1 master seminar fluoreszenzmessung an roten blutzellen claudia hahn 30.05.2012
TRANSCRIPT
11
Master Seminar
Fluoreszenzmessung an roten Blutzellen
Claudia Hahn
30.05.2012
22
Inhalt
Einleitung
Stokes Shift
Qualitative und quantitative Messung
Fluoreszenzmikroskop
Nachweis des Proteins NHE 7
Problem des Fluoreszenznachweises
Zusammenfassung
33
Einleitung
Fluoreszenz:Fähigkeit der Absorption von Photonen und die spätere Abgabe eines Teils der absorbierten Energie
Energie von Photonen:E = hvBetrachtung des Photons als Welle:E = hc/λ
Photonen geringer Wellenlänge besitzen eine höhere Energie als langwellige Photonen
44
http://www2.uni-siegen.de/dept/fb08/studium/pcfprakt/pics/jablonski.gif
55
Stokes Shift
Bei der Emission der Fluoreszenz wird zusätzlich Wärme abgegeben
Folge:Anregungswellenlänge ist kleiner also EnergiereicherEmissionswellenlänge ist größer also Energieärmer
Der Shift (Verschiebung) beträgt 20-50 nm
http://www.univie.ac.at/mikroskopie/3_fluoreszenz/img_fluoreszenz/stokes-shift.png
66
Emissionswellenlänge so wählen, dass sie keine andere Fluoreszenz hervorruft, die die eigentliche überlagert
Bei mehreren Parametern Emissions- und Anregungswellenlängen dürfen sich nicht überlagern
77
Qualitative und Quantitative Messung
Qualitative Messung
Änderung der Intensität durch Bindung des Liganden (Fluo-4)=> Keine Messung der Konzentration möglich
http://www.systektum.de/uploads/pics/20.4.1.Signalauswertung_Intensit_tsmessung_1.jpg
88
http://www-user.tu-chemnitz.de/~awill/diplom/Bilder/abb3_3.gif
Quantitative Messung
Abhängig von Ligandenkonzentration => Änderung der Anregungs- und Emissionsspektren (Fura-2)=> Konzentrationsbestimmung möglich
99
Fluoreszenzmikrokop
http://www.zoologie-skript.de/methoden/fluo/epifluol.jpg
1010
Nachweis des Proteins NHE 7
1 µL gewaschene Erythrocyten in 1 ml PBS suspendiert
Primärantikörper (1 Stunde)
Zugabe des Sekundärantikörpers (Rhodamin gebunden) (1 Stunde)
=> Fluoreszenzmikroskopie
1111
Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes
1212
Kontrollmessung im FACS
Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes
1313
Messergebnis der behandelten Zellen
Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes
1414
Problem des Fluoreszenznachweises
Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007
1515
Problem des Fluoreszenznachweises
Bindestelle des primären Antikörpers ist am C-terminalen Ende von NHE 7 Antikörper muss durch die Membran diffundieren
Der sekundäre Antikörper muss ebenfalls durch die Membran diffundieren
Am sekundären Antikörper ist Rhodamin gebunden
Damit die Diffusion gewährleistet werden kann muss die Membran durchlässig gemacht werden Verwendung verschiedener Suspensionslösungen
1616
PBS mit Triton-X
Triton-X = Detergenz
Permeabilisierung der Zellmembran
Zunächst Test des Verhaltens der Zellen
Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes
1717
PBS mit Glycerin
Suche nach Substanz, die Zellen permeabel machen aber nicht zerstören=> Glycerin
Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes
1818
Mikroskopie der Zellen in PBS und Glycerin
Viel Hintergrundfluoreszenz Keine spezifische Fluoreszenz erkennbar
Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes
1919
PBS mit DMSO
Zunächst der Test ob die Zellen hämolysieren
Geringfügige Formänderung, aber keine Hämolyse
Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes
2020
Auch hier konnte nur Hintergrundfluoreszenz gemessen werden
Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes
2121
Zusammenfassung der betrachteten Versuche
Die hier vorgestellten Substanzen hatten keinen Einfluss auf die Permeabilität der beiden Antikörper
Neue Methoden zur Permeabilisierung der Membran müssen gefunden werden
Verwendung eines anderen sekundären Antikörpers (Rhodamin evtl. zu groß)
Empfindlichere Nachweise: FACS oder konfokales Mikroskop
Andere Nachweismethoden als Fluoreszenz einsetzen
2222
Referenzen
Attaphitaya S, Park K and Melvin JE. Molecular cloning and functionalexpression of a rat Na+/H+ exchanger (NHE5) highly expressed in brain.J Biol Chem 274: 4383-4388, 1999.Baird NR, Orlowski J, Szabo EZ, Zaun HC, Schultheis PJ, Menon AGand Shull GE. Molecular cloning, genomic organization, and functionalexpression of Na+/H+ exchanger isoform 5 (NHE5) from human brain. JBiol Chem 274: 4377-4382, 1999.Bookstein C, DePaoli AM, Xie Y, Niu P, Musch MW, Rao MC andChang EB. Na+/H+ exchangers, NHE-1 and NHE-3, of rat intestine.Expression and localization. J Clin Invest 93: 106-113, 1994.Bookstein C, Musch MW, DePaoli A, Xie Y, Rabenau K, Villereal M,Rao MC and Chang EB. Characterization of the rat Na+/H+ exchangerisoform NHE4 and localization in rat hippocampus. Am J Physiol 271:C1629-38, 1996.Goyal S, Vanden Heuvel G and Aronson PS. Renal expression ofnovel Na+/H+ exchanger isoform NHE8. Am J Physiol 284: F467-F473,2003.
2323
Hoogerwerf WA, Tsao SC, Devuyst O, Levine SA, Yun CH, Yip JW,Cohen ME, Wilson PD, Lazenby AJ, Tse CM and Donowitz M. NHE2and NHE3 are human and rabbit intestinal brush-border proteins. Am JPhysiol 270: G29-41, 1996.Kapus A, Grinstein S, Wasan S, Kandasamy R and Orlowski J.Functional characterization of three isoforms of the Na+/H+ exchangerstably expressed in Chinese hamster ovary cells. ATP dependence,osmotic sensitivity, and role in cell proliferation. J Biol Chem 269: 23544-23552, 1994.Lang J, Untersuchungen zur Existenz von NHE-Isoformenin Plasmamembranen humaner Erythrozyten 2012Numata M and Orlowski J. Molecular cloning and characterization of anovel Na+,K+/H+ exchanger localized to the trans-Golgi network. J BiolChem 276: 17387-17394, 2001.Numata M, Petrecca K, Lake N and Orlowski J. Identification of amitochondrial Na+/H+ exchanger. J Biol Chem 273: 6951-6959, 1998.Pizzonia JH, Biemesderfer D, Abu AA, Wu MS, Exner M, Isenring P,Igarashi P and Aronson PS. Immunochemical characterization ofNa+/H+ exchanger isoform NHE4. Am J Physiol 275: F510-F517, 1998.Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007
2424
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit