gestión Ambiental de la Facultad de Química de la UNAM, para que dicha dependencia los recolectara.
R2. Generados de la tinción de Gram para observar la morfología de las bacterias de estudio, los cuales fueron una
combinación de los colorantes, por lo que se consideran dañinos para el ambiente, por lo que fueron almacenados y
etiquetados bajo los lineamientos de la Unidad de Gestión Ambiental de la Facultad de Química de la UNAM para su
disposición controlada.
R3. Después de efectuar las observaciones, los portaobjetos se sumergen durante 10 min en una solución sanitizante de
hipoclorito de sodio al 10% a partir de una solución comercial, se lavan con detergente líquido, se enjuagan y sumergen
en alcohol al 95% durante 24h.
R5. Proveniente de las pruebas de identificación bacteriana, todo el material con las soluciones utilizadas fueron
esterilizadas en autoclave a 121°C, 103.42 kPa (15 lbf/in2) de presión 15 min, para su posterior disposición como
residuos orgánicos, mientras que el material fue lavado con detergente líquido se enjuagaron y secaron para su uso
posterior.
R6. Corresponden a desechos generados de las pruebas con biocidas (cloruro de benzalconio, metam sodio y
formaldehído), los cuales son considerados peligrosos y tóxicos para la salud, por lo que fueron almacenados y
etiquetados bajo los lineamientos de la Unidad de Gestión Ambiental de la Facultad de Química de la UNAM para su
disposición controlada.
179
Segunda Parte
II-1
METODOLOGÍAS PARA LA DETERMINACIÓN DE
METAM SODIO POR CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS
Segunda Parte II-1: Índice
180
Pág.
SEGUNDA PARTE 179 II-1
METODOLOGÍAS PARA LA DETERMINACIÓN DE METAM SODIO POR CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
Resumen 182 1. Problemática 184 1.1. Planteamiento 184
Pág.
1.2. Objetivos 185 1.3. Objetivos particulares 185 1.4. Hipótesis 185
2. Marco teórico 186 2.1. Importancia del tema 186 2.2. Justificación 186 2.3. Microorganismos importantes en la caña de azúcar 187 2.4. Plaguicidas 187 24.1 Carbamatos 188 2.4.1.1. Ditiocarbamatos 189 2.4.1.2. Ditiocarbamato de sodio 189 3. Metodología 191 3.1. Diagrama de bloques 191 3.2. Procedimiento 192 3.2.1. Lavado y preparación del material 192 3.2.2. Preparación de la solución madre y fase móvi 192 3.2.3. Establecimiento de las condiciones para determinar el Metam
Sodio (MS) 192
3.2.4. Determinación del tiempo de retención (tr) 193 3.2.5. Elaboración del diseño experimental 193 3.2.6. Elaboración de curvas de calibración en agua y jugo de caña 193 3.2.7. Cuantificación metam-sodio 194 3.2.8. Determinación del tiempo de vida media del metam-sodio en
agua y jugo de caña 195
3.3. Análisis estadístico 195 4. Resultados y discusión 196 4.1. Identificación y cuantificación del plaguicida 196 4.2. Curvas de calibración 197
Segunda Parte II-1: Índice
181
Pág.
4.2.1. Precisión 197 4.3. Determinación de la velocidad de degradación del MS 199 4.4. Análisis estadístico 205 5. Conclusiones y perspectivas 206 5.1. Conclusiones 206 5.2. Perspectivas 207 Anexos 208 Anexo I. Curvas de calibración en agua y jugo de caña 208 Anexo II. Datos de las curvas de calibración 210 Anexo III. Curvas de cinética de degradación del diseño experimental 211 Anexo IV. Datos cinéticos 213 Anexo V. Disposición controlada de los residuos producidos 215
Bibliografía 217
Segunda Parte II-1: Resumen
182
En la actualidad, es frecuente identificar residuos de plaguicidas en los alimentos y que,
en muchos casos, se detectan concentraciones de éstos por encima de los límites
máximos residuales (LMR). Por lo tanto, en los últimos años ha aumentado de manera
significativa en el mundo entero la demanda de los consumidores por productos
saludables e inocuos. Debido a esto, es necesario desarrollar e implementar
metodologías analíticas basadas en procesos de separación específicamente en el
sector azucarero que contribuyan a la detección, cuantificación y evaluación de la
degradación de uno de los compuestos más utilizados, el N-metil ditiocarbamato de
sodio (MS), para la eliminación del microorganismo Leuconostoc mesenteroides que
hidroliza la sacarosa y forma dextranas durante el proceso de extracción de jugo de
caña para la obtención de azúcar. La aplicación del compuesto es una práctica muy
común para aumentar el rendimiento de sacarosa. La eficiencia del bactericida es
fundamental para obtener un balance económico favorable entre el costo del
tratamiento y el beneficio obtenido. Bajo diferentes condiciones de pH, el metam-sodio
(MS) genera subproductos altamente tóxicos. En un medio ácido, el metam-sodio se
hidroliza dando como resultado metilamina (CH3NH2) y disulfuro de carbono (CS2)
(Wales, 2002). En soluciones alcalinas diluidas, el MS produce una reacción de
oxidación caracterizada por la formación de azufre elemental (S) e isotiocianato de
metilo (MITC). El MS es una sustancia química que posee actividad fungicida,
insecticida, nematicida y herbicida. En agua es eliminado por hidrólisis, teniendo un bajo
potencial de bioconcentración en organismos acuáticos. Es posible identificar dicho
compuesto por medio de un análisis por cromatografia de líquidos de alta resolución
(CLAR). Por lo anterior, el interés académico de este estudio radica en primer término
en revisar el estado del arte de uno de los biocidas más utilizados en la industria
azucarera el ditiocarbamato de sodio. En segundo término, se procederá a implementar
la metodología analíticas por CLAR para determinar y cuantificar cómo se ve afectado
el compuesto MS en su actividad bajo ciertos factores como son: pH, temperatura,
humedad y luz, que son los más preponderantes en el proceso de molienda de la caña
de azúcar, todo lo anterior bajo un diseño de experimento factorial. Finalmente, será
cuantificada su velocidad de degradación y vida media bajo los diferentes factores que
Segunda Parte II-1: Resumen
183
afectan el proceso. El resultado esperado es conocer la vida media del compuesto de
interés MS y con ello confirmar la existencia o no de este en el producto final "azúcar",
ya que es de suma importancia para el consumidor directo así como para el industrial.
Segunda Parte II-1: Capítulo 1
184
1. Problemática
1.1. Planteamiento
Los productos que se han utilizado para la desinfección y/o sanitización de la caña de
azúcar son: ditiocarbamatos (metam de sodio, MS), cloruro de benzalconio y otras sales
cuaternarias de amonio como bifluoruro de amonio y formaldehído (Kochergin, 2002).
Sin embargo, el uso de reactivos químicos para el control de microorganismos en la
industria alimentaria se ve confrontado con el hecho de que pueden ser tóxicos al
humano o dañar al ambiente (Cuervo et al., 2010).
El metam de sodio (MS) de la familia de los ditiocarbamatos es una sustancia química
que posee actividad fungicida, insecticida, nematicida y herbicida (Pérez-Cordero y
Flores-Santillán, 2013).
Dicho compuesto genera subproductos altamente tóxicos. En un medio ácido, el
metam-sodio se hidroliza dando como resultado metilamina (CH3NH2) y disulfuro de
carbono (CS2).
En soluciones alcalinas diluidas, el MS produce una reacción de oxidación
caracterizada por la formación de azufre elemental (S) e isotiocianato de metilo (MITC)
(Bonilla-Vidal, 2013).
Por lo tanto, es de suma importancia conocer el comportamiento del MS bajo diferentes
parámetros de operación en el proceso de molienda de la caña de azúcar.
Con base en esto, a continuación se presentan los objetivos de esta fase de la
investigación.
Segunda Parte II-1: Capítulo 1
185
1.2. Objetivos
Implementar la metodología analítica para determinar y cuantificar el MS empleando la
cromatografía de líquidos de alta resolución, CLAR.
Estudiar el efecto sobre su comportamiento de ciertos factores como: pH, temperatura,
humedad y luz, que son los más preponderantes en el proceso de molienda de la caña
de azúcar, todo lo anterior bajo un diseño de experimentos factorial.
1.3. Objetivos específicos
Determinar las condiciones de operación del CLAR
Realizar curvas de calibración del MS en agua y jugo de caña
Evaluar la degradación del MS, modificando pH, temperatura y tiempo
Calcular la vida media del MS en función de las condiciones establecidas en el
diseño experimental
1.4. Hipótesis
Se plantean esta fase la:
Hipótesis Nula Ho= Los factores como pH, temperatura, y tiempo no produce efectos de
degradación sobre el MS
Hipótesis Alternativa Ha= Los factores como pH, temperatura y tiempo produce efectos
de degradación sobre el MS
En el siguiente capítulo se presenta el marco teórico que sustenta esta investigación.
Segunda Parte II-1: Capítulo 2
186
2. Marco teórico
2.1. Importancia del tema
Al encontrarse presente en el jugo de caña Leuconostoc mesenteriodes el rendimiento
de la sacarosa obtenida se reduce notablemente, ya que este microorganismo hidroliza
a la sacarosa del jugo de caña en glucosa y fructosa, formando posteriormente
dextranas a partir de la glucosa.
Por lo tanto es de suma importancia el uso de un biocida de amplio espectro como el
ditiocarbamato de sodio para conseguir un buen control sobre este microorganismoy así
evitar pérdidas.
2.2. Justificación
En la actualidad, es frecuente identificar residuos de plaguicidas en los alimentos y que,
en muchos casos, se detectan concentraciones de éstos por encima de los límites
máximos residuales (LMR), recomendados por la FAO/OMS (OMS, 1982).
Por lo tanto, en los últimos años ha aumentado de manera significativa en el mundo
entero la demanda de los consumidores por productos saludables e inocuos.
Debido a esto, es necesario desarrollar e implementar metodologías analíticas basadas
en procesos de separación específicamente en el sector azucarero que contribuyan a la
detección, cuantificación y evaluación de la degradación de uno de los compuestos más
utilizados, el N-metil ditiocarbamato de sodio (conocido como metam de sodio, MS).
Este biocida se usa para la eliminación del microorganismo Leuconostoc mesenteroides
que hidroliza la sacarosa y forma dextranas durante el proceso de extracción de jugo de
caña para la obtención de azúcar.
Segunda Parte II-1: Capítulo 2
187
2.3. Microorganismos presentes en la caña de azúcar
Durante el proceso de fabricación, la sacarosa de los jugos de la caña de azúcar se van
concentrando paulatinamente hasta que se satura la solución azucarada y el azúcar se
separa en estado cristalino de las melazas residuales donde quedan los compuestos
más solubles como la glucosa, la fructosa, etc.
La sacarosa puede alterarse por inversión, fermentación ácida u oxidación por
bacterias, levaduras y mohos.
Entre los microorganismos presentes en la caña de azúcar se encuentran Leuconostoc,
Enterobacteriaceae, Lactobacillus, Flavobacterium, Xanthomonas, Pseudomonas,
Micrococcus, Bacillus y Corynebacterium. Como ya se mencionó Leuconostoc
mesenteroides es la que crea más problemas y se ha encontrado en cantidades de
5x103/g UFC (Thompson, 2010).
2.4. Plaguicidas
Un plaguicida es la sustancia o mezcla de ellas destinada a prevenir, destruir o controlar
plagas, incluyendo los vectores de enfermedad humana o animal; las especies no
deseadas de plantas o animales que ocasionan un daño duradero u otras que
interfieren con la producción, procesamiento, almacenamiento, transporte y
comercialización de alimentos (OMS, 1982).
Los plaguicidas se clasifican en función de algunas de sus características principales,
como son la toxicidad aguda, la vida media, la estructura química y su uso.
La Organización Mundial de la Salud (OMS) estableció una clasificación basada en su
peligrosidad o grado de toxicidad aguda (Tabla 1), definida ésta como la capacidad del
Segunda Parte II-1: Capítulo 2
188
plaguicida de producir un daño agudo a la salud a través de una o múltiples
exposiciones, en un período de tiempo relativamente corto (Ramírez y Lacazaña, 2001).
Tabla 1. Clasificacion de los plaguicidas según la familia química (Ramírez y Lacazaña, 2001)
Familia química Ejemplos con nombres comerciales Organoclorados DDT, aldrín, endosulfán, endrín Organofosforados Bromophos, diclorvos, malation Carbamatos Carbaryl, methomyl, propoxur Tiocarbamatos Ditiocarmato, mancozeb, maneb Piretroides Cypermetrin, fenvalerato, permetrín Derivados bipiridilicos Clormequat, diquat, paraquat Derivados del ácido fenoxiacético Dicloroprop, piclram, silvex Derivados cloronitrofenólicos DNOC, dinoterb, dinocap Derivados de triazinas Atrazina, ametryn, desmetryn, simazine Compuestos orgánicos del estaño Cyhexatin, dowco, plictran Compuestos inorgánicos Arsénico pentóxido, OBPA, fosfito de magnesio,
cloruro de mercurio, arsenato de plomo, bromuro de metilo
Compuestos de origen botánico Rotenona, nicotina, aceite de canola
2.4.1. Carbamatos (OMS, 1982)
Los carbamatos (C) son un grupo de plaguicidas que pueden ser de tres tipos
principales: a) derivados de ésteres carbamatos, comúnmente usados como
insecticidas; b) derivados del ácido tiocarbámico, utilizados como fungicidas y c)
carbamatos propiamente dichos, que se emplean como herbicidas.
Todos ellos son relativamente inestables, se les atribuye un tiempo corto de
persistencia ambiental y cuentan con cierta selectividad.
Su degradación se realiza por oxidación y sus metabolitos finales son hidrosolubles
pudiendo excretarse por la orina y las heces fecales.
Segunda Parte II-1: Capítulo 2
189
2.4.1.1. Ditiocarbamatos (OMS, 1982)
Los ditiocarbamatos son compuestos derivados del ácido carbamico donde se
reemplaza el oxígeno por el azufre, la forma general de estos compuestos es
RSCSNR1R2 (Fig. 1).
La clasificación de los ditiocarbamatos está basada en la sustitución de uno o ambos
hidrógenos en cada nitrógeno.
Fig. 1. Fórmula general del ditiocarbamato (Pruett et al., 2001)
2.4.1.2. Ditiocarbamato de sodio
El ditiocarbamato de sodio es muy utilizado en la industria de los alimentos,
principalmente en la extracción del jugo de caña de azúcar ya que inhibe a Leuconostoc
mesenteroides, microorganismo responsable de la formación de las gomas dextranas.
De acuerdo con el CODEX ALIMENTARIUS (2015), la concentración usada de dicho
biocida es de 0.5 mg/kg para la industria azucarera.
En soluciones neutras, el metam sodio se descompone en metilisotiocianato (MIT) e
hidrogenosulfuro de sodio (NaSH) (Figura 2)
Fig. 2. Degradación de metam-sodio en solución neutra (LAINCO, 2010)
Segunda Parte II-1: Capítulo 2
190
En soluciones alcalinas diluidas se produce una reacción de oxidación, caracterizada por la formación de azufre elemental (S) y MIT (Figura 3).
Fig. 3. Degradación de metam-sodio en solución alcalina (LAINCO, 2010)
En soluciones ácidas se produce una descomposición no oxidativa que inicialmente
produce la mitad de MIT que el que se forma en la descomposición oxidativa (Figura 4).
Fig. 4. Degradación de metam-sodio en solución ácida (LAINCO, 2010)
Por ello, en esta segunda parte de la investigación se evaluará primero, la
concentración del metam de sodio empleando una metodología basada en la
cromatografía de líquidos.
Segunda Parte II-1: Capítulo 3
191
3. Metodología
3.1 Diagrama de bloques
En la Fig. 5. se observa el diagrama de bloques con la metodología empleada para esta
investigación.
Figura 5. Diagrama de bloques de la metodología empleada en esta
etapa de la investigación
Segunda Parte II-1: Capítulo 3
192
3.2. Procedimiento
3.2.1. Lavado y preparación de material
El material de vidrio que se utilizó se sometió a un lavado específico con jabón Dextran
al 15%, se enjuagó con agua desionizada y fue sumergido en una solución de HNO3 al
10% durante 24 horas. Posteriormente, se retiró el material de vidrio de la solución
ácida y se procedió a enjuagar con agua desionizada después se cubrió la boca de los
viales y frascos con papel aluminio y fue secado en la estufa a 120°C durante 1 hora, al
finalizar esta operación el material se dejó enfriar y se almacenó en bolsas ziploc para
su posterior uso.
3.2.2. Preparación de la solución madre y fase móvil
La solución madre fue preparada a partir del MS a una concentración de 100 mg L-1 en
una matriz de metanol. La fase móvil es de agua:acetonitrilo grado cromatográfico en
una proporción de (70:30). Todos los solventes (agua, acetonitrilo y metanol fueron
filtrados mediante un equipo de filtración al vacío Millipore, utilizando una membrana de
47mm de Nylon previamente acondicionada. Antes de usar la fase móvil fue
desgasificada en un baño ultrasonico Modelo 3210, 0-60 Hz por 10 minutos.
3.2.3. Establecimiento de las condiciones cromatográficas para determinar MS
La identificación y cuantificación del plaguicida en estudio, se realiza utilizando un
equipo de cromatografía de líquidos de alta resolución Perkin-Elmer, que emplea una
columna cromatográfica Nucleosil C-18 de 10 cm de longitud, 4.5 mm de diámetro
interno y partículas esféricas de 5 µm. La velocidad de flujo es de 1.1 mL min-1. La fase
móvil es de agua:acetonitrilo grado cromatográfico en una proporción de 70:30. Se
emplea un detector UV a una longitud de onda (λ) de 200 nm. El volumen de inyección
de cada muestra es de 20 µL y el tiempo de corrida es de 10 minutos (Arvizu- Ramos,
2010).
Segunda Parte II-1: Capítulo 3
193
3.2.4. Determinación del tiempo de retención (tr)
Se procedió a inyectar mediante una jeringa Hamilton de 100 µL un volumen de 20 µL
de una solución de 10 ppm preparada a partir de la solución madre (100 mg L-1). El pico
fue identificado así como su tiempo de retención. Para corroborar esto fue necesario
inyectar la solución a diferentes concentraciones (5, 4, 3, 2, 1 mg L-1).
3.2.5. Diseño experimental
Para desarrollar el experimento, se determinaron los factores que afectan la
degradación del ditiocarbamato, los cuales son: matriz (A), pH (B), temperatura (C) y
tiempo (D). Una vez seleccionados los factores y los niveles para cada uno de ellos se
definió un diseño factorial para cada matriz (Tabla 2), proporcionando 36 muestras para
su análisis, realizando cada inyección por triplicado, dando un total de 108 muestras
para cada matriz (agua y jugo de caña).
Tabla 2. Diseño experimental Factores:Niveles 1 2 3 4 5 A: Matriz Agua Jugo de caña B: pH Sin modificar 4.5 7.0 C: Temperatura (°C) 25 35 45 D: Tiempo (min) 0 60 180 240 300 3.2.6. Elaboración de curvas de calibración en agua y jugo de caña Agua
La curva de calibración en agua sin modificar el pH se elaboró a partir de una solución
madre de MS con una concentración de100 mg L-1, la cual fue utilizada para realizar las
10 diferentes diluciones de 10a 100 mg L -1 de la curva de calibración. Para la curvas de
calibración a pH= 7, fue necesario ajustar con NH4OH 0.01 M. También se emplearon
10 diluciones cuya concentración se encuentra en un intervalo de 10 a 100 mg L-1,
mientras que para la curva de calibración a pH= 4.5, el pH es ajustado con H3PO4 0.01
M. Nuevamente se realizaron 10 diluciones diferentes de 10 a 100 mg L -1 para la curva
de calibración.
Segunda Parte II-1: Capítulo 3
194
Jugo de caña
Para precisión, exactitud y confiabilidad, la curva de calibración debe contar con al
menos 10 puntos en un intervalo de concentraciones que vayan de 10 a 100 mg L-1 de
MS en jugo de caña. Primeramente, el jugo se extrajo y filtró con una membrana de
Nylon de 0.45 µm. El filtrado fue almacenado a 4°C. En el momento preciso de la
inyección se ajustaron los valores de pH a 4.5 y se realizaron las extracciones en fase
sólida con un cartucho Envi-carb de 6 mL con 0.5 g de empaque. Con una regresión
lineal se comprobó la linealidad, indicada por el coeficiente de correlación. Del mismo
modo, se obtuvo una ecuación de regresión lineal tipo y=mx+b. Los valores de la
pendiente (m) y de la ordenada al origen (b) que sirvieron para calcular la concentración
del metam de sodio (x) en la matriz de jugo de caña se obtuvieron de estos datos
experimentales.
3.2.7. Cuantificación del MS
En el estudio de la degradación del plaguicida se prepararon 9 combinaciones que
contuvieran el plaguicida en una concentración de 80 mg L-1 empleando agua grado
cromatográfico y 3 combinaciones con jugo de caña, bajo los factores de pH,
temperatura y tiempo. Dichas combinaciones se muestran en la Figura 6.
Con ese arreglo se obtuvieron un total de 12 muestras bajo las condiciones
establecidas en el diseño experimental.
Éstas se inyectaron en 6 tiempos, que corresponde a 0, 60, 120, 180, 240, 300 minutos,
para las muestras en agua y 0, 30, 60, 90, 120 y 150 minutos, en jugo de caña.
La finalidad de este experimento fue el de observar la disminución de la concentración
bajo los diferentes factores seleccionados. Esto se hizo cuantificando el área bajo la
curva correspondiente al pico del plaguicida.
Segunda Parte II-1: Capítulo 3
195
Fig. 6. Combinación de factores para el desarrollo experimental
3.2.8 Determinación de la vida media del ( ) del MS en agua y jugo de caña
A partir de la constante cinética de degradación(k), se calcula el tiempo que se necesita
para degradar el 50% del MS agregado en los ingenios azucareros y así obtener lo que
se conoce como tiempo de vida media (t1/2).
3.2.9. Análisis estadístico
De los datos del diseño experimental. Se realizó un análisis de varianza (ANDEVA).
Matriz: Agua
Matriz: Jugo de caña
Muestra con concentración conocida
25°C
45°C
35°C
25°C
45°C
35°C
pH sin modificar
pH =4.5
pH = 4.5
pH = 7.0
pH sin modificar
pH = 4.5
pH = 7.0
pH sin modificar
pH = 4.5
pH = 7
Segunda Parte II-1: Capítulo 4
196
4. Resultados y discusión
4.1. Identificación y cuantificación del plaguicida
Utilizando las condiciones de operación establecidas por Nollet (1996) para un CLAR
(Tabla 3), en esta investigación se logró identificar al plaguicida en estudio.
Tabla 3. Condiciones cromatográficas
Condiciones cromatográficas Columna 100mm x 4mm nucleosil RP-18 (5µm) Fase móvil Agua/Acetonitrilo (70:30) Velocidad de flujo 1.1 mL min-1 Volumen de inyección 20 µL Detector UV; 200 nm
mm: milímetros; µL: microlitros; µm:micrómetros; mL: mililitros; nm:nanómetros; UV:ultravioleta
Los compuestos polares son más reactivos lo que da lugar a problemas durante su
análisis debido a su adsorción y degradación. Éste es el caso del ditiocarbamato de
sodio. Sin embargo, en esta investigación se logró identificar al plaguicida en estudio,
así como también determinar su tiempo de retención (tr) el cual fue de 3.5 minutos en la
matriz de agua (Figura 7).
Fig. 7. Cromatograma del ditiocarbamato de sodio en agua. Columna: 100 mm x
4.6 mmNucleosil RP-18 (5 µm); fase móvil: Agua/Acetonitrilo (70:30); flujo: 1.1 mL min-1; volumen de inyección: 20 µL; detector: UV; λ=200 nm (tiempo de retención,
tr , 8.2 minutos)
3.5
Segunda Parte II-1: Capítulo 4
197
4.2. Curvas de calibración
Para realizar la cuantificación se hicieron 4 curvas de calibración del plaguicida en agua
y jugo de caña, con concentraciones que van de 10 a 100 mg L-1, a pH de 4.5, 7 y sin
modificar en el caso de la matriz de agua y a pH de 4.5 para la matriz de jugo de caña,
obteniendo los valores que se presentan en la Tabla 4, tanto para la pendiente (m),
como para la ordenada al origen (b) y para el coeficiente de correlación lineal (r). Las
Figuras 8 a 11 muestran los resultados.
Tabla 4. Coeficientes de las curvas de calibración del ditiocarbamato en agua y
jugo de caña
Pendiente Ordenada al origen Coeficiente de correlacióny=mx+b
(m) (b) (R2)
pH Agua Jugo Agua Jugo Agua Jugo
Sin modificar 1087.2 n.d -1313.7 n.d 0.9811 n.d 7 1053.4 n.d -2062 n.d 0.9448 n.d
4.5 645.6 1284 -1751 11984 0.9857 0.9854
y: área bajo la curva;x: concentración; m: pendiente; b: ordenada al origen; R2: coeficiente de correlación; n.d: no determinada
4.2.1. Precisión
En la Tabla 5 se presentan los valores de la media (x), desviación estándar (s) y
coeficiente de variación (CV), obtenidos de las áreas del pico para la concentración de
50 mg L-1 de cada curva de calibración; el cual correspondió al punto medio de cada
curva. Los coeficientes de variación se encuentran en un rango de 0.314 y 14.17%, los
cuales son aceptables.
La excepción es la de la matriz de agua a pH=7, que presenta un coeficiente de
variación de 22.53% este valor sobrepasa el límite establecido que no debe ser mayor
al 15%.
Segunda Parte II-1: Capítulo 4
198
Fig. 8. Curva de calibración en agua pH=4.5
Fig. 9. Curva de calibración en agua pH=7
Fig.10. Curva de calibración en agua sin modificar pH
Segunda Parte II-1: Capítulo 4
199
Fig. 11. Curva de calibración en jugo de caña
Tabla 5. Valores de media, desviación estándar y coeficiente de variación del punto medio (50ppm) de cada cueva de calibración
Media Desviación estándar Coeficiente de variación
(x) (s) (CV)
pH Agua Jugo Agua Jugo Agua Jugo
Sin modificar 61313.3 n.d 192.8 n.d 0.314% n.d 7 60872.7 n.d 13698.4 n.d 22.53% n.d
4.5 33162.4 24270.3 4701 2463.8 14.17% 10.15%
X: media, S: Desviación estándar, CV: coeficiente de variación
4.3. Determinación de la velocidad de degradación del MS
Tanto la estabilidad como el comportamiento del MS está condicionada por ciertos
factores, de tal manera que no solamente un parámetro interviene en su degradación.
El área bajo la curva de cada inyección fue cuantificada mediante las curvas de
calibración para agua y para jugo de caña obtenidas en el punto 4.3, obteniendo la
concentración de cada muestra. Al graficar el logaritmo natural de la concentración (C1)
entre la concentración inicial (Co), contra el tiempo que se presenta y aplicando un
análisis de regresión lineal se obtuvieron las pendientes equivalentes a las constantes
de la velocidad de degradación del metam de sodio (k) presente en la matriz a las
Segunda Parte II-1: Capítulo 4
200
temperaturas de 25, 35 y 45°C para agua (Figs. 12 a la 20) y para jugo de caña (Figs.
21, 22 y 23).
Fig. 12. Degradación del MS en agua, pH= S/M a 25°C
Fig. 13. Degradación del MS en agua, pH= 4.5 a
25°C
Fig. 14. Degradación del MS en agua, pH=7 a 25°C
Segunda Parte II-1: Capítulo 4
201
Fig. 15. Degradación del MS en agua, pH=S/M a
35°C
Fig. 16. Degradación del MS en agua, pH=4.5 a
35°C
Fig. 17 Degradación del MS en agua, pH=7.0 a 35°C
Segunda Parte II-1: Capítulo 4
202
Fig. 18. Degradación del MS en agua, pH=S/M a 45°C
Con las constantes cinéticas de degradación, se calcularon los tiempos que se
necesitan para degradar el 50% del MS agregado en los ingenios azucareros y así
obtener lo que se conoce como tiempo de vida media (t1/2).
Fig. 19. Degradación del MS en agua, pH=4.5 a 45°C
Los resultados de velocidad de degradación del ditiocarbamato (k) (Tabla 6), en la
matriz de agua van de 0.0006 a 0.0540 min-1 encontrando el valor más bajo para una
temperatura de 45°C, pH= 4.5, un porcentaje de degradación de 90.6% y un tiempo de
vida media de 12.83 min.
Segunda Parte II-1: Capítulo 4
203
El valor más alto presentado es para 25°C, pH =sin modificar, un porcentaje de
degradación de 54.8% y un tiempo de vida media de 1155min.
Fig. 20. Degradación del MS en agua, pH=7 a 45°C
Fig. 21. Degradación del MS en jugo de caña, pH=S/M a 45°C
En cuanto a la matriz de jugo de caña solo se trabajó con un pH = 4.5 y se observa que
a la temperatura de 45°C se tiene se obtiene una velocidad de degradación (k) de 0.118
min-1 lo que da un tiempo de vida media muy corto el cual fue de 5.874 min.
Este comportamiento se debe a que en condiciones ácidas de pH = 4.5 y bajo un
incremento de la temperatura se produce una descomposición que produce
isotiocianato de metilo, metilamina, sulfuro de sodio y sulfuro de carbono según lo
reportado por LAINCO (2010).
Segunda Parte II-1: Capítulo 4
204
Fig. 22. Degradación del MS en jugo de caña, pH=4.5 a 45°C
Fig. 23. Degradación del MS en jugo de caña, pH=7 a 45°C
4.4. Análisis estadístico
Para analizar cuáles eran los factores que influían en la degradación del plaguicida,
como se mencionó en la metodología, se realizó un diseño factorial multinivel con 4
factores experimentales y un número de bloques de 2. Para el análisis estadístico se
llevó a cabo un análisis de varianza (ANDEVA) y los resultados obtenidos se muestran
en la Tabla 7. En este caso solamente dos factores tienen los valores de significancia
observada menores a 0.05 (tiempo y temperatura) indicando que son significativamente
Segunda Parte II-1: Capítulo 4
205
diferentes de cero al 95.0% de nivel de confianza, es decir estos factores tiempo y
temperatura son los que tienen un aporte significativo sobre la degradación del
ditiocarbamato de sodio.
Tabla 6. Degradación del ditiocarbamato de sodio de cada combinación del
diseño experimental
Matriz Agua Jugo de caña
Temperatura pH %D K(min-1) t1/2(min) %D K(min-1) t1/2(min)
S/M 54.8 0.0006 1155.00
4.5 67.2 0.0013 533.13 78.76 0.0036 192.540
25C°
7 60.3 0.0008 866.43
S/M 69.6 0.0070 99.02
4.5 75.7 0.0120 57.76 85.43 0.0376 18.434
35C°
7 70.1 0.0085 81.55
S/M 80.4 0.0069 99.88
4.5 90.6 0.0540 12.83 96.67 0.118 5.874
45C°
7 82.7 0.0077 90.02 %D: porcentaje de degradación, K: velocidad de la degradación, t1/2: tiempo de vida media
Tabla 7.Análisis de varianza para la degradación del ditiocarbamato de sodio
Fuente Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado medio
Razón-F Valor-P
COVARIABLES BLOQUE 1.58784 1 1.58784 0.01 0.9097 EFECTOS PRINCIPALES A:Factor_A (pH) 326.083 2 163.041 1.33 0.2702 B:Factor_B (temperatura) 19458.0 2 9728.98 79.16 0 C:Factor_C (tiempo) 5761.03 5 1152.21 9.37 0 RESIDUOS 11921.9 97 122.906 TOTAL (CORREGIDO) 37468.6 107
Los factores que tienen mayor aporte a la degradación del MS son:
temperatura>tiempo>pH, confirmando con ello la hipótesis alternativa Ha= Los factores
como pH, temperatura y tiempo tienen efecto sobre la degradación del MS y, por lo
tanto, la rapidez o velocidad de degradación es diferente para cada factor seleccionado.
Segunda Parte II-1: Capítulo 5
206
5. Conclusiones y recomendaciones
5.1. Conclusiones
Con base en uno de los objetivos generales de esta investigación que fue el de
determinar la cinética de degradación del ditiocarbamato de sodio usando como técnica
la cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR) y teniendo como factores de
estudio la matriz en la que se disolvió el plaguicida (agua y jugo de caña), los valores de
pH (4.5, 7 y sin modificar), el tiempo en el que se llevó a cabo el estudio (0 a 300
minutos) y la temperatura (25, 35 y 45°C), se obtuvieron las siguientes conclusiones.
La degradación del ditiocarbamato se determinó mediante un diseño
multifactorial y se observó que existe diferencia significativa entre los factores de
tiempo y temperatura, esto indica que el comportamiento del plaguicida en una
matriz de jugo de caña a una temperatura de 45°C se degrada más rápido.
En la matriz de jugo de caña se observa la mayor velocidad de degradación
(K=0.118min-1), una temperatura de 45°C y un tiempo de vida media de
5.874min.
El porcentaje de degradación del ditiocarbamato de sodio que se obtuvo con el
diseño experimental propuesto fue de hasta un 96.67%, teniendo en cuenta que
en un ingenio azucarero las condiciones de proceso son más drásticas, muy
probablemente se pueda alcanzar el 100% de su degradación y con esto
garantizar al consumidor que el producto final (azúcar de mesa) es inocuo para la
salud.
Es posible decir que el método propuesto (CLAR) presenta una buena alternativa
para la identificación y cuantificación del ditiocarbamato de sodio en el jugo de
Segunda Parte II-1: Capítulo 5
207
caña y que también dicha técnica podría ser útil en la identificación de biocidas
en otro tipo de alimentos.
5.2. Recomendaciones
Con base en estos experimentos se recomienda continuar la investigación probando la
extracción en fase sólida calculando los porcentajes de recuperación.
Para la extracción en fase sólida, donde los llamados “cartuchos” son muy costosos se
plantea la utilización de un polímero de bajo costo como pudiera ser el harina obtenida
de los residuos de exoesqueletos y cefalotórax de crustáceos, que son actualmente un
residuo aunque debieran ser una materia prima valiosa.
Segunda Parte II-1: Anexos
208
Anexo I.
Curvas de calibración en agua y jugo de caña
Fig. A.1. Curva de calibración en agua pH=4.5
Fig. A2. Curva de calibración en agua pH=7
Segunda Parte II-1: Anexos
209
Fig. A.3. Curva de calibración en agua sin modificar pH
Fig. A4. Curva de calibración en jugo de caña
Segunda Parte II-1: Anexos
210
Anexo II
Datos de las curvas de calibración
Matriz Agua
Tabla A1. Datos para la Curva de calibración en agua pH=4.5
Concentración
(mg/L)
20 30 40 50 60 70 80 90 100
Área 17926 26022 27996 29499 33162 38276 54607 63740 72189
Tabla A2. Datos para la Curva de calibración en agua pH=7.5
Concentración
(mg/L)
20 30 40 50 60 70 80 90 100
Área 19930 23569 27376 60872 73110 75177 84317 91153 94964
Tabla A3. Datos para la Curva de calibración en agua pH=S/M
Concentración
(mg/L)
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Área 11458 18421 29644 52622 61313 69626 77244 81581 98923 110148
Tabla A3. Datos para la Curva de calibración en jugo de caña pH=S/M
Concentración
(mg/L)
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Área 8409 16068 24146 36794 44878 59274 75856 94878 106428 119606
Segunda Parte II-1: Anexos
211
Anexo III.
Curvas de cinética de degradación del diseño experimental
Fig. A1. Degradación del ditiocarbamato de sodio en agua, pH= S/M, 25°C
Fig. A2. Degradación del ditiocarbamato de sodio en agua, pH= 4.5, 25°C
Fig. A3. Degradación del ditiocarbamato de sodio en agua, pH= 7.0, 25°C
Segunda Parte II-1: Anexos
212
Fig. A4. Degradación del ditiocarbamato de sodio en agua, pH= S/M, 35°C
Fig. A5. Degradación del ditiocarbamato de sodio en agua, pH= 4.5 35°C
Fig. A6. Degradación del ditiocarbamato de sodio en agua, pH= 7, 35°C
Segunda Parte II-1: Anexos
213
Anexo IV
Datos cinéticos
Matriz Agua
Tabla A1. Tabla de resultados para curva de cinética pH=S/M, 25°C
Tiempo 0.000 60.000 120.000 180.000 240.000 300.000Área 63513.000 55154.000 55013.000 54978.000 52282.000 51269.000Concentración 57.221 49.531 49.401 49.369 46.889 45.957
ln(c1/Co) -0.335 -0.479 -0.482 -0.483 -0.534 -0.554
Tabla A2. Tabla de resultados para curva de cinética pH=4.5, 25°C
Tiempo 0.000 60.000 120.000 180.000 240.000 300.000
Área 31521.000 31081.000 29689.000 25653.000 22282.000 11269.000Concentración 46.112 27.385 26.104 22.391 19.290 9.159ln(c1/Co) -0.551 -1.072 -1.120 -1.273 -1.422 -2.167
Tabla A3. Tabla de resultados para curva de cinética pH=7, 25°C
Tiempo 0.000 60.000 120.000 180.000 240.000 300.000Área 57390.000 52060.000 48827.000 44241.000 42282.000 40322.000Concentración 56.438 46.685 43.710 39.492 37.689 35.886ln(c1/Co) -0.349 -0.539 -0.604 -0.706 -0.753 -0.802
Tabla A4. Tabla de resultados para curva de cinética pH=S/M, 35°C
tiempo 0.000 60.000 120.000 180.000 240.000 300.000Área 38619.000 3790.000 4823.000 4238.000 2014.000 2424.000Concentración 34.320 2.278 3.228 2.690 0.644 1.021ln(c1/Co) -0.846 -3.559 -3.210 -3.392 -4.822 -4.361
Tabla A5. Tabla de resultados para curva de cinética pH=4.5, 35°C
tiempo 0.000 60.000 120.000 180.000 240.000 300.000Área 46121.000 20293.000 4115.000 3960.000 2096.000 1751.000Concentración 68.726 17.460 2.577 2.434 0.720 0.402ln(c1/Co) -0.152 -1.522 -3.435 -3.492 -4.711 -5.293
Segunda Parte II-1: Anexos
214
Tabla A6. Tabla de resultados para curva de cinética pH=7, 35°C.
Tiempo 0.000 60.000 120.000 180.000 240.000 300.000Área 30729.000 23172.000 21045.000 20705.000 10086.000 8701.000Concentración 31.129 20.109 18.152 17.839 8.070 6.796ln(c1/Co) -0.944 -1.381 -1.483 -1.501 -2.294 -2.466
Tabla A7. Tabla de resultados para curva de cinética pH=S/M, 45°C.
tiempo 0.000 60.000 120.000 180.000 240.000 300.000Área 37526.000 34526.000 33510.000 30900.000 21378.000 17424.000Concertación 33.314 30.554 29.619 27.218 18.458 14.821ln(c1/Co) -0.876 -0.963 -0.994 -1.078 -1.467 -1.686
Tabla A8. Tabla de resultados para curva de cinética pH=4.5, 45°C.
Tiempo 0.000 60.000 120.000 180.000 240.000 300.000Área 28982.000 18922.000 13351.000 10544.000 5627.000 3370.000Concertación 42.179 16.199 11.074 8.492 3.968 1.892ln(c1/Co) -0.640 -1.597 -1.977 -2.243 -3.004 -3.745
Tabla A9. Tabla de resultados para curva de cinética pH=7, 45°C.
Tiempo 0.000 60.000 120.000 180.000 240.000 300.000Área 23972.000 23172.000 20233.000 20705.000 10086.000 3919.000Concertación 24.714 20.109 17.405 17.839 8.070 2.397ln(c1/Co) -1.175 -1.381 -1.525 -1.501 -2.294 -3.508
Matriz jugo de caña
Tabla A10. Tabla de resultados para curva de cinética pH=4.5, 25°C.
tiempo 0.000 60.000 120.000 180.000 240.000 300.000área 84711.000 64748.000 54711.000 48495.000 42894.000 31030.000concentración 76.124 59.760 51.943 47.102 42.740 33.500ln(c1/Co) -0.050 -0.292 -0.432 -0.530 -0.627 -0.870
Segunda Parte II-1: Anexos
215
Tabla A11. Tabla de resultados para curva de cinética pH=4.5, 35°C.
Tiempo 0.000 60.000 120.000 180.000 240.000 300.000Área 68207.000 52396.000 45787.000 23597.000 18905.000 549.000Concentración 61.293 50.140 44.993 27.711 24.057 9.761ln(c1/Co -0.266 -0.467 -0.576 -1.060 -1.202 -2.104
Tabla A12. Tabla de resultados para curva de cinética pH=4.5, 45°C.
Tiempo 0.000 60.000 120.000 180.000 240.000 300.000Área 69105.000 64940.000 36909.000 30694.000 2455.000 0.000concentración 62.100 59.910 38.079 33.238 11.245 9.333ln(c1/Co -0.253 -0.289 -0.742 -0.878 -1.962 -2.148
Anexo V
Disposición controlada de los residuos producidos
De la investigación de Bonilla-Vidal (2013), se tomaron las siguientes imágenes:
Segunda Parte II-1: Anexos
216
Prácticamente, en esta fase de la investigación se realizó la misma secuencia para la
disposición controlada de los residuos generados. La única diferencia es que en esta
investigación no se utilizaron metanol ni cloruro de dansilo por lo que no estaban
presentes en los residuos dispuestos con la UGA de la Facultad de Química de la
UNAM. Tampoco se tenía metilamina sino MS.
Segunda Parte II-1: Anexos
217
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Segunda Parte II-2: Resumen
219
Segunda Parte
II-2
METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN
DEL METAM DE SODIO USANDO EXTRACCIÓN
EN FASE SÓLIDA
Segunda Parte II-2: Índices
220
Pág.
SEGUNDA PARTE 219
II-2 METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DEL metam de sodio usando
extracción en fase sólida
Resumen 223 1. Problemática 224 1.1. Planteamiento 224 1.3. Hipótesis 225 1.4. Objetivos 225 2. Fundamento teórico y antecedentes 226 2.1. Justificación e importancia del tema 226 2.2. Antecedentes 226 2.2.1. Quitina 226 2.2.2. Quitosana 227 2.3. Extracción en fase sólida 228 2.4. Adsorbentes 228 3. Metodología 229 3.1. Desarrollo experimental 229 3.2. Obtención de la harina de camarón 229 3.3. Caracterización de la harina del camarón 230 3.4. Cartuchos de extracción en fase sólida 230 3.5. Preparación de los estándares 231 3.6. Extracción del jugo de caña 231 3.7. Extracción en fase sólida (EFS) 231 3.8. Cuantificación por cromatografía de líquidos de alta resolución
(CLAR, HPLC) 232
3.8.1. Límite máximo de detección del ditiocarbamato en el equipo 233 3.8.2. Curva de calibración de ditiocarbamato 234 3.9. Análisis estadísticos 234 4. Resultados y discusión 235 4.1. Obtención de la harina de camarón 235 4.2. Desmineralización de la harina de camarón 235 4.3. Caracterización de la harina 236
Pág.
4.4. Extracción del jugo de caña 237 4.5. Cuantificación de MS por CLAR (HPLC) 237 4.5.1. Límite máximo de detección del ditiocarbamato en el equipo 237
Segunda Parte II-2: Índices
221
Pág.
4.5.2. Curva de calibración de ditiocarbamato 238 4.5.3. Porcentaje de recobro de ditiocarbamato 238 5. Conclusiones y recomendaciones 242 5.1. Conclusiones 242 5.2. Recomendaciones 243 Anexos 244 Anexo I. Disposición controlada de los residuos producidos en la
investigación 244
Bibliografía 246
Índices de Figuras y Tablas Pág. Fig. 1.1. Estructura del metam de sodio (NCBI, 2016) 224 Fig. 2.1. Estructura de la quitina (Flores, 2008) 227 Fig. 2.2. Estructura de la quitosana (Flores, 2008) 227 Fig. 3.1. Esquema de la metodología 229 Fig. 3.2. Cartucho de EFS. Elaborado con adsorbente de harina de
camarón 230
Fig. 3.3. Extracción en fase sólida (EFS) (Pawliszyn, 2002) 232 Fig. 3.4. Equipo de HPLC utilizado para la cuantificación del metam de
sodio 233
Fig. 4.1. Esquema del cuerpo de un camarón (Zavaleta, 2010) 235 Fig. 4.2. Residuos de camarón obtenidos después del descabezado de los
camarones 235
Fig. 4.3. Harina del cefalotórax de camarón 235 Fig. 4.4. Agitación 236 Fig. 4.5. Filtración 236 Fig. 4.6. Harina húmeda 236 Fig. 4.7. Harina desmineralizada 236 Fig. 4.8. Determinación de humedad por termobalanza 237 Fig. 4.9. Determinación de cenizas, se observan los crisoles con las
muestras en la campana 237
Fig. 4.10. Determinación de grasa, se observan dos equipos Soxhlet con la muestra en digestión
237
Fig. 4.11. Determinación de proteínas por método de Kjeldahl 237 Fig. 4.12. Determinación de fibra (kit de enzimas para su determinación) 237 Fig. 4.13. Extracción del jugo de caña en un extractor casero 238 Fig. 4.14. Curva de calibración de la cuantificación de metan de sodio en
HPLC 239
Fig. 4.15. Extracción en fase sólida con los cartuchos de harina de camarón 239
Segunda Parte II-2: Índices
222
Pág.
Tabla 3.1. Condiciones establecidas para la cuantificación de Metam de
sodio por cromatografía de líquidos de alta resolución, CLAR (HPLC, high performance liquid chromatography)
233
Tabla 4.1. Caracterización de las harinas de camarón 236 Tabla 4.2. Porcentaje de recuperación con diferentes mezclas metanol/agua 239 Tabla 4.3. Porcentaje de recuperación con diferentes volúmenes de
disolución pasada por el cartucho 240
Tabla 4.4. Porcentaje de recuperación en las diferentes fracciones de fluido eluído
240
Tabla 4.5. Porcentaje de recuperación con diferentes cartuchos de EFS 241
Segunda Parte II-2: Resumen
223
El proceso de extracción del jugo de caña es el punto de mayor contaminación en los
ingenios azucareros por lo que se añade el plaguicida N-metil ditiocarbamato de
sodio o metam de sodio (MS) para inhibir el crecimiento de Leuconostoc
mesenteroides que forma polisacáridos y daña los jugos. El metam de sodio (MS),
perteneciente a la familia de los ditiocarbamatos, es una sustancia química que
posee actividad fungicida, insecticida, nematicida y herbicida. Para su cuantificación
se han desarrollado varios métodos de preparación de la muestra, tales como
extracción tipo Soxhlet, en fase sólida, microextracción líquido-líquido, extracción
sólido-líquido, extracción asistida por ultrasonido, así como por microondas y la
microextracción en fase sólida. Estos métodos deben ser rápidos, fáciles, baratos,
eficaces, resistentes y seguros. Por ello, en esta investigación se aplicó el método de
extracción en fase sólida (EFS) del plaguicida MS presente en el jugo de caña
empleando como adsorbente harina de cefalotórax de camarón, un residuo
actualmente, usando como control una fase comercial octadecil-sílice C18(J.T.
Baker®). Asimismo, se cuantificaron y compararon los resultados del adsorbente en
estudio y el control utilizando cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR) o
HPLC por sus siglas en inglés, bajo diferentes factores de operación. Al observar si
había diferencias significativas al variar los parámetros, con los resultados obtenidos,
se concluye que las mejores condiciones de extracción para este biocida en los
cartuchos son las siguientes: eluyente: metanol/agua (60:40), volumen de eluyente: 1
mL y volumen de muestra: 1 mL. Tras cuantificar el MS extraído, mediante
cromatografía de líquidos de alta resolución, se pudo determinar que sí existen
diferencias significativas debidas al origen del adsorbente en la extracción en fase
sólida (EFS) del MS. Se obtuvo el mejor porcentaje de recuperación con la columna
comercial de octadecil-sílice C18 (J.T. Baker®), seguida de las columnas de harina
de camarón entera y por último con el menor porcentaje de recuperación, las
columnas que tienen como adsorbente la harina de camarón desmineralizada. Esto
indica que las condiciones estudiadas en esta fase de la investigación pueden ser
mejoradas con objeto de que el desempeño del material de bajo costo sea
comparable con el comercial.
Segunda Parte II-2: Capítulo 1
224
1. Problemática
1.1. Planteamiento
El proceso de extracción del jugo de caña es el punto de mayor contaminación en los
ingenios azucareros por lo que se añade el plaguicida N-metil ditiocarbamato de
sodio o metam de sodio (MS) para inhibir el crecimiento de Leuconostoc
mesenteroides que forma polisacáridos y daña los jugos. El metam de sodio (MS)
(Fig.1), perteneciente a la familia de los ditiocarbamatos, es una sustancia química
que posee actividad fungicida, insecticida, nematicida y herbicida.
Fig. 1.1. Estructura del metam de sodio
(NCBI, 2016)
Para la cuantificación de residuos de plaguicidas se han desarrollado varios métodos
de preparación de la muestra, tales como extracción tipo Soxhlet, en fase sólida,
microextracción líquido-líquido, extracción sólido-líquido, extracción asistida por
ultrasonido, así como por microondas y la microextracción en fase sólida. Estos
métodos deben ser rápidos, fáciles, baratos, eficaces, resistentes y seguros. Por ello,
en esta investigación se aplicó el método de extracción en fase sólida (EFS) del
plaguicida MS presente en el jugo de caña empleando como adsorbente harina de
cefalotórax de camarón que actualmente es un subproducto subutilizado y una fase
comercial octadecil-sílice C18 (J.T. Baker®) como control. Asimismo, se cuantificaron
y compararon los resultados del adsorbente en estudio y el control utilizando
cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR) o HPLC por sus siglas en inglés,
bajo diferentes factores de operación.
Segunda Parte II-2: Capítulo 1
225
1.2. Hipótesis
Para esta investigación se consideró la hipótesis Nula Ho= El origen del
adsorbente en la extracción en fase sólida (EFS) del MS presente en el jugo de caña
no produce efectos sobre la cuantificación por HPLC.
Y la hipótesis Alternativa Ha= El origen del adsorbente en la extracción en fase
sólida (EFS) del MS presente en el jugo de caña produce efectos sobre la
cuantificación por HPLC.
1.3. Objetivos
Cuantificar por cromatografía de líquidos de alta resolución, CLAR (HPLC por sus
siglas en inglés), la extracción en fase sólida (EFS) del MS presente en el jugo de
caña utilizando dos tipos de adsorbentes, las harinas de cefalotórax de camarón
entera y desmineralizada
y
Comparar su desempeño con un control comercial de octadecil-sílice C18 (J.T.
Baker®).
Segunda Parte II-2: Capítulo 2
226
2. Fundamento teórico y antecedentes
2.1. Justificación e importancia del tema
La producción anual nacional de camarón en 2013 fue de 127 527 toneladas, de
acuerdo con SAGARPA-CONAPESCA (2014). De este total se generan de 20 a 35%
de su masa total como residuos durante el proceso de limpieza del camarón, debido
a que únicamente la parte abdominal de camarón es aprovechada como alimento.
Estos residuos tienen una composición de 44.7% de proteína, 26.3% de cenizas,
20.7% de fibra cruda, 5.2% de grasa, y 3.1% de otros carbohidratos (Flores, 2004).
De ellos se tiene un alto contenido de quitina, del 14 al 27% (Flores, 2004) el cual es
un polímero estructuralmente parecido a la celulosa, por lo que existe la posibilidad
de utilizar la harina obtenida del cefalotórax del camarón como adsorbente en la
extracción en fase sólida de un plaguicida (MS) obteniendo porcentajes de
recuperación similares a las columnas comerciales más utilizadas de octadecil-sílice
C18 (J.T. Baker®) (de Oliveira-Arias, 2014).
2.2. Antecedentes
2.2.1. Quitina
Es el amino-polisacárido natural más abundante, se encuentra principalmente en el
exoesqueleto de crustáceos, insectos y hongos. Se estima que se produce
anualmente casi tanto como la celulosa. La quitina posee una estructura lineal de
poli-[β-(1-4)-2-acetamido-2-desoxi-D-glucopiranosa (Figura 2.1), de alta masa
molecular. Al igual que la celulosa, funciona naturalmente como un polisacárido
estructural. Es blanca, dura, inelástica, altamente hidrofóbica e insoluble en agua y
es la principal fuente de contaminación superficial en las zonas costeras (Kumar,
2000).
Segunda Parte II-2: Capítulo 2
227
Debido a su abundancia, su obtención como una fuente renovable no tóxica y
biodegradable la ha convertido en los últimos años en un nuevo material funcional, el
cual tiene la posibilidad de remplazar a los polímeros derivados del petróleo (Flores,
2008; Ortega-Granados, 2011; Sarabia-Bañuelos, 2011).
Fig. 2.1. Estructura de la quitina (Flores, 2008)
2.2.2. Quitosana
Se trata de un polisacárido de alta masa molecular, obtenido por desacetilación
parcial de la quitina (Figura 2.2). Es decir, se quita parte del grupo acetil de la quitina,
por tratamiento con álcali fuerte. Este nuevo polímero sintético (como es una goma
termina en -ana), cuenta con mejores propiedades de reactividad y solubilidad. Se ha
descrito como un polímero catiónico lineal, biodegradable, de alta masa molecular,
de fácil aplicación y ambientalmente amigable. La presencia de grupos de aminas en
la cadena polimérica ha hecho de la quitosana uno de los materiales más versátiles
que se estudian, ya que le confiere una mayor polaridad que la quitina, lo cual
implicaría una mejor capacidad de absorbencia de compuestos polares (como es el
caso del metam de sodio) (Sarabia-Bañuelos, 2011).
Fig. 2.2. Estructura de la quitosana (Flores, 2008)
Segunda Parte II-2: Capítulo 2
228
2.2.3. Extracción en fase sólida
La purificación por extracción en fase sólida se basa en el grado de interacción que
tengan de los analitos de interés de una muestra con su disolvente y con una fase
estacionaria con naturaleza adsorbente.
2.2.4. Adsorbentes
Las fases estacionarias empleadas en la EFS son similares a las utilizadas en
cromatografía de líquidos. De acuerdo con el carácter químico del grupo funcional
unido a la sílice o al copolímero, las fases resultantes se pueden clasificar en: no
polares, polares o de intercambio iónico. La elección de los disolventes utilizados
depende de la naturaleza de la fase estacionaria (Berrueta et al., 1995). Octadecil-
sílice C18. Para formar la fase de extracción sólida de recubre o se liga un
compuesto orgánico hidrofóbico a sílice en polvo. En este caso los grupos
funcionales ligados al empaquetamiento atraen a los compuestos hidrofóbicos de la
muestra por interacciones de van der Waals y los extraen de la disolución acuosa
(Skoog et al., 2005).
Segunda Parte II-2: Capítulo 3
229
3. Metodología
3.1. Desarrollo experimental
En la Fig. 3.1 se presenta el esquema de bloques de la estrategia experimental.
Fig. 3.1. Esquema de la metodología
3.2. Obtención de la harina de camarón
A partir de los residuos de camarón adquiridos en la central de abastos, “La Nueva
Viga”, de la Ciudad de México, se obtuvieron los cefalotórax de camarón, los cuales se
lavaron a chorro de agua y enjuagaron con agua destilada. Posteriormente, se secaron
en una estufa convencional a 60°C±5°C por 18 horas. La muestra fue molida en
licuadora durante 5 minutos, por intervalos de 30 segundos y tamizada en tamiz del No.
Segunda Parte II-2: Capítulo 3
230
100 (Bárcenas, 2010; Ramírez et al., 2003). Para obtener las harinas desmineralizadas,
se utilizó EDTA 0.5 M, con agitación constante por dos horas, en una relación 1:9
(masa:volumen), se filtró con tela de seda y se enjuagó con agua destilada y des-
ionizada.
3.3. Caracterización de la harina de camarón
Se realizaron las siguientes determinaciones:
-Determinación de humedad mediante una termobalanza (OHAUS MB200) (Kirk et al.,
1996)
-Materia grasa por el método de Soxhlet (James, 1999)
-Determinación de cenizas por el método de calcinación utilizando una mufla
FURNANCE 4800 T (0-1100°C) (Kirk et al., 1996)
-Determinación de proteína por el método de Kjeldahl (Nielsen, 1998).
-Determinación de fibra mediante método gravimétrico y enzimático (Kit de ensayo de
fibra dietética de Sigma-Aldrich®)
3.4. Cartuchos de extracción en fase sólida
Con las harinas obtenidas (entera y desmineralizada) se empacaron 54 cartuchos (Fig.
3.2) de cada una de las harinas, en jeringas de plástico desechables (Sensimedical ®)
de capacidad de 5 mL, con una masa de 0.5 g de harina. Para ello se elaboraron
tapones de fibra de vidrio previamente lavada con metanol grado HPLC, colocándolos
en la base de la jeringa y en la parte superior del adsorbente (harina).
Fig. 3.2. Cartucho de EFS. Elaborado
con adsorbente de harina de camarón
Segunda Parte II-2: Capítulo 3
231
3.5. Preparación de los estándares
Se utilizó el MS (analytical standard ≥95% Sigma-Aldrich), realizando pruebas de
estabilidad de la solución analítica (50 mg/L). Terminadas las pruebas se preparó una
curva patrón según Lorenzo et al. (2014). Posteriormente, se realizó la validación de la
curva patrón según lo establecidos en la guía de la Agencia para Alimentos y
Medicamentos de los Estados Unidos, FDA Draft Guidance, en inglés (Revicki, 2007).
3.6. Extracción del jugo de caña
Para la extracción del plaguicida se consultaron diferentes artículos con la finalidad de
encontrar un método que permitiera extraer al plaguicida de la matriz de jugo de caña
(Bossi et al., 2003; Gustaffson y Thompson, 1981; Gustaffson y Fahihrem, 1983;
Hartmann et al., 2000; Mullins y Kirkbright, 1987; Picó et al., 2004; Stout et al., 1998).
Sin embargo; no se encontró en la bibliografía consultada una metodología para la
extracción de este plaguicida por lo que se tuvo que adaptar un método de extracción
de flavonoides presentes en jugo de caña (Colombo et al., 2006) complementándolo
con otro método para la extracción de carbamatos de jugos de manzana, cereza y fresa
(Sagratini et al., 2007). De la caña almacenada en refrigeración se procedió a la
extracción del jugo, con la ayuda de un extractor de tipo casero, para realizar las
pruebas correspondientes de un mismo lote.
3.7. Extracción en fase sólida (EFS)
Los procedimientos de purificación por extracción en fase sólida se basan en el uso de
dispositivos comerciales que contienen entre 50 y 1000 mg de un sólido poroso
particulado, que generalmente es sílice o resinas poliméricas (polipropileno). En esta
investigación se usaron harinas de cefalotórax de camarón, entera y desmineralizada
(Mejía-Galán, 2015) y como control octadecil-sílice C18. El plaguicida MS fue aislado de
Segunda Parte II-2: Capítulo 3
232
la matriz, extrayéndolo con un fluido adecuado. La secuencia de la Figura 3.3 indica la
metodología empleada (Pawliszyn, 2002).
1. Activar 2.Pasar 3. Lavar 4. Eluir
1. Activar el adsorbente con un disolvente adecuado; 2. Pasar la disolución que contiene los analitos de interés a través del adsorbente activado; 3. Lavar el adsorbente para permitir eliminar el mayor número de interferencias posibles; 4. Eluir los compuestos de interés mediante el paso del volumen necesario de una disolvente adecuado
Fig. 3.3. Extracción en fase sólida (EFS) (Pawliszyn, 2002)
Se tomaron 10 mL de las matrices de estudio: metanol, agua y muestra de jugo de
caña, adicionadas con 10 mL de una dilución 30 mgL-1 del estándar analítico del
plaguicida de estudio, MS (Sigma-Aldrich®) en metanol grado cromatográfico; se
sometieron al baño sónico por 15 min, posteriormente fueron centrifugadas por 15
minutos y los sobrenadantes se filtraron con una membrana de Nylon de 0.45µm.
Finalmente, 3 mL de esta mezcla se hicieron pasar por los cartuchos de extracción con
los diferentes adsorbentes (harina entera, harina desmineralizada y C18) previamente
acondicionados con 5 mL de agua seguida de 5 mL de metanol. Para llevar a cabo la
elución del compuesto de interés se utilizaron 1 mL, 3 mL y 5 mL de una mezcla de
metanol/agua grado cromatográfico en diferentes proporciones. Las muestras eluídas
se inyectaron en el HPLC por triplicado para su cuantificación.
3.8. Cuantificación por cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR, HPLC)
Se utilizó un cromatógrafo de líquidos de alta resolución PerkinElmer® (Fig. 3.4) y se
realizó la adaptación de las condiciones establecidas por Arvizu-Bernal y Ramos-
Segunda Parte II-2: Capítulo 3
233
Medina (2011) para realizar la cuantificación de MS. En la Tabla 3.1 se presentan las
condiciones empleadas.
Fig. 3.4. Equipo de HPLC utilizado para la cuantificación del metam de sodio
Tabla 3.1. Condiciones establecidas para la cuantificación de Metam de sodio por cromatografía de líquidos de alta resolución, CLAR (HPLC, high performance liquid
chromatography)
Condición Arvizu-Bernal y Ramos-Medina
(2011) Adaptación en este
experimento
Columna 100 mm x 4 mm Nucleosil RP-18
(5 µm) 100 mm x 4 mm Hypersil™
ODS C18 (5 µm)
Fase móvil Agua/Acetonitrilo (50:50) Agua/Acetonitrilo (50:50) Velocidad de
flujo 1.4 min-1 1.4 min-1
Volumen de inyección
20 µL 20 µL
Detector UV, 210 nm UV, 210 nm Tiempo de
corrida 10 min 5 min
3.8.1. Límite máximo de detección del ditiocarbamato en el equipo
Para obtener el límite de detección del plaguicida en el equipo, se realizaron diluciones
a partir de una concentración de 50 mgL-1; las cuales se inyectaron en el equipo de
cromatografía de líquidos y como concentración límite se considera aquélla en la que el
pico del compuesto aparece, pero ya no es posible integrarlo adecuadamente (Arvizu-
Bernal y Ramos-Medina, 2011).
Segunda Parte II-2: Capítulo 3
234
3.8.2. Curva de calibración de ditiocarbamato
Se realizó una curva de calibración de 10 puntos con concentraciones que fueron de 0
a 50 mgL-1 de MS en metanol. Las disoluciones de cada concentración fueron
preparadas en el momento de la inyección en el HPLC. Cada concentración se inyectó
por triplicado y la concentración media (25 mgL-1) se inyectó 5 veces.
3.9. Análisis estadísticos
Para la comparación de las variables estudiadas se realizó la comprobación de
diferencias significativas mediante un análisis de varianza (anova en inglés)
multifactorial tipo III (P<0.05), con ayuda del software de análisis de datos estadístico
StatGraphics®.
Segunda Parte II-2: Capítulo 4
235
Capítulo 4. Resultados y discusión
4.1. Obtención de la harina de camarón
En primera instancia se realizó la obtención de la harina de cefalotórax del camarón
(Fig. 4.1), conseguida a partir de los residuos adquiridos gratuitamente en el local 26 de
la Central de Abastos en la Ciudad de México “La Nueva Viga” (Fig. 4.2). En la Fig. 4.3
se presenta la harina después de la limpieza del cefalotórax del camarón y su secado,
molienda y tamizado.
4.2. Desmineralización
En seguida se procedió a desmineralizar la mitad de la harina obtenida agitando la
harina con EDTA 0.5 M (Fig. 4.4).
Posteriormente, se filtró la mezcla de harina con EDTA en un matraz tipo Kitasato con
tela de seda (Fig. 4.5), obteniendo una harina húmeda después de la filtración (Fig.
4.6). Finalmente, la harina seca desmineralizada (Fig. 4.7) se almacenó en el cuarto frío
a 4±1°C.
Fig. 4.1. Esquema del cuerpo de un camarón (Zavaleta, 2010)
Fig. 4.2. Residuos de camarón obtenidos después del
descabezado de los camarones
Fig. 4.3. Harina del cefalotórax de camarón
Segunda Parte II-2: Capítulo 4
236
Fig. 4.4. Agitación Fig. 4.5. Filtración Fig. 4.6. Harina húmeda
Fig. 4.7. Harina desmineralizada
4.3. Caracterización de la harina
En la Tabla 4.1 se presentan los resultados de la determinación del porcentaje de
humedad (Fig. 4.8), porcentaje de cenizas por calcinación (Fig. 4.9), porcentaje de
grasa cruda (Fig. 4.10), contenido de nitrógeno (proteína cruda) (Fig. 4.11), así como el
contenido de fibra (Fig. 4.12).
Tabla 4.1. Caracterización de las harinas de camarón
Determinación
(%) Harina entera Harina desmineralizada
Humedad 6.40 ± 0.000 5.33 ± 0.058
Cenizas 35.64 ± 0.998 22.24 ± 0.628
Grasa cruda 0.31 ± 0.020 0.33 ± 0.012
Proteína 30.26 ± 0.404 43.91 ± 0.089
Fibra 27.44 ± 0.036 28.16 ± 0.047
Se observa que únicamente se pierden el 13.5% de los minerales en la harina
desmineralizada tras el tratamiento con EDTA, con respecto a la harina inicial. Se
puede notar que la humedad es mayor en la harina entera, ya que a pesar de haberse
metido el mismo tiempo al horno los cefalotórax del camarón y la harina
desmineralizada, la harina tiene una mayor superficie de contacto, por lo que su secado
fue mejor que la de los cefalotórax sin moler.
Segunda Parte II-2: Capítulo 4
237
Fig. 4.8. Determinación de humedad por Termobalanza
Fig. 4.9. Determinación de cenizas, se observan los crisoles con las muestras
en la campana
Fig. 4.10. Determinación de grasa, se observan dos
equipos Soxhlet con la muestra en digestión
Fig. 4.11. Determinación de proteínas por método de Kjeldahl
Fig. 4.12. Determinación de fibra (kit de enzimas para su determinación)
4.4. Extracción del jugo de caña
Por cada 8 trozos de caña (300 g aproximadamente) se obtuvieron 200 mL de jugo de
caña (Fig. 4.13). El jugo se recolectó en un frasco de vidrio transparente Duran de 500
mL y se conservó en refrigeración.
4.5. Cuantificación de MS por CLAR (HPLC)
4.5.1. Límite máximo de detección del ditiocarbamato en el equipo
La concentración límite para el compuesto MS en metanol fue de 2.5 mgL-1. Además de
integrarse sin problemas el pico del compuesto, fue al menos 10 veces mayor que el
ruido de fondo.
Segunda Parte II-2: Capítulo 4
238
Fig. 4.13. Extracción del jugo de caña en un extractor casero
4.5.2. Curva de calibración de ditiocarbamato
Con la regresión lineal se pudo comprobar la linealidad de la recta, indicada por el
coeficiente de correlación. Del mismo modo, se obtuvo la ecuación de la recta, la cual
sirve para calcular la concentración del ditiocarbamato de sodio (x) en la matriz de
metanol (Fig. 4.14). El coeficiente de variación (C.V.) para el punto medio fue de 5.92%
indicando que hay poca variabilidad debida a la inyección de la muestra.
4.5.3. Porcentaje de recobro de ditiocarbamato
Para poder analizar la recuperación del Metam sodio después de realizadas las
extracciones con los cartuchos de harina de camarón entera (tal como se observa en la
Fig. 4.15), el MS se cuantificó tanto en la disolución inicial, como en el producto eluido.
Se realizaron las primeras eluciones con 3mL de eluyente y diferentes mezclas
metanol/agua (Tabla 4.2), en donde al realizar la elución de la muestra con un
porcentaje de agua mayor al 40% y realizar la inyección de ésta.
Segunda Parte II-2: Capítulo 4
239
y = 10759x - 47945R² = 0.9886
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
0 10 20 30 40 50 60
Áre
a de
l pic
o
Metam sodio [ppm]
Curva de calibración: [Metam sodio] vs. Area del pico
Fig. 4.14. Curva de calibración de la cuantificación de metan de sodio en HPLC
Fig. 4.15. Extracción en fase sólida con los cartuchos de harina de camarón
Tabla 4.2. Porcentaje de recuperación con diferentes mezclas metanol/agua
Metanol: agua Recuperación MS (%) 100:0 0.752 ± 0.648
90:10 0.954 ± 0.211
80:20 3.520 ± 0.082
70:30 7.569 ± 0.102
60:40 12.864 ± 0.092
Se observó que los picos provenientes tanto del metanol como del Metam de sodio se
ensanchaban demasiado y no se lograba una buena separación entre ellos, por lo que
Segunda Parte II-2: Capítulo 4
240
se decidió realizar las eluciones con la mezcla metanol/agua en proporción de 60:40, ya
que con ellas se obtuvo el mayor porcentaje de recuperación.
El siguiente factor a considerar fue el volumen de la disolución que se pasa por el
cartucho. Para esto se probaron 3 volúmenes diferentes: 5, 3 y 1 mL. Se observa en la
Tabla 4.3, que el volumen de ruptura tiene un valor bajo, es decir, que a mayor volumen
se tiene una menor retención del compuesto. Por tanto, el mejor volumen para obtener
la mayor extracción de los tres estudiados es de 1 mL.
Tabla 4.3. Porcentaje de recuperación con diferentes volúmenes de disolución pasada por el cartucho
Disolución (mL) MS no retenido (%) Recuperación de MS
(%) 1 12.144 ± 0.114 36.291 ± 0.055 3 55.432 ± 0.084 12.864 ± 0.092 5 89.002 ± 0.2040 8.089 ± 0.029
Una vez establecida la mejor mezcla para el eluyente y la cantidad de disolución que se
debe pasar por el cartucho de extracción, se procedió a establecer la cantidad de
eluyente necesario para recuperar todo el compuesto. Para ello se recuperaron las
fracciones después de cada mililitro de eluyente, obteniendo los resultados mostrados
en la Tabla 4.4. Tras realizar un análisis estadístico se determinó que no existe
diferencia significativa entre las fracciones a partir de 3 mL, por lo que el volumen de
elución seleccionado fue de 3 mL.
Tabla 4.4. Porcentaje de recuperación en las diferentes fracciones de fluido eluído Fracción (mL) Recuperación en la fracción de MS (%) Recuperación total de MS (%)
1 47.380 ± 0.037 47.380 2 4.103 ± 0.030 51.484 3 2.763 ± 0.060 54.247 4 1.090 ± 0.068 55.337 5 0.162 ± 0.221 55.499
Por último, con las condiciones establecidas se procedió a probar la recuperación en los
tres cartuchos: con harina entera, con harina desmineralizada y usando los cartuchos
Segunda Parte II-2: Capítulo 4
241
comerciales C18. Al analizar los resultados de la Tabla 4.5, puede verse que existe
diferencia significativa entre cada uno de ellos.
Tabla 4.5. Porcentaje de recuperación con diferentes cartuchos de EFS
Cartucho Recuperación MS (%)Octadecil-sílice C18 (J.T. Baker®) 47.380 ± 0.037
Harina de camarón desmineralizada 8.145 ± 0.032
Harina de camarón entera 36.291 ± 0.055
Segunda Parte II-2: Anexo
242
5. Conclusiones y recomendaciones
5.1. Conclusiones
De acuerdo con los objetivos de esta investigación: Cuantificar por cromatografía de
líquidos de alta resolución, CLAR (HPLC por sus siglas en inglés), la extracción en fase
sólida (EFS) del MS presente en el jugo de caña utilizando dos tipos de adsorbentes,
las harinas de cefalotórax de camarón entera y desmineralizada y comparar su
desempeño con un control comercial de octadecil-sílice C18 (J.T. Baker®) se
obtuvieron las siguientes conclusiones.
Se observó que los resultados obtenidos en las determinaciones de humedad, ceniza,
fibra, proteínas y grasa realizadas fueron similares con respecto a los resultados
consultados en otros estudios (Flores, 2004, 2008).
Se realizó de manera experimental la optimización del método de extracción en fase
sólida. Al observar si había diferencias significativas al variar los parámetros, con los
resultados obtenidos, se concluye que las mejores condiciones de extracción para este
biocida en los cartuchos son las siguientes: eluyente: metanol/agua (60:40), volumen de
eluyente: 1 mL y volumen de muestra: 1 mL.
Tras cuantificar el MS extraído, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución,
se pudo determinar que sí existen diferencias significativas debidas al origen del
adsorbente en la extracción en fase sólida (EFS) del MS.
Se obtuvo el mejor porcentaje de recuperación con la columna comercial de octadecil-
sílice C18 (J.T. Baker®), seguida de las columnas de harina de camarón entera y por
último con el menor porcentaje de recuperación, las columnas que tienen como
adsorbente la harina de camarón desmineralizada. Esto indica que las condiciones
estudiadas en esta fase de la investigación pueden ser mejoradas con objeto de que el
desempeño del material de bajo costo sea comparable con el comercial.
Segunda Parte II-2: Anexo
243
5.2. Recomendaciones
Para la continuación de este trabajo se probará únicamente la quitina extraída de la
harina de camarón comparando los resultados con los obtenidos hasta el momento sin
realizar ni la desacetilación ni la desmineralización.
Se hará una evaluación económica muy simple (±30%) para determinar el costo de los
cartuchos empacados con harina de residuos de camarón versus los materiales
comerciales.
Segunda Parte II-2: Anexo
244
Anexo V
Disposición controlada de los residuos producidos
De la investigación de Bonilla-Vidal (2013), se tomaron las siguientes imágenes:
En esta fase de la investigación se realizó la misma secuencia para la disposición
controlada de los residuos generados. La única diferencia es que en esta investigación
no se utilizaron metanol ni cloruro de dansilo por lo que no estaban presentes en los
residuos dispuestos con la UGA de la Facultad de Química de la UNAM. Tampoco se
tenía metilamina sino MS.
Los cartuchos usados se dispusieron como residuos peligrosos enviándolos a la Unidad
de Gestión Ambiental de la Facultad de Química de la Universidad Nacional Autónoma
de México (UGA-FQ-UNAM).
Segunda Parte II-2: Anexo
245
Segunda Parte II-2: Bibliografía
246
Arvizu-Bernal, D.I., Ramos-Medina, J.C. 2010. Degradación del ditiocarbamato de sodio
usado como plaguicida en el proceso de elaboración de azúcar en México
mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR). Tesis
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250
SEGUNDA PARTE
II-3
METODOLOGÍAS PARA ESTUDIAR LOS
PRODUCTOS DE FOTODESCOMPOSICIÓN DE
BIOCIDAS UTILIZADOS EN LA INDUSTRIA
AZUCARERA – CASO: METAM SODIO A SUS
SUBPRODUCTOS METILAMINA (CH3NH2) E
ISOTIOCIANATO DE METILO (MITC) Y
DETERMINACIÓN DE LA DIMETILTIOUREA
(C3H8N2S) Y METILTIOUREA (C2H6N2S)
DERIVADOS DEL MITC EN INGENIOS
AZUCAREROS
Segunda Parte II-3: Índice
251
Pág.
SEGUNDA PARTE 250
II-3 METODOLOGÍAS PARA ESTUDIAR LOS PRODUCTOS DE
FOTODESCOMPOSICIÓN DE BIOCIDAS UTILIZADOS EN LA INDUSTRIA AZUCARERA – CASO: METAM SODIO A SUS SUBPRODUCTOS METILAMINA (CH3NH2) E ISOTIOCIANATO DE METILO (MITC) Y
DETERMINACIÓN DE LA DIMETILTIOUREA (C3H8N2S) Y METILTIOUREA (C2H6N2S) DERIVADOS DEL MITC EN INGENIOS AZUCAREROS
Resumen 260 1. Problemática 261 1.1. Planteamiento 261 1.2. Justificación 262 1.3. Objetivos 262 1.3.1. Objetivo general 262 1.3.2. Objetivos particulares 263 1.4. Hipótesis 263 2. Antecedentes 264 2.1. Antecedentes históricos de la producción de azúcar en México 264 2.1.1. Historia y evolución 264 2.1.2. Época colonial de la caña en México 265 2.1.3. La industria de la caña en el México independiente 266 2.1.4. La industria azucarera antes y después de la Revolución
Mexicana 267
2.1.5. Tiempos de recuperación de la industria azucarera 268 2.2. Producción de azúcar en México 269 2.2.1. Participación de la industria azucarera mexicana en el mundo 272 2.2.2. Visión y expectativa futura de la producción de azúcar nacional y
mundial 274
2.3. Proceso de elaboración de la caña de azúcar 276 2.3.1. Operaciones unitarias de la extracción de azúcar de caña 276 2.3.2. Microorganismos presentes en la caña de azúcar 282 2.3.3. Biocidas utilizados en la industria azucarera 284 2.3.4. Metam sodio (MS) y sus productos de descomposición 286 2.3.4.1. Metilamina (MA) 288 2.3.4.2. Metilisotiocianato (MITC) 290 2.3.4.2.1. Dimetiltiourea (DMTU) y metiltiourea (MTU) 291 2.4. Normatividad 294 2.4.1. Normatividad en México 294 2.4.2. FAO-OMS 295
Segunda Parte II-3: Índice
252
Pág.
2.4.3. Normatividad de la Unión Europea 297 3. Fundamentos analíticos 298 3.1. Cinética química 298 3.2. Velocidad de reacción 298 3.3. Orden de reacción 300 3.3.1. Métodos gráficos para determinar el orden de reacción 300 3.4. Tiempo de vida media 302 3.5. Fundamentos de espectrofotometría 302 3.5.1. Propiedades de la luz 303 3.5.2. Absorción de la luz 303 3.6. El espectrofotómetro 306 3.6.1. Lámparas 307 3.6.2. Monocromadores 308 3.6.3. Celdas y cubetas 308 3.6.4. Detectores 309 3.7. Errores en la espectrofotometría 310 4. Metodología 311 4.1. Parámetros de operación 311 4.2. Diseño experimental 311 4.3. Material y equipo 312 4.4. Reactivos 312 4.4.1. Preparación de reactivos 314 4.4.2. Tratamiento de caña de azúcar 315 4.5. Curvas de calibración de MS, MA, MITC, DMTU y MTU 315 4.6. Fotodescomposición de MS, MA, MITC, DMTU y MTU 316 4.7. Análisis estadísticos 317 5. Resultados y discusión 318 5.1. Identificación y cuantificación del plaguicida 318 5.2. Curvas de calibración 318 5.3. Fotodescomposición 321 5.3.1. Fotodescomposición en agua 322 5.3.2. Fotodescomposición en jugo de caña 327 5.4. Análisis estadístico 330 6. Conclusiones y recomendaciones 337 6.1. Conclusiones 337 6.2. Recomendaciones 340 Anexos 341 Anexo I. Lavado de material de vidrio 341 Anexo II. Espectros de absorción UV-Visible 342
Segunda Parte II-3: Índice
253
Pág.
Anexo III. Curvas de calibración 347 Anexo IV. Curvas de fotodegradación 352 Anexo V. Disposición controlada de los residuos producidos en la
investigación 359
Bibliografía 361
Segunda Parte II-3: Índice de tablas
254
Pág.
Tabla 1. Cierre de producción de caña de azúcar (SIAP, 2014) 271
Tabla 2. Rendimiento de la producción de azúcar hasta el 2014 (SIAP, 2014) 271
Tabla 3. Productos químicos utilizados en la industria azucarera (Herrero, 2014) 272
Tabla 4. Producción mundial de azúcar ciclo 2015-2016 (CONADESUCA, 2016) 273
Tabla 5. Estimaciones de la oferta y demanda de la caña de azúcar hasta 2018
(SAGARPA, 2009)
275
Tabla 6. Propiedades fisicoquímicas del metam de sodio (Sigma-Aldrich, 2016b) 287
Tabla 7. Propiedades fisicoquímicas de la metilamina (Praxair, 2008) 289
Tabla 8. Propiedades fisicoquímicas del metilisotiocianato (Sigma-Aldrich, 2016a) 291
Tabla 9. Propiedades fisicoquímicas de la dimetiltiourea (Sigma-Aldrich, 2014b) 293
Tabla 10. Propiedades fisicoquímicas de la metiltiourea (Sigma-Aldrich, 2014a) 294
Tabla 11. Límite máximo residual (LMR) de plaguicidas en caña de azúcar y maíz
(MINSA, 2009)
296
Tabla 12. Límite máximo residual de ditiocarbamatos en caña de azúcar (Unión
Europea, 2009)
297
Tabla 13. Método gráfico para cada uno de los órdenes de reacción (Laidler y Meiser,
2007)
302
Tabla 14. Ecuaciones de vida media (Harris, 2003) 302
Tabla 15. Diseño experimental en agua 311
Tabla 16. Diseño experimental en jugo de caña 311
Tabla 17. Equipo y material utilizado con sus especificaciones técnicas 312
Tabla 18. Reactivos utilizados 313
Tabla 19. Curvas de calibración de MS bajo las diferentes condiciones experimentales 319
Tabla 20. Curvas de calibración de MA bajo las diferentes condiciones experimentales 320
Tabla 21. Curvas de calibración de MITC bajo las diferentes condiciones
experimentales
320
Tabla 22. Curvas de calibración de DMTU bajo las diferentes condiciones
experimentales
320
Tabla 23. Curvas de calibración de MTU bajo las diferentes condiciones experimentales 321
Tabla 24. Cinética de degradación del MS en agua 323
Segunda Parte II-3: Índice de tablas
255
Pág.
Tabla 25. Cinética de degradación de la MA en agua 323
Tabla 26. Cinética de degradación del MITC en agua 324
Tabla 27. Cinética de degradación de la DMTU en agua 325
Tabla 28. Cinética de degradación de la MTU en agua 326
Tabla 29. Cinética de degradación del MS en jugo de caña 328
Tabla 30. Cinética de degradación de la MA en jugo de caña 328
Tabla 31. Cinética de degradación del MITC en jugo de caña 328
Tabla 32. Cinética de degradación de la DMTU en jugo de caña 329
Tabla 33. Cinética de degradación de la MTU en jugo de caña 330
Tabla 34. Análisis de varianza de la degradación del MS en agua 331
Tabla 35. Análisis de varianza de la degradación del MS en jugo de caña 332
Tabla 36. Análisis de varianza de la degradación de la MA en agua 332
Tabla 37. Análisis de varianza de la degradación de la MA en jugo de caña 333
Tabla 38. Análisis de varianza de la degradación del MITC en agua 333
Tabla 39. Análisis de varianza de la degradación del MITC en jugo de caña 334
Tabla 40. Análisis de varianza de la degradación de la DMTU en agua 334
Tabla 41. Análisis de varianza de la degradación de la DMTU en jugo de caña 335
Tabla 42. Análisis de varianza de la degradación de la MTU en agua 335
Tabla 43. Análisis de varianza de la degradación de la MTU en jugo de caña 336
Segunda Parte II-3: Índice de figuras
256
Pág.
Figura 1. Principales estados productores de caña y azúcar de caña en México
(SAGARPA, 2012)
270
Figura 2. Diagrama del proceso de obtención de azúcar de caña (IMSA, 1991) 277
Figura 3. Síntesis general de dextranas a partir de sacarosa (Larrahondo, 1995) 283
Figura 4. Cristales de sacarosa en forma de aguja (Calahorro, 1995) 284
Figura 5. Plaguicidas más usados en la industria azucarera (Varona-Uribe et al.,
2006)
285
Figura 6. Estructura del metam sodio (Wales, 2002) 287
Figura 7. Degradación del metam sodio en una solución neutra (LAINCO, 2010) 288
Figura 8. Degradación del metam sodio en una solución alcalina diluída
(LAINCO, 2010)
288
Figura 9. Degradación del metam sodio en solución ácida (LAINCO, 2010) 288
Figura 10. Estructura química general de las tioureas (Mertschenk et al., 1995) 292
Figura 11. Síntesis general de tioureas no sustituidas (Koketsu et al., 2003) 292
Figura 12. Reducción de las tiorureas (Kaneko et al., 1974) 292
Figura 13. Información técnica del Metam Sodio (CICOPLAFEST, 2004) 295
Figura 14. Variaciones de concentración con el tiempo para una reacción
H2 + I2 → 2HI (Harris, 2003)
299
Figura 15. Reacción de orden cero (Laidler, 2007) 300
Figura 16. Reacción de primer orden (Laidler, 2007) 301
Figura 17. Reacción de segundo orden (Laidler, 2007) 301
Figura 18. Radiación electromagnética polarizada en el plano de longitud de onda
λ (Kotz et al., 2003)
303
Figura 19. Energía de absorción y emisión de una molécula (Kotz et al., 2003) 304
Figura 20. Diagrama esquemático de una medida espectrofotométrica de haz
simple (Kotz et al., 2003)
304
Figura 21. Lámpara de arco (Vilanova y Sogorb, 2004) 307
Figura 22. Fototubo empleado en la detección de UV-visible (Vilanova y Sogorb,
2004)
309
Figura 23. Principales etapas de la metodología 313
Figura 24. Sistema de fotodescomposición de las muestras 317
Figura 25. Parámetros del diseño experimental 318
Segunda Parte II-3: Índice de figuras
257
Pág.
Figura A2.1. Barrido de 200 – 400nm MS 342
Figura A2.2. Barrido de 200 – 300nm MS 342
Figura A2.3. Barrido de 190 – 250nm MA 343
Figura A2.4. Barrido de 190 – 210nm MA 343
Figura A2.5. Barrido 190 – 300nm MITC 344
Figura A2.6. Barrido 190 – 210nm MITC 344
Figura A2.7. Barrido 200 – 300nm DMTU 345
Figura A2.8. Barrido 190 – 210nm DMTU 345
Figura A2.9. Barrido 190 – 300nm MTU 346
Figura A2.10. Barrido 190 – 210nm MTU 346
Figura A3.1. Curva de calibración MS en agua pH 4.5 y luz 347
Figura A3.2. Curva de calibración MS en agua pH 4.5 y oscuridad 347
Figura A3.3. Curva de calibración MA en agua pH 4.5 y luz 347
Figura A3.4. Curva de calibración MA en agua pH 4.5 y oscuridad 347
Figura A3.5. Curva de calibración MITC en agua pH 4.5 y luz 347
Figura A3.6. Curva de calibración MITC en agua pH 4.5 y oscuridad 347
Figura A3.7. Curva de calibración DMTU en agua pH 4.5 y luz 347
Figura A3.8. Curva de calibración DMTU en agua pH 4.5 y oscuridad 347
Figura A3.9. Curva de calibración MTU en agua pH 4.5 y luz 348
Figura A3.10. Curva de calibración MTU en agua pH 4.5 y oscuridad 348
Figura A3.11. Curva de calibración MS en agua pH 7 y luz 348
Figura A3.12. Curva de calibración MS en agua pH 7 y oscuridad 348
Figura A3.13. Curva de calibración MA en agua pH 7 y luz 348
Figura A3.14. Curva de calibración MA en agua pH 7 y oscuridad 348
Figura A3.15. Curva de calibración MITC en agua pH 7 y luz 348
Figura A3.16. Curva de calibración MITC en agua pH 7 y oscuridad 348
Figura A3.17. Curva de calibración DMTU en agua pH 7 y luz 349
Figura A3.18. Curva de calibración DMTU en agua pH 7 y oscuridad 349
Figura A3.19. Curva de calibración MTU en agua pH 7 y luz 349
Figura A3.20. Curva de calibración MTU en agua pH 7 y oscuridad 349
Figura A3.21. Curva de calibración MS en agua pH sin modificar y luz 349
Figura A3.22. Curva de calibración MS en agua pH sin modificar y oscuridad 349
Segunda Parte II-3: Índice de figuras
258
Pág.
Figura A3.23. Curva de calibración MA en agua pH sin modificar y luz 349
Figura A3.24. Curva de calibración MA en agua pH sin modificar y oscuridad 349
Figura A3.25. Curva de calibración MITC en agua pH sin modificar y luz 350
Figura A3.26. Curva de calibración MITC en agua pH sin modificar y oscuridad 350
Figura A3.27. Curva de calibración DMTU en agua pH sin modificar y luz 350
Figura A3.28. Curva de calibración DMTU en agua pH sin modificar y oscuridad 350
Figura A3.29. Curva de calibración MTU en agua pH sin modificar y luz 350
Figura A3.30. Curva de calibración MTU en agua pH sin modificar y oscuridad 350
Figura A3.31. Curva de calibración MS en jugo de caña y luz 350
Figura A3.32. Curva de calibración MS en jugo de caña y oscuridad 350
Figura A3.33. Curva de calibración MA en jugo de caña y luz 351
Figura A3.34. Curva de calibración MA en jugo de caña y oscuridad 351
Figura A3.35. Curva de calibración MITC en jugo de caña y luz 351
Figura A3.36. Curva de calibración MITC en jugo de caña y oscuridad 351
Figura A3.37. Curva de calibración DMTU en jugo de caña y luz 351
Figura A3.38. Curva de calibración DMTU en jugo de caña y oscuridad 351
Figura A3.39. Curva de calibración MTU en jugo de caña y luz 351
Figura A3.40. Curva de calibración MTU en jugo de caña y oscuridad 351
Figura A4.1. Curvas de degradación MS pH 4.5 352
Figura A4.2. Curvas de degradación MS pH 7 352
Figura A4.3. Curvas de degradación MS pH sin modificar 352
Figura A4.4. Curvas de degradación MA pH 4.5 353
Figura A4.5. Curvas de degradación MA pH 7 353
Figura A4.6. Curvas de degradación MA pH sin modificar 353
Figura A4.7. Curvas de degradación MITC pH 4.5 354
Figura A4.8. Curvas de degradación MITC pH 7 354
Figura A4.9. Curvas de degradación MITC pH sin modificar 354
Figura A4.10. Curvas de degradación DMTU pH 4.5 355
Figura A4.11. Curvas de degradación DMTU pH 7 355
Figura A4.12. Curvas de degradación DMTU pH sin modificar 355
Figura A4.13. Curvas de degradación MTU pH 4.5 356
Figura A4.14. Curvas de degradación MTU pH 7 356
Segunda Parte II-3: Índice de figuras
259
Pág.
Figura A4.15. Curvas de degradación MTU pH sin modificar 356
Figura A4.16. Curvas de degradación MS en jugo de caña 357
Figura A4.17. Curvas de degradación MA en jugo de caña 357
Figura A4.18. Curvas de degradación MITC en jugo de caña 357
Figura A4.19. Curvas de degradación DMTU en jugo de caña 358
Figura A4.20. Curvas de degradación MTU en jugo de caña 358
Segunda Parte II-3: Resumen
260
Por más de 30 años el ditiocarbamato de sodio conocido como metam de sodio (C2H4NS2Na)
ha sido empleado con éxito en la industria azucarera como plaguicida, el cual reduce
sustancialmente las poblaciones de bacterias, nemátodos y hongos, siendo el de mayor
importancia Leuconostoc mesenteroides una bacteria Gram positiva que a partir de los glúcidos
presentes en la caña de azúcar es capaz de producir oligosacáridos de alto masa molecular
conocidos como dextranas cuyo aspecto físico se caracteriza por ser “gomas”. Dichas gomas
afectan el proceso de los ingenios azucareros bloqueando las tuberías y equipos por donde
pasa el jugo de caña disminuyendo considerablemente el rendimiento de la obtención de la
sacarosa. El metam de sodio usado para eliminar a éste y otros microorganismos, al diluirse en
agua se descompone principalmente en tres productos que han sido designados como
altamente tóxicos los cuales son: metilamina (CH3NH2), disulfuro de carbono (CS2) y
metilisotiocianato (C2H3NS). La metilamina es un compuesto precursor de la nitrosaminas las
cuales son cancerígenas; el disulfuro de carbono es un compuesto de igual manera tóxico y es
altamente volátil por lo que la exposición prolongada a sus vapores lleva a síntomas de
intoxicación que van desde el enrojecimiento de la cara hasta parálisis de la respiración; el
metilisotiocianato por su parte, es precursor de otros dos productos de descomposición tóxicos
como son la dimetiltiourea (C3H8N2S) y metiltiorurea (C2H6N2S). Debido a lo anterior, en esta
investigación se estudió la degradación del metam de sodio, metilamina, metilisotiocianato,
dimetiltiourea y metiltiourea sometiendo las muestras a diferentes condiciones ambientales que
ocurren durante la producción de azúcar de caña con la finalidad de poder determinar el tiempo
de vida media de cada uno de los compuestos de estudio y concluir qué factores tienen mayor
contribución en la degradación de éstos con el objetivo de garantizar la inocuidad del producto
final. Los compuestos fueron estudiados mediante espectrofotometría en las longitudes de onda
del UV-Visible. Se evaluaron los factores A: matriz (agua y jugo de caña), B: pH (4.5, 7 y sin
modificar), C: fotólisis (luz y oscuridad), y D: tiempo (0-12min). Los datos experimentales
mostraron que los tiempos de vida media de acuerdo con los factores de mayor contribución en
la degradación de cada uno de los compuestos estudiados fueron los siguientes: MS t1/2 2.6h a
pH sin modificar en agua y t1/2 4.77h en jugo de caña, MA t1/2 1.7h a pH 7 en agua y t1/2 1.87h en
jugo de caña, MITC t1/2 4.09min a pH 4.5 en agua y t1/2 8.94min en jugo de caña, DMTU t1/2
0.86h a pH 4.5 en agua y t1/2 0.57h en jugo de caña y MTU t1/2 0.09h a pH 4.5 en agua y t1/2
6.41min en jugo de caña.
Segunda Parte II-3: Capítulo 1. Problemática
261
1.1. Introducción
La industria azucarera se ha desarrollado en México en forma ininterrumpida desde la
década inicial de la conquista española, siendo una de las actividades de mayor
tradición y trascendencia en el desarrollo histórico del país. Por ello la participación de
esta industria dentro de la economía nacional ha tenido gran importancia desde varios
puntos de vista. Uno de éstos es la producción de un bien de consumo popular
generalizado a precio accesible para toda la población del país, así como la creación y
sostenimiento de empleos productivos y remunerados a lo largo de la nación (Crespo,
1988). Para la industria azucarera es indeseable la formación de dextranas durante los
procesos llevados a cabo en planta, el microorganismo Leuconostoc mesenteroides es
una bacteria que produce dichos compuestos y tienen un nivel de multiplicación de
25.7% y representan una gran parte de la microflora contaminante, si se considera que
en este tipo de medio en el que existen grandes concentraciones de sacarosa, se debe
dedicar más atención al desarrollo de esta microbiota, porque no solamente provoca
pérdidas de azúcar, sino también causan daños a los procesos de elaboración del
azúcar (Mora, 1994). Para el control de este microorganismo se ha empleado entre uno
de tantos biocidas, al ditiocarbamato de sodio, comercialmente conocido como metam
sodio, el cual se ha utilizado para la desinfección y/o sanitización en el procesamiento
de la caña de azúcar en un intervalo de aplicación de 40-80mg/L y es agregado de
forma continua durante la extracción de jugo ya que es donde se homogeneiza
fácilmente (Villa, 2008). Dicho compuesto es una sustancia química que posee
actividad fungicida, insecticida, nematicida y herbicida (Bonilla-Vidal, 2013). Los
productos de descomposición del metam sodio son altamente tóxicos. En un medio
ácido el metam sodio se hidroliza dando como resultado metilamina (CH3NH2) y
disulfuro de carbono (CS2). En soluciones alcalinas diluidas, el metam sodio produce
una reacción de oxidación caracterizada por la formación de azufre elemental (S) y
metilisotiocianato (MITC) (Cuervo et al., 2010). Las emisiones a la atmósfera de este
último subproducto del metam sodio, representan un peligro potencial para los
trabajadores agrícolas, así como para la población que vive cerca de los campos
fumigados (Matthiessen y Kirkegaard, 2006).
Segunda Parte II-3: Capítulo 1. Problemática
262
El análisis de los compuestos de interés se realizó mediante espectrofotometría entre
las longitudes de onda del espectro del UV-Visible tomando en cuenta que es una
técnica analítica cuantitativa de alta reproducibilidad por las repetidas señales obtenidas
a partir del compuesto en estudio, alta sensibilidad, fácil de usar y el gran intervalo
lineal de concentraciones y la selectividad (Harris, 2003).
1.2. Justificación
En la actualidad, es frecuente identificar residuos de plaguicidas en los alimentos y que,
en muchos casos, se detectan en concentraciones por encima de los límites máximos
residuales (LMR), recomendados por la FAO/OMS (OMS, 1982).
Por lo tanto, en los últimos años ha aumentado de manera significativa en el mundo
entero la demanda de los consumidores por productos saludables e inocuos (Nollet,
1996).
Debido a esto, es necesario desarrollar e implementar metodologías analíticas que
contribuyan a la detección, cuantificación y evaluación de la degradación de uno de los
compuestos más utilizados, el metam sodio (MS), para la eliminación del
microorganismo Leuconostoc mesenteroides que hidroliza la sacarosa y forma
dextranas durante el proceso de extracción de jugo de caña para la obtención de
azúcar.
1.3. Objetivo
1.3.1. Objetivo general
Evaluar la velocidad de fotodescomposición del metam sodio (MS) en agua y jugo de
caña a sus productos de degradación como son: la metilamina (MA), el
metilisotiocianato (MITC), metiltiourea (MTU) y dimetiltiourea (DMTU).
Segunda Parte II-3: Capítulo 1. Problemática
263
1.3.2. Objetivos particulares
Conocer a profundidad la técnica analítica de espectrofotometría y sus
aplicaciones para la cuantificación de la concentración de un analito.
Determinar la longitud máxima de absorción del espectro electromagnético en la
región del UV-Vis del MS y sus productos de descomposición MA, MITC, DMTU
y MTU mediante la técnica analítica de espectrofotometría.
Evaluar la degradación del MS, MA, MITC, DMTU y MTU, bajo diferentes
condiciones de pH, fotólisis, tiempo y matriz.
1.4. Hipótesis
Nula Ho= El factor de luz, pH, matriz y tiempo no produce efectos de degradación
sobre el metam sodio (MS) por lo que no se forman los productos metilamina
(MA), metilisotiocianato (MITC), metiltiourea (MTU) y dimetiltiourea (DMTU)
Alternativa Ha= Los factores de luz, pH, matriz y tiempo produce efectos de
degradación sobre el metam sodio (MS) formándose los productos metilamina
(MA), metilisotiocianato (MITC), metiltiourea (MTU) y dimetiltiourea (DMTU).
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
264
2.1. Antecedentes históricos de la producción de azúcar en México
Antes de profundizar en la evolución de la industria azucarera mexicana, se debe saber
que el azúcar es uno de los alimentos básicos más importantes de todo el mundo. Por
ser pura y estar constituida por carbohidratos solamente, es una de las mejores y más
baratas fuentes de energía. El azúcar, sólo o en combinación con otros alimentos
proporciona un promedio de 12% de hidratos de carbono, los elementos productores de
energía en la dieta humana (Maturana, 1970). Alrededor de 1900, además del azúcar
se había sumado ya el pan, la sal y el vino como algunos de los componentes en la
dieta del hombre occidental, asentado en el hecho de que la caña de azúcar produce
mayores cantidades de calorías utilizables. De esto se desprende su presencia como
un producto estratégico en el sector alimentario y en el comercio mundial (Crespo,
1988).
2.1.1. Historia y evolución
El origen y los inicios de la caña de azúcar son un poco cuestionados. Algunas
investigaciones dicen que sus orígenes provienen de China, cuando otras dicen que de
la India y Asia Meridional. Sin embargo, la caña de azúcar llegó a tierra continental
americana con sus bonanzas y sus secuelas sobrias por la doble vía de los
conquistadores y colonizadores ibéricos (Crespo, 1988). Con el intercambio comercial
que se estaba dando entre los países colonizadores y sus colonias existían productos
destinados a enriquecer la flora comercial de sus colonias. Con el descubrimiento de
América, el azúcar viaja de manos de Colón a las islas del Caribe, a Santo Domingo,
donde se cultiva por primera vez a gran escala, llegando más tarde a Cuba y a México,
en este último país con Cortés quien instaló el primer “trapiche” de México siendo la
primera agroindustria de tierra firme en el continente americano. Paralelamente, otros
españoles en sus viajes favorecen su expansión a zonas asiáticas, como las Islas
Filipinas y archipiélagos del Pacífico. De manos de los portugueses la caña de azúcar
llega a Brasil, los franceses la introducen en sus colonias del Océano Índico y los
holandeses en las Antillas (Hernández y Hernández, 2013).
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
265
2.1.2 Época colonial de la caña en México
En México la industria de fabricación de azúcar fue una de las primeras industrias de
transformación que se funda, en lo que entonces en el siglo XVI, se empezó a llamar la
Nueva España (Sandoval, 1951).
Reafirmando lo que dice Fernando Sandoval en el libro “La industria del azúcar en
Nueva España”, posiblemente fue el aspecto y el clima de la costa veracruzana, tan
parecida a la de Cuba, lo que hizo pensar en establecer ahí la primera industria
azucarera. La caña de azúcar es una planta propia de los climas tropicales y
subtropicales que tengan, cuando menos, una lluvia moderada, combinada con una
estación seca bien definida que permita efectuar la zafra (Maturana, 1970).
A partir de este periodo los ingenios fabricantes de azúcar, fueron aumentando en
número e importancia junto con el cultivo de la caña de azúcar. Se extendieron con
rapidez por toda la región y donde el clima era propicio se establecieron pequeños
molinos, movidos por la tracción animal, que empezaron a fabricar el azúcar morena
(Sandoval, 1951).
Con base en lo anterior y a causa principalmente del incremento de la demanda por
parte de los colonos se puede explicar su rápida expansión por todo el territorio
mexicano y es posible darse cuenta que desde los inicios del siglo XVII, la industria
azucarera comenzó a tomar un lugar muy importante en la economía de esta nación.
Algunos autores han afirmado que, después de la minería, la fabricación del azúcar
constituyó la industria más importante del país (Sandoval, 1951).
Y así, el azúcar continuó como una materia preciosa durante el periodo de la colonia,
haciendo prosperar a las haciendas españolas las cuales acumularon grandes
cantidades de dinero tanto en el Viejo como en el Nuevo Mundo (Reynoso-J., 2006).
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
266
2.1.3. La industria de la caña en el México independiente
Como consecuencia de la guerra de Independencia en México (1810-1821), la
producción azucarera se vio severamente afectada en algunas de las regiones más
importantes. Los daños en ingenios y cañaverales fueron particularmente duros en la
zona de Córdoba, Veracruz, Cuernavaca, Morelos y Zacualpan de las Amilpas,
Morelos. Desapareció además, el incentivo de las exportaciones. Resulta imposible
cuantificar la dimensión de la disminución de la producción de azúcar, a causa de la
ausencia de datos estadísticos, pero de acuerdo con testimonios existentes en la zona
central de Veracruz, la caída parece haber alcanzado niveles radicales. La recuperación
fue rápida ya que, en 1870, la producción nacional azucarera fue de 25000 toneladas,
lo cual reflejó una duplicación en la producción en comparación con el periodo novo-
hispano de fines del siglo XVIII (Crespo, 1988).
En la historia moderna de México (a partir del siglo XIX), durante el Porfiriato se
presenta una etapa de una gran crecimiento económico sostenido, donde el gran apoyo
a la industria fortaleció la economía del país. “El desarrollo del país estuvo fincado en la
estabilidad política lograda por Porfirio Díaz y una política económica diseñada para
atraer la inversión extranjera y estimular las exportaciones mexicanas (Melville y
Melville, 1979). En el periodo del Porfiriato la industria azucarera en la región de
Morelos fue de gran importancia, ya que tuvo alcances de significación para la
evolución de la industria azucarera mexicana por la singular importancia que esa región
tenía no únicamente como productora, sino por ser el lugar donde con mayor
dinamismo y capacidad de transformación se abordó la cuestión de la modernización
tecnológica y económica. En el sector del campo de la industria azucarera se
contabiliza la introducción de maquinaria moderna y el desarrollo de la infraestructura
hidráulica. En este aspecto las haciendas azucareras estuvieron a la cabeza de lo que
fue la mayor transformación en la agricultura mexicana desde la introducción del arado
con tracción animal más de tres siglos antes, hasta este periodo (Crespo, 1988).
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
267
Puede decirse que la industria azucarera fue una de las primeras favorecidas con estas
nuevas visiones económicas, lo que permitió que los ingenios comenzaran a
dispersarse por el país. Así, la industria azucarera tomó un lugar muy importante dentro
de las exportaciones que eran apoyadas en este periodo. De 8,820 toneladas
registradas en 1903, se pasó a 42,660 dos años más tarde (Maturana, 1970).
2.1.4 La industria azucarera antes y después de la revolución
Con la Revolución Mexicana en 1910, la situación en la industria azucarera comenzó a
cambiar. La revolución trajo consigo reformas agrarias y la destrucción del sistema de
haciendas, dando a los campesinos el derecho de adueñarse de tierras (Sano, 2010).
De 1910 a 1921 la producción se redujo en forma muy considerable debido al
movimiento armado y la inestabilidad política que el país contemplaba (Maturana,
1970). Todo esto paralizó prácticamente a esta industria, a causa de que fue en el
estado de Morelos donde se dieron la mayoría de los movimientos armamentistas, y en
este mismo estado de Morelos era donde se encontraban la mayoría de los ingenios
azucareros. En Morelos, la expansión del campo cañero comenzó en los inicios de los
años 90 del siglo XIX, con la incorporación de mejoras técnicas que llevaron a ampliar
la escala de operación de los ingenios (Crespo, 1988).
Una de las consecuencias de la destrucción del sistema de haciendas fue la división de
la producción de caña en dos grupos, los que cosechaban la caña de azúcar y que
actualmente se conocen como los “cañeros” y los dueños de los ingenios de caña de
azúcar, quienes a partir de esto comienzan a tener muchos problemas económicos y
financieros. Desde los inicios de la Revolución Mexicana se puede ver cómo se
comienza a transformar la industria azucarera mexicana. Se ve una gran
desintegración, un mal manejo por parte del gobierno a causa de los diferentes
intereses que había por parte de los cultivadores y los dueños de los ingenios. Y es
hasta mediados de la década de 1920, que se comienza a reactivar la producción
donde existía una administración muy inestable. En 1922 se produjeron 126 mil
toneladas, marcándose en inicio de una etapa ascendente que comenzó a presentar
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
268
graves problemas en 1929, debido a la gran depresión económica mundial (Maturana,
1970).
2.1.5. Tiempos de recuperación de la industria azucarera
En 1969 el país exportó un total de 605,553 toneladas, de las cuales 604,919 fueron
vendidas a los Estados Unidos y el resto del mercado mundial. Estas exportaciones
fueron de mucho beneficio para la economía mexicana. El valor de las exportaciones
fue de 1,180 millones de pesos el mismo año, con lo que el azúcar siguió siendo el
segundo renglón en la balanza comercial del país. Las exportaciones al mercado
estadounidense se vieron beneficiadas, a partir de 1961, con el aumento de las cuotas,
ya que Estados Unidos decidió sustituir la importación de azúcar cubana por la de otros
países, dentro de los cuales estaba México. Es así que para inicios de la década de
1970, la industria azucarera comienza nuevamente a ser considerada de gran
importancia para la economía mexicana, principalmente por su exportación al mercado
norteamericano. Todo este rápido crecimiento se estaba dando sin unas bases
administrativas eficientes. También fue durante esta misma década, cuando los
controles a los precios de azúcar provocaron distorsión en su proceso de
comercialización (Herrera, 2002). Con el tiempo esta industria se fue lentamente
hundiendo hacia una profunda crisis económica: estructuras viejas y obsoletas, sin
dinero para pagar los préstamos que habían beneficiado solamente a individuos
privados y el país cayendo en la peor crisis económica de 1920.
La respuesta del gobierno para impedir esta crisis fue tomar el control de Operadora
Nacional de Ingenios Azucareros (ONISA). En 1971, ONISA estaba formada, y el
gobierno tenía control de 19 ingenios. Para finales de la década de 1970, el gobierno
controlaba 49 de los 66 ingenios azucareros del país. Para entonces el gobierno ya
había formado la Comisión Nacional de la Industria Azucarera (CNIA), con el fin de
coordinar las políticas azucareras del gobierno. Eventualmente CNIA tomó control de
las funciones de ONISA (Cárdenas, 1990).
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
269
Fue hasta 1982 cuando el gobierno decide nacionalizar los ingenios azucareros con el
propósito de limpiar sus problemas financieros. Y en 1988 (dentro del sexenio de De la
Madrid) el gobierno privatiza estos ingenios y les deja en manos de sectores privados el
trabajo de revivir esta industria. Desde inicios de la producción azucarera en el siglo XVI
hasta el periodo de los años 80 del siglo XX la industria azucarera estuvo marcada por
etapas de crecimiento, inestabilidad, hundimiento y corrupción en su manejo. Según el
autor Horacio Crespo, en la dinámica de la producción de azúcar en México, pasada la
etapa de la lucha armada de la Revolución Mexicana, pueden reconocerse cuatro
periodos, caracterizados por los distintos ritmos de crecimiento presentes en casa uno
de ellos: Recuperación y estabilización (1922-1950), Crecimiento acelerado (1950-
1967), Estancamiento y crisis (1967-1982) y Reordenamiento y autosuficiencia (a partir
de 1982) (Crespo, 1988).
2.2. Producción de azúcar de caña en México
En México la industria azucarera es históricamente una de las más importantes, debido
a su relevancia económica y social en el campo. Genera más de dos millones de
empleos, tanto en forma directa como indirecta. Se desarrolla en 15 entidades
federativas y 227 municipios. Genera un valor de producción primaria de alrededor de
30 mil millones de pesos. La industria azucarera ha requerido en los últimos diez años
una superficie cultivada del orden de 700,000 hectáreas por año, cuya producción
alcanza en promedio los 46 millones de toneladas de caña de azúcar y 5 millones de
toneladas de azúcar. El estado de Veracruz ocupa el primer lugar en cuanto a la
producción de la caña de azúcar (Fig. 1), aportando el 37% de la producción total
nacional y de la superficie total cosechada (SAGARPA, 2012).
Los datos de producción nacional hasta 2014 para la Zafra 2014 se muestran en la
Tabla 1. En ella se puede confirmar que el estado de Veracruz tiene la mayor
participación en cuanto a la producción de caña de azúcar. Esto se debe a que es el
estado con mayor número de ingenios (veintidós ingenios de un total nacional de
cincuenta y siete). Tomando en cuenta que el rendimiento de fábrica entre cada uno de
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
270
los estados productores de azúcar se puede observar en la Tabla 2 que el estado de
Morelos encabeza la lista, estando muy encima del estado de Veracruz, el cual como
anteriormente se mencionó ocupa el primer lugar en cuanto a la producción de la caña
debido a la superficie sembrada en el periodo del 2014.
Fig. 1. Principales estados productores de caña y azúcar de caña en México (SAGARPA,2012)
Generalmente, los problemas de rendimiento de la obtención de azúcar se deben
principalmente a condiciones físicas o ambientales como son las largas demoras de la
fecha de cosecha, el corte y la molienda. Sin embargo, el proceso no está exento de
sufrir pérdidas de sacarosa como consecuencia del ataque a la materia prima por parte
de microorganismos presentes en el ambiente como en este caso se ha hecho énfasis
de la importancia de Leuconostoc mesenteroides, el cual puede aprovechar los
procesos de molienda y extracción del jugo de caña que dejan más biodisponibles los
glúcidos y así ser convertidos por esta bacteria a oligosacáridos de cadena larga que se
conocen como dextranas (Villa, 2008).
Con el fin de asegurar los mejores rendimientos de fábrica, el productor debe tener
estricto cuidado con los tiempos de cosecha y almacenamiento para evitar el deterioro
de la caña de azúcar y la proliferación de microorganismos. En los ingenios modernos
se utilizan muchos productos químicos además del metam de sodio (Tabla 3).
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
271
Tabla 1. Cierre de producción de caña de azúcar (SIAP, 2014) Ubicación Sup. cosechada
(ha) Producción
(ton) PMR
($/ton)Valor producción(miles de pesos)
Veracruz 277,567.77 19,143,157.33 445.50 8,528,322.34
Jalisco 78,804.70 7,541,028.88 462.03 3,484,202.88
San Luis Potosí 80,222.12 5,041,239.65 467.61 2,357,326.30
Oaxaca 68,226.05 4,144,837.33 454.31 1,883,033.25
Tamaulipas 51,184.49 3,520,279.44 499.15 1,757,145.09
Chiapas 30,729.01 2,854,599.01 538.70 1,537,771.36
Nayarit 31,071.77 2,375,614.67 486.28 1,155,217.58
Tabasco 31,012.00 2,211,116.82 442.98 979,477.16
Morelos 16,685.42 2,027,620.14 477.58 968,354.26
Michoacán 17,996.25 1,720,352.27 552.99 951,345.80
Puebla 13,947.77 1,573,938.87 441.83 695,411.87
Quintana Roo 25,697.00 1,552,032.75 364.05 565,021.81
Colima 16,261.13 1,456,564.83 449.45 654,658.88
Sinaloa 10,705.78 818,632.59 513.63 420,470.45
Campeche 11,722.25 691,814.33 416.54 288,168.34
Total 761,833.51 56,672,828.91 462.76 26,225,927.38
Tabla 2. Rendimiento de la producción de azúcar hasta el 2014 (SIAP, 2014)
Ubicación Sup. sembrada (ha)
Sup. cosechada(ha)
Rendimiento (ton/ha)
Morelos 20,081.52 16,685.42 121.52
Puebla 16,101.88 13,947.77 112.84
Jalisco 81,715.20 78,804.70 95.69
Michoacán 18,436.25 17,996.25 95.60
Chiapas 30,735.01 30,729.01 92.90
Colima 16,261.13 16,261.13 89.57
Sinaloa 11,491.86 10,705.78 76.47
Nayarit 33,110.20 31,071.77 76.46
Tabasco 36,263.00 31,012.00 71.30
Veracruz 287,054.84 277,567.77 68.97
La calidad se reconoce entonces por la cantidad de azúcar recuperable o rendimiento
que se obtiene por tonelada de caña molida, que depende de características como: alto
contenido de sacarosa, bajo contenido de materiales extraños, bajo contenido de
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
272
sólidos solubles diferentes de la sacarosa y bajos niveles de fibra (Larrahondo, 1995).
La calidad de la caña y, por ende, el rendimiento de fábrica es de gran importancia ya
que con ello se está originando que la producción nacional de azúcar tenga una mayor
o menor competencia en el mercado mundial.
Tabla 3. Productos químicos utilizados en la industria azucarera (Herrero, 2014) COMPUESTO FUNCIÓN
Alcoholes polioxietilenados Humectante de caña Metam de sodio Etilenbisditiocarbamato disódico Cloruro de dialquildimetilamonio
Bactericida
Triclosán Dióxido de cloro Isotiazolinonas
Biocida
Peróxido de hidrógeno 1,6 – alfa – D – glucano – 6 – glucanohidrolasa Reductor de gomas Polímeros de bajo peso molecular Bentonita Fosfatos Copolímeros catiónicos de masa molecular alta
Clarificador de jugo
Copolímero de acrilamida y acrilato de sodio Floculante Bases orgánicas filmógenas Inhibidor de corrosión Monooleatos de sorbitán Surfactantes aniónicos
Tensoactivo
Azúcar Nucleador de cristalizaciónAlfa – amilasa bacteriana Copolímeros catiónicos de masa molecular baja
Reductor de almidón
Sulfito de sodio Eliminador de oxígeno Agentes antiespumantes Antiespumantes Copolímeros dispersantes Dispersantes
2.2.1. Participación de la industria azucarera mexicana en el mundo
De acuerdo con la Organización Internacional del Azúcar (ISO por sus siglas en inglés),
para el ciclo 2012-2013 el consumo mundial de azúcar fue de 173 millones de
toneladas, y la producción de 184 millones de toneladas, lo que arrojó un superávit de
11 millones de toneladas (SE, 2012).
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
273
La mayor producción de azúcar respecto a la demanda, contribuye a incrementar los
inventarios de azúcar. Asimismo, la sobreoferta de azúcar en el mercado mundial es un
factor determinante que impacta en la disminución de los precios internacionales del
producto. Para el mismo ciclo, México fue el sexto productor de azúcar con el 4% de la
producción mundial. Por su parte, los EE.UU. fue el quinto productor (4.5%). No
obstante, se presentó un déficit anual de aproximadamente 2.5 millones de toneladas
de azúcar que se cubrió con importaciones de México, así como cuotas preferenciales
que reparte con 38 países del mundo (FIRA, 2009).
Con el Tratado del Libre Comercio de America del Norte (TLCAN), México es el único
país que tiene acceso limitado para la exportación de azúcar a EE.UU. Brasil es el
principal productor y exportador de azúcar en el mundo (Tabla 4). Muestra liderazgo en
toda la cadena desde la investigación y desarrollo de materiales genéticos hasta la
innovación tecnológica en la producción de azúcar y etanol con elevado porcentaje de
participación en la cogeneración de energía eléctrica (CONADESUCA, 2016).
Tabla 4. Producción mundial de azúcar ciclo 2015-2016 (CONADESUCA, 2016) País Producción mundial (tonx106) Participación (%)
Brasil 36 22 India 25.5 15.6
Tailandia 9.7 5.9 China 8.9 5.4 EE.UU. 7.5 4.6 México 6.18 3.8
Pakistán 5.33 3.2 Rusia 5.2 3.2
Australia 4.8 2.9 Francia 4 2.4
Los demás 50.71 31 TOTAL MUNDIAL 163.91 100
En el caso de Norteamérica, la abundancia o escasez de azúcar se incrementó a
consecuencia de los altos precios del azúcar observados en el periodo de 2009-2011,
que incentivaron la siembra de caña en superficies adicionales y las condiciones
climáticas favorables, por lo que las exportaciones de México alcanzaron la cifra
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
274
histórica de 2.2 millones de toneladas de las que 1.9 millones fueron en el marco del
TLCAN y 151 mil a otros destinos.
La participación del azúcar mexicana en el contexto global se da en un entorno
complejo debido a la alta intervención gubernamental en la mayoría de los países
productores de azúcar, incluyendo EE.UU., socio de México en el TLCAN. El 15 de
noviembre de 2013, el Departamento de Agricultura de dicho país (USDA por sus siglas
en inglés), emitió un reporte en el cual detalla los gastos del gobierno de dicho país
para apoyar el precio del azúcar y el ingreso de sus productores, por un monto que tan
sólo en 2013 ascendió a 278 millones de dólares (USDA, 2013). Apoyos de diversa
índole existen también en la Unión Europea, India, China y Brasil.
2.2.2. Visión y expectativa futura de la producción de azúcar nacional y mundial
Como consecuencia del aumento de la privatización de 27 ingenios azucareros de los
más de 50 que tiene México, con la esperanza de salvarlos de la quiebra se estima que
los próximos años habrá un crecimiento en la rentabilidad del azúcar de caña
(SAGARPA, 2009).
En el periodo de 2008-2009, ocurrió una ligera disminución de la superficie cosechada
de caña de azúcar como resultado del ciclo natural de este cultivo; en ése periodo se
tuvieron 719 mil hectáreas sembradas para 2008 y 687 mil para 2009, pese a esta
disminución se prevé un ligero incremento a lo largo de la proyección hasta 2018 como
se puede observar en la Tabla 5 (SAGARPA, 2009).
Debido al precio de los fertilizantes en 2008, se tuvo una reducción de los rendimientos
para la Zafra del 2009 de 73.6 ton/ha, el cual se incrementará a lo largo de la
proyección base hasta alcanzar en promedio 75.29 ton/ha en 2018. El escenario base
estima un incremento cercano a 1% anual hacia el final del periodo analizado, de esta
manera la producción de azúcar pasará de 5.1 mil toneladas de 2009 a 5.6 en 2018.
Por otra parte, el consumo per cápita se estima en 49.7 kg para 2018. En el mismo
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
275
contexto, el precio del azúcar nacional responde en cierta medida al precio internacional
(Caribe), el cual en 2007 alcanzó un máximo de US$301/ton para después registrar una
caída a US$287/ton en 2008. Se estima que este precio llegue a los US$329/ton por
saco de 50kg en el largo plazo (SAGARPA, 2009).
Tabla 5. Estimaciones de la oferta y demanda de la caña de azúcar hasta 2018
(SAGARPA, 2009)
2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 Área plantada (1000 ha)
719 687 683 686 689 694 699 703 706 709 711
Área cosechada (1000 ha)
669 639 635 638 641 646 650 653 657 659 661
Rendimiento (ton/ha) 74.3 73.3 74 74.3 74.4 74.6 74.8 74.9 75 75.1 75.2 (1000 ton)
Producción caña 49,713 46,996 46,866 46,996 47,379 47,743 48,180 48,962 49,326 49,536 49,790 Producción de azúcar
5,394 5,146 5,108 5,146 5,212 5,276 5,348 5,419 5,549 5,598 5,651
Importación de azúcar
230 254 236 254 252 250 249 247 240 240 360
Exportación de azúcar
580 469 577 469 460 478 506 531 571 576 392
Exportación a EE.UU.
565 469 567 459 450 468 496 521 561 566 382
Exportación a otros países
15 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
kg Consumo doméstico 5,054 4,958 4.967 5,001 5,040 5,080 5,122 5,148 5,202 5,250 5,292Consumo per cápita 47.4 46.1 45.8 45.8 45.8 45.8 45.9 45.8 46 46.2 46.2
$/50kg Precio de azúcar
estándar 267.6 285.5 306.7 314.4 322.6 326.9 328.5 331.3 326.9 327.3 329.3
US$/ton EE.UU.
promedio 466 500 482.6 479.6 484 488.2 491.6 491.4 486.6 485.3 484.2
Caribe 286.6 286.9 279.5 286.5 292.3 298.1 305 2310 314.8 322.7 329.4
Se prevé que la producción mundial supere a la demanda en los próximos años,
provocando que las existencias de sitúen en los niveles más altos de la historia, según
los datos de la organización internacional de azúcar, con sede en Londres. Todo ese
azúcar apunta a que los precios mundiales que ya han bajado un 50% en tres años, van
a caer aún más y se estima que la producción global de azúcar superará a la demanda
en 620 mil toneladas, llevando las existencias acumuladas, una cifra que prácticamente
bastaría para abastecer durante un año a los siete principales países consumidores,
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
276
según datos de la organización intergubernamental del sector. La media en el mundo
del consumo de azúcar de caña es de 23 kg por persona (SAGARPA, 2009).
2.3. Proceso de obtención de azúcar de caña
La caña de azúcar ha sido sin lugar a dudas uno de los productos de mayor importancia
para el desarrollo comercial en el mundo. El azúcar puede obtenerse principalmente a
partir de la caña de azúcar y la remolacha. Para su obtención se requiere de un largo
proceso, desde que la semilla de caña se germina hasta que el azúcar se comercializa
nacional e internacionalmente. El proceso productivo se inicia con la preparación del
terreno, etapa previa de la siembra de la caña. La planta madura entre los 12 y 14
meses. Las personas encargadas del área de cosecha se disponen a cortarla y
recogerla a través de alce mecánico y llevarla hacia los ingenios azucareros
(INAZUCAR, 2004). En México el periodo de la Zafra va de noviembre a julio de cada
año, tiempo en el cual casi todos los ingenios en México se concentran en la producción
de azúcar que servirá para satisfacer la demanda nacional e internacional. De acuerdo
con la Real Academia Española, se entiende como zafra al tiempo que dura el proceso
a través del cual se cosecha la caña y fabrica el azúcar (IMSA, 1991).
2.3.1. Operaciones unitarias de la extracción de azúcar de caña
El proceso productivo se inicia con la adecuación del campo y el estudio del suelo,
teniendo en cuenta la topografía del terreno. La labranza es la manipulación física del
suelo con implementos apropiados para ablandar la superficie del suelo; cuyos
objetivos son preparar la tierra para que haya un flujo apropiado de agua y aire que
permita la proliferación de las raíces, la incorporación de abonos orgánicos y así facilitar
una adecuada actividad química y biológica del suelo. Una vez listo el suelo, la caña se
siembra en un agujero poco profundo o en surcos en la parte superior de varias hileras,
la planta se cubre con la ayuda de un azadón y se añaden herbicidas de preemergencia
poco después de la siembra. El cultivo siempre se debe ubicar de oriente a occidente
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
277
para facilitar la penetración de la luz solar, con mayor eficiencia. Por otra parte las
semillas deben poseer ciertas características, tales como:
Que provengan de cañas libres de plagas y enfermedades
Tallos con buen estado nutricional
Cañas de entre siete y ocho meses de edad
Semilla de una misma variedad con yemas sanas y funcionales
A medida que se acerca la época de la cosecha en áreas de regadío, es posible
retardar el crecimiento y aumentar el contenido de sacarosa limitando el nitrógeno y el
agua. Este tipo de siembra requiere de bastante agua de forma oportuna para alcanzar
una producción satisfactoria. El riego se aplica hasta dos meses antes de la cosecha,
sin embargo en las áreas de alta precipitación, el crecimiento y madurez son
controlados por el clima. Este proceso, algunas veces lo aceleran con productos
químicos. Entre los 12 y 14 meses, la planta madura y la cosecha se dispone a ser
cortada (Zafranet, 2016). Una vez cosechada la caña, entra a la fábrica en donde se
llevan a cabo las siguientes operaciones unitarias (Fig. 2).
Fig. 2. Diagrama del proceso de obtención de azúcar de caña (IMSA,1991)
A continuación, se detallan estas operaciones unitarias (IMSA, 1991).
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
278
a) Entrada: Inicia con el registro de la masa5 en básculas de las unidades que
transportan la caña de azúcar en el ingenio y que se encuentran al ingreso del área
industrial. Además, en esta parte se determina la calidad de la materia prima,
tomando muestras que se analizan continuamente en el laboratorio de control de
calidad. La caña que llega a la fábrica se descarga sobre las mesas de alimentación
por medio de viradores de caña con capacidad de hasta 50 ton. Para tener un
proceso más limpio, en las mesas de caña se aplica agua entre 110 y 120°F para
lavado, eliminando así sólidos o materia extraña como la tierra, sales, minerales,
piedras y otros que se adhieren a ella en el campo durante el alce a las jaulas que
la transportan hacia la fábrica. Luego la caña se somete a un proceso de
preparación que consiste en romper y desfibrar las celdas de los tallos por medio de
troceadoras, picadoras oscilantes y desfibradoras, para poder pasar al proceso de
extracción del jugo.
b) Molienda: Este es un proceso continuo que actualmente se realiza en tres
“tándemes” de molinos. Hacia estos tándem6 se alimenta con caña preparada, la
cual es sometida a una serie de extracciones mecánicas utilizando molinos de
rodillo o mazas7 y todos los molinos son de cuatro mazas rayados en forma de “V”.
Para hacer más eficiente el proceso de molienda, los jugos pobres de los molinos
posteriores se aplican nuevamente en el proceso (proceso de maceración) y en el
último molino se aplica agua caliente con temperatura entre 155-179°F para
aumentar la extracción.
El bagazo es un subproducto industrial que se transporta hacia el sistema de
calderas para usarlo en calidad de biomasas como combustible. El sobrante tiene
como destino la hidrolización y reserva para cubrir paros de emergencia. El jugo
mixto es un medio ideal para el crecimiento de microorganismos, además llega a
5 Masa y peso no son sinónimos. La primera tiene unidades de kg y el otro de newtons (Anónimo, 2016)
6 Tándem. Conjunto de dos elementos que se complementan. Del ingl. tandem, y este del lat. tandem 'al fin', 'al cabo', 'a la larga', al interpretar humorísticamente a la larga con valor espacial en vez de temporal (Diccionario de la lengua, www.rae.es)
7 Maza. En Cuba cada uno de los tres cilindros horizontales que componen el trapiche de los ingenios de azúcar (Diccionario de la lengua, www.rae.es)
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
279
tener una concentración de glúcidos de 10-18ºBrix y un pH entre 5 y 5.6,
abundantes sales inorgánicas y orgánicas, aminoácidos y otros nutrientes y una
temperatura media entre 25-30ºC. El recuento de bacterias del jugo procede del
primer rodillo es de 105 a 107 UFC/mL para la caña normal y aproximadamente de
108 UFC/mL para la caña ácida (Silliker et al., 1980). Las condiciones de operación
de los molinos y la calidad de la caña contribuyen a las pérdidas de sacarosa que
pueden ocurrir por inversión ácida, inversión enzimática e infección microbiana. La
inversión ácida comprende la inversión química de la sacarosa en glucosa y
fructosa; ocurre en condiciones ácidas; la tasa de inversión se incrementa con pH
bajo y altos niveles de temperatura, mientras que la descomposición enzimática
resulta por la acción de proteínas, principalmente la invertasa, que actúa como un
catalizador para promover la inversión de la sacarosa. La invertasa puede estar
presente en la caña de azúcar naturalmente o ser producida por las levaduras
Saccharomyces sp. y se desactiva a temperaturas superiores a 65ºC (Calero, et al.,
2009). Bajo condiciones favorables de temperatura y humedad, la
dextranasacarasa hidroliza la sacarosa y forma dextranas. La elevada viscosidad
de los jugos y la presencia en ellos de dextranas de elevada masa molecular junto
con otros sólidos insolubles, obstruyen las mallas filtrantes y provocan pérdidas de
los jugos por derrames de los molinos a los drenajes.
c) Clarificación: El jugo proveniente de los molinos pasa por calentadores, que llegan
a temperaturas entre 140 y 155°F. Luego pasa por la torre de sulfatación, bajando
el pH para producir azúcar blanco únicamente. En esta etapa se utiliza azufre como
agente decolorante; luego mediante la adición de la lechada de cal entre 6 y
10°Baume se neutraliza el jugo. El calentamiento del jugo se realiza en tres etapas;
la primera por vapor vegetal de 34.5 kPa (5.0 psi) alcanzando temperaturas entre
80 y 85°C (175 y 185°F); la segunda por vapor de 34.5 kPa (5.0 psi) alcanzando
temperaturas entre 96 y 101°C (205 y 215°F) y la última con vapor de 69 kPa (10
psi) para rectificación del jugo en forma automática. Con el proceso anterior se logra
que el jugo, al ser liberado a presión atmosférica, sufra una pequeña evaporación
en el tanque flash evitando que los flóculos floten o decanten con lentitud por la
presencia de burbujas atrapadas en el interior. El siguiente paso es alimentar el
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
280
jugo a los clarificadores a baja velocidad para permitir la concentración de lodos y
que pueden ser extraídos por gravedad en un clarificador. En la etapa final de este
proceso se utilizan coladores vibratorios con malla para la eliminación de bagazo y
evitar que llegue al producto final. Los filtros de cabeza son parte indispensable del
proceso, pues sin ellos, la pérdida de sacarosa en la cachaza seria significativa.
d) Evaporación: La operación es relativamente sencilla debido a que se fijan las
condiciones de entrada, salida, nivel de cada evaporador y extracción de vapores
vegetales hacia el exterior. La evaporación se realiza en evaporadores en los
cuales el vapor y el jugo se encuentran en cámaras separadas que fluyen en el
mismo sentido. El jugo pasa de un evaporador a otro con bombas denominadas “de
transferencia”. El control global de un evaporador se ejecuta a través de la
estabilización de cinco factores muy importantes:
La concentración del producto final
La presión absoluta en el último cuerpo
La alimentación de vapor y jugo al primer evaporador
Remoción de condensados y gases incondensables
El control de incrustación en cada evaporador.
En este paso, la presencia de las dextranas provoca el aumento de incrustaciones
en las superficies de calentamiento y con ello, un mayor gasto energético. El tiempo
de cocción de las masas se incrementa y el agotamiento de éstas se reduce.
e) Cristalización: La cristalización o crecimiento de la sacarosa que contiene el jarabe
se lleva a cabo en tachos al vacío. Estos cocimientos, según su pureza producirán
azúcar crudo y azúcar blanco. Este es un proceso demorado que industrialmente se
acelera introduciendo al tacho unos granos microscópicos de azúcar, denominados
semillas. La experiencia del operativo debe juzgar el punto exacto del cocimiento,
para la obtención de un buen producto. Si existe la presencia de dextranas
provocará un incremento del tiempo de cristalización del azúcar, la masa cocida en
los cristalizadores se enfría más de los apropiado y aumenta aún más la anormal
viscosidad del fluido, se incrementan los tiempo de lavado en las centrífugas para
alcanzar la calidad requerida del azúcar, así como los tiempos totales de la
centrifugación y de la purga. El azúcar derivado de tales masas cocidas es
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
281
pegajoso, difícil de manipular, secar y envasar. Algunos estudios han confirmado
que la calidad de la masa cocido afecta significativamente el rendimiento de los
cristales de azúcar, pues se ha llegado a reducir hasta el 86% en el caso de
755ppm de dextranas en las masas cocidas con 84.3% de pureza. La reducción de
la velocidad de cristalización del azúcar se manifiesta específicamente en la
disminución de la velocidad de crecimiento del cristal en los ejes a y b, es decir, los
cristales de azúcar se deforman en el eje c, adquieren una forma alargada con las
dextranas ocluida en ellos. Este cristal es llamado “de aguja”, reduce la eficiencia
de la purga de las masas cocidas durante la centrifugación, lo cual provoca la pobre
separación del cristal de las mieles y decae la calidad de refinación del azúcar
(Cuddihy et al., 1998).
f) Separación: Los cristales del azúcar se separan de la miel restante en las
centrifugas. La miel pasa a través de las telas, los cristales quedan atrapados
dentro de las centrifugas y luego se lavan con agua. Las mieles vuelven a los
tachos o bien se utilizan como materia prima para la producción de alcohol en las
destilerías. El azúcar pasa al proceso de secado y enfriado.
g) Refinación: En el caso de la producción de azúcar blanca refinada, existe un
proceso adicional, que utiliza como materia prima azúcar blanco estándar o azúcar
crudo. En este proceso se disuelve el azúcar a 60ºBrix, luego se le adiciona carbón
activado y tierra diatomácea. Esta solución se hace pasar por primera y segunda
filtración en filtros verticales, hasta obtener un licor claro. El licor es evaporado y
empieza la cristalización de los granos.
h) Secado: En el proceso de centrifugado se utiliza agua de condensado para lavar el
azúcar, lo cual da como resultado humedades entre 0.3% y 0.6%, por lo que es
necesario pasarla por un proceso de secado para alcanzar niveles entre 0.2% para
azúcar crudo y 0.03% para azúcar blanca.
i) Envasado: El azúcar crudo de exportación sale directamente de la secadora a las
bodegas de almacenamiento. En las bodegas se carga a granel en camiones que la
transportan al puerto de embarque. El azúcar blanco estándar y refinada se empaca
en sacos de 50 y 46 kg y jumbos de 1400 kg para ser comercializado local e
internacionalmente.
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
282
De manera general, las pérdidas generadas por las dextranas oscilan desde 0.35 hasta
8kg por tonelada de caña molida por la presencia de cada 1000mgL-1 de dextranas en
el jugo mezclado. Cualquiera que sea el resultado, es evidente la necesidad de eliminar
las dextranas del proceso de producción de azúcar y el método más utilizado es el uso
de biocidas (IMSA, 1991).
2.3.2. Microorganismos presentes en la caña de azúcar
Durante el proceso de obtención de azúcar de caña, los jugos de la caña de azúcar se
van concentrando paulatinamente hasta que se separa el azúcar en estado cristalino de
las melazas residuales. Cuanto más puro sea el producto, más pobre será como medio
de cultivo. La sacarosa puede alterarse por inversión, fermentación ácida u oxidación
por bacterias, levaduras y mohos. Entre los microorganismos presentes en la caña de
azúcar se encuentran Leuconostoc, Enterobacteriaceae, Lactobacillus, Flavobacterium,
Xanthomonas, Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus y Corynebacterium (ICMSF, 1998).
Las levaduras halladas en el azúcar crudo son osmófilas, la más importante es
Zygosaccharomyces rouxii, pero sueles hallarse Pichia, Torulopsis, Candida y otras
(Hocking y Pitt, 1997).
La refinación del azúcar destruye los microorganismos patógenos, si estuvieran
presentes. Sobreviven las endosporas de bacilos aerobios y anaerobios, tales como
Bacillus coagulans, B. stearothermophilus, Clostridium thermosaccharolyticum y C.
nigrificans (Speck, 1992).
Algunas de las bacterias más molestas en la producción de azúcar son Leuconostoc
mesenteroides y L. dextranicum que hidrolizan la sacarosa y sintetizan dextranas, pues
esta sustancia viscosa puede llegar a taponar cañerías (Fig. 3). Las dextranas son
polisacáridos constituidos por unidades de glucosa unidas en forma de cadena recta
mediante enlaces α-1,6. Al menos entre 50% y 60% de las uniones deben ser α-1,6
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
283
para que el polímero se defina como dextrana, existiendo un amplio rango de masas
moleculares entre ellos, ya que oscilan desde unos miles hasta varios millones de
unidades de masa molecular, dependiendo de la clase de bacteria que las produzca, lo
cual causa diferencias estructurales en el polímero (Larrahondo, 1995).
Fig. 3. Síntesis general de dextranas a partir de sacarosa (Larrahondo, 1995)
La síntesis de las dextranas ocurre a partir de la sacarosa mediante la acción de la
enzima dextransacarasa. De la masa molecular de azúcar que se consume se utiliza
solamente la fracción de glucosa en la síntesis de la dextrana, permaneciendo como
subproducto la fructosa, la cual se descompone en ácidos orgánicos y otros productos
coloreados que inducen un descenso de pH. Lo anterior ocasiona un aumento en la
tasa de inversión de la sacarosa por catálisis ácida y contribuye, en consecuencia, al
incremento de las pérdidas adicionales de azúcar comercial. Los principales
subproductos originados durante la acción microbiológica de Leuconostoc y de otros
microorganismos como las levaduras (Saccharomyces) después del corte de la caña,
son los ácidos acético, láctico y butírico, el manitol y el etanol, los cuales ayudan, aún
más, al descenso del pH de los jugos y a la síntesis de materiales coloridos. Además de
las pérdidas de sacarosa a consecuencia de la formación de dextranas, estos polímeros
incrementan la viscosidad de los jugos, creando problemas en los evaporadores y
tachos. Adicionalmente, las dextranas causan elongación de los cristales de azúcar, lo
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
284
cual se denomina técnicamente como cristal aguja (Fig. 4), incrementando las pérdidas
de sacarosa en forma de mieles y aguas de lavado (Calahorro, 1995).
Fig. 4. Cristales de sacarosa en forma de aguja (Calahorro, 1995)
2.3.3. Biocidas utilizados en la industria azucarera
La actividad agrícola requiere de herbicidas, fungicidas, bactericidas, insecticidas,
nematicidas, acaricidas, rodenticidas y otros plaguicidas. Los plaguicidas son
sustancias xenobióticas usadas en la producción de cosechas para el control de plagas,
enfermedades y malezas. La aplicación de estas sustancias implica la emisión de
residuos a los diferentes compartimientos del medio ambiente (van der Werf y Zimmer,
1998). Los peligros asociados con estos productos químicos son los siguientes:
La baja biodegradabilidad hace que su toxicidad persista largo tiempo en el
medio ambiente, especialmente los clorados y los fosforados
La posibilidad de que percolen hasta los mantos acuíferos que pueden servir
como agua de consumo humano
La destrucción del control biológico y disminución de la polinización.
El impacto ambiental de la aplicación de los plaguicidas depende de las características
de:
La toxicidad del plaguicida sobre los organismos acuáticos
El ambiente o medio receptor
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
285
Su aplicación ya sea sobre el suelo o alguna matriz específica.
La presencia en forma continua de ciclos superpuestos de las diferentes plagas y a su
vez, de los enemigos naturales de éstas, ha determinado el uso de plaguicidas a lo
largo del ciclo productivo (Varona et al., 2006). Los ingenios azucareros han estado
utilizando con buenos resultados los plaguicidas tales como el diutrón, (2,4) D,
terbutrina, glifosato, fusilade y ametrina para el control de ellos en la caña de azúcar
(Fig. 5). Sin embargo, debido a las características inherentes a su carácter tóxico y al
manejo inapropiado que en la mayoría de las ocasiones se hace de estas sustancias,
se genera gran variedad de impactos negativos sobre los componentes de los
ecosistemas sometidos a su acción.
Fig. 5. Plaguicidas más usados en la industria azucarera (Varona-Uribe et al., 2006)
El diutrón por ejemplo, es generalmente persistente en suelos, aguas superficiales y
subterráneas; también es altamente tóxico para los mamíferos y pájaros como
moderadamente tóxico para los invertebrados acuáticos. Sin embargo, su principal
producto de biodegradación la 3,4-dicloroanilina exhibe su mayor toxicidad y es también
persistente en el suelo y las aguas (Giacomazzi y Cochet, 2004).
La toxicidad del (2,4) D ha sido verificada mediante varios ensayos de toxicidad (Okay y
Gaines, 1996; Sarikaya y Selvi, 2005). También se reporta que C. nobilii es afectada
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
286
por concentraciones de glisofato menores a las usualmente encontradas en cuerpos de
aguas naturales. El fusilade presenta características residuales que impiden el
surgimiento y crecimiento de las semillas de diferentes plantas (Rokich et al., 2009). La
ametrina interfiere en el proceso fotosintético produciendo nitritos, tóxicos que
contribuyen a la muerte de la planta (Churchill, K. y Lowell, K. 1979; Franck et al., 1995;
Koohpaei et al., 2009) y encontraron para la terbutrina que el impacto de una dosis
simple sobre el ambiente puede ser mínima.
Otros productos que se han utilizado o que se recomiendan para su uso en
desinfección y/o sanitización de la caña de azúcar son los siguientes (Villa, 2008):
Ditiocarbamatos y otros carbamatos
Cloruro de benzalconio y otras sales cuaternarias de amonio como bifloruro de
amonio
Formaldehído
Formalina
2.3.4. Metam sodio (MS) y sus productos de descomposición
El metam sodio (Fig. 6) es ampliamente utilizado en la industria azucarera durante la
extracción del jugo de caña debido a su acción inhibitoria de Leuconostoc
mesenteroides, principal responsable de la formación de dextranas. Los plaguicidas
diticarbamatos son compuestos derivados del ácido carbámico que poseen una ligera
actividad anticolinesterásica y presentan una gran capacidad para la captación de
metales e interacción con radicales sulfhidrilo. Entre estos plaguicidas se encuentra el
metam sodio, cuyo mecanismo de acción se fundamenta en su carácter quelante de
ciertos metales que son vitales para el microorganismo. En el caso del
metilditiocarbamato de sodio se tiene una inhibición competitiva en el desarrollo celular,
removiendo el ión férrico del citocromo, deteniendo así la cadena transportadora de
energía y causando la muerte del microorganismo (Cremlyn, 1991).
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
287
El metam sodio se conoce por una variedad de sinónimos incluyendo: ditiocarbamato
de sodio, metam y carbatión (Tabla 6). Su fórmula molecular es C2H4NNaS2, con una
masa molecular de 129.18 g/mol. A temperatura ambiente se forma un gas incoloro,
con un desagradable olor similar al del disulfuro de carbono. Es corrosivo para el
aluminio, cobre, zinc y latón. Es estable en si estado seco y cristalino y en solución
acuosa concentrada (Wales, 2002).
Fig. 6. Estructura del metam sodio (Wales, 2002)
Tabla 6. Propiedades fisicoquímicas del metam de sodio (Sigma-Aldrich, 2016b)
Sinónimos: Sal de sodio del ácido bimetilditio-carbámico; Sal de sodio del ácido bicarbamoditioico; Sal de sodio del ácido N-metilaminoditiofórmico; Sal de sodio del ácido N-metilaminometantionotiólico; Sal de sodio del ácido metilcarbamoditioico; N-metilaminoditioformato de sodio; Monometilditiocarbamato de sodio; Basamid-fluid; Carbam; Karbation; Mapasol; Masposol; Nematin; Sistan; SMDC; Sometam; Trapex; Trimaton; Vapam; VPM
Estado físico Cristales blancos Insoluble Disolventes orgánicos Punto de ebullición 110ºC Volatilidad No es volátil Solubilidad en agua 722 g/L Corrosiva Al latón, cobre y zinc Otros disolventes acetona, xileno y
keroseno Masa molecular 129.17 g/mol
En dilución acuosa se descompone en el compuesto activo y volátil llamado metil
isotiocianato (MITC). El pH de la matriz afecta de manera considerable la
descomposición del metam sodio. Los productos de descomposición varían al variar el
pH de la matriz. En pH neutro o ligeramente alcalino se obtiene MIT como producto
principal.
En soluciones neutras, el metam sodio se descompone en metil isotiocianato (MITC) e
hidrogenosulfuro de sodio (NaSH) como se presenta en la Fig. 7.
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
288
Fig. 7. Degradación del metam sodio en una solución neutra (LAINCO, 2010)
En soluciones alcalinas diluidas se produce una reacción de oxidación (Fig. 8)
caracterizada por la formación de azufre elemental (S) y MITC.
Fig. 8. Degradación del metam sodio en una solución alcalina diluída (LAINCO, 2010)
En soluciones ácidas se produce una descomposición no oxidativa (Fig. 9), que
inicialmente produce la mitad de MITC del que se forma en la descomposición
oxidativa:
Fig. 9. Degradación del metam sodio en solución ácida (LAINCO, 2010)
2.3.4.1. Metilamina (MA)
La metilamina es una amina alifática. Éstas se forman cuando uno o más átomos de
hidrógeno del amoniaco (NH3) son sustituidos por uno, dos, tres radicales alquil o
alcanol. Las aminas alifáticas inferiores son gases como el amoniaco y perfectamente
solubles en agua, pero lo homólogos superiores son insolubles en agua, todas las
aminas son básicas. Las aminas alifáticas de cadena corta son emitidas a la atmósfera
a partir de fuentes antropogénicas, tales como las operaciones de ganado en engorda,
incineración de residuos, tratamiento de aguas residuales y diversos procesos
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
289
industriales (Parmeggiani, 1999). Además de su origen por procesos industriales, las
aminas alifáticas pueden generarse como productos de degradación de productos
orgánicos, como las proteínas y los aminoácidos u otros compuestos que contienen
nitrógeno (Lloret et al., 2002; Singh et al., 2011; Verma, 1999). De acuerdo con sus
propiedades fisicoquímicas (Tabla 7) es una base de fuerza intermedia, reacciona
violentamente con mercurio provocando peligro de incendio y explosión; también
reacciona violentamente con oxidantes fuertes como el cloro (Parmeggiani, 1999). En
estado gaseoso se degrada en la atmósfera por dos vías: por reacción con radicales
hidroxilo producidos fotoquímicamente; y la vida media para esta reacción en el aire se
estima en 18 horas; la otra reacción al interaccionar con el ozono y la vida media de
ésta reacción en el aire se estima en 540 días (PubChem, 2004).
Tabla 7. Propiedades fisicoquímicas de la metilamina (Praxair, 2008)
Sinónimos: Aminometano, metanoamina y monometilamina
Estado físico Gas licuado comprimido incoloro, de olor característico
Densidad 0.6628
Punto de ebullición
-6.3ºC Volatilidad Volátil
Solubilidad en agua
108g/100mL a 20ºC Presión de vapor
290 kPa
Punto de fusión -94ºC Masa molecular
31.1 g/mol
Color Incoloro Olor Amoniacal
Una preocupación actual es la posibilidad de que algunas aminas irritantes alifáticas
puedan reaccionar con los nitritos o nitratos in vivo para formar compuestos nitrosos,
muchos de los cuales son cancerígenos potentes en animales (Parmeggiani, 1999). Las
aminas alifáticas y poliaminas son bien conocidas como sustancias con olor parecido al
amoniaco y precursoras de N–nitrosaminas, las cuales son cancerígenas, tóxicas,
sensibilizadoras e irritantes para la piel, ingestión y contacto directo (Kumar et al., 2011;
Lloret et al., 2002; Verma, 1999). Las nitrosaminas son potentes cancerígenos
animales, pruebas bioquímicas, patológicas y experimentales de las nitrosaminas
aportan pocos indicios de que la especie humana sea resistente al potencial
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
290
cancerígeno de las nitrosaminas. Se ha demostrado que los tejidos humanos
metabolizan las nitrosaminas para formar compuestos que se unen al ADN, un proceso
considerado como el primer paso en el desarrollo de cáncer. El National Toxicology
Program (NTP) de Estados Unidos ha clasificado a cinco nitrosaminas como sustancias
que pueden considerarse razonablemente cancerígenas para humanos (Parmeggiani,
1999).
2.3.4.2. Metilisotiocianato (MITC)
El metilisotiocianato (MITC), es la sustancia activa y principal producto proveniente de
la descomposición del metam sodio y metam potasio, es más tóxico que los anteriores
e interfiere en el metabolismo de los organismos por quelación las enzimas con radical
metálico así, impide la absorción de oxígeno en la respiración celular. Es una sustancia
química muy volátil que se difunde en el suelo en forma de gas y que posee actividad
fungicida, insecticida, nematicida y herbicida (LAINCO, 2010).
Como se mencionó en el párrafo anterior, el metilisotiocianato es más tóxico que el
metam sodio con valores de LD50 intraperitoneales en ratones de 100 y 750 mg/kg,
respectivamente (Lam et al., 1993). Investigaciones anteriores relacionados con el
destino ambiental de metam sodio y MITC se han llevado a cabo en un esfuerzo para
mejorar la eficacia de control de plagas y para evitar daño al cultivo asociado con
residuos de pesticidas persistentes (Wales, 2002; Zheng et al., 2004). La velocidad de
descomposición depende fuertemente de la temperatura, del medio, y la humedad. La
eficiencia de conversión está reportada de ser muy alta, que va desde el 87% al 95%
(Smelt et al., 1989; Turner y Corden, 1963; Wales, 2000).
Comparado con el metam sodio no volátil, MITC entre otras de sus propiedades
fisicoquímicas (Tabla 8) tiene una presión de vapor relativamente alta (16mmHg a
20ºC), que le permite volatilizarse y dispersarse en la fase gaseosa. Por lo tanto, la
preocupación ambiental primaria asociado con aplicaciones agrícolas de metam sodio
es el de las emisiones considerables de MITC a la atmósfera. Se ha informado de que
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
291
hasta un 10 a 60% del sodio metam aplicado se puede perder a través de MITC
volatilización de campo o suelo del invernadero (Leistra y Crum, 1990; Van den Berg,
1993; Van den Berg et al., 1999).
Tabla 8. Propiedades fisicoquímicas del metilisotiocianato (Sigma-Aldrich, 2016a)
Sinónimos: Isotiocianato de metilo
Estado físico Sólido amorfo, cristalino
Densidad 1.069g/mL a 25ºC
Punto de ebullición
117-118ºC Punto de inflamación
30ºC
Solubilidad en agua
Soluble Presión de vapor 40hPa (30mmHg) a 30ºC
28hPa (21mmHg) a 20ºC
Punto de fusión 30-34ºC Masa molecular 73.12 g/mol
Color Incoloro Olor Sin datos disponibles
La pérdida de emisión de MITC depende de varios factores tales como la técnica de
aplicación, las condiciones climáticas, la temperatura, la humedad y las características
de suelo o alimento en el que se aplique.
Las altas tasas de aplicación y alta toxicidad para los mamíferos de MITC indican que
las grandes emisiones de este fumigante a la atmósfera tienen el potencial de poner en
peligro a los trabajadores agrícolas y otras personas que viven y trabajan cerca de
donde se emiten gases de este compuesto. Por lo tanto, el desarrollo de estrategias
para minimizar las emisiones es imprescindible.
2.3.4.2.1. Dimetiltiourea (DMTU) y metiltiourea (MTU)
La DMTU y la MTU son tioureas (Fig. 10) provenientes de la fotodescomposición del
MITC. En general las tioureas son moléculas planas (así como muchos de sus
derivados).
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
292
Fig. 10. Estructura química general de las tioureas (Mertschenk et al., 1995)
Muchos derivados de tiourea son útiles en organocatálisis. Las N,N'-tioureas no
sustituidos se pueden preparar generalmente por tratamiento de la cianamida
correspondiente con "LiAlHSH" (Fig. 11) en presencia de HCl 1 N en éter dietílico
anhidro (Koketsu et al., 2003).
Fig. 11. Síntesis general de tioureas no sustituidas (Koketsu et al., 2003)
Las tioureas reducen peróxidos de los dioles correspondientes. El intermediario de la
reacción es un epidióxido inestable que sólo puede ser identificado en -100°C (Fig. 12).
El epidióxido es similar al epóxido excepto que con dos átomos de oxígeno. Este
intermediario se reduce a diol por tiourea (Kaneko et al., 1974).
Fig. 12. Reducción de las tiorureas (Kaneko et al., 1974)
Por su parte la dimetiltiourea es un destructor muy importante de radicales hidroxilo. Se
sabe que la dimetiltiourea actúa como un potente destructor de radicales OH-,
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
293
peroxinitrito y en menor grado H2O2 y, por tanto, se podría suponer que revierte los
efectos de cualquier OH- o peroxinitrito preformado. La formación de peroxinitrito
procede de la interacción de ON y O2. Se sabe que produce peroxidación de los lípidos
de membranas y se descompone a radicales hidroxilo. Se ha demostrado también que
el peroxinitrito puede producirse a partir de ON, SOD y H2O2. En pacientes que
padecen epilepsia, el efecto nocivo de los radicales libres sobre la neurona se
encuentra claramente establecido. Sin embargo, se ha intentado minimizarlo por medio
de dos mecanismos: inhibición de la producción y ataque directo a través de agentes
antioxidantes, como el caso de la dimetiltiourea usada como antioxidante o removedor
de radicales libres por su capacidad para bloquear la reacción de peroxidación, aunque
con eficacia clínica se ve limitada por la lenta capacidad de captación cerebral, sin
embargo no altera el metabolismo de la glucosa, se han obtenido buenos resultados en
estudios experimentales, aunque no han demostrado eficacia clínica significativa
(Medina, 2004). Otro uso de la dimetiltiouirea como antioxidante es en la industria
alimentaria, esto para aumentar la vida útil de los productos, así como también ha sido
utilizada la vitamina E, estos antioxidantes rompen la cadena de peroxidación ya que
pueden inhibir la fase de propagación (Vasudevan, 2010).
Sin embargo las propiedades peligrosas no pueden ser excluidas, tanto DMTU y MTU
son sustancias tóxicas (MTU LD50=50mg/kg en ratas), pueden causar reacciones
alérgicas en la piel y en caso de combustión de dichos compuestos se pueden generar
vapores peligrosos como óxido de nitrógeno y óxido de azufre (Sigma-Aldrich, 2014).
Sus propiedades fisicoquímicas se muestran en las Tablas 9 y 10.
Tabla 9. Propiedades fisicoquímicas de la dimetiltiourea (Sigma-Aldrich, 2014b)
Sinónimos: N,N’-dimetiltiourea
Estado físico Cristales pH 6.5 a 100g/L 20ºC
Punto de ebullición 155ºC Densidad aparente 600kg/m3
Solubilidad en agua 1g/L Temperatura de descomposición >65ºC
Punto de fusión 60-64ºC Peso molecular 104.16 g/mol
Color Blanco Olor Característico
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
294
Tabla 10. Propiedades fisicoquímicas de la metiltiourea (Sigma-Aldrich, 2014a)
Sinónimos: N-metiltiourea
Estado físico Cristales pH n.d.
Punto de ebullición n.d. Densidad aparente n.d.
Solubilidad en agua n.d. Temperatura de descomposición n.d.
Punto de fusión 118-121ºC Masa molecular 90.15 g/mol
Color Blanco Olor n.d. n.d.= no determinado
2.4. Normatividad
2.4.1. Normatividad en México
La normatividad nacional, NOM-010-STPS-1999 (STPS, 1999) establece como límite
máximo permisible de exposición promedio ponderado en el tiempo (LMPE-PPT), que
es la concentración promedio ponderada en el tiempo de un contaminante del ambiente
laboral para una jornada de ocho horas diarias y una semana laboral de cuarenta horas
a la cual se pueden exponer la mayoría de los trabajadores sin sufrir daños a la salud
de 10mg L-1 y 10 mg m-3.
En México existe una Comisión Intersecretarial para el Control del Proceso y Uso de
Plaguicidas Fertilizantes y Sustancias Tóxicas (CICOPLAFEST), la cual se enfoca a la
protección de la salud y al manejo adecuado de plaguicidas y fertilizantes en la
agricultura y medidas fitosanitarias. En el catálogo de plaguicidas por la CICOPLAFEST
se encuentra el dimetilditiocarbamato de sodio denominado como Metam Sodio
(nombre común). Este compuesto viene reportado para uso agrícola como fumigante de
suelos en presiembra y en el tratamiento de suelos en viveros, semilleros, tabaco,
maceta y áreas de cultivo. Pero todavía no se ha desarrollado un límite máximo de
residuos (LMR) para uso como bactericida en la caña de azúcar y/o jugo de caña como
se muestra en la Fig. 13 (CICOPLAFEST, 2004).
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
295
Fig. 13. Información técnica del Metam Sodio (CICOPLAFEST, 2004)
2.4.2 FAO-OMS
Con base en su uso, el ditiocarbamato debe acoplarse a la base legal y técnica de la
norma sanitaria aplicable a los glúcidos y jarabes destinados al consumo humano.
Tiene como base legal el Reglamento sobre Vigilancia y Control Sanitario de Alimentos
y Bebidas aprobado por Decreto Supremo, Transitoria y Final, la expedición de normas
sanitarias aplicables a la fabricación de productos alimenticios y tiene como referencia
técnica la norma internacional del Codex Alimentarius CODEX STAN 212-1999
(Enmienda 1-2001) para glúcidos. Los residuos de plaguicidas en los alimentos y sus
límites máximos permitidos se ajustan a lo establecido por la Autoridad de Salud y por
la Comisión Conjunta FAO-OMS del Codex Alimentarius, los cuales están sujetos a
modificación según los avances en la investigación científica sobre la evaluación de los
riesgos (MINSA, 2009) como se presenta en la Tabla 11.
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
296
Tabla 11. Límite máximo residual (LMR) de plaguicidas en caña de azúcar y maíz (MINSA,
2009)
LMR en mg/kg Plaguicida
Caña de azúcar Maíz dulce (granos) Maíz dulce (mazorca)
2,4 D 0.05 n.d. 0.05
Aldicarb 0.1 n.d. n.d.
Azinfos-metilo 0.2 n.d. n.d.
Carbofuran 0.1 n.d. n.d.
Etoprofos 0.02 n.d. n.d.
Propiconazol 0.05 n.d. n.d.
Tebufenozida 1 n.d. n.d.
Disulfoton n.d. 0.02 n.d.
Lindano n.d. 0.01 n.d.
Carbarilo n.d. n.d. 0.1
Cipermetrin n.d. n.d. 0.05
Clorotalonilo n.d. n.d. 0.01
Clorpirifos n.d. n.d. 0.01
Deltametrin n.d. n.d. 0.02
Diazinon n.d. n.d. 0.02
Disulfoton n.d. n.d. 0.02
Ditiocarbamato de
sodio
n.d. n.d. 0.1
Fenvalerato n.d. n.d. 0.1
Forato n.d. n.d. 0.05
Glifosato n.d. n.d. 0.1
Imidacloprid n.d. n.d. 0.02
Malation n.d. n.d. 0.02
Metomilo n.d. n.d. 2 basado en el uso de
Tidiocarb
Permetrin n.d. n.d. 0.1
Pirimicarb n.d. n.d. 0.05
Spinosad n.d. n.d. 0.01
Segunda Parte II-3: Capítulo 2. Antecedentes
297
2.4.3. Normatividad de la Unión Europea
Con la base de datos de plaguicidas de la Unión Europea, que se presenta en la Tabla
12, el nivel máximo de residuos de cualquier tipo de ditiocarbamatos (expresados como
disulfuro de carbono), aplicado para la caña de azúcar, es de 0.05mgkg-1 (Unión
Europea, 2009). Es importante mencionar que en la metodología que se emplea, los
plaguicidas se transforman en CS2, cuantificándose por medio de cromatografía de
gases. Esto impide la cuantificación del ditiocarbamato de sodio solamente.
Tabla 12. Límite máximo residual de ditiocarbamatos en caña de azúcar
(Unión Europea, 2009)
Código Grupos y ejemplos de
productos individuales para
los cuales aplica LMR
Ditiocabamatos (ditiocarbamatos expresados
como CS2, incluyendo maneb, mancozeb,
metiram, propineb, thiram y ziram)
900020 Caña de azúcar 0.05 mg kg-1 (0.125 mg L-1)
Segunda Parte II-3: Capítulo 3. Fundamentos analíticos
298
3.1. Cinética química
La cinética química estudia las velocidades y mecanismos de las reacciones químicas.
El estudio de la cinética química se divide en dos partes: la primera es el nivel
macroscópico que toma en cuenta las velocidades de reacción, lo que significa la
velocidad de reacción, cómo se determina experimentalmente y de qué manera influyen
en la velocidad de reacción los factores como la temperatura y la concentración de los
reactivos. En la segunda parte, se consideran las reacciones químicas a nivel de
partículas; en este caso lo principal es el mecanismo de reacción, la vía detallada que
toman los átomos y moléculas conforme la reacción se desarrolla (Laidler y Meiser,
2007).
La mayoría de las reacciones que ocurren en la naturaleza se pueden clasificar como
reacciones complejas y elementales. Las reacciones elementales se llevan a cabo en
un solo paso, así para una reacción de estequiometría aA + bB → yY + zZ la velocidad
de consumo de A se define como –d[A]/dt, y la velocidad de formación de Y se define
como d[Y]/dt. Estas cantidades en general no son iguales para distintos reactivos y
productos y es conveniente contar con una cantidad que simplemente se denomina
como velocidad de reacción (Harris, 2003).
3.2. Velocidad de reacción
La velocidad de una reacción química se refiere al cambio de concentración de una
sustancia por unidad de tiempo. En el curso de una reacción química, las cantidades de
reactivos disminuyen con el tiempo y las cantidades de productos aumentan (Laidler y
Meiser, 2007).
Es posible describir la velocidad de una reacción basándose en el aumento de
concentración de algún producto o en la disminución de concentración de algún reactivo
por unidad de tiempo como se muestra en la Fig. 14 (Laidler y Meiser, 2007).
Segunda Parte II-3: Capítulo 3. Fundamentos analíticos
299
Fig. 14. Variaciones de concentración con el tiempo para una reacción H2 + I2 → 2HI
(Harris, 2003)
Los átomos y moléculas son móviles en solución o en fase gaseosa, en estas
circunstancias varios factores afectan la velocidad de una reacción:
Las concentraciones de los reactivos
Temperatura, a menudo se calienta para que la reacción ocurra más rápido
Catalizadores, que son sustancias que aceleran las reacciones químicas sin
sufrir ninguna transformación ellos mismos.
La relación entre la concentración de reactivos y la velocidad de la reacción a una
temperatura dada, se expresa mediante una ecuación llamada ecuación de velocidad o
ley de velocidad, donde la constante de proporcionalidad k. La ecuación de velocidad
de reacción es proporcional a la concentración del reactivo, para una reacción del tipo
aA + bB → yY, la ecuación de velocidad a menudo tiene la forma v=k[A]a[B]b, es
importante reconocer que los exponentes a y b no son necesariamente los coeficientes
estequiométricos de la ecuación química balanceada. Estos exponentes deben
determinarse experimentalmente. A menudo son números enteros positivos, pero
también pueden ser negativos, fracciones o cero (Laidler y Meiser, 2007).
Segunda Parte II-3: Capítulo 3. Fundamentos analíticos
300
3.3. Orden de reacción
El exponente “a” de la ecuación v=k[A]a[B]b, se conoce como el orden de reacción con
respecto a A y puede denominarse orden parcial, de manera muy similar el orden
parcial “b” es el orden parcial con respecto de B (Harris, 2003) y el orden total de una
reacción es la suma de los exponentes sobre todos los términos de la concentración
(Laidler y Meiser, 2007).
3.3.1. Métodos gráficos para determinar el orden de reacción
Para una reacción de orden cero del tipo R → P, la ecuación de velocidad es -
d[R]/dt=k[R]0 lo que conduce a la ecuación de velocidad integrada [R]0 - [R]t = kt (Fig.
15), donde las unidades de k son mol L-1 min-1] (Laidler y Meiser, 2007).
Fig. 15. Reacción de orden cero (Laidler y Meiser, 2007)
Para una reacción de primer orden –d[R]/dt=k[R], esto significa que la velocidad de
reacción es directamente proporcional a la concentración de R elevada a la primera
potencia y empleando los métodos de cálculo integral la ecuación se puede manejar
como Ln[R]-Ln[R]0=-kt (Fig.16). Se observa que k es independiente de la concentración
y tiene unidades de tiempo-1(Laidler y Meiser, 2007).
Segunda Parte II-3: Capítulo 3. Fundamentos analíticos
301
Fig. 16. Reacción de primer orden (Laidler y Meiser, 2007)
En una reacción de segundo orden (Fig. 17), la ecuación de velocidad es –
d[R]/dt=k[R]2, esta relación se puede transformar en la ecuación 1/[R]t – 1/[R]0 = kt,
donde k es la constante de velocidad de segundo orden en las unidades de L mol-1 min-
1 (Laidler y Meiser, 2007).
Fig. 17. Reacción de segundo orden (Laidler y Meiser, 2007)
Haciendo un leve ordenamiento, todas estas ecuaciones tienen la forma “y = mx + b”,
ésta es la ecuación de la recta, donde “m” es la pendiente de la línea y “b” es la
intersección con el eje “y” (el valor de “y” cuando “x” es cero). Como se ilustra en la
Tabla 13, x = t en todos los casos.
Segunda Parte II-3: Capítulo 3. Fundamentos analíticos
302
Tabla 13. Método gráfico para cada uno de los órdenes de reacción
(Laidler y Meiser, 2007) Orden cero Primer orden Segundo orden
[R]t = -kt + [R]0 Ln[R] = - kt + Ln[R]0 1/[R]t = kt + 1/[R]0
↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
y mx b y mx b y mx b
3.4. Tiempo de vida media
Para una reacción dada, la vida media t1/2 de un reactivo en particular es el tiempo
necesario para que su concentración alcance un valor intermedio entre sus valores
inicial y final (Harris, 2003). Ésta indica la velocidad a la cual se consume un reactivo en
una reacción química; a medida que la vida media es más prolongada, la reacción es
más lenta. (Laidler y Meiser, 2007).
Para los principales órdenes de reacción cero, primer orden y segundo orden, la vida
media siempre es inversamente proporcional a la constante de velocidad; y en general
depende de las concentraciones de los reactivos como se muestra en la Tabla 14.
Tabla 14. Ecuaciones de vida media (Harris, 2003)
Orden de reacción Unidades de constante de velocidad Vida media t1/2
Cero mol L-1min-1 [C]0/2k
Primer orden min-1 Ln2/k
Segundo orden L mol-1min-1 1/(k[C]0)
3.5. Fundamentos de espectrofotometría
La espectrofotometría es el conjunto de procedimientos que utilizan la luz para medir
concentraciones químicas (Kotz et al., 2003).
Segunda Parte II-3: Capítulo 3. Fundamentos analíticos
303
3.5.1. Propiedades de la luz
Es conveniente describirla luz a la vez en términos de partículas y ondas. Las ondas de
la luz constan de campos eléctricos y magnéticos, que oscilan en planos
perpendiculares entre sí. En la Fig. 18 se muestra una onda polarizada en el plano, el
campo eléctrico se encuentra en el plano xy y el campo magnético en el plano xz. La
longitud de onda, es la distancia entre las crestas de dos ondas y se representa con la
letra λ. La frecuencia, ע, es el número de oscilaciones completas de una onda en un
segundo. La unidad de frecuencia es el inverso de los segundos (s-1). Una oscilación
por segundo también se llama hertzio (Hz). La relación entre frecuencia y longitud de
onda es c = ν λ (Kotz et al., 2003).
Fig. 18. Radiación electromagnética polarizada en el plano de longitud de
onda λ (Kotz et al., 2003)
3.5.2. Absorción de la luz
Cuando una molécula absorbe un fotón, su energía aumenta. Se dice que la molécula
ha pasado a un estado excitado (Fig. 19), si una molécula emite un fotón su energía
disminuye, el estado de mínima energía de una molécula se llama estado fundamental.
En el caso de las radiaciones UV y visible hacen que los electrones pasen a orbitales
de mayor energía (Kotz et al., 2003).
Segunda Parte II-3: Capítulo 3. Fundamentos analíticos
304
Fig. 19. Energía de absorción y emisión de una molécula (Kotz et al., 2003)
Cuando una muestra absorbe luz, la potencia radiante del haz de luz disminuye. La
potencia radiante “P”, es la energía por segundo por unidad de área del haz de luz.
Como se muestra en la Fig. 20, la luz se hace pasar a través de un monocromador
(prisma, red de difracción o incluso un filtro) para seleccionar una longitud de onda. La
luz monocromática tiene un solo color (la longitud de onda), aunque es imposible
producir luz monocromática, cuanto mejor es el monocromadormás estrecho es el
intervalo de longitudes de onda del haz emergente. La luz monocromática, con una
potencia Po, incide en una muestra de longitud b, la potencia radiante del haz que
emerge por el lado opuesto de la muestra es P y como la muestra puede haber
absorbido algo de luz, P ≤ Po (Kotz et al., 2003).
Fig. 20. Diagrama esquemático de una medida espectrofotométrica de haz simple
(Kotz et al., 2003)
La transmitancia T, se define como la fracción de la luz incidente que pasa a través de
la muestra y se define como T=P/P0, por tanto T puede valer de 0 a 1. El porcentaje de
transmitancia es simplemente 100T, y puede valer desde 0 a 100%. La absorbancia A,
Segunda Parte II-3: Capítulo 3. Fundamentos analíticos
305
se define como A = log10(P/P0) = -logT, y es importante porque es directamente
proporcional a la concentración c, de la especie que absorbe la luz en la muestra. Esto
obedece la Ley de Beer o Lambert-Beer (A = εbc) que es el fundamento de le
espectrofotometría tal y como se aplica en la química analítica, la absorbancia es
adimensional. La concentración de la muestra c, viene dada en unidades de mol L-1 (M)
y el paso óptico b normalmente se expresa en centímetros (cm). La cantidad ε, se llama
absortividad molar (o coeficiente de extinción molar) y tiene unidades de M-1cm-1, y así
el producto es adimensional. La absortividad molar es la característica de una sustancia
que nos dice cuánta luz absorbe a una longitud de onda determinada; cuanto mayor es
la absortividad molar, mayor es la absorbancia (Kotz et al., 2003).
Un espectro de absorción es un gráfico que muestra como varía la absorbancia al variar
la longitud de onda. La parte de una molécula responsable de la absorción de la luz se
llama cromóforo. Toda sustancia que absorbe luz visible aparece coloreada cuando
transmite o refleja la luz (la luz blanca contiene todos los colores del espectro visible)
(Kotz et al., 2003).
La ley de Beer afirma que la absorbancia es proporcional a la concentración de la
especie absorbente. Esta ley se aplica a la radiación monocromática y es válida
exactamente para disoluciones diluidas (≤0.01M) de la mayoría de las sustancias. En
disoluciones concentradas, las moléculas de soluto interaccionan entre sí debido a su
proximidad. Cuando las moléculas de soluto se acercan unas a otras, sus propiedades
(entre las que se encuentra la absortividad molar) cambian (Kotz et al., 2003).
A concentraciones muy altas, los solutos se convierten prácticamente en disolvente.
Los solutos de una disolución que no absorben también pueden interaccionar con las
especies absorbentes y alterar la absortividad (Kotz et al., 2003).
Segunda Parte II-3: Capítulo 3. Fundamentos analíticos
306
3.6. El espectrofotómetro
Los requisitos mínimos de un espectrofotómetro como ya se mencionó anteriormente
constan de una luz procedente de una fuente continua que pasa a través de un
monocromador, que selecciona una banda estrecha de longitudes de onda del haz
incidente. Esta luz monocromática atraviesa una muestra de paso óptico b, y mide la
potencia radiante de la luz que emerge. En espectrofotometría UV-visible se coloca
normalmente una muestra dentro de una celda, que tiene paredes planas de sílice
fundido (SiO2). El vidrio es adecuado para espectroscopía visible pero no para UV,
porque absorbe radiación UV. Las celdas más utilizadas tienen una longitud de paso de
1,000cm. En el análisis espectrofotométrico normalmente se analiza a qué longitud de
onda la muestra es capaz de presentar la máxima absorción, ésta se conoce como
longitud máxima de absorción o longitud de onda máxima de absorbancia, esto por dos
razones:
La curva es relativamente aplanada alrededor del máximo, de manera que apenas
varía la absorbancia si deriva un poco el monocromador. La ley de Beer se cumple
mejor cuando la absorbancia es casi constante a lo largo de la banda escogida de
longitudes de onda
La sensibilidad del análisis es máxima en el máximo de absorbancia (es decir, se
consigue el máximo de respuesta para una concentración dada de un analito).
En un espectrofotómetro de haz simple generalmente se deben colocar
alternativamente en el haz de luz la muestra y la referencia. Para medidas a diferentes
longitudes de onda, se debe medir la referencia a cada longitud de onda. Un
instrumento de haz simple es poco adecuado para medir la absorbancia en función del
tiempo, como en experimentos cinéticos, porque tanto la intensidad de la fuente como
la respuesta del detector suelen presentar deriva (Kotz et al., 2003).
En un espectrofotómetro de doble haz, la luz pasa alternadamente por la celda de la
muestra y de la referencia, dirigida por un motor que gira un espejo, que de esta
manera entra y sale del paso de la luz. Cuando el cortador no desvía el haz, la luz pasa
Segunda Parte II-3: Capítulo 3. Fundamentos analíticos
307
a través de la muestra, y el detector mide la potencia radiante que llamamos P, cuando
el cortador desvía el haz a través de la cubeta de referencia, el detector mide P0. El haz
se corta varias veces por segundo y el circuito compara automáticamente P y P0, dando
así la absorbancia y transmitancia. Este procedimiento permite hacer una corrección
automática de las variaciones de intensidad de la fuente, y de la respuesta del detector
con el tiempo y la longitud de onda, porque se comparan con mucha frecuencia la
potencia que sale de las dos muestras (Kotz et al., 2003).
Los espectrofotómetros de mayor calidad permiten un barrido automático de longitudes
de onda y un registro continuo de absorbancia. Para un espectrofotómetro UV-visible la
luz blanca procede de una lámpara de halógeno de cuarzo y la fuente ultravioleta es
una lámpara de arco de deuterio que emite en el intervalo de 200-400nm (Kotz et al.,
2003).
3.6.1. Lámparas
La espectroscopia UV normalmente utiliza una lámpara de arco (Fig. 21), son las
fuentes de radiación ultravioleta más utilizadas en espectroscopía. Estas lámparas
están formadas por una ampolla hermética interna que contiene dos electrodos
conectados a una fuente de energía. (Vilanova y Sogorb, 2004).
Fig. 21. Lámpara de
arco (Vilanova y
Sogorb, 2004)
Segunda Parte II-3: Capítulo 3. Fundamentos analíticos
308
La ampolla se rellena con un gas (generalmente de hidrógeno, deuterio, argón, xenón o
un vapor metálico de mercurio o sodio). Los electrodos aplican una descarga eléctrica
que excita las partículas del gas. Cuando las partículas excitadas vuelven al estado
fundamental, lo hacen emitiendo luz ultravioleta con un espectro continuo de 190 a
320nm (Vilanova y Sogorb, 2004).
3.6.2. Monocromadores
La función principal de un monocromador es la de proporcionar un haz de energía
radiante con una longitud de onda dada. La salida de cualquier monocromador usado
con una fuente de radiación continua consiste en una gama de longitud de onda con un
valor medio de longitud que se ajusta orientando el monocromador, éste consta de:
Una rendija de entrada que proporciona una imagen óptica estrecha de la fuente
de radiación
Una lente colimadora que hace paralela la radiación procedente de la rendija de
entrada
Una red de difracción para dispersar la radiación incidente
Otra lente colimadora para reformar las imágenes de la rendija de entrada sobre
la rendija de salida
Una rendija de salida para aislar la banda espectral deseada, bloqueando toda la
radiación dispersada excepto la del intervalo deseado (Vilanova y Sogorb, 2004).
3.6.3. Celdas y cubetas de vidrio
Es el contenedor donde se deposita la muestra a analizar. Es conveniente que este
contenedor esté aislado de la luz exterior. Las cubetas de vidrio (glass cuvettes, en
inglés) donde se depositan las muestras para realizar las medidas han de ser de
plástico, vidrio o cuarzo en el caso de espectroscopía de absorción ultravioleta. La
necesidad del cuarzo en el último caso viene dada por la opacidad del plástico y el
Segunda Parte II-3: Capítulo 3. Fundamentos analíticos
309
vidrio a la radiación ultravioleta. Normalmente las cubetas utilizadas para absorción
ultravioleta y visible son siempre de 1cm de paso de luz. No obstante, si se desean
ganar sensibilidad se puede aumentar la longitud del paso óptico (Vilanova y Sogorb,
2004).
3.6.4. Detectores
Generalmente los detectores también son transductores, es decir, convierten la
radiación electromagnética que atraviesa la muestra en una corriente o voltaje que se
mide después de ser amplificado en el circuito electrónico de lectura. Para el
ultravioleta, visible e infrarrojo cercano se utilizan los fototubos de vacío, que contienen
un cátodo sensible a la radiación. El fototubo basa su funcionamiento en el efecto
fotoeléctrico, es decir, detecta los electrones que emiten determinados materiales
cuando reciben el impacto de fotones de determinadas frecuencias (Fig. 22) (Vilanova y
Sogorb, 2004).
Fig. 22. Fototubo empleado en la detección de UV-visible (Vilanova y Sogorb, 2004)
Segunda Parte II-3: Capítulo 3. Fundamentos analíticos
310
3.7. Errores en la espectrofotometría
El fabricante de un espectrofotómetro suele indicar el error instrumental que se puede
esperar. La incertidumbre de las medidas acumula además otros errores, asociados
con la preparación de muestra y con la posición de las celdas. La ley de Beer, que
afirma que la absorbancia es proporcional a la concentración, se aplica a una radiación
monocromática.
En el pico de absorbancia, la variación de absorbancia con la longitud de onda es
mínima. De éste modo, el efecto de usar luz no perfectamente monocromática será
menor porque la absortividad molar es prácticamente constante en un periodo intervalo
de longitudes de onda (Kotz et al., 2003).
Las medidas espectrofotométricas más fiables de absorbancia son entre 0.4 y 0.9. Si la
absorbancia es menor, la potencia radiante que atraviesa la muestra es parecida a la
que atraviesa la referencia, y la incertidumbre relativa de la diferencia entre estos dos
números sería grande. Si la absorbancia es alta, llega poca luz al detector y disminuye
la relación señal ruido. Para obtener la máxima precisión, las muestras no deben
contener partículas en suspensión y las celdas deben estar exentas de huellas
dactilares, o de cualquier otra suciedad (Kotz et al., 2003).
Segunda Parte II-3: Capítulo 4. Metodología
311
4.1. Parámetros de operación
La identificación y cuantificación del plaguicida y sus subproductos de descomposición
en estudio, se realizó utilizando un espectrofotómetro UV-visible Rayleigh UV1800 que
utiliza un software UV-Software, las pruebas se realizaron en celdas de cuarzo entre las
longitudes de onda (λ) de 190-200nm.
4.2. Diseño experimental
Para desarrollar el experimento se determinaron los factores que afectan la
degradación de los analitos MS, MA, MITC, DMTU y MTU los cuales son: matriz (A), pH
(B), fotólisis (C) y tiempo (D). Una vez seleccionados los factores y los niveles para
cada uno de ellos, se definió un diseño factorial para la matriz agua (Tabla 15) y la
matriz jugo de caña (Tabla 16), se realizó tres veces la lectura de cada uno de los
puntos de las diferentes curvas de calibración y degradación para cada matriz (agua y
jugo de caña).
Tabla 15. Diseño experimental en agua
Factores: Niveles
1 2 3 4 5 6
A: Matriz Agua B: pH Sin
modificar 4.5 7.0
C: Fotólisis Luz Oscuridad D: Tiempo (min) 2 4 6 8 10 12
Tabla 16. Diseño experimental en jugo de caña
Factores: Niveles
1 2 3 4 5 6
A: Matriz Jugo de caña B: pH Sin modificar C: Fotólisis Luz Oscuridad D: Tiempo (min) 2 4 6 8 10 12
Segunda Parte II-3: Capítulo 4. Metodología
312
4.3. Material y equipo
Los equipos y materiales utilizados para la elaboración de la presente investigación se
presentan a continuación (Tabla 17).
Tabla 17. Equipo y material utilizado con sus especificaciones técnicas
EQUIPO Y MATERIAL ESPECIFICACIONES TÉCNICAS
Espectrofotómetro Rayleigh
UV1800
λ= 190-800nm
Software de control en el
espectrofotómetro
UV Software
Celdas para espectrofotómetro De material de cuarzo
Micropipeta Tranferpette de 100-10000μL
Kit de viales Viales de vidrio transparentes y color ámbar con tapa de
silicón de 2.5cm y 10mL de capacidad
Vasos de precipitados Kymax de 50, 100 y 600mL de capacidad
Matraz aforado Kymax de 50 y 100mL de capacidad
Estufa Felisa Digital (5°C-250°C)
Centrífuga Eppendorf Modelo 5810 R
Tubos Falcon 50mL de capacidad
Balanza analítica ATN Comparator
4.4. Reactivos
Los reactivos utilizados para la preparación de soluciones patrón y las muestras
utilizadas para el estudio de fotodescomposición se enlistan en la Tabla 18.
La metodología empleada de acuerdo a lo señalado por Harris D.C. (2003), el análisis
cuantitativo mediante la espectrofotometría consta de tres pasos.
Segunda Parte II-3: Capítulo 4. Metodología
313
Tabla 18. Reactivos utilizados
REACTIVO DESCRIPCIÓN Agua J.T. Baker HPLC; pureza 99.9% Metanol J.T. Baker HPLC; pureza 99.9% Ditiocarbamato de Sodio (MS) Pureza 99% Metialamina (MA) 38-40% Metilisotiocianato (MITC) Pureza 98% Dimetiltiourea (DMTU) Pureza 99% Metiltiourea (MTU) Pureza 99% H3PO4 0.01M NH4OH 0.01M
Estos son: la determinación de longitud de onda máxima de absorción a partir de una
solución patrón del analito de interés; la elaboración de curvas patrón a partir de una
disolución de concentración conocida y la elaboración de las curvas de degradación del
compuesto para poder determinar su tiempo de vida media (Fig. 23). Es importante
resaltar que las curvas de calibración del analito deben estar hechas a partir de un
reactivo de alta pureza con el fin de mejorar la confiabilidad del método.
Fig. 23. Principales etapas de la metodología
Segunda Parte II-3: Capítulo 4. Metodología
314
4.4.1. Preparación de reactivos
Todo el material de vidrio y plástico se le dio un tratamiento de limpieza que se describe
en el Anexo 1.
A continuación, las soluciones madre que se prepararon, se almacenaron en frascos de
vidrio ámbar con tapa de silicón, las diluciones para la elaboración de las curvas patrón
se almacenaron en los viales de color ámbar y los transparentes fueron forrados con
papel aluminio.
Todos los anteriores se guardaron a una temperatura de 4°C para evitar su
descomposición.
a) Solución madre de MS, DMTU y MTU 10mg L-1. En cada caso pesar
aproximadamente 0.5mg de MS, DMTU o MTU 99% pureza en balanza analítica
y transferir la masa a un matraz aforado de 50mL, llevar al aforo disolviendo con
metanol 99.9% de pureza.
b) Solución madre de MA 1.44M. Tomar 5mL con pipeta volumétrica 38-40% y
transferir el volumen a un matraz aforado de 50mL, llevar al aforo disolviendo
con metanol 99.9% de pureza.
c) Solución madre de MITC 2mg L-1. Vaciar una ampolleta de MITC C= 100μg mL-1
en matraz aforado de 50mL, llevar al aforo disolviendo con metanol 99.9% de
pureza.
d) Solución de HPO4 0.01M. Se parte de una solución de ácido fosfórico al 83.5-
85%, de ésta se toman 0.17mL y se llevan al aforo en matraz 250mL con agua
destilada.
e) Solución NH4OH. Se parte de una solución de hidróxido de amonio al 28-30%, de
ésta de toman 0.34mL y se llevan al aforo en matraz de 250mL con agua
destilada.
Segunda Parte II-3: Capítulo 4. Metodología
315
4.4.2. Tratamiento de la caña de azúcar
Para la elaboración de jugo de caña se parten y limpian las cañas, posteriormente se
retira la cáscara gruesa y se vuelven a partir trozos pequeños para su molienda en un
extractor de jugos marca Oster de 300W de potencia. El jugo obtenido se filtra con una
coladera y luego se vacía en tubos falcon de 50mL para centrífuga; la centrifugación se
lleva a cabo por a 3000 rpm por 5min. Una vez separadas las fases se decanta el
líquido obtenido y se transfiere a un vaso de precipitados en donde se mantiene en
agitación con 0.5g de carbón activado por 5 minutos con el fin de eliminar la mayor
cantidad de compuestos coloridos. Debido a que el jugo de caña obtenido después del
tratamiento aún presenta una coloración que no permite que se puedan realizar las
lecturas correspondientes en el espectrofotómetro utilizado, dicho jugo se diluye en
agua destilada grado cromatográfico en proporción 1:1 y se deja tapada para evitar su
rápida oxidación.
4.5. Curvas de calibración de MS, MA, MITC, DMTU y MTU
Metanol. Los estándares de MS, DMTU y MTU se pesaron en una balanza
analítica ATN21 Comparator y se disolvieron en metanol para tener una solución
madre de 10ppm. Para el estándar de MA se tomó un volumen de 5mL con
pipeta volumétrica y se disolvió en metanol para tener una solución madre de
1.44M. En el caso del MITC se tomó una ampolleta de 1mL 100μg mL-1 y se
disolvió en metanol para tener una solución madre de 2mg L-1.
Agua. Las curvas de calibración en agua sin modificar el pH (agua pH=6.8) se
elabora a partir de las soluciones madre de MS, MA, MITC, DMTU y MTU, las
cuales se utilizaron para realizar las 10 diferentes diluciones (MS: 0.056 a
0.52mg L-1, MA: 0.03 a 1.44M, MITC: 0.02 a 2mg L-1, DMTU: 0.02 a 5.4mg L-1 y
MTU: 0.02 a 1.43mg L-1) de las curvas de calibración. Para la curvas de
Segunda Parte II-3: Capítulo 4. Metodología
316
calibración a pH= 7, es necesario ajustar con NH4OH 0.01 M, mientras que para
la curva de calibración a pH= 4.5, el pH es ajustado con H3PO4 0.01 M,
realizando las diluciones en el mismo intervalo que las curvas de pH sin
modificar. Los patrones elaborados para el estudio de los analitos sometidos a
oscuridad se guardaron en frascos ámbar y envueltos en papel aluminio mientras
que los patrones sometidos a luz se guardaron en frascos transparentes.
Jugo de caña. Debido a la interferencia de compuestos coloridos en la lectura
de las diluciones en el espectrofotómetro, el jugo es diluido en una proporción de
1:1 con agua destilada grado cromatográfico, posteriormente se elabora la
solución madre de MS, DMTU y MTU en jugo de caña con una concentración de
10 mg L-1, la solución madre de MA a una concentración de 1.44M y la de MITC
a una concentración de 2 mg L-1. Se realizan 10 diluciones consecutivas (MS:
0.056 a 0.52mg L-1, MA: 0.03 a 1.44M, MITC: 0.02 a 2mg L-1, DMTU: 0.02 a
5.4mg L-1 y MTU: 0.02 a 1.43mg L-1) para la elaboración de las curvas de
calibración. Los patrones elaborados para el estudio de los analitos sometidos a
oscuridad se guardaron en frascos ámbar y envueltos en papel aluminio mientras
que los patrones sometidos a luz se guardaron en frascos transparentes.
4.6. Fotodescomposición de MS, MA, MITC, DMTU y MTU
Los experimentos para la evaluación de la fotodescomposición se realizaron en un
reactor UV Pyrex de 500mL (Fig. 24) equipado con una lámpara de aditivos metálicos
de 400W marca Sylvania 400 Metalarc M59R, que emite luz principalmente en la región
visible y en el ultravioleta del espectro electromagnético. El reactor está equipado con
un ventilador como sistema de enfriamiento, una parrilla de agitación, mientras la
muestra en estudio es agitada magnéticamente durante la iluminación (Menéndez,
2004), se tomaron muestras del reactor para ser leídas en el espectrofotómetro cada 2
minutos durante 12 minutos.
Segunda Parte II-3: Capítulo 4. Metodología
317
Fig. 24. Sistema de fotodescomposición de las muestras
4.7. Análisis estadísticos
El análisis estadístico de los resultados obtenidos se realizó mediante un análisis de
varianza conocido como ANOVA. Para cada uno de los experimentos se hizo un
estudio de ANOVA multifactorial ya que, está diseñado para construir un modelo
estadístico describiendo el impacto de dos o más factores categóricos o numéricos “xj”
de una variable dependiente “y” (Statgraphics, 2011). Se realizaron las pruebas para
determinar si hay o no diferencias significativas entre las medias a diferentes niveles de
los factores y si hay o no interacciones entre los factores mediante el software
MiniTab17.
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
318
5.1. Identificación y cuantificación del plaguicida
Utilizando las condiciones de operación establecidas por para espectrofotometría (Pino
y Pérez, 1983), en esta investigación se realizaron diferentes barridos entre 190 y
300nm logrando determinar la longitud de onda de máxima absorción para cada uno de
los compuestos estudiados. Los espectros de absorción se muestran en el Anexo 2, las
longitudes de onda máximas de absorción fueron para el MS de 190nm (Fig. A2.1 y Fig.
A2.2), MA de 200nm (Fig. A2.3 y Fig. A2.4), MITC de 197nm (Fig. A2.5 y Fig. A2.6),
DMTU de 199nm (Fig. A2.7 y Fig. A2.8) y MTU de 200nm (Fig. A2.9 y Fig. A2.10). El
MS por fotodescomposición dará origen a los productos de degradación MA, MITC,
DMTU y MTU.
5.2. Curvas de calibración
Las curvas de calibración de MS, MA, MITC, DMTU y MTU fueron elaboradas de
acuerdo con las diferentes condiciones de pH y fotólisis planteadas en el diseño
experimental para las matrices agua y jugo de caña, estas son tomadas en cuenta para
la cuantificación de la cantidad del compuesto de interés durante la degradación bajo
los parámetros establecidos en el punto 4.2 (Fig. 25).
Fig. 25. Parámetros del diseño experimental
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
319
Inicialmente el experimento no fue reproducible puesto que a partir de las
concentraciones planteadas (0 a 10mgL-1), daban como resultado curvas irregulares en
las que se podían observar algunas mesetas, lo que no permitió analizar un
comportamiento lineal y en consecuencia se realizaron más diluciones en un rango de
concentraciones más corto, lo anterior con el propósito de que las ecuaciones obtenidas
por el método gráfico tuvieran coeficientes de correlación lo más cercano a 1. En el
Anexo 3 se presentan las curvas de calibración a pH 4.5 en las condiciones de fotólisis
respectivas para MS (Fig. A3.1 y Fig. A3.2), MA (Fig. A3.3 y Fig. A3.4), MITC (Fig. A3.5
y Fig. A3.6), DMTU (Fig. A3.7 y Fig. A3.8) y MTU (Fig. A3.9 y Fig. A3.10); también para
el caso de pH 7 MS (Fig. A3.11 y Fig. A3.12), MA (Fig. A3.13 y Fig. A3.14), MITC (Fig.
A3.15 y Fig. A3.16), DMTU (Fig. A3.17 y Fig. A3.18) y MTU (Fig. A3.19 y Fig. A3.20); en
pH sin modificar MS (Fig. A3.21 y Fig. A3.22), MA (Fig. A3.23 y Fig. A3.24), MITC (Fig.
A3.25 y Fig. A3.26), DMTU (Fig. A3.27 y Fig. A3.28) y MTU (Fig. A3.29 y Fig. A3.30);
así como las curvas de calibración elaboradas en la muestra real de jugo de caña MS
(Fig. A3.31 y Fig. A3.32), MA (Fig. A3.33 y Fig. A3.34), MITC (Fig. A3.35y Fig. A3.36),
DMTU (Fig. A3.37 y Fig. A3.38) y MTU (Fig. A3.39 y Fig. A3.40). Los resultados
obtenidos se resumen en las siguientes tablas para cada uno de los analitos en estudio
MS (Tabla 19), MA (Tabla 20), MITC (Tabla 21), DMTU (Tabla 22) y MTU (Tabla 23); en
donde se puede observar que algunos de los coeficientes de correlación muestran ser
menores a 0.99.
Tabla 19. Curvas de calibración de MS bajo las diferentes condiciones experimentales
MATRIZ
AGUA JUGO DE CAÑA FOTÓLISIS pH (m) (b) (R2) (m) (b) (R2)
Sin modificar 3.4476 0.0496 0.9724 0.3808 0.0199 0.9716 4.5 3.5742 0.2594 0.9614
Luz
7 1.1047 0.1559 0.9896 Sin modificar 3.2099 0.0563 0.9768 1.1535 0.124 0.9215
4.5 4.2399 0.1419 0.971
MS
Oscuridad
7 0.72 0.2572 0.9621
m: pendiente; b: ordenada al origen; R2: coeficiente de correlación
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
320
Tabla 20. Curvas de calibración de MA bajo las diferentes condiciones experimentales
MATRIZ AGUA JUGO DE CAÑA
FOTÓLISIS pH (m) (b) (R2) (m) (b) (R2) Sin modificar 2.0183 0.1907 0.9572 0.2283 0.0181 0.9758
4.5 0.6746 0.0868 0.9722 Luz
7 0.6737 0.1084 0.9551 Sin modificar 2.3991 0.1018 0.9912 0.8473 -0.0042 0.9933
4.5 0.0.8036 0.0355 0.9813
MA
Oscuridad
7 0.7301 0.09 0.9788 m: pendiente; b: ordenada al origen; R2: coeficiente de correlación
Tabla 21. Curvas de calibración de MITC bajo las diferentes condiciones experimentales
MATRIZ
AGUA JUGO DE CAÑA FOTÓLISIS pH (m) (b) (R2) (m) (b) (R2)
Sin modificar 0.4918 0.0192 0.9967 0.2932 0.0433 0.9739 4.5 0.7363 0.0613 0.9861
Luz
7 0.8796 0.088 0.994 Sin modificar 1.269 -0.0483 0.9896 0.1838 0.0063 0.9988
4.5 1.346 0.0941 0.9927
MITC
Oscuridad
7 1.2235 0.0627 0.9856 m: pendiente; b: ordenada al origen; R2: coeficiente de correlación
Tabla 22. Curvas de calibración de DMTU bajo las diferentes condiciones experimentales
MATRIZ AGUA JUGO DE CAÑA
FOTÓLISIS pH (m) (b) (R2) (m) (b) (R2) Sin modificar 0.24 0.1433 0.9671 0.0746 0.0128 0.9741
4.5 0.7331 0.2443 0.9678 Luz
7 0.6544 0.1035 0.9958 Sin modificar 0.3982 0.21 0.9552 0.4137 0.0296 0.9926
4.5 0.6814 0.329 0.9741
DMTU
Oscuridad
7 0.5827 0.2458 0.9648 m: pendiente; b: ordenada al origen; R2: coeficiente de correlación
Sin embargo, tomando en cuenta que para la elaboración de las curvas de calibración
no hubo una buena reproducibilidad cuando se usaban valores de concentración más
distantes por las mesetas e irregularidades. Esto evitó un análisis lineal, decidiendo
que, de esta manera, eran las mejores condiciones conseguidas para proseguir con el
experimento, puesto que los resultados con las segundas concentraciones que se
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
321
usaron mostraron una mejor linealidad y se continuó con el análisis de cada uno de
ellos.
Tabla 23. Curvas de calibración de MTU bajo las diferentes condiciones experimentales MATRIZ
AGUA JUGO DE CAÑA FOTÓLISIS pH (m) (b) (R2) (m) (b) (R2)
Sin modificar 1.4802 0.0186 0.9912 0.672 0.0468 0.99 4.5 1.6074 0.1233 0.9854
Luz
7 1.8177 0.404 0.9674 Sin modificar 1.6067 0.0631 0.98 0.8884 0.0271 0.9908
4.5 1.3706 0.2443 0.976
MTU
Oscuridad
7 0.9623 0.09 0.9833 m: pendiente; b: ordenada al origen; R2: coeficiente de correlación
Los resultados obtenidos de las curvas de calibración podrán aportar información no
sólo de la presencia de MS en muestras de jugo de caña sino que también, a medida
que se pudiera observar una menor concentración del plaguicida en la muestra de
interés, ayudaría a determinar si se está degradando para dar subproductos como son
MA, MIT, DMTU y MTU.
5.3. Fotodescomposición
En la matriz de agua y de jugo de caña se adiciona el compuesto de interés (MS, MA,
MITC, DMTU o MTU) en una concentración conocida y se somete a los diferentes
valores de pH en el equipo descrito en el punto 4.6.
La solución en estudio se retiraba y analizaba cada 2min durante 12 min en un
espectrofotómetro a la longitud de onda correspondiente a cada analito mencionadas
en el punto 5.1.
La absorbancia medida se cuantificó mediante las curvas de calibración para agua y
jugo de caña obtenidos en el punto 5.2, determinando la concentración de cada
muestra.
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
322
5.3.1. Fotodescomposición en agua
Las curvas de degradación de los distintos analitos bajo las condiciones de fotólisis, pH,
tiempo y matriz calculados a partir de las curvas de calibración de cada uno de ellos se
muestran en el Anexo 4. El orden de reacción para cada una de las reacciones se
determinó de acuerdo al modelo que mejor se ajustaron (orden cero, uno o dos), con
base al valor del índice de correlación resultante y que fuera lo más cercano a uno.
La cinética de degradación del MS demostró ser de orden cero ([Ci]=[C0]-kt), lo que
indica que su rapidez de degradación fue independiente de la concentración y se vio
afectada principalmente por los factores a los que fue expuesto como fueron fotólisis,
pH, tiempo y matriz. Al graficar la concentración (Ci), contra el tiempo que se presenta y
aplicando un análisis de regresión lineal se obtuvieron las pendientes respectivas a
cada gráfica que son equivalentes a la constante de la velocidad de degradación del
MS (k) presente en la matriz.
Con la constante cinética de degradación, se calculó el tiempo que se necesita para
degradar el 50% de los compuestos de interés y así obtener lo que se conoce como
tiempo de vida media (t1/2).
Las concentraciones de las curvas de degradación se muestran en el Anexo 4 y están
calculadas a partir de los datos obtenidos de las curvas de calibración para MS en
donde se analizó la condición de fotólisis para diferentes valores de pH: 4.5 (Fig. A4.1),
7 (Fig. A4.2), sin modificar (Fig. A4.3); los datos de la cinética de degradación de MS
bajo las combinaciones de los diferentes factores se muestran en la Tabla 24.
Después de los 12 minutos en que se llevaron a cabo cada una de las reacciones de
degradación, el MS tuvo un mayor porcentaje de degradación a partir de una
concentración inicial de 0.04 mgL-1 bajo las condiciones de luz y pH sin modificar de
97.47%, con un tiempo de vida media de 2.6 horas, menos de la mitad de tiempo si se
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
323
compara por ejemplo con el caso de condiciones de oscuridad y pH 7 donde el tiempo
de vida media fue de 9.1 horas. Lo anterior indica que hay un efecto importante de la
exposición del MS a la luz sin ser una condición fundamental el ascenso o descenso de
pH del agua.
Tabla 24. Cinética de degradación del MS en agua
Condiciones experimentales
Cinética de degradación Experimento
Fotólisis Co
(mg/L)pH %
Degradación k0
(mg/Lmin) t1/2
(min) t1/2
(h) 1 0.052 4.5 94.81 0.0027 426.3 7.1 2 0.051 7 82.65 0.0079 146.3 2.4 3
Luz
0.049 --- 97.47 0.0074 156.2 2.6 4 0.052 4.5 94.68 0.0023 500.4 8.3 5 0.049 7 74.78 0.0021 550.5 9.1 6
Oscuridad
0.051 --- 96.82 0.0079 146.3 2.4 Co: Concentración inicial; k0: Rapidez de degradación de orden cero; t1/2: Tiempo de vida media;
min: minutos; h: hora
Para la MA la cinética de degradación (Tabla 25), mostró ser de orden cero en las
condiciones de pH 4.5 (Fig. A4.4) y sin modificar (Fig. A4.6).
Tabla 25. Cinética de degradación de la MA en agua
Condiciones experimentales
Cinética de degradación Ex perimento
Fotólisis Co
(Molar) pH %
Degradación k0
(mol/Lmin) k2
(L/molmin) t1/2
(min) t1/2
(h)
1 1.55 4.5 4.72 0.0048 161.45 2.69 2 1.55 7 15.35 0.006 107.52 1.79 3
Luz
0.55 --- 12.15 0.0017 161.76 2.7 4 1.55 4.5 15.90 0.004 193.75 3.22 5 1.55 7 20.29 0.0063 102.40 1.70 6
Oscuridad
0.55 --- 19.36 0.0014 196.42 3.3 Co: Concentración inicial; k0: Rapidez de degradación de orden cero; k2: Rapidez de degradación de orden
dos; t1/2: Tiempo de vida media; min: minutos; h: hora
Sin embargo, las reacciones llevadas a cabo en pH 7 (Fig. A4.5) tuvieron una cinética
de degradación de segundo orden (1/[C]t = kt– 1/[C]0). Esto puede deberse a que la
reacción se lleva a cabo más rápido en comparación con las reacciones anteriores que
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
324
dependen de la concentración inicial de la MA y que probablemente debido a sus
respectivas condiciones, en el medio de reacción se estén formando otros subproductos
nitrosos de la degradación de la metilamina como es el caso de las nitrosaminas.
De acuerdo con los resultados experimentales obtenidos, la degradación de MA al
transcurrir los 12 minutos de la reacción se determinó que tuvo un mayor porcentaje de
degradación siendo de 20.29% bajo las condiciones de oscuridad y pH 7 con un tiempo
de vida media de 1.7 horas a partir de una reacción de segundo orden.
Lo anterior se debió a que dicha reacción mediante el método gráfico demostró tener el
índice de correlación más cercano a uno. La degradación de MA parece que no está
fuertemente determinada por el factor luz, siendo entonces la variación de pH el factor
de mayor influencia.
Para el caso del MITC la cinética de degradación (Tabla 26), mostró de ser de segundo
orden en las condiciones de pH 4.5 (Fig. A4.7) y de orden cero en las condiciones de
pH 7 (Fig. A4.8) sin modificar (Fig. A4.9).
Tabla 26. Cinética de degradación del MITC en agua
Co: Concentración inicial; k0: Rapidez de degradación de orden cero; k2: Rapidez de degradación de orden dos; t1/2: Tiempo de vida media; min: minutos; h: hora
El MITC según la ficha técnica consultada por sus características fisicoquímicas, al ser
un compuesto altamente volátil, sensible a cualquier cambio de pH y altamente
susceptible a descomponerse al ser expuesto a la luz, se degradó mucho más
Condiciones experimentales
Cinética de degradación Experimento
Fotólisis Co
(mg/L) pH %
Degradaciónk0
(mg/Lmin)k2
(L/mgmi) t1/2 (mi)
1 0.4 4.5 47.82 0.232 10.77 2 0.4 7 84.32 0.0037 54.05 3
Luz
0.4 --- 32.5 0.0057 35.08 4 0.4 4.5 77.55 0.6103 4.09 5 0.4 7 99.75 0.0027 74.07 6
Oscuridad
0.4 --- 60.3 0.0022 90.90
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
325
rápidamente que los compuestos anteriores. La reacción de segundo orden llevada a
cabo a pH 4.5 y oscuridad, produjo un mayor porcentaje de degradación de 77.55%,
teniendo como resultado que el tiempo de vida media para este compuesto es de 4.09
minutos. En este caso particular a medida que la reacción fue llevada a cabo
transcurriendo aproximadamente 8 minutos no se observó un cambio en la
absorbancia.
El MITC pudo haber sido degradado en su totalidad después de los 12 minutos que se
plantean en el diseño experimental. Este subproducto del MS al tener la principal
actividad biológica contra Leuconostoc mesenteroides, se estima que tiene un lapso de
actividad relativamente rápido y que al finalizar el proceso de la obtención de azúcar de
caña, por su sensibilidad a las condiciones ambientales a las que se trabaja, no se
encuentra presente en el producto final.
En las condiciones de pH 4.5 (Fig. A4.10) y sin modificar (Fig. A4.12) las reacciones de
fotodescomposición de la DMTU mostraron ser de orden cero, mientras que la reacción
llevada a cabo en pH 7 fue de orden dos (Fig. A4.11).
Los datos experimentales de la cinética de degradación de la DMTU (Tabla 27) se
obtuvieron a partir de trabajar con la misma concentración inicial del analito.
Tabla 27. Cinética de degradación de la DMTU en agua
Condiciones experimentales
Cinética de degradación Experimento
Fotólisis Co
(mg/L) pH %
Degradaciónk0 (mg/Lmin)
k2
(L/mgmin) t1/2
(min) t1/2
(h) 1 4.68 4.5 75.03 0.0045 520 8.66 2 4.68 7 63.41 0.0041 52.11 0.86 3
Luz
4.68 --- 20.3 0.0019 1231.57 20.524 4.68 4.5 75.79 0.0048 487.5 8.12 5 4.68 7 64.13 0.0035 61.05 1.01 6
Oscuridad
4.68 --- 42.1 0.0036 650 10.83Co: Concentración inicial; k0: Rapidez de degradación de orden cero; k2: Rapidez de degradación de orden
dos; t1/2: Tiempo de vida media; min: minutos; h: hora
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
326
Como se puede observar únicamente la reacción llevada a cabo en pH 7 es
dependiente de la concentración. Para el caso de la DMTU su degradación muestra
estar más influenciada bajo las condiciones de pH 7 y luz, con un porcentaje de
degradación de 63.41%, un tiempo de vida media de 0.86h como resultado de una
reacción de segundo orden.
De acuerdo con lo mencionado anteriormente, la DMTU es un subproducto de la
descomposición del MITC, el cual como se mostró anteriormente tiene un tiempo de
vida media muy corto, por lo tanto la DMTU podría generarse rápidamente sin embargo
sus características fisicoquímicas no la hacen susceptible a los mismos factores que
influyeron en la degradación que el compuesto del que proviene.
La degradación de la MTU fue de orden cero para el caso de las reacciones a pH 7
(Fig. A4.14) y pH sin modificar (Fig. A4.15), la reacción a pH 4.5 (Fig. A4.13) fue de
segundo orden. La cinética de degradación como se muestra en la Tabla 28 tiene una
diferencia importante entre las reacciones de orden cero comparadas con las
reacciones de segundo orden.
Tabla 28. Cinética de degradación de MTU en agua
Condiciones experimentales
Cinética de degradación Experimento
Fotólisis Co
(mg/L) pH %
Degradación k0
(mg/Lmin) k2
(L/molmi) t1/2
(min) t1/2 (h)
1 5.16 4.5 93.17 0.0327 5.92 0.09 2 5.16 7 97.85 0.0041 629.2 10.4 3
Luz
5.16 --- 91.36 0.0027 955.5 15.9 4 5.16 4.5 93.82 0.032 6.05 0.1 5 5.16 7 89.62 0.0077 335.0 5.58 6
Oscuridad
5.16 --- 92.58 0.0027 955.5 15.9 Co: Concentración inicial; k0: Rapidez de degradación de orden cero; k2: Rapidez de degradación de orden
dos; t1/2: Tiempo de vida media; min: minutos; h: hora
Si se tomaba en cuenta que las reacciones en pH 4.5 obedecían una cinética de orden
cero tenían un resultado más cercano y parecido al resto de las demás reacciones. Sin
embargo, se decidió tomar en cuenta que a pH 4.5 fue de segundo orden porque el
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
327
índice de correlación mostró ser más cercano a uno en el método gráfico comparado
con el orden cero para las mismas reacciones.
Los resultados muestran que la reacción a pH 4.5 y en exposición a luz provoca una
mayor degradación de la MTU siendo esta descomposición del 93.17%, considerando
como se mencionó anteriormente que dicha reacción es de segundo orden y el tiempo
de vida media de la MTU entonces fue de 0.09h. Esto explica que la degradación del
analito en estudio se puede llevar a cabo con mayor facilidad a valores de pH bajos. Al
igual que la DMTU, aunque ambas son subproductos del MITC, ninguna muestra estar
directamente influenciada por los factores que determinaron la degradación de la
sustancia de la que provienen.
5.3.2. Fotodescomposición en jugo de caña
Las curvas de degradación elaboradas en la matriz jugo de caña se muestran en el
también en el Anexo 4, de acuerdo al diseño experimental planteado, estas reacciones
se trabajaron con el pH propio del jugo de caña que fue de aproximadamente 5.3 y sólo
fueron sometidas a la condición de fotólisis (luz u oscuridad).
Al igual que las reacciones de degradación en agua, la degradación del MS en jugo de
caña también demostró ser de orden cero (Fig. A4.16) en las condiciones de luz y
oscuridad. La cinética de degradación bajo las condiciones antes mencionadas en la
matriz de jugo de caña se muestra en la Tabla 29. En el caso de la degradación del MS
en la muestra de jugo de caña como se puede observar su degradación fue mayor bajo
condiciones de oscuridad, con un tiempo de vida media de 4.77 horas. Para el caso de
la exposición a la luz el tiempo de vida media fue de 1.57 horas, lo que indica que el MS
al igual que en agua da una mayor degradación bajo condiciones de luz. Dado que en
este caso, al jugo de caña no se le modificó el pH, se puede inferir que no
necesariamente juega un papel importante en la degradación del plaguicida. Entonces,
cualquiera que pudiera ser el valor de pH la reacción va a estar favorecida y se
presenta una degradación.
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
328
Tabla 29. Cinética de degradación del MS en jugo de caña Condiciones
experimentales Cinética de degradación Experimento
Fotólisis Co
(mg/L) %
Degradación k0
(mg/Lmin) t1/2
(min) t1/2
(h) 1 Luz 98.18 0.013 94.79 1.57 2 Oscuridad
11.76 99.85 0.0043 286.59 4.77
Co: Concentración inicial; k0: Rapidez de degradación de orden cero; t1/2: Tiempo de vida media; min: minutos; h: hora
Para la MA ambas condiciones de luz y oscuridad (Fig. A4.17), las reacciones
resultaron ser de segundo orden como se muestra en la Tabla 30.
Tabla 30. Cinética de degradación de la MA en jugo de caña Condiciones
experimentales Cinética de degradación Experimento
Fotólisis Co
(Molar) %
Degradación k2
(mg/Lmin) t1/2
(min) t1/2
(h) 1 Luz 7.23 0.0057 122.68 2.04 2 Oscuridad
1.43 14.48 0.0062 112.79 1.87
Co: Concentración inicial; k2: Rapidez de degradación de orden dos; t1/2: Tiempo de vida media; min: minutos; h: hora
Para MITC el orden de reacción en luz y oscuridad fue de orden cero (Fig. A4.18) como
se muestra en la Tabla 31.
Tabla 31. Cinética de degradación del MITC en jugo de caña Condiciones experimentales Cinética de degradación Experimento
Fotólisis Co
(mg/L) %
Degradaciónk0
(mg/Lmin) t1/2
(min)1 Luz 71.46 0.0559 8.94 2 Oscuridad
1 34.34 0.0892 5.61
Co: Concentración inicial; k0: Rapidez de degradación de orden cero; t1/2: Tiempo de vida media; min: minutos; h: hora
La degradación de la MA fue mayormente influenciada por la condición de oscuridad
siendo de 14.48% el porcentaje de degradación de la misma, con un tiempo de vida
media de 1.87h siendo un poco mayor que en el caso de la matriz agua. Lo anterior
puede deberse que la MA puede reaccionar con los glucósidos presentes en el jugo de
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
329
caña y generar compuestos característicos de las reacciones de Maillard siendo
importante la generación de melanoidinas, mientras que en agua no hay algún otro
posible sustrato con el cual pueda reaccionar.
El MITC tuvo un mayor porcentaje de degradación en la condición de luz 71.46%, como
la reacción resultó ser de orden cero, quiere decir que al menos en la matriz jugo de
caña la degradación no depende de la concentración inicial y su tiempo de vida media
resultó ser de 8.94min. Como se puede notar el MITC por sus características
fisicoquímicas vuelve a mostrar que se degrada muy rápido comparado con el resto de
las analitos en estudio. En jugo de caña la DMTU tuvo una reacción de segundo orden
para ambos casos: luz y oscuridad (Fig. A4.19). Como se muestra en la Tabla 32 la
velocidad de degradación de la DMTU depende de la concentración inicial del analito.
Tabla 32. Cinética de degradación de la DMTU en jugo de caña Condiciones experimentales Cinética de degradación Experimento
Fotólisis Co
(mg/L) % Degradación k2
(mg/Lmin) t1/2 (min) t1/2 (h)
1 Luz 60.59 0.0255 34.39 0.57 2 Oscuridad
1.14 10.78 0.0116 72.62 1.21
Co: Concentración inicial; k2: Rapidez de degradación de orden dos; t1/2: Tiempo de vida media; min: minutos; h: hora
Se encontró entonces que, bajo el factor luz, el porcentaje de degradación es mayor
para DMTU siendo de 60.59% y un tiempo de vida media. La diferencia, como se puede
notar en todas las reacciones llevadas a cabo en jugo de caña, es que existe una mayor
concentración de reactivos en el medio de reacción, posiblemente k en esta situación
podría variar dependiendo de la superficie de contacto de los analitos con los solutos
que se encuentran en el jugo de caña.
Para la MTU ambas condiciones de luz y oscuridad (Fig. A4.20), las reacciones
resultaron ser de segundo orden como se muestra en la Tabla 33. La degradación de
MTU fue mayor en la condición de oscuridad que fue de 79.47% con una constante de
degradación de segundo orden y a partir de esta se encontró que el tiempo de vida
media bajo estas condiciones para la MTU es de 6.41min.
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
330
Tabla 33. Cinética de degradación de la MTU en jugo de caña Condiciones experimentales Cinética de degradación Experimento
Fotólisis Co
(mg/L) %
Degradaciónk2
(mg/Lmin) t1/2
(min)1 Luz 14.33 0.0266 65.952 Oscuridad
0.57 79.47 0.2733 6.41
Co: Concentración inicial; k2: Rapidez de degradación de orden dos; t1/2: Tiempo de vida media; min: minutos; h: hora
En esta y reacciones anteriores respecto de la diferencia entre la velocidad de
degradación bajo los distintos factores también puede estar determinada por la energía
mínima para que dichas reacciones ocurran. Ésta es conocida como energía de
activación.
Por lo tanto, a pesar de que se trate del mismo reactivo las condiciones de reacción
pueden dar lugar a una reacción exotérmica o endotérmica y, así, dichas reacciones
pueden tener distintas energías de activación que afectarán en el tiempo del transcurso
de la degradación.
Las posibilidades entonces, de que el MS y sus subproductos de degradación se
encuentren presentes en los subproductos del jugo de caña (miel, cachaza, melaza,
etc.) se ven reducidas considerando que a nivel industrial las condiciones de trabajo
son más severas.
5.4. Análisis estadístico
Con el propósito de analizar los factores que tuvieron mayor efecto en la degradación
de cada uno de los analitos estudiados (MS, MA, MITC, DMTU Y MTU), se realizó un
análisis de variaza o andeva (ANOVA), se tomaron como principales fuentes de
variación: fotólisis, pH y tiempo. Se indicó que son significativamente diferentes de cero
al 95% de nivel de confianza.
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
331
En el caso del MS los siguientes factores tienen un aporte significativo sobre la
degradación como se muestra en la Tabla 34.
Tabla 34. Análisis de varianza de la degradación de MS en agua
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor pModelo 6 1386.63 231.106 36.43 0.000 Lineal 3 1146.68 382.225 60.25 0.000 Fotólisis 1 0.67 0.670 0.11 0.748 pH 1 547.96 547.960 86.38 0.000 Tiempo 1 598.05 598.046 94.27 0.000 Interacción de 2 factores 3 330.27 110.092 17.35 0.000 Fotólisis*pH 1 0.87 0.866 0.14 0.714 Fotólisis*Tiempo 1 0.27 0.273 0.04 0.837 pH*Tiempo 1 329.14 329.136 51.88 0.000 Error 29 183.97 6.344
De acuerdo con el valor “p” fijado se puede observar que pH y tiempo tienen un valor
menor a 0.05 y por lo tanto se rechaza la hipótesis nula de que dichos factores no
tienen efecto en la degradación del MS, así como la interacción entre ellos y por lo tanto
son los que influyen mayormente en la degradación del analito. El efecto del pH tiene
relevancia pues como se mencionó anteriormente para el caso del MS, de esto
depende la formación y proporción de los principales productos de degradación que se
obtendrán, además como se pudo observar en la experimentación, el tiempo de vida
media en condiciones ácidas fue más rápido, lo que indica que en estas condiciones el
MS y su reacción de degradación tiene una energía de activación menor y por lo tanto
rápidamente se formarán productos como el MITC, MA y disulfuro de carbono.
Para el caso de la degradación en jugo de caña (Tabla 35) como se trataba de la
muestra problema, no se le modificó el pH y en este caso los factores evaluados fueron
el efecto de la presencia o ausencia de luz y el tiempo. De acuerdo con esta tabla, el
efecto del factor tiempo (p=0.025) demuestra que la hipótesis nula se rechaza al
obtenerse que dicho factor si influye en la degradación del MS en la matriz de jugo de
caña.
El análisis de varianza para la MA se presenta en la Tabla 36, de acuerdo con el diseño
experimental en la matriz agua aplicado a cada uno de los analitos estudiados.
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
332
Tabla 35. Análisis de varianza de la degradación de MS en jugo de caña
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor pModelo 3 4119.17 1373.06 2.62 0.123 Lineal 2 4118.49 2059.25 3.93 0.065 Fotólisis 1 128.88 128.88 0.25 0.633 Tiempo 1 3989.61 3989.61 7.62 0.025 Interacción de 2 factores 1 0.68 0.68 0.00 0.972 Fotólisis*Tiempo 1 0.68 0.68 0.00 0.972 Error 8 4189.15 523.64 Total 11 8308.32
Tabla 36. Análisis de varianza de la degradación de MA en agua
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor pModelo 6 116.708 19.4513 4.90 0.001 Lineal 3 92.464 30.8213 7.77 0.001 Fotólisis 1 6.093 6.0932 1.54 0.225 pH 1 5.680 5.6804 1.43 0.241 Tiempo 1 80.690 80.6902 20.34 0.000 Interacción de 2 factores 3 17.100 5.7000 1.44 0.252 Fotólisis*pH 1 5.432 5.4322 1.37 0.251 Fotólisis*Tiempo 1 0.025 0.0252 0.01 0.937 pH*Tiempo 1 11.643 11.6427 2.93 0.097 Error 29 115.063 3.9677 Total 35 231.771
Aunque los resultados experimentales para la degradación de MA demuestran una
diferencia en cada una de las reacciones llevadas a cabo, el análisis estadístico
muestra que el factor tiempo es el que principalmente influye en la degradación de la
MA.
Esto puede ser por el estado físico de los reactivos ya que entre más homogéneos se
encuentren el tiempo de la reacción será menor y la concentración del reactivo tendrá
menos efecto porque al aumentar la concentración aumentan los choques entre las
moléculas y, por lo tanto, la velocidad y tiempo en que se lleva a cabo la reacción será
mayor. A continuación se muestra el análisis estadístico para la MA en la matriz jugo de
caña (Tabla 37), de acuerdo con el diseño experimental en la matriz problema los
factores que se evaluaron fueron fotólisis y tiempo. Al igual que la evaluación en la
matriz agua, en el jugo de caña el factor de mayor influencia para la degradación de MA
es el tiempo.
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
333
Tabla 37. Análisis de varianza de la degradación de MA en jugo de caña
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor pModelo 3 83.6648 27.8883 21.87 0.000 Lineal 2 83.6642 41.8321 32.80 0.000 Fotólisis 1 4.4292 4.4292 3.47 0.099 Tiempo 1 79.2350 79.2350 62.13 0.000 Interacción de 2 factores 1 0.0005 0.0005 0.00 0.984 Fotólisis*Tiempo 1 0.0005 0.0005 0.00 0.984 Error 8 10.2032 1.2754 Total 11 93.8679
En la Tabla 38 se presenta el análisis de varianza (ANOVA, en inglés) del MITC en la
matriz agua.
Tabla 38. Análisis de varianza de la degradación de MITC en agua
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor pModelo 6 3479.15 579.86 407.09 0.000 Lineal 3 3393.66 1131.22 794.18 0.000 Fotólisis 1 606.05 606.05 425.48 0.000 pH 1 2711.24 2711.24 1903.44 0.000 Tiempo 1 76.37 76.37 53.62 0.000 Interacción de 2 factores 3 143.22 47.74 33.52 0.000 Fotólisis*pH 1 133.83 133.83 93.95 0.000 Fotólisis*Tiempo 1 7.77 7.77 5.46 0.027 pH*Tiempo 1 1.62 1.62 1.14 0.294 Error 29 41.31 1.42 Total 35 3520.46
Para el MITC se obtuvo que los tres factores tienen una influencia significativa en la
degradación del mismo, por lo tanto se rechaza la hipótesis nula de que dichos factores
no son importantes en la degradación de MITC, así como la interacción de los factores
fotólisis*pH. Esto da información de que, sin importar el pH al que se encuentre en
disolución el analito, éste se va a degradar a sus subproductos como son la DMTU y
MTU. Aquí se observa la diferencia de los resultados obtenidos para la degradación de
este mismo analito en la matriz de jugo de caña que se muestran en la Tabla 39.
El efecto fotólisis y tiempo de manera individual tienen una influencia significativa en la
degradación de MITC, no así con la interacción de los mismos factores de acuerdo a lo
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
334
que se muestra en la tabla anterior ya que el valor de “p” es mayor que la probabilidad
de 0.05 establecida.
Tabla 39. Análisis de varianza de la degradación de MITC en jugo de caña
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor pModelo 3 5427.37 1809.12 13.07 0.002 Lineal 2 5330.39 2665.19 19.26 0.001 Fotólisis 1 3486.59 3486.59 25.19 0.001 Tiempo 1 1843.80 1843.80 13.32 0.006 Interacción de 2 factores 1 96.99 96.99 0.70 0.427 Fotólisis*Tiempo 1 96.99 96.99 0.70 0.427 Error 8 1107.21 138.40 Total 11 6534.58
Para la DMTU el análisis estadístico de resultados obtenidos se muestran en la Tabla
40, donde se obtuvo que los factores fotólisis y pH tuvieron una influencia en su
degradación.
Tabla 40. Análisis de varianza de la degradación de DMTU en agua
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor pModelo 6 14675.6 2445.9 13.69 0.000 Lineal 3 12428.8 4142.9 23.19 0.000 Fotólisis 1 2233.4 2233.4 12.50 0.001 pH 1 10136.3 10136.3 56.73 0.000 Tiempo 1 59.1 59.1 0.33 0.570 Interacción de 2 factores 3 2760.9 920.3 5.15 0.006 Fotólisis*pH 1 2740.5 2740.5 15.34 0.001 Fotólisis*Tiempo 1 1.2 1.2 0.01 0.936 pH*Tiempo 1 19.2 19.2 0.11 0.745 Error 29 5181.7 178.7 Total 35 19857.3
Aunado a lo anterior, también la interacción de dichos factores fotólisis*pH tuvo
influencia, lo que quiere decir que ya sea bajo exposición o no a la luz de la DMTU, ésta
se puede degradar y el pH puede provocar un cambio de la energía cinética de las
moléculas lo que podría hacer alcanzar más rápidamente o no la energía de activación
que se ve reflejado en los resultados del tiempo de vida media la DMTU en la matriz
agua.
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
335
A diferencia del mismo analito estudiado en la matriz problema jugo de caña el factor
fotólisis y tiempo, así como su interacción fotólisis*tiempo tienen un efecto importante
en la degradación de la DMTU como se muestra en la Tabla 41.
Tabla 41. Análisis de varianza de la degradación de DMTU en jugo de caña
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor pModelo 3 8179.63 2726.54 3394.47 0.000 Lineal 2 8162.79 4081.40 5081.23 0.000 Fotólisis 1 8059.54 8059.54 10033.90 0.000 Tiempo 1 103.25 103.25 128.55 0.000 Interacción de 2 factores 1 16.84 16.84 20.96 0.002 Fotólisis*Tiempo 1 16.84 16.84 20.96 0.002 Error 8 6.43 0.80 Total 11 8186.05
En análisis de varianza para la MTU se muestra en la Tabla 42.
Tabla 42. Análisis de varianza de la degradación de MTU en agua
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor pModelo 6 306.81 51.135 0.79 0.588 Lineal 3 135.11 45.038 0.69 0.564 Fotólisis 1 67.48 67.482 1.04 0.317 pH 1 16.55 16.546 0.25 0.618 Tiempo 1 51.09 51.086 0.79 0.383 Interacción de 2 factores 3 142.75 47.582 0.73 0.541 Fotólisis*pH 1 138.77 138.770 2.13 0.155 Fotólisis*Tiempo 1 0.53 0.529 0.01 0.929 pH*Tiempo 1 3.45 3.447 0.05 0.819 Error 29 1885.28 65.010 Total 35 2192.09
De acuerdo con la tabla anterior se aceptaría la hipótesis nula de que los factores
fotólisis, pH y tiempo no influyen en la degradación de la MTU. Sin embargo, como se
obtuvo en la parte de resultados de la degradación de este analito, dichos factores si
provocaron la degradación del mismo, la diferencia es evidente a medida en que se
varía el pH de acuerdo con la Tabla 28. Por el contrario en la matriz jugo de caña los
factores fotólisis y tiempo se demuestra de acuerdo con la Tabla 43 que tienen una
influencia significativa para la degradación de MTU, sin embargo su interacción
Fotólisis*Tiempo no representa un factor de interés para la degradación del mismo.
Segunda Parte II-3: Capítulo 5. Resultados y discusión
336
Tabla 43. Análisis de varianza de la degradación de MTU en jugo de caña
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor pModelo 3 13468.8 4489.6 6191.88 0.000 Lineal 2 13465.4 6732.7 9285.48 0.000 Fotólisis 1 13288.7 13288.7 18327.26 0.000 Tiempo 1 176.7 176.7 243.69 0.000 Interacción de 2 factores 1 3.4 3.4 4.69 0.062 Fotólisis*Tiempo 1 3.4 3.4 4.69 0.062 Error 8 5.8 0.7 Total 11 13474.6
Segunda Parte II-3: Capítulo 6.1. Conclusiones
337
Se cumplió con el objetivo general de la presente investigación de evaluar la velocidad
de fotodescomposición del MS y sus subproductos de degradación como fueron MA,
MITC, DMTU y MTU, bajo diferentes condiciones de pH, fotólisis y matriz acuosa (agua
y jugo de caña), considerando que las condiciones establecidas en el laboratorio
asemejan lo que ocurre a nivel industrial en la producción de azúcar.
Se logró obtener resultados de los objetivos particulares sobre conocer a profundidad la
técnica analítica de espectrofotometría y sus aplicaciones para la cuantificación de la
concentración de un analito, determinar la longitud máxima de absorción de MS, MA,
MITC, DMTU y MTU en la región del UV-Visible del espectro electromagnético mediante
la técnica analítica de espectrofotometría e identificar a los factores que contribuyen en
mayor proporción con la degradación de los mismos, determinar los parámetros de la
cinética química de los analitos estudiados en las matrices y condiciones estudiadas.
Para la hipótesis planteada por la que el factor luz, pH, matriz y tiempo no produce
efectos de degradación sobre el metam de sodio (MS) por lo que no se forman los
productos metilamina (MA), metilisotiocianato (MITC), metiltiourea (MTU) y
dimetiltiourea (DMTU), se tienen las siguientes conclusiones:
Se evaluó la degradación del metam de sodio bajo las condiciones de pH (4.5, 7
y sin modificar), fotólisis (luz y oscuridad), tiempo (0-12min) donde los factores de
mayor importancia fueron pH y tiempo en la matriz agua y el factor tiempo para la
matriz jugo de caña.
El factor de mayor importancia en la degradación de MA en la matriz agua y jugo
de caña fue el tiempo.
Para la MA el factor tiempo tiene la mayor influencia en la degradación de MA,
éste factor también tiene la misma consecuencia en la matriz jugo de caña.
En la degradación de MITC los tres factores pH, fotólisis y tiempo, así como la
interacción fotólisis*pH tienen mayor influencia en esta reacción en la matriz
agua, en la matriz jugo de caña los factores fotólisis y tiempo tienen influencia
significativa para la degradación de MITC.
Segunda Parte II-3: Capítulo 6.1. Conclusiones
338
En el caso de DMTU los factores fotólisis y pH son los de mayor influencia en la
degradación de ésta tiourea así como la interacción de los mismos factores para
la matriz agua, mientras que en la matriz jugo de caña fueron fotólisis y tiempo y
su interacción fotólisis*tiempo
La MTU no se obtuvo un factor de mayor influencia en su degradación en la
matriz agua, pero en la matriz jugo de caña los factores que tienen influencia
significativa sobre su degradación fueron fotólisis y tiempo
Se alcanzó el objetivo general, ya que la degradación del MS si se lleva a cabo
en las condiciones trabajadas en el laboratorio siendo esta de hasta 99.85% y ya
que las condiciones en los ingenios azucareros son más severas y drásticas, es
casi 100% que se alcance su total degradación así como la de sus subproductos
en condiciones reales
Se utilizó la metodología propuesta por Harris, D., 2003; para realizar la
identificación y cuantificación de MS, MA, MITC, DMTU y MTU en las muestras
de agua y jugo de caña, sin embargo se tuvieron que realizar modificaciones
principalmente en las concentraciones tomadas en cuenta para la elaboración de
las curvas de calibración
Las condiciones en las que menos se degrada el MS en la matriz agua es a pH 7
y condiciones de oscuridad siendo el porcentaje de degradación de 74.78%, para
MA a pH 4.5 y luz, MITC pH 4.5 y luz, DMTU pH 4.5 y luz, pero tomando en
cuenta como se mencionó anteriormente de que las condiciones de producción
en los ingenios azucareros son más severas y aunque la velocidad de
degradación haya sido menor, no se considera que el compuesto pueda persistir
durante todo el proceso de la elaboración de azúcar de caña
La degradación del MS y sus subproductos en el jugo de caña, puede dar lugar a
otras reacciones ya que pueden interaccionar con otros compuestos del jugo de
caña como lo son en su mayoría los carbohidratos, dando como posible
resultado reacciones de Maillard las cuales se ven favorecidas por el efecto del
aumento de la temperatura, para este estudio no se consideró la temperatura
como una de los factores de degradación, sin embargo deberá ser corroborado
en investigaciones posteriores
Segunda Parte II-3: Capítulo 6.1. Conclusiones
339
La metodología empleada además de cuantificar la presencia de MS, MA, MITC,
DMTU y MTU, es una herramienta para la determinación de la calidad del jugo
de caña y pudiera ser aplicada para realizar inspecciones que permitan asegurar
la inocuidad de los productos provenientes de los ingenios azucareros.
Con la información obtenida de la presente investigación se rechaza la hipótesis nula
(H0) la cual menciona que los factores de luz, pH, matriz y tiempo no influyen en la
degradación del MS y sus subproductos; bajo todas las posibles condiciones
establecidas en el diseño experimental se demostró que los factores planteados sí
influyen en la degradación del plaguicida.
Segunda Parte II-3: Capítulo 6.2. Recomendaciones
340
De acuerdo con la investigación realizada en este estudio se recomienda continuar con
los siguientes puntos.
Realizar una metodología para llevar a cabo el experimento pero mediante
alguna otra técnica analítica, lo que permita comparar si existe una diferencia en
los resultados de acuerdo al método empleado
Incluir el factor Temperatura en la metodología para poder analizar su
contribución en la degradación del plaguicida metam sodio (MS) y sus
subproductos de degradación (MA, MITC, DMTU y MTU)
Realizar las determinaciones de las propiedades fisicoquímicas de la
dimetitiourea (DMTU) y metiltiourea (MTU) ya que en la bibliografía consultada y
las hojas de seguridad proporcionadas por el proveedor hace falta reportar datos
que podrían ayudar a explicar o predecir mejor la reactividad de estos
compuestos.
Cuantificar la formación de los subproductos de la metilamina (MA) que no
fueron estudiados en este proyecto como nitrosaminas o melanoidinas en
función de la concentración de la MA en jugo de caña, con el fin de ampliar la
información sobre la posible presencia de dichos compuestos cancerígenos en
los subproductos del jugo de caña.
Segunda Parte II-3: Anexo I. Lavado de material de vidrio
341
Segunda Parte II-3: Anexo II. Espectros de absorción UV-Visible
342
Fig. A2.1. Barrido de 200 – 400nm MS
Fig. A2.2. Barrido de 200 – 300nm MS
Segunda Parte II-3: Anexo II. Espectros de absorción UV-Visible
343
Fig. A2.3. Barrido de 190 – 250nm MA
Fig. A2.4. Barrido de 190 – 210nm MA
Segunda Parte II-3: Anexo II. Espectros de absorción UV-Visible
344
Fig. A2.5. Barrido 190 – 300nm MITC
Fig. A2.6. Barrido 190 – 210nm MITC
Segunda Parte II-3: Anexo II. Espectros de absorción UV-Visible
345
Fig. A2.7. Barrido 200 – 300nm DMTU
Fig. A2.8. Barrido 190 – 210nm DMTU
Segunda Parte II-3: Anexo II. Espectros de absorción UV-Visible
346
Fig. A2.9. Barrido 190 – 300nm MTU
Fig. A2.10. Barrido 190 – 210nm MTU
Segunda Parte II-3. Anexo III. Curvas de calibración
347
Fig. A3.1. Curva de calibración MS en agua pH=4.5 y luz
Fig. A3.2. Curva de calibración MS en agua pH=4.5 y oscuridad
Fig. A3.3. Curva de calibración MA en agua
pH 4.5 y luz Fig. A3.4. Curva de calibración MA en agua
pH 4.5 y luz
Fig. A3.5. Curva de calibración MITC en
agua pH 4.5 y luz Fig. A3.6. Curva de calibración MITC en
agua pH 4.5 y oscuridad
Fig. A3.7. Curva de calibración DMTU en agua pH 4.5 y luz
Fig. A3.8. Curva de calibración DMTU en agua pH 4.5 y oscuridad
Segunda Parte II-3. Anexo III. Curvas de calibración
348
Fig. A3.9. Curva de calibración MTU en agua
pH 4.5 y luz Fig. A3.10. Curva de calibración MTU en
agua pH 4.5 y oscuridad
Fig. A3.11. Curva de calibración MS en agua pH=7 y luz
Fig. A3.12. Curva de calibración MS en agua pH=7 y oscuridad
Fig. A3.13. Curva de calibración MA en agua
pH 7 y luz Fig. A3.14. Curva de calibración MA en agua
pH 7 y oscuridad
Fig. A3.15. Curva de calibración MITC en agua pH 7 y luz
Fig. A3.16. Curva de calibración MITC en agua pH 7 y oscuridad
Segunda Parte II-3. Anexo III. Curvas de calibración
349
Fig. A3.17. Curva de calibración DMTU en
agua pH 7 y luz Fig. A3.18. Curva de calibración DMTU en
agua pH 7 y oscuridad
Fig. A3.19. Curva de calibración MTU en
agua pH 7 y luz Fig. A3.20. Curva de calibración MTU en
agua pH 7 y oscuridad
Fig. A3.21. Curva de calibración MS en agua
pH sin modificar y luz Fig. A3.22. Curva de calibración MS en agua
pH sin modificar y oscuridad
Fig. A3.23. Curva de calibración MA en agua pH sin modificar y luz
Fig. A3.24. Curva de calibración MA en agua pH sin modificar y oscuridad
Segunda Parte II-3. Anexo III. Curvas de calibración
350
Fig. A3.25. Curva de calibración MITC en
agua pH sin modificar y luz Fig. A3.26. Curva de calibración MITC en
agua pH sin modificar y oscuridad
Fig. A3.27. Curva de calibración DMTU en
agua pH sin modificar y luz Fig. A3.28. Curva de calibración DMTU en
agua pH sin modificar y oscuridad
Fig. A3.29. Curva de calibración MTU en
agua pH sin modificar y luz Fig. A3.30. Curva de calibración MTU en
agua pH sin modificar y oscuridad
Fig. A3.31. Curva de calibración MS en jugo
de caña y luz Fig. A3.32. Curva de calibración MS en jugo
de caña y oscuridad
Segunda Parte II-3. Anexo III. Curvas de calibración
351
Fig. A3.33. Curva de calibración MA en jugo
de caña y luz Fig. A3.34. Curva de calibración MA en jugo
de caña y oscuridad
Fig. A3.35. Curva de calibración MITC en
jugo de caña y luz Fig. A3.36. Curva de calibración MITC en
jugo de caña y oscuridad
Fig. A3.37. Curva de calibración DMTU en
jugo de caña y luz Fig. A3.38. Curva de calibración DMTU en
jugo de caña y oscuridad
Fig. A3.39. Curva de calibración MTU en jugo de caña y luz
Fig. A3.40. Curva de calibración MTU en jugo de caña y oscuridad
Segunda Parte II-3. Anexo IV. Curvas de fotodegradación
352
Fig. A4.1. Curvas de degradación MS pH 4.5
Fig. A4.2. Curvas de degradación MS pH 7
Fig. A4.3. Curvas de degradación MS pH sin modificar
Segunda Parte II-3. Anexo IV. Curvas de fotodegradación
353
Fig. A4.4. Curvas de degradación MS en jugo de caña
Fig. A4.5. Curvas de degradación MA pH 4.5
Fig. A4.6. Curvas de degradación MA pH 7
Segunda Parte II-3. Anexo IV. Curvas de fotodegradación
354
Fig. A4.7. Curvas de degradación MA pH sin modificar
Fig. A4.8. Curvas de degradación MA en jugo de caña
Fig. A4.9. Curvas de degradación MITC pH 4.5
Segunda Parte II-3. Anexo IV. Curvas de fotodegradación
355
Fig. A4.10. Curvas de degradación MITC pH 7
Fig. A4.11. Curvas de degradación MITC pH sin modificar
Fig. A4.12. Curvas de degradación MITC en jugo de caña
Segunda Parte II-3. Anexo IV. Curvas de fotodegradación
356
Fig. A4.13. Curvas de degradación DMTU pH 4.5
Fig. A4.14. Curvas de degradación DMTU pH 7
Fig. A4.15. Curvas de degradación DMTU pH sin modificar
Segunda Parte II-3. Anexo IV. Curvas de fotodegradación
357
Fig. A4.16. Curvas de degradación DMTU en jugo de caña
Fig. A4.17. Curvas de degradación MTU pH 4.5
Fig. A4.18. Curvas de degradación MTU pH 7
Segunda Parte II-3. Anexo IV. Curvas de fotodegradación
358
Fig. A4.19. Curvas de degradación MTU pH sin modificar
Fig. A4.20. Curvas de degradación MTU en jugo de caña
Segunda Parte II-3: Anexo V. Disposición controlada de los residuos producidos en la investigación
359
R1: Corresponde a los desechos orgánicos de la extracción de jugo de caña: la cáscara, el bagazo y demás materia orgánica.
R2: Corresponde al bagazo restante que se obtiene mediante el proceso de centrifugación.
R3: Corresponde a la mezcla de los puntos de las curvas de calibración y degradación de MS en jugo de caña y agua, hidróxido de amonio y ácido fosfórico.
R4: Corresponde a la mezcla de los puntos de las curvas de calibración y degradación de MA en jugo de caña y agua, hidróxido de amonio y ácido fosfórico.
R5: Corresponde a la mezcla de los puntos de las curvas de calibración y degradación de MITC en jugo de caña y agua, hidróxido de amonio y ácido fosfórico.
R6: Corresponde a la mezcla de los puntos de las curvas de calibración y degradación de DMTU en jugo de caña y agua, hidróxido de amonio y ácido fosfórico.
Segunda Parte II-3: Anexo V. Disposición controlada de los residuos producidos en la investigación
360
R7: Corresponde a la mezcla de los puntos de las curvas de calibración y degradación de MTU en jugo de caña y agua, hidróxido de amonio y ácido fosfórico.
RESIDUO TRATAMIENTO R1 Se desecha con los residuos orgánicos enviados a la Unidad de Gestión
Ambiental, UGA, de la Facultad de Química R2 Se desecha con los residuos orgánicos enviados a la Unidad de Gestión
Ambiental, UGA, de la Facultad de Química R3 R4 R5 R6 R7
Se coloca en envase de plástico, es etiquetado con la información correspondiente a su concentración, características físicas y químicas de acuerdo. Se entregan a la Unidad de Gestión Ambiental, UGA, de la Facultad de Química.
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ode%2520matchpartialmax%26lang%3Des%26region%3DMX%26focus%3Dpro
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Segunda Parte
II-IV
METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DEL
SUBPRODUCTO DEL METAM SODIO:
DISULFURO DE CARBONO (CS2) EN INGENIOS
AZUCAREROS
Segunda Parte II-4: Índice
372
Pág.
SEGUNDA PARTE 371
II-4 METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DEL SUBPRODUCTO DEL
METAM SODIO: DISULFURO DE CARBONO (CS2) EN INGENIOS AZUCAREROS
Resumen 374
1. Problemática 375
1.1. Planteamiento 375
1.2. Objetivos 376
1.3. Hipótesis 376
2. Marco teórico 377
2.1. La caña 377
2.2. Glúcidos (“Azúcares”) y no glúcidos (“No azúcares”)8
377
2.3. Proceso de la elaboración del azúcar: Microflora inicial 378
2.4. Biocidas utilizados en la industria azucarera 379
2.5. Justificación 380
3. Metodología 381
3.1. Esquema de bloques 381
3.2. Materiales 381
3.2.1. Equipo 381
3.2.2. Reactivos utilizados 382
3.3. Procedimiento 383
3.4. Análisis estadístico 386
8 El uso de la palabra azúcares ha llevado a múltiples confusiones entre la población no experta en química ya que
asocian esta palabra con el azúcar. Hay incluso libros que la emplean por glúcidos o hidratos de carbono. Por
ello, es importante emplear el término glúcidos que involucra a cualquier compuesto formado por carbono,
hidrógeno y oxígeno, incluída el azúcar, pero también monoglúcidos y di‐ y poliglúcidos (en vez de sacáridos,
también derivada del nombre científico del azúcar, sacarosa), como la glucosa (o dextrosa), la fructosa (o
levulosa), la maltosa, la lactosa, la galactosa, etc., etc.
Segunda Parte II-4: Índice
373
4. Resultados y discusión 387
4.1. Identificación y cuantificación del CS2 por CG-EM 387
4.2. Tiempo de retención del CS2 387
4.3. Límites de detección 388
4.4. Curvas de calibración 389
4.5. Precisión 390
5. Conclusiones y recomendaciones 392
5.1. Conclusiones 392
5.2. Recomendaciones 393
Anexos 394
Anexo I. Disulfuro o bisulfuro de carbono 394
Anexo II. Proceso de elaboración del azúcar 398
Anexo III. Estructura del metam-sodio 405
Anexo IV. Disposición controlada de los residuos producidos en la investigación
Bibliografía 409
Segunda Parte II-4: Resumen
374
El N-Metil ditiocarbamato de sodio (metam-sodio, MS) es un biocida que se agrega de
forma continua durante la extracción de jugo de caña, para la eliminación del
microorganismo Leuconstoc mesenteriodes. Como el jugo obtenido durante la molienda
tiene un pH ligeramente ácido, el mecanismo de degradación del MS puede dar como
resultado el disulfuro de carbono, compuesto de gran relevancia ambiental y que figura
en la lista de substancias peligrosas de la OMS (Hazardous Substance List) y está
reglamentada por la OSHA estadounidense (Occupational Safety & Health
Administration). También está considerado en la lista de substancias extremadamente
peligrosas para la salud (Special Health Hazard Substance List). Por lo anterior, resulta
de considerable interés su estudio, identificación y cuantificación durante las primeras
operaciones unitarias en un ingenio azucarero para conocer su grado de
descomposición y confirmar que no se encuentra presente en los subproductos del
azúcar (mieles finales). El objetivo de esta fase de la investigación fue la de
implementar una metodología analítica para determinar y cuantificar el CS2 por
cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM), mediante un equipo marca
Fissons MD800. La columna empleada fue de 5% fenil-metilsiloxano (DB-5), la
temperatura inicial en el horno fue de 50°C y se aumentó a 160°C a 10°C min-1 y el
tiempo total de la corrida fue de 4 minutos. El tiempo de retención (tr) fue de 1.2 minutos
en las matrices de metanol y de jugo de caña. Para la cuantificación, las curvas de
calibración presentaron coeficientes de correlación de 0.9985 y 0.9359 en metanol y
jugo de caña, respectivamente. Puede concluirse, por tanto, que se podrá cuantificar
este compuesto y tomar las medidas de seguridad adecuadas en los centros de trabajo.
Un ejemplo: Actualmente, el personal que aplica el MS si se convirtiera a CS2 quedaría
directamente expuesto al sulfuro vía dérmica, por inhalación, por ingestión y por vía
ocular pudiendo provocar un riesgo para su salud. El siguiente paso sería hacer un
seguimiento real en planta sobre los productos intermedios después de la aplicación del
N-Metil ditiocarbamato de sodio (MS) y corroborar si hay formación de estos
subproductos intermedios antes de su mineralización.
Palabras clave: Ditiocarbamato de sodio, Leuconostoc mesenteroides, disulfuro de carbono, cromatografía de gases-espectrometría de masas
Segunda Parte II-4: Capítulo 1
375
1. Problemática
1.1. Planteamiento
La caña de azúcar es uno de los cultivos más eficientes desde el punto de vista
fotosintético. Este cultivo es capaz de fijar entre el 2-3% de la radiación solar, con una
acumulación promedio de 30% de materia seca, de los cuales 15% corresponde en
promedio a fibra (materia insoluble) y 15% a los sólidos totales solubles. Una hectárea
de caña de azúcar puede producir 100 toneladas de caña por año, la cual es más del
doble de la producción agrícola de otros cultivos. A principios del siglo XX la producción
mundial de azúcar, de todas las fuentes, alcanzaron niveles de 12 millones de
toneladas y un consumo per cápita de 8 kg. Hacia el 2000, la producción se incrementó
diez veces con un consumo per cápita de glúcidos (mal llamados azúcares) tres veces
mayor, debido a la aparición de nuevos edulcorantes en el mercado (Almazan et al.,
2001). Uno de los inconvenientes en la industria azucarera en general, es la inversión
de la sacarosa en el jugo de caña que va desde el momento de su extracción en los
molinos hasta que llega a la sala de cocimiento. El jugo extraído ofrece un medio ideal
para la propagación de microorganismos que causan destrucción de sacarosa. En
estudios realizados sobre estas pérdidas reporta que pueden alcanzar hasta el 1.0% de
la sacarosa en el jugo. El jugo de la caña no tratado químicamente al pasar por las
canaletas y cañerías durante la recirculación, entra en contacto directo con una gran
cantidad de microorganismos que están adheridos a las superficies del metal. Además,
los lodos o fangos que se acumulan en los molinos constituyen la fuente más
importante de contaminación microbiana y con ello la producción de invertasa,
ocasionando el desdoblamiento de la sacarosa. A pesar de que se realice una limpieza
frecuente en molinos, las pérdidas por inversión de sacarosa se mantienen debido a la
multiplicación continua de microorganismos. Por ello, el efecto perjudicial de la
presencia de las dextranas comienza desde el momento en que estas se forman, ya
que la presencia de 0.05% de dextranas en el azúcar crudo para su formación consume
0.2 kg/t de azúcar o 0.02 kg/t de caña procesada. Por tanto, el empleo de biocidas
Segunda Parte II-4: Capítulo 1
376
como el metam de sodio para solucionar dicho problema en los ingenios azucareros es
una práctica importante. Debido a estas consideraciones, la presente investigación se
dedica a identificar y cuantificar uno de los principales productos de degradación (CS2)
del biocida más utilizado en la industria azucarera (metam de sodio).
1.2. Objetivo
Evaluar el comportamiento del disulfuro de carbono (CS2), uno de los principales
productos de degradación del biocida metam-sodio que se forma en las primeras
operaciones unitarias en un ingenio azucarero, mediante cromatografía de gases-
espectrometría de masas (CG-EM).
1.3. Hipótesis
1.3.1. Nula Ho= La aplicación del biocidas metam sodio no produce el compuesto de
degradación CS2
1.3.2. Alternativa Ha= La aplicación del biocidas metam sodio produce el compuesto
de degradación CS2
Segunda Parte II-4: Capítulo 2
377
2. Marco teórico
2.1. La caña
La caña de azúcar (Saccharum officinarum L.) es una gramínea tropical, un pasto
gigante emparentado con el sorgo y el maíz en cuyo tallo se forma y acumula un jugo
rico en sacarosa, compuesto que al ser extraído y cristalizado en el ingenio forma el
azúcar. La sacarosa es sintetizada por la caña gracias a la energía tomada del sol
durante la fotosíntesis (Perafan, 2009).
2.2. Glúcidos (“Azúcares”) y no glúcidos (“No azúcares”)9
La sacarosa en el jugo y la celulosa en la fibra son los dos principales constituyentes
químicos de la caña de azúcar. Cada uno de ellos está compuesto por glúcidos simples.
Los glúcidos simples, glucosa (dextrosa) y fructosa (levulosa), se encuentran sin formar
cadenas en la caña de azúcar, por lo general, en cantidades menores que la sacarosa.
La producción de sacarosa a partir del jugo de caña de azúcar se basa en la capacidad
que tiene la sacarosa de cristalizar a partir de un jarabe espeso, mientras que la
glucosa y la fructosa permanecen disueltas (Chen, 1991).
La sacarosa se encuentra en muchos vegetales disuelta en la savia; pero no todos en
cantidad suficiente para su obtención industrial. La caña de azúcar es la principal fuente
de producción y, por su orden de importancia, pueden ser como sigue: caña,
remolacha, sorgo y maíz (Herrero y Silva, 1997).
9 El uso de la palabra azúcares ha llevado a múltiples confusiones entre la población no experta en química ya que
asocian esta palabra con el azúcar. Hay incluso libros que la emplean por glúcidos o hidratos de carbono. Por ello,
es importante emplear el término glúcidos que involucra a cualquier compuesto formado por carbono, hidrógeno y
oxígeno, incluída el azúcar, pero también monoglúcidos y di‐ y poliglúcidos (en vez de sacáridos, también derivada
del nombre científico del azúcar, sacarosa), como la glucosa (o dextrosa), la fructosa (o levulosa), la maltosa, la
lactosa, la galactosa, etc., etc.
Segunda Parte II-4: Capítulo 2
378
La sacarosa tiene la fórmula empírica C12H22O11 (masa molecular 342.30 g/mol). Se ha
determinado que su estructura y configuración estereoquímica son las de D-
Glucopiranosil - (1→2) - beta-D-Fructofuranósido (Spencer, 1967). La sacarosa es
un disacárido formado por la unión de una molécula del monosacárido glucosa
(dextrosa) con una del monosacárido fructosa (levulosa) a través de los carbonos 1 y 2
y con la pérdida de una molécula de agua (Charley, 1997).
2.3. Proceso de elaboración de azúcar: Microflora inicial
Los organismos presentes en la caña de azúcar proceden del suelo y de las estructuras
vegetales en putrefacción. La rizosfera (suelo en interacción con la raíz) contiene una
amplia gama de organismos, si bien no se sabe si la rizosfera de la caña de azúcar esté
asociada de manera constante con microorganismos específicos. En un estudio
(Mayeux y Colmer, 1960) se encontró un elevado número de Enterobacter (105/g) en el
suelo próximo a la caña y en menor cuantía a medida que aumenta la distancia desde
el tallo.
Aunque no de forma constante, Leuconostoc mesenteroides también puede
encontrarse en la rizosfera en un número superior a 5 x 103 / g. Con el tiempo húmedo y
caluroso el jugo que exuda la caña de azúcar al ser cortada pueden contener un
elevado número de microorganismos, aproximadamente 109 bacterias y 106 levaduras y
mohos por gramo (Mayeux y Colmer, 1960).
La infestación de la caña por el insecto Diatraea saccharalis, conocido como “borer” y el
ataque de roedores favorecen la contaminación microbiana de la gramínea en el campo
(Mayeux y Colmer, 1960; Silliker et al., 1980).
Por otra parte las dextranas no son compuestos propios de la caña y el contenido de
estos poliglúcidos en la caña es muy bajo o casi cero. Su formación ocurre por la acción
de la enzima dextrana“sacarasa” de microorganismos contaminantes que se alojan en
la savia de la planta o la atacan posteriormente al ser dañada su corteza (Mayeux y
Colmer, 1960; Silliker et al., 1980).
Segunda Parte II-4: Capítulo 2
379
2.4. Biocidas utilizados en la industria azucarera
El método de control empleado habitualmente en la industria contra los
microorganismos y en especial de las bacterias acidolácticas como Leuconostoc sp es
el uso de agentes químicos. Sin embargo, la industria alimentaria o aquella industria
que elabora productos de consumo humano se ve en dificultad para el control de
microorganismos, dado que estos agentes pueden ser tóxicos al humano o acarrear
graves consecuencias al ambiente (Kochergin, 2002). Existen productos que se han
utilizado o que se recomiendan para su uso en desinfección y/o sanitización de la caña
de azúcar. Uno de los más empleados es el Metil-ditiocarbamato de sodio (metam-
sodio).
El ditiocarbamato de sodio es ampliamente utilizado en la industria azucarera durante la
extracción del jugo de caña debido a su acción inhibitoria de Leuconostoc
mesenteroides, principal responsable de la formación de dextranas. Los plaguicidas
ditiocarbamatos son compuestos derivados del ácido carbámico que poseen una ligera
actividad anticolinesterásica y presentan una gran capacidad para la captación de
metales e interacción con radicales sulfhidrilo. El metam-sodio se conoce por una
variedad de sinónimos incluyendo: metam, metam-sodio y carbation.
En soluciones ácidas (Fig. 1), se produce una descomposición no oxidativa que
inicialmente produce la mitad de MIT que se forma en la descomposición oxidativa, pero
además se produce sulfuro de sodio, metilamina y disulfuro de carbono que es el
compuesto de interés de esta investigación.
Fig. 1. Degradación de metam-sodio en solución ácida (LAINCO, 2010)
Segunda Parte II-4: Capítulo 2
380
2.5. Justificación
En un medio ácido (pH <5), el metam-sodio se hidroliza, dando como resultado
metilamina (CH3NH2) y disulfuro de carbono (CS2), como se mencionó arriba (Wales,
2002).
El jugo obtenido durante la molienda tiene un pH ligeramente ácido de 5.2 y ya que el
biocida es agregado de forma continua durante la extracción, el mecanismo de
degradación del ditiocarbamato de sodio dará como resultado el disulfuro de carbono.
Este compuesto es de gran relevancia ya que figura en la lista de substancias
peligrosas (Hazardous Substance List) debido a que está reglamentada por la OSHA
(Occupational Safety & Health Administration) estadounidense y también está
considerada en la lista de substancias extremadamente peligrosas para la salud
(Special Health Hazard Substance List) ya que es inflamable.
Por lo anterior resulta de considerable interés su estudio, identificación y cuantificación
durante las primeras operaciones unitarias en un ingenio azucarero para ver si se
descompone después y ya no queda en los primeros subproductos del azúcar (mieles
finales).
En los Anexos 1 a 3 se complementa el marco teórico.
Segunda Parte II-4: Capítulo 3
381
3. Metodología
3.1. Diagrama de bloques
En la Fig. 2 se presenta el esquema de bloques utilizado para el desarrollo experimental
de la investigación.
Fig. 2. Diagrama de boques de la metodología
3.2. Materiales
3.2.1. Equipo
El equipo y condiciones usadas para el estudio, identificación y cuantificación durante
las primeras operaciones unitarias en un ingenio azucarero del disulfuro de carbono son
Segunda Parte II-4: Capítulo 3
382
las siguientes: Cromatógrafo de gases-espectrómetro de masas Marca FISSONS
intruments Modelo GC8060MSCB11. Detector de espectrometría de masas Marca
FISSONS intruments. Software de control y procesamiento de datos Finnigan MassLab
1.4 MD Family GC-MS data system. Columna capilar de 5% difenil, 95% dimetil
polisiloxano (15m x 0.25mm x 0.25µm de espesor) ZB-5. Baño maría Marca Büchi 461.
Jeringa Hamilton Capacidad de 0-10 μL Hamilton 81065, 1710RNR SYR (22S/2”/3),
REVD, Lot#449139, 8/10/11. Micropipetas Transferpette de volumen variable de 10-100
μL y de 100-1000 μL. Equipo de filtración Millipore Glass 47 mm Filter Holder
XX1004700, Teflon®-faced Glass 47 mm Filter Holder XX1004720, Stainless Screen
Glass 47 mm Filter Holder XX1004730. Membrana de filtración Titan 47 mm, Material:
Nylon, tamaño de poro de 0.20 μm. Kit de viales de vidrio con tapa de silicón de 8 mm y
capacidad de 2, 5, 10, 20 mL. Frascos de vidrio Duran de 400 mL y 200 mL de
capacidad. Agitador Marca Vortex- Genie 2. Horno Felisa Modelo F-293D Temperatura
(0-250°C).
3.2.2. Reactivos utilizados
Los reactivos utilizados para la preparación de las soluciones empleadas durante la
investigación fueron: Agua de alta pureza grado cromatográfico (J.T Baker: Agua de
alta pureza y estéril) para la preparación de reactivos analíticos, para emplearse en
equipos de alta precisión (HPLC, Absorción atómica, UV), como blanco en análisis de
agua, para calibrar instrumentos de alta precisión, análisis del agua, resistencia
eléctrica 18 MΩ en SiO2 < 3 ppb, TOC < 50 ppb, Na 1 ppb, Cl ppm, longitud de onda
220 nm < 0.001. Metanol (J.T Baker): CH3OH (by GC, Corrected for Water) 99.97%,
Ultraviolet Absorbance (1.00 cm cell vs. water) 400-254 nm (0.003), 225 nm (0.110), UV
“cut-off”, nm 204.5, gradient elution test (a·v) 254 nm (0.001) (Fluorescence trace
impurities, in ppb measured as quinine base: at 450 nm emission 0.05 at emission
maximum of impurities 0.07), acetona 0.001%, residuo después de la evaporación 0.5
ppm, ácido titulable (μeq/g) 0.30, bases titulables (μeq/g) 0.04, agua (por KF “coulomb-
métrico”) 0.02%. Disulfuro de carbono 99.9% Marca Sigma Aldrich CS2 CHROMASOLV
for HPLC ≥99.9% CAS 75-15-0; CS2 76.14; fp -30°C(-22°F), bp 46°C, mp-117-117°C, d
1.26 Water <=0.030% , Evapn residue <0.0005% US Flamable. Toxic. Ácido clorhídrico
Segunda Parte II-4: Capítulo 3
383
36.5-38%, pureza 36.6-38%, FW 36.46. Grado reactivo CAS No 7647-01-0; Water
7732-18.5 J.T Baker NEUTRASORB or TEAM. (Recomendados: Neutralizadores de
ácido bajos en Na+ para posibles derrames). Rev 021810. Cloruro estannoso
dihidratado Marca J.T Baker Cristales. Pureza 101.0% PM 225 646. Dietanolamina2,2´-
Iminodiethanol, Bis(2-hidroxyethyl)amine CAS: 111-42-2 , C4H11NO2, 105.14, mp 28°C
(lit), bp 217°C/150mmHg (lit), fp 138°C closed cup, d: 1.097g <0.98atm (100°C) assay
≥98.0% Air sensitive. Safety datasheet is available for R&D use only. Gas helio
cromatográfico Pureza 99.998% Marca Infra S.A. de C.V. Gas aire comprimido
extraseco UN 1002 Marca Infra S.A. de C.V.
3.3. Procedimiento
Para llevar a cabo la determinación y cuantificación se estableció el siguiente
procedimiento:
A. El material de vidrio que se utilizó (Frascos Duran, viales con sus respectivas tapas
y equipo de filtración), se sometió a un lavado específico con jabón Dextran al 15%. Se
enjuagaron con agua desionizada y se sumergieron en una solución de HNO3 al 10%
durante 24 horas. Posteriormente, se retiró el material de vidrio de la solución ácida y
se procedió a enjuagar con agua desionizada. El material fue secado en estufa Felisa a
120°C durante 1 hora, al finalizar esta operación se cubrió la boca de los viales y
frascos con papel aluminio y se almacenó para su posterior uso.
B. Las soluciones de trabajo según Royer et al. (2001): Ácido clorhídrico/cloruro
estannoso: Pesar 36 g de cristales de SnCl2.2H2O y disolver en 640 mL de HCl, para
posteriormente aforar a 1 L con agua grado HPLC. Guardar en una botella de vidrio
color ámbar para evitar la degradación por la luz, además de ser almacenadas a 4ºC y
etiquetadas con fecha de preparación. Dietanolamina al 10%: medir 55 mL de
dietanolamina, adicionar 445 mL de agua HPLC para llegar a un volumen de aforo de
500 mL. Guardar en una botella de vidrio color ámbar para evitar la degradación por la
luz, además de ser almacenadas a 4ºC y etiquetadas con fecha de preparación.
Solución stock de CS2: es preparada a partir del estándar. Se midieron 15.8 μL
Segunda Parte II-4: Capítulo 3
384
estándar completando un volumen de 250 mL con metanol HPLC. La concentración
obtenida es de 100 mg L-1, las cuales fueron colocadas en un vial color ámbar para
evitar la degradación por la luz, además de ser almacenadas a 4ºC. Nota: Tanto el
metanol como el agua ultra pura deben ser filtradas antes de usarse mediante un
equipo de filtración al vacío Millipore, utilizando una membrana Titan 47 mm de
Nylon previamente acondicionada, cuyo tamaño de poro es de 0.20 μm.
C. Condiciones de operación del CG-EM. El compuesto se determina por
cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM), usando el modo de ion
selectivo (Fig. 3). La temperatura inicial en el horno es de 50°C durante un minuto y se
aumenta a 70°C a una tasa de cambio de 10°C min-1. El tiempo total de la corrida es de
3 minutos. Las condiciones cromatógraficas que se emplearon fueron las propuestas
por Royer et al. (2001), solamente se modificó la rampa de temperatura del horno
(Tabla 1).
Fig. 3. Cromatógrafo de gases acoplado a un espectrófotometro de masas
Segunda Parte II-4: Capítulo 3
385
Tabla 1. Condiciones cromatográficas experimentales
mm: Milímetros; μm: Micrómetros; mL: Mililitros; μL: Microlitros
D. Preparación de la muestra para evaluar el CS2: Agregar en un vial de vidrio 1800 µL
de jugo de caña ó solución estándar, 3300 µL de la solución de dietanolamina al 10% y
4900 µL de la solución de HCl/SnCl2. Tapar inmediatamente y agitar en el Vortex
durante 15 segundos. Tener listo el baño maría (temperatura de 85°C), la muestra es
colocada en este durante 60 minutos, transcurrido el tiempo, tomar con la jeringa
Hamilton 1 µL del espacio de cabeza (Head Spice) del vial e inyectar en el
cromatógrafos de gases. El cromatograma y el espectro del CS2 obtenidos serán
analizados.
E. Tiempo de retención (tR ). Al tener las condiciones cromatográficas adecuadas, se
procedió a la determinación del tiempo de retención (tR ) del estándar. Para ello fue
necesario inyectar mediante una jeringa de vidrio Hamilton de capacidad de 10 μL un
volumen de 1 μL tanto el metanol como del jugo de caña para determinar los tiempos
de elusión, así como, posibles interferencias. El pico fue identificado, así como su
tiempo de retención, para confirmar dicho resultado es necesario inyectar la solución a
diferentes concentraciones.
F. Límites de detección Para determinar la concentración mínima detectable del CS2
se inyectó a una concentración inicial de 1 mg L-1 y, paulatinamente, se fue
Especificaciones
Inyector T = 200˚C Columna Columna capilar de 5% difenil, 95%
dimetil polisiloxano (15m x 0.25 mm x 0.25 µm de espesor) ZB-5
T inicial 50˚C aumenta 10˚C/min hasta 70˚CGas acarredor He Velocidad de flujo 4.0 mL/minuto Volumen de inyección 1 μL Detector Espectrometría de masas
Segunda Parte II-4: Capítulo 3
386
disminuyendo hasta que el área bajo la curva fuera tres veces más grande que el ruido
de fondo.
Precisión: La evolución de la precisión del sistema se realizó mediante la inyección por
triplicado de una concentración del compuesto de 0.1 mg L-1.
G. Curvas de calibración: Se realizaron dos curvas de calibración, en metanol y en
jugo de caña, donde se inyectaron seis diferentes concentraciones del estándar. Estas
concentraciones fueron consecutivas y hechas a partir de la solución de 100 mg L-1. El
grupo de concentraciones inyectadas para las dos matrices fueron de 0.03, 0.05, 0.1,
0.2, 0.5 y 1 mg L-1. Cada una se inyectó por triplicado y la concentración del punto
medio (0.1 mg L-1), se inyectó cinco veces esto para observar la reproducibilidad de
cada inyección.
H. Cuantificación del CS2: La cuantificación de las muestras reales es mediante las
ecuaciones de la recta obtenidas de cada una de las curvas de calibración del punto G.
3.4. Análisis estadístico
Los datos experimentales fueron analizados para corroborar precisión, exactitud y
confiabilidad así como posibles diferencias significativas entre ellos (95%) usando los
procedimientos estandarizados internacionalmente.
Segunda Parte II-4: Capítulo 4
387
4. Resultados y discusión
4.1. Identificación y cuantificación del CS2 por CG-EM
Como se mencionó, existen diferentes metodologías para la identificación y
cuantificación del CS2. Las condiciones cromatográficas que se tomaron como
referencia para este proyecto fueron las propuestas por Royer et al. (2001). Como las
condiciones analíticas existentes en los laboratorios donde se realizó esta investigación
eran diferentes, se modificaron para poder analizar el CS2 con la instrumentación
disponible. En la Tabla 2 se presentan las condiciones bajo las cuales se llevó a cabo
esta investigación, tomando en cuenta las propiedades físico-químicas del CS2 (Anexo
1). Algunas de estas son la masa molecular, polaridad, solubilidad, así como la
densidad y reactividad química.
4.2. Tiempo de retención del CS2
En esta investigación se logró identificar al compuesto en estudio, así como determinar
su tiempo de retención (tr), que fue de 1.2 minutos en metanol y jugo de caña. En las
Figs. 4 y 5 se presentan los cromatogramas del compuesto en metanol y jugo de caña,
respectivamente, así como el espectro del compuesto de interés en la Fig. 6.
Fig. 4. Disulfuro de carbono en metanol tr = 1.282: Columna DB-5 (5% fenil-metilsiloxano) de 30 m x 0.25 mm i.d; 0.25 m. Gas acarreador helio (He 4 mL/min); Gas auxiliar aire; Temperatura del inyector: 200°C; Rampa de temperatura en el horno: 50°C, aumenta a una velocidad de 10°C/min a 70°C. El tiempo total de la corrida es de 3 min
Segunda Parte II-4: Capítulo 4
388
Fig. 5. Disulfuro de carbono en jugo de caña tr = 1.277: Columna DB-5 (5% fenil-metilsiloxano) de 30 m x 0.25 mm i.d; 0.25 m. Gas acarreador helio (He 4 mL/min); Gas auxiliar aire; Temperatura del inyector: 200°C; Rampa de temperatura en el horno: 50°C, aumenta a una velocidad de 10°C/min a 70°C. El tiempo total de la corrida es de 3 min
Fig. 6. Espectro de masas del disulfuro de carbono: Columna DB-5 (5% fenil-metilsiloxano) de 30 m x 0.25 mm i.d; 0.25 m. Gas acarreador helio (He 4 mL/min); Gas auxiliar aire; Temperatura del inyector: 200°C; Rampa de temperatura en el horno: 50°C, aumenta a una velocidad de 10°C/min a 70°C. El tiempo total de la corrida es de 3 min
4.3. Límites de detección
El límite de detección obtenido en el CG-EM es de 0.05 mg L-1 en metanol y 0.03 mg L-1
en jugo de caña, por lo cual esta metodología puede mejorarse mediante las
Segunda Parte II-4: Capítulo 4
389
modificaciones de la rampa de temperatura, para obtener límites de detección más
bajos.
4.4. Curvas de calibración
Como se mencionó en el punto anterior, para realizar la cuantificación se deben realizar
dos curvas de calibración del CS2 en metanol y jugo de caña (Figs. 7 y 8). Los valores
se presentan en la Tabla 2, tanto para la pendiente (m), como para la ordenada al
origen (b) y el coeficiente de correlación lineal (R2). En la continuación del trabajo
(siguiente proyecto), se obtendrán las curvas de calibración en metanol y jugo de caña
a diferentes temperaturas y se probarán jugos del ingenio azucarero reales (Anexo 2).
-4000000
-2000000
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Área
baj
o la
cur
va
Concentración mg/L
Fig. 7. Curva de calibración en MeOH
Tabla 2. Coeficientes de las curvas de calibración en metanol y jugo de caña
Pendiente Ordenada al origen Coeficiente de correlacióny=mx+b→ Matriz↓ (m) (b) (R2)
Metanol 6960717±3335389 347967±2161579 0.9985 Jugo de caña 21191474.8±16931526 -2133289.0±9624571 0.9354
y: Área bajo la curva; x: Concentración; m: Pendiente; b: Ordenada al origen; R2: Coeficiente de correlación; nd: no determinada
Segunda Parte II-4: Capítulo 4
390
-20000000
-10000000
0
10000000
20000000
30000000
40000000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Áre
a ba
jo la
cur
va
Concentración mg/L
Fig. 8. Curva de calibración en jugo de caña
4.5. Precisión
En la Tabla 3 se presentan los valores de la media (X), desviación estándar (S) y
coeficiente de variación (CV), obtenidos de las áreas del pico correspondientes a la
concentración de cada curva de calibración; el cual corresponde al punto medio de la
curva. Los coeficientes de variación están entre 0.19 y 0.023, los cuales son adecuados
para la identificación de compuestos en concentraciones traza.
Tabla 3. Valores de media, desviación estándar y coeficiente de variación del punto medio de cada curva de calibración
media Desviación estándar Coeficiente de variación
(X) (S) (CV)
Matriz
Metanol 3691927,5
222.0367 0.1967
Jugo de caña 1892283 3.18 0.023
X: Media; S: Desviación estándar; CV: Coeficiente de variación; nd: no determinada
Segunda Parte II-4: Capítulo 4
391
Los resultados obtenidos hasta el momento permitirán continuar con el seguimiento del
compuesto bajo condiciones reales de operación en un ingenio azucarero tanto de pH
como de temperatura, ya que son los dos factores que influyen más en el biocida
metam-sodio y formación de sus productos de degradación en este caso en CS2.
Segunda Parte II-4: Capítulo 5
392
5. Conclusiones y recomendaciones
5.1. Conclusiones
De acuerdo con el objetivo de esta fase de la investigación que era el de evaluar el
comportamiento del disulfuro de carbono (CS2), uno de los principales productos de
degradación del biocida metam-sodio que se forma en las primeras operaciones
unitarias en un ingenio azucarero, mediante cromatografía de gases-espectrometría de
masas (CG-EM) a continuación se presentan las conclusiones.
1) Con base en la revisión bibliográfica realizada, la metodología propuesta por Royer
et al. (2001) pudo emplearse complementándola y, finalmente, adaptándola a las
condiciones del equipo utilizado. Con esto se pudo lograr obtener las mejores
condiciones para trabajar en esta investigación, a pesar de que es necesario
optimizar el método para disminuir los límites de detección del compuesto de
interés
2) Se determinaron los tiempos de retención del compuesto en las dos diferentes
matrices siendo para ambos el mismo, tr = 1.2 minutos
3) En cuanto a las curvas de calibración se obtuvieron los siguientes coeficientes de
correlación y coeficientes de variación, respectivamente: para la curva de
calibración en metanol fueron de 0.9985 y 0.1090, en jugo de caña de 0.9354 y
0.023, respectivamente, los cuales se consideran adecuados para las
concentraciones a las cuales se están trabajando
4) Además del compuesto adicionado como control se identificó en una muestra real
bajo las mismas condiciones del estándar que, por naturaleza, la caña de azúcar
contiene dicho compuesto y será necesaria su cuantificación para que no interfiera
con el CS2 que se genera por la adición de ditiocarbamato.
Segunda Parte II-4: Capítulo 5
393
5) El objetivo de esta primera fase de la investigación se logró alcanzar como se
había planteado por lo que, para el desarrollo del proyecto global, que constituye la
determinación y seguimiento del metam-sodio y sus posibles derivados en el jugo
de caña que se extrae en el proceso de elaboración de azúcar se podrá emplear en
los propios ingenios azucareros o en laboratorios autorizados para garantizar la
inocuidad del azúcar y las mieles finales.
5.2. Recomendaciones
Con base a la revisión bibliográfica realizada, es necesario continuar con la
investigación concerniente a este subproducto ya que es muy tóxico y es importante
asegurarse de que se decompone completamente en las primeras etapas del proceso
de producción de azúcar a partir de la caña en condiciones reales.
Segunda Parte II-4: Anexos. Anexo I
394
Disulfuro o bisulfuro de carbono
ICSC: 0022 Octubre 2000
CAS: 75-15-0 Bisulfuro de carbono RTECS: FF6650000 Sulfuro de carbono NU: 1131 CS2 CE Índice Anexo I: 006-003-00-3 Masa molecular: 76.1 CE / EINECS: 200-843-6 TIPO DE PELIGRO / EXPOSICIÓN
PELIGROS AGUDOS / SÍNTOMAS
PREVENCIÓN PRIMEROS AUXILIOS / LUCHA CONTRA INCENDIOS
INCENDIO Altamente inflamable. Muchas reacciones pueden producir incendio o explosión. En caso de incendio se desprenden humos (gases) tóxicos e irritantes
Evitar las llamas, NO producir chispas y NO fumar. NO poner en contacto con superficies calientes
Polvo, agua pulverizada, espuma, dióxido de carbono
EXPLOSIÓN Las mezclas vapor/aire son explosivas
Sistema cerrado, ventilación, equipo eléctrico y de alumbrado a prueba de explosión. Evitar la generación de cargas electrostáticas (por ejemplo, mediante conexión a aire). NO utilizar aire comprimido para llenar, vaciar o manipular. NO exponer a fricción o choque
En caso de incendio: mantener fríos los bidones y demás instalaciones rociando con agua
EXPOSICIÓN ¡HIGIENE ESTRICTA! ¡EVITAR LA EXPOSICION DE MUJERES (EMBARAZADAS)!
¡CONSULTAR AL MEDICO EN TODOS LOS CASOS!
Segunda Parte II-4: Anexos. Anexo I
395
TIPO DE PELIGRO / EXPOSICIÓN
PELIGROS AGUDOS / SÍNTOMAS
PREVENCIÓN PRIMEROS AUXILIOS / LUCHA CONTRA INCENDIOS
Inhalación Vértigo, dolor de cabeza, nauseas, jadeo, vómitos, debilidad, irritabilidad y alucinación
Ventilación, extracción localizada o protección respiratoria
Aire limpio, reposo Proporcionar asistencia médica
Piel
¡PUEDE ABSORBERSE! Piel seca, enrojecimiento, (Para mayor información, véase inhalación)
Guantes de protección Traje de protección
Aclarar con agua abundante, después quitar la ropa contaminada y aclarar de nuevo. Proporcionar asistencia médica
Ojos Enrojecimiento, dolor
Gafas ajustadas de seguridad, pantalla facial o protección ocular combinada con la protección respiratoria
Enjuagar con agua abundante durante varios minutos (quitar los lentes de contacto si puede hacerse con facilidad), después proporcionar asistencia médica
Ingestión (Para mayor información, véase inhalación)
No comer, ni beber, ni fumar durante el trabajo
No dar nada a beber. Proporcionar asistencia médica
DERRAMES Y FUGAS ENVASADO Y ETIQUETADO Evacuar la zona de peligro. Consultar a un experto. Eliminar toda fuente de ignición, absorber el líquido residual en arena o absorbente inerte y trasladarlo a un lugar seguro. NO verterlo al alcantarillado. (Protección personal adicional: traje de protección completa incluyendo equipo autónomo de respiración)
Hermético. Envase irrompible; colocar el envase frágil dentro de un recipiente irrompible cerrado. No transportar con alimentos y piensos Clasificación UE Símbolo: F, T R: 11-36/38-48/23-62-63 S: (1/2-)16-33-36/37-45 Clasificación NU Clasificación de Peligros NU: 3 Riesgos Subsidiarios de las NU: 6.1 Grupo de Envasado NU: I
RESPUESTA DE EMERGENCIA ALMACENAMIENTO Ficha de emergencia de transporte (Transport Emergency Card): TEC (R)-30S1131 Código NFPA: H 3; F 4; R 0
A prueba de incendio. Separado de oxidantes, alimentos y piensos Mantener en lugar fresco. Almacenar en un área sin acceso a desagües o alcantarillas
Segunda Parte II-4: Anexos. Anexo I
396
DATOS IMPORTANTES ESTADO FÍSICO; ASPECTO Líquido incoloro, de olor característico PELIGROS FÍSICOS El vapor es más denso que el aire y puede extenderse a ras del suelo; posible ignición en punto distante. Como resultado del flujo, agitación, etc., se pueden generar cargas electrostáticas PELIGROS QUÍMICOS Puede descomponerse con explosión por choque, fricción o sacudida. Puede explotar por calentamiento intenso. La sustancia puede incendiarse espontáneamente en contacto con el aire y con superficies calientes, produciendo humos tóxicos de dióxido de azufre (ver FISQ 0074). Reacciona violentamente con oxidantes, originando peligro de incendio y explosión. Ataca algunas formas de plástico, caucho y recubrimientos LÍMITES DE EXPOSICIÓN TLV: 10 ppm; (piel) Cambio en estudio; BEI establecido (ACGIH 2004). MAK: 5 ppm; 16 mg/m³; H (absorción dérmica); Categoría de limitación de pico: II(2); Riesgo para el embarazo: grupo B (DFG, 2007)
VÍAS DE EXPOSICIÓN La sustancia se puede absorber por inhalación a través de la piel y por ingestión RIESGO DE INHALACIÓN Por evaporación de esta sustancia a 20°C se puede alcanzar muy rápidamente una concentración nociva en el aire EFECTOS DE EXPOSICIÓN DE CORTA DURACIÓN La sustancia irrita los ojos la piel y el tracto respiratorio. La ingestión del líquido puede dar lugar a la aspiración del mismo por los pulmones y la consiguiente neumonitis química. La sustancia puede causar efectos en sistema nervioso central. La exposición podría causar disminución del estado de alerta. La exposición entre 200 y 500 ppm podría causar la muerte EFECTOS DE EXPOSICIÓN PROLONGADA O REPETIDA El contacto prolongado o repetido con la piel puede producir dermatitis. La sustancia puede afectar al sistema cardiovascular y al sistema nervioso, dando lugar a enfermedades coronarias y severos efectos neurocomportamentales, polineuritis, psicosis. La experimentación animal muestra que esta sustancia posiblemente cause efectos tóxicos en la reproducción humana
PROPIEDADES FÍSICAS Punto de ebullición: 46°C Punto de fusión: -111°C Densidad relativa (agua = 1): 1.26 Solubilidad en agua, g/100 mL a 20°C: 0.2 Presión de vapor, kPa a 25°C: 48 Densidad relativa de vapor (aire = 1): 2.63
Punto de inflamación: -30°C c.c. Temperatura de autoignición: 90°C Límites de explosividad, % en volumen en el aire: 1-50 Coeficiente de reparto octanol/agua como log Pow: 1.84
DATOS AMBIENTALES La sustancia es tóxica para los organismos acuáticos
Segunda Parte II-4: Anexos. Anexo I
397
NOTAS Está indicado examen médico periódico dependiendo del grado de exposición. Esta ficha ha sido parcialmente actualizada en octubre de 2004: ver límites de exposición, respuesta de emergencia
INFORMACIÓN ADICIONAL Límites de exposición profesional (INSHT, 2012): VLA-ED: 5 ppm; 15 mg/m3 Notas: Agente químico que tiene establecido un valor límite indicativo por la UE; vía dérmica; alterador endocrino VLB: 1.5 mg/g creatinina en orina de ácido 2-Tiotiazolidín-4-carboxílico (TTCA) NOTA LEGAL Esta ficha contiene la opinión colectiva del Comité Internacional de Expertos del IPCS y es independiente de requisitos legales. Su posible uso no es responsabilidad de la CE, el IPCS, sus representantes o el INSHT, autor de la versión española
© IPCS, CE 2005 Preparada en el Contexto de Cooperación entre el IPCS y la Comisión Europea © CE, IPCS, 2005 IPCS International Programme on Chemical Safety
Segunda Parte II-4: Anexo II
398
Proceso de elaboración del azúcar
En la Figura A-2.1 se muestra la caña de azúcar “quemada”, producto de la zafra.
Fig. A-2.1. Caña de azúcar
En la Figura A-2.2 se presenta el mecanismo de formación de la sacarosa.
Fig. A.2.2. Formación de la sacarosa (Charley, 1997)10
10 Charley, H. (1997). Tecnología de Alimentos Procesos Químicos y Físicos en la Preparación de
Alimentos. LIMUSA. México D.F. México
Segunda Parte II-4: Anexo II
399
A continuación se desglosa el proceso completo de obtención de azúcar a partir de
caña de azúcar. Las referencias se encuentran listadas al final de esta sección.
A-2.1. Labores de campo, cosecha y corte
El proceso productivo se inicia con la adecuación del campo (etapa previa de siembra
de la caña). La cosecha empieza cuando los tallos dejan de desarrollarse, las hojas se
marchitan y se caen y la corteza se vuelve quebradiza. Esto ocurre aproximadamente
11 ó 16 meses después de la siembra. Posteriormente se lleva a cabo:
A-2.2. Quema
La operación de quema se realiza para eliminar las hojas que son muy cortantes y
dañan a los cortadores ahuyentando la fauna nociva (víboras de cascabel, entre otros
animales) y aumentar la temperatura del tallo de 55 hasta 85°C. Estas temperaturas no
destruyen aparentemente las bacterias sensibles al calor (microorganismos termófilos),
ya que, estos se pueden encontrar tras la operación de quemado. El microorganismo
Leuconostoc mesenteroides ha sido detectado en las cañas aproximadamente con la
misma frecuencia antes y después del quemado además, observándose el rápido
aumento del nivel de dextranas en casi diez veces desde las 12 a las 48 horas, hasta
alcanzar las 3200 ppm. Cuando el leuconostoc y otras bacterias formadoras de ácido se
desarrollan en la caña de azúcar recolectada, esta se vuelve ácida. Se produce el
llamado “azúcar” invertido (glucosa+fructosa, que reduce la eficiencia de obtención de
sacarosa), ácido láctico, ácido acético y con frecuencia dextranas (Silliker et al., 1980).
A-2.3. Corte
El corte se puede realizar manual o mecánicamente. Durante este paso Leuconostoc
mesenteroides es la bacteria láctica que fundamentalmente agrede a la caña. El nivel
de exposición del tejido interno de la caña se incrementa con el corte mecanizado, el
trozado o por la quema, lo cual provoca la inactivación de las enzimas fenol-oxidasas
de acción protectora o bactericida en la planta. En caña cortada sin trozar, el contenido
de dextranas no excedió las 250 ppm en el jugo, mientras que la caña trozada exhibió
mayor velocidad de formación de dextranas, debido a la mayor área de tallos expuestos
Segunda Parte II-4: Anexo II
400
y, por lo tanto, mayor grado de infección bacteriana. Por otro lado, se reportó que en la
caña trozada, después de dos horas de acopiada, se observó la infección masiva con
Leuconostoc y otras bacterias, hasta a 15 cm (seis pulgadas) de distancia de los
extremos. Posteriormente las cañas son transportadas al ingenio azucarero Lo ideal es
que este tiempo no sea mayor de 36 horas para evitar pérdidas de sacarosa (Chang et
al., 2012).
A-2.4. Molienda
Al llegar la caña al ingenio azucarero, pasa a los desfibradores, aparatos que se
emplean para completar la preparación y la desintegración de la caña y facilitar así la
extracción del jugo de la caña (Hugot, 1963). El jugo mixto es un medio ideal para el
desarrollo de muchos microorganismos (se llama jugo mixto o mezclado a la suma del
jugo extraído por prensado y el extraido por imbibición con agua caliente proveniente de
los evaporadores donde se concentra el jugo). Además, tiene un grado Brix (porcentaje
de sacarosa P/V o equivalente en sólidos solubles) de 10 a18, un pH de 5.0 a 5.6,
abundante sales orgánicas e inorgánicas, aminoácidos y otros nutrientes y una
temperatura media entre 25 a 30°C. El recuento de bacterias del jugo procedente del
primer rodillo es de 105 a 107 / mL para la caña normal y aproximadamente de 108 / mL
para la caña ácida (Silliker et al., 1980). Las condiciones de operación de los molinos y
la calidad de la caña contribuyen a las pérdidas de sacarosa que pueden ocurrir por
inversión ácida, inversión enzimática e infección microbiana. La inversión ácida
comprende la inversión química de la sacarosa en glucosa y fructosa. Ocurre en
condiciones ácidas; la tasa de inversión se incrementa con pH bajos y altos niveles de
temperatura, mientras que la destrucción enzimática resulta por la acción
principalmente de la invertasa, que actúa como un catalizador para promover la
inversión de la sacarosa. La invertasa puede estar presente en la caña de azúcar
naturalmente o ser producida por las levaduras Saccharomyces sp. que se desactivan a
temperaturas superiores a 65ºC (Calero-Salazar et al., 2009). Bajo condiciones
favorables de temperatura y humedad, la dextranasacarasa hidroliza la sacarosa y
forma dextranas. Junto con el jugo, estas dextranas se extraen en los molinos y
contaminan los flujos del llamado “ingenio” en México o “central” en otros países
Segunda Parte II-4: Anexo II
401
hispanoparlantes y su nivel en el jugo llega a exceder las 10,000 ppm (1%) en los casos
extremos. La elevada viscosidad de los jugos y la presencia en ellos de dextranas de
elevada masa molecular junto a otros sólidos insolubles, obstruyen las mallas filtrantes
y provocan pérdidas de los jugos por derrames de los molinos a los drenajes.
A-2.5. Clarificación
El jugo obtenido es ácido (pH aproximado 5.0), opaco y turbio. Mediante tratamiento
químico con cal y calentamiento cercano a su punto de ebullición (105°C), se neutraliza
la acidez. La viscosidad de la solución durante la clarificación del azúcar reduce la
velocidad de la precipitación de las impurezas, forma incrustaciones, disminuye la
eficiencia calorífica del flujo y empobrece, de manera general, ese proceso. El jugo que
proviene de las cañas deterioradas con valores de pH más ácidos, consume mayor
cantidad de cal para su neutralización, lo cual le aporta mayor turbiedad y genera mayor
volumen de “cachaza” como se conoce a estos sólidos o “lodos” con características
pegajosas que colmatan los filtros prensa (Geplacea, 1988).
A-2.6. Evaporación
Durante esta etapa el jugo clarificado es sometido al proceso de evaporación en
equipos conocidos como “tachos” que operan al vacío, para eliminar la mayor cantidad
de agua contenida a temperaturas de ebullición bajas que impidan la caramelización del
azúcar y obtener la llamada meladura (jarabe). En este paso, la presencia de las
dextranas provoca el aumento de incrustaciones en las superficies de calentamiento y
con ello un mayor gasto energético. El tiempo de cocción de las masas de jugo mixto o
mezclado también se incrementa y el llamado agotamiento (eliminación de agua para
promover la sobresaturación de las soluciones de sacarosa) de estas se reduce.
A-2.7. Cristalización
Este proceso se lleva a cabo por evaporación, donde al sobre saturase la solición y
agregar pequeños cristales de azúcar provenientes de los sistemas de centrifugación
como “siembra” se cristaliza la sacarosa y se forma la llamada “masa cocida”
Segunda Parte II-4: Anexo II
402
(“massecuite” o “masacote” o mazacote11, mezcla de cristales de azúcar y meladura). Si
existe la presencia de dextranas provocarán un incremento del tiempo de cristalización
del azúcar, ya que la masa cocida en los cristalizadores se enfría más de lo apropiado y
aumenta aún más la anormal viscosidad del fluido, se incrementan los tiempos de
lavado en las centrífugas para alcanzar la calidad requerida del azúcar, así como los
tiempos totales de la centrifugación y de la purga. El azúcar crudo, derivado de tales
masas cocidas, es pegajoso, difícil de manipular, secar y envasar. Algunos estudios
han confirmado que la calidad de la masa cocida afecta significativamente el
rendimiento de los cristales de azúcar, pues se reduce al 86% en el caso de 755 ppm
de dextranas en las masas cocidas con 84.3% de pureza. La reducción de la velocidad
de cristalización del azúcar se manifiesta específicamente en la disminución de la
velocidad de crecimiento del cristal en los ejes a y b. Es decir, los cristales de azúcar se
deforman en el eje c, y adquieren una forma alargada con las dextranas ocluidas en
ellos. Este cristal, llamado “de aguja” (ver Figura 4 de la p. 284 de este documento),
reduce la eficiencia de la purga de las masas cocidas durante la centrifugación, lo cual
provoca la pobre separación del cristal de las mieles y decae la calidad de refinación del
azúcar (Calahorro, 1995; Cuddihy et al., 1998)
A-2.8. Centrifugación
El proceso de centrifugado separa el grano (azúcar) del líquido (miel). Después de un
giro inicial corto, el azúcar se lava con agua caliente para eliminar residuos de miel que
están sobre la superficie de los cristales. La masa evaporada en un sistema de triple
efecto (tres cuerpos de evaporación idénticos conocidos como “tachos”) del primer
“tacho”, masa A, al pasar por la centrífuga produce el azúcar A y la miel A. La miel A
pasa al segundo “tacho” donde vuelve a cristalizarse formando la masa B que a su vez
se vuelve a separar en las centrífugas. La miel B pasa al tercer “tacho” donde se repite
el proceso. La meladura final, después de separar los granos de la masa C, se llama
11 Diccionario de la Real Academia Española (http://dle.rae.es/?id=OgTyflL): 6. m. Arg., Bol., Par., R. Dom., Ur. y Ven. Masa espesa y pegajosa. 7. m. Arg. Pasta hecha de los residuos del azúcar que, después de refinada, quedan adheridos al fondo y a las paredes de la caldera. Desde el punto de vista técnico estas definiciones no son muy precisas ni correctas
Segunda Parte II-4: Anexo II
403
miel final (melaza) y se comercializa como alimento animal, como fuente de carbono
para la fermentación con Saccharomyces cerevisiae para producir alcohol etílico en los
ingenios azucareros-alcoholeros o como fuente de carbono para muchos procesos
biotecnológicos (producción de antibióticos, aminoácidos, de ácidos orgánicos, etc.,
etc.) (Asocaña, 2012; Bazúa, 1994; Bazúa y Wilke, 1977; Durán-Domínguez-de-Bazúa,
2012; Durán-Domínguez-de-Bazúa y Bernal-González, 2014; Edye et al., 2005).
A-2.9. Secado, enfriado y envasado
El azúcar húmeda se somete a calentamiento aproximadamente a una temperatura de
60°C, para secarla y reducir su humedad aproximadamente hasta 0.05% para evitar la
formación de terrones, posteriormente, es llevado a enfriadores rotatorios para disminuir
su temperatura aproximadamente a unos 40-45°C, para llevarla finalmente al proceso
de envasado (CRC, 2010).
De manera general, las pérdidas generadas por las dextranas oscilan desde 0.35 kg de
azúcar por tonelada de caña molida por la presencia de cada 1000 ppm de dextranas
en el jugo mezclado, hasta 8 kg. Cualquiera que sea el resultado, es evidente la
necesidad de eliminar las dextranas del proceso de producción de azúcar y el método
más utilizado es el uso de biocidas (Rodríguez-Berthely et al., 2015).
Las Figuras A-2.1(a) a (l) muestran el proceso completo.
a)
b)
c)
Segunda Parte II-4: Anexo II
404
d)
e)
f)
g)
h)
i)
j)
k)
l)
Fig. A-2.1. Proceso de elaboración de azúcar. a) siembra; b) quema; c) cosecha manual; d) cosecha mecanizada; e) transporte; f) troceado; g) molinos; h) Clarificación; i) Evaporación; j) centrifugación; k) secado; l) envasado
Segunda Parte II-4: Anexo III
405
Estructura del metam-sodio
Metam-sodio tiene la fórmula molecular C2H4NNaS2, y una masa molecular de 129.18 g
mol-1. A temperatura ambiente, se forma un gas incoloro, con un desagradable olor
similar al del disulfuro de carbono (Figura A-3.1). Es corrosivo para el aluminio, cobre,
zinc, y latón. Es estable en su estado seco y cristalino, y en solución acuosa
concentrada (Cremlyn, 1991; Wales, 2002).
Fig. A-3.1. Estructura del ditiocarbamato de sodio (Wales, 2002)
En dilución acuosa se descompone en el compuesto activo y volátil llamado metil
isotiocianato (MIT). El pH de la matriz afecta de manera considerable la
descomposición de metam-sodio. Los productos de descomposición varían al variar el
pH de la matriz. En pH neutro o ligeramente alcalino se obtiene MIT como producto
principal. En soluciones neutras, metam-sodio se descompone en metil isotiocianato
(MIT) e hidrogenosulfuro de sodio (NaSH) (Fig. A-3.2)
Fig. A-3.2. Degradación de metam-sodio en una solución neutra (LAINCO, 2010)
En soluciones alcalinas diluidas se produce una reacción de oxidación, caracterizada
por la formación de azufre elemental (S), MIT e hidróxido de sodio (Fig. A-3.3).
Segunda Parte II-4: Anexo III
406
Fig. A-3.3. Degradación de metam-sodio en una solución alcalina diluida (LAINCO,
2010)
En soluciones ácidas (Fig. A-3.4), se produce una descomposición no oxidativa que
inicialmente produce la mitad de MIT que se forma en la descomposición oxidativa, pero
además se produce sulfuro de sodio, metilamina y disulfuro de carbono que es el
compuesto de interés de esta investigación (Bernal-González et al., 2014).
Fig. A-3.4. Degradación de metam-sodio en solución ácida (LAINCO, 2010)
Disulfuro de carbono (Anexo 1). Se realizó una búsqueda bibliográfica sobre las
metodologías analíticas que son empleadas para la determinación del compuesto
(Tabla A-3.1).
Segunda Parte II-4: Anexo III
407
Tabla A-3.1. Metodologías analíticas empleadas para la determinación y cuantificación del disulfuro de carbono
Método Condiciones Reactivos Referencia Espectrofotométrico λ=435 nm
Celdas de cuarzo de 1 cm 400 g SnCl2 , HCl concentrado, 30 mL sol. acetato de plomo II, 35 g dietanolamina y etanol
Royer et al., 2001
HS-CG-DCE (Espacio superior o “de cabeza”-cromatografía de gases-detector de captura de electrones)
No se mencionan Muestra HCl Cloruro de estaño
Mondell y Candela, 1998
CG-EM (Cromatografía de gases-espectrometría de masas)
Columna CP-sil 5 o columna DB-1 Tiempo= 1.5-3 min Intervalo de masas m/z=78 alrededor de 10% de abundancia m/z=76
50 g muestra 150 mL sol. de cloruro de estaño (II)/ HCl 5.6M 25 mL iso-octano
Reynolds, 2006
CG-EM (Cromatografía de gases-Espectrometría de masas)
Columna DB-17 de 30 m x 0.25 mm con un espesor de película de 0.25 µL Temperatura = 240°C Horno 70°C, 2 min aumenta 20°C / min hasta 280°C Voltaje de ionización 70 eV m/z = 88
Muestras: cereales, legumbres, frutos secos, semillas, té, frutas y verduras. Solución EDTA/ cisteína Solución yoduro de metilo Solución TBA (tetrabutilamonio sulfato de hidrógeno) Diclorometano, HCl 6M, Cloruro de sodio
Nakamuri et al., 2010
FV-MEL-IR (Fase vapor-microextracción de fase líquida-espectroscopia infrarroja)
Espectrofotómetro Resolución 2 cm-1 Vel de scaneer de 10 kHz frecuencia de HeNe Región infrarroja media= 4000 a 950cm-1 Celda de flujo estándar con 2 mm de espesor ventanas de CaF2, con un espaciador de 1 mm de Pb Tubo de transferencia de acero inoxidable de diámetro interno 0.12 mm y longitud de 100 mm
2.5-5 g muestra Sol 1: EDTA 0.25M/ NaOH 045M (pH sol 9-10) Sol 2: 1 g cloruro de estaño (II) en 25 mL HCl (35/37%) diluido en 50 mL de agua destilada, tetracloretileno (blanco IR)
Gonzalvez et al., 2011
Segunda Parte II-4: Anexo III
408
Tabla A-3.1. Metodologías analíticas empleadas para la determinación y cuantificación del disulfuro de carbono (Continua….)
HS-CG-EM (Espacio superior o “de cabeza”-cromatografía de gases-espectrometría de masas)
Temperatura de inyección 120°C Temperatura de horno 60°C durante 10 min, aumentando la velocidad 20°C / min a 180°C, durante 5 min. Columna HP5MS de 30 m x 0.32 mm y 0.25 µm Línea de transferencia T =280°C MS 70 eV Flujo de helio 0.3 mL/min masas de m / z 40 hasta 500 Tdet 250°C.
Muestra HCl/ Cloruro de estaño (II) Iso-octano
Gonzalvez et al., 2011
HS-CG-EM (Espacio superior o “de cabeza”-cromatografía de gases-espectrometría de masas)
Temp inyector: 200°C Temp detector: 300°C T columna inicial: 30°C hasta 220°C Gas portador N2 a 122 kPa (3 psi) Tiempo de retención 2min Columna capilar de sílice fundida (30 m x 0.53 mm) recubierta con una película de poli (etilenoglicol) de 1µm de espesor DB-WAX
36 g SnCl2 en 640 mL HCl concentrado aforado a 1000 mL con agua ultrapura 100 g dietanolamina en 1000 mL de agua ultrapura, 20 g o 20 mL de muestra
Royer et al., 2001
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ISBN Obra Independiente: 978-607-96506-1-2 Este libro se terminó de editar el martes 30 de abril de 2019 con base en la edición
hecha el lunes 27 de marzo de 2017 en los Laboratorios de Ingeniería Química Ambiental y de Química Ambiental, DIQ-FQ-UNAM con la RACAM
/
Edited April 30, 2019 based on the edition made March 27, 2017 in the Laboratories for Environmental Chemical Engineering and Chemistry, DIQ-FQ-
UNAM with RACAM
Responsables / Responsible persons:
Dra. Marisela Bernal González, M. en C. Rolando Salvador García-Gómez,
M. en A.I. Landy Irene Ramírez-Burgos, Profa. Dr.-Ing. María del Carmen Durán-Domínguez-deBazúa
Revisó y compiló / Reviewed and compiled by:
Profa. Dr.-Ing. María del Carmen Durán-Domínguez-de-Bazúa
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