1 2 4.4. 3 11.4. vl grundlagen der biophysik mol. struktur ... · 7 auftretende potentiale membran...

11
1 1 Einführung, Organisatorisches, Wurzeln der Biophysik Datum Name Thema 9 7.5. Gimsa Passive elektrische Eigenschaften (PEE): elektrische Zellstruktur, Oberflächenpotential, Elektrokinetik 10 9.5. Baumann Membran als Grenzfläche: Grenzflächenspannung, Rastermikroskopietechniken 11 14.5. Baumann Aktive elektrische Eigenschaften: Transmembranpotential, Nervenerregung, Patch-Clamp 12 16.5. Seminar/Fragestunde und TESTAT 13 21.5. Gimsa PEE: Feldverlauf um Zellen, Impedanz, induziertes Transmembranpotential 14 23.5. Gimsa PEE: elektrisch induzierte Kräfte, Elektrodeformation, Dielektrophorese, Elektrorotation 30.5. Reserve (Pfingstwoche=Projektwoche) 15 4.6. Baumann Biomechanik (BM): Ähnlichkeitsanalyse, Allometrie, Elastizität 16 6.6. Baumann BM: Skelett, Rheologie, Blutkreislauf 17 11.6. Baumann BM: Strömungen, Schwimmen und Fliegen 18 13.6. Kuznetsov BM: Zytomechanik 19 18.6. Wachner Physikal. Umweltfaktoren: ionisierende Strahlung, Einführung in die Radioökologie 20 20.6. Haberland Physikal. Umweltfaktoren: nichtionisierende Strahlen 21 25.6. Sakowski Grundlagen der Systemtheorie: Kinetik, Stoffwechsel- und Austauschsysteme 22 27.6. Sakowski Grundlagen der Systemtheorie: Modelle zur Vermehrung, Populationskinetik 23 2.7. Pufferzeit bzw. Molekülstrukturaufklärung, Moleküldynamik (NMR/ESR) 24 4.7. Baumann Moderne Entwicklungen: biologische Anwendungen der Mikrosystemtechnik 25 9.7. Seminar/Fragestunde 26 11.7. KLAUSUR VL Grundlagen der Biophysik G8 Alternativveranstaltungen http://www.g8-alternative-summit.org/de/ 30.5.07, 20Uhr, Uni Rostock, Ulmenstr. 69; Attac Diskussion 3 Aktive elektrische Eigenschaften Transmembranpotential Nervenerregung Patch Clamp 4 Transmembranpotential Auftretende Potentiale Wiederholung Diffusion/Flux/.. Nernst-Potential Goldmann-Gleichung Diffusionspotential 5 Messung des Membranpotentials Modi fie d d raft from NMI intrazelluläre Messung optisch (voltage sens. dyes) 6 Messung des Membranpotentials © Adam, Läuger, Stark: "Physikalische Chemie und Biophysik" • Messung durch Einstechen einer Glasmikroelektrode • Messung gegen Referenzelektrode über ein Voltmeter

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Page 1: 1 2 4.4. 3 11.4. VL Grundlagen der Biophysik Mol. Struktur ... · 7 Auftretende Potentiale Membran für einfache Ionen permeabel und für eine geladene Proteinsorte nicht permeabel

1

1 Einführung, Organisatorisches, Wurzeln der Biophysik2 4.4. Gimsa Mol. Struktur biol. Syst. (MSBS): Elektrostatik, Atommodelle, Orbitale, Bindungen, chem. & elektr. Potentiale3 11.4. Gimsa MSBS: molekulare & ionale Wechselwirkung, Wasserstruktur, Entropie, Molekülbewegung4 16.4. Gimsa MSBS: Aktivierungsenergie, Debye-Hückel, Inter- & intramolekulare Wechselwirkungen5 18.4. Wachner Thermodynamik (TD): Grundlagen (Rekapitulation Physik &Chemie)6 23.4. Wachner TD: Elektrodeneigenschaften, Wasser- und Ionengleichgewicht, Osmotischer Druck7 25.4. Wachner TD: Donnan-Gleichgewicht, Nernst-Gleichung, Goldmann-Gleichung,

Datum Name Thema9 7.5. Gimsa Passive elektrische Eigenschaften (PEE): elektrische Zellstruktur, Oberflächenpotential, Elektrokinetik

10 9.5. Baumann Membran als Grenzfläche: Grenzflächenspannung, Rastermikroskopietechniken

11 14.5. Baumann Aktive elektrische Eigenschaften: Transmembranpotential, Nervenerregung, Patch-Clamp

12 16.5. Seminar/Fragestunde und TESTAT

13 21.5. Gimsa PEE: Feldverlauf um Zellen, Impedanz, induziertes Transmembranpotential

14 23.5. Gimsa PEE: elektrisch induzierte Kräfte, Elektrodeformation, Dielektrophorese, Elektrorotation

30.5. Reserve (Pfingstwoche=Projektwoche)

15 4.6. Baumann Biomechanik (BM): Ähnlichkeitsanalyse, Allometrie, Elastizität

16 6.6. Baumann BM: Skelett, Rheologie, Blutkreislauf17 11.6. Baumann BM: Strömungen, Schwimmen und Fliegen

18 13.6. Kuznetsov BM: Zytomechanik

19 18.6. Wachner Physikal. Umweltfaktoren: ionisierende Strahlung, Einführung in die Radioökologie

20 20.6. Haberland Physikal. Umweltfaktoren: nichtionisierende Strahlen

21 25.6. Sakowski Grundlagen der Systemtheorie: Kinetik, Stoffwechsel- und Austauschsysteme

22 27.6. Sakowski Grundlagen der Systemtheorie: Modelle zur Vermehrung, Populationskinetik

23 2.7. Pufferzeit bzw. Molekülstrukturaufklärung, Moleküldynamik (NMR/ESR)

24 4.7. Baumann Moderne Entwicklungen: biologische Anwendungen der Mikrosystemtechnik

25 9.7. Seminar/Fragestunde

26 11.7. KLAUSUR

VL Grundlagen der Biophysik

2

G8 Alternativveranstaltungen

http://www.g8-alternative-summit.org/de/30.5.07, 20Uhr, Uni Rostock, Ulmenstr. 69; Attac Diskussion

3

Aktive elektrische

Eigenschaften

Transmembranpotential

Nervenerregung

Patch Clamp

4

Transmembranpotential

Auftretende Potentiale

Wiederholung Diffusion/Flux/..

Nernst-Potential

Goldmann-Gleichung

Diffusionspotential

5

Messung des Membranpotentials

Modified draft from

NMI

intrazelluläre Messungoptisch

(voltage sens. dyes)

6

Messung des Membranpotentials

© Adam, Läuger, Stark: "Physikalische Chemie und Biophysik"

• Messung durch Einstechen einerGlasmikroelektrode

• Messung gegen Referenzelektrodeüber ein Voltmeter

Page 2: 1 2 4.4. 3 11.4. VL Grundlagen der Biophysik Mol. Struktur ... · 7 Auftretende Potentiale Membran für einfache Ionen permeabel und für eine geladene Proteinsorte nicht permeabel

7

Auftretende Potentiale

Membran für einfache Ionen permeabel und für eine geladene Proteinsorte nicht permeabel

Donnanpotential

Unterschiedliche Diffusionskoeffizienten der durch die Membran der Glasmesselektrode tretenden Ionen

Diffusionspotential

Membran für mehrere Ionensorten permeabelGoldmann-Gleichung

Gleichgewichtspotential, wenn Membran nur für eine Ionensorte permeabel

Nernstpotential

Eigenschaften/VerwendungBezeichnung

( ) ( ) ( )21.sin EaaiiEtrMesV ϕϕϕϕϕϕ −+−+−=Membran-potential

Diffusions-potential Elektrode 1

Diffusions-potential Elektrode 2

8

c (1)i c (2)i

Membran

ψ(2)ψ(1)

)1()1(ln)1( 0 ψµµ ezcTk iiBieli +⋅+=

)2()2(ln)2( 0 ψµµ ezcTk iiBieli +⋅+=

µiel (2) = µi

el(1)

)2()2(ln)1()1(ln 00 ψµψµ ezcTkezcTk iiBiiiBi +⋅+=+⋅+

( ) ( )( ) ( ) ( )( )1ln2ln12 iiBi ccTkez −−=−ψψ

( ) ( ) ( )( )12ln12

i

i

i

B

cc

ezTk

−=−=∆ ψψψ

Nernst-Potential I (Membran nur für eine Ionensorte durchlässig)

L

LB

NeFNRk

== /

( ) ( ) ( )( )12ln12

i

i

iM c

cFzRTV −=−=∆= ψψψ

Thermodynamische Berechnung

9

Was ist Diffusion?

Materietransport

Konzentrationsunterschiede

Brownsche Molekularbewegung

© Adam, Läuger, Stark: "Physikalische Chemie und Biophysik"

Wiederholung fürFluxberechnung

10

Brownsche Molekularbewegung

unregelmäßige Teilchenverschiebung

Zufallsbewegung

mit der Temperatur zunehmend

ungeordnete Wärmebewegung

durch thermisch bedingte Zusammenstöße

vom Botaniker Brown an Sporen entdeckt

Wiederholung fürFluxberechnung

11

1. Ficksches Gesetz

dxdcDJ i

ii −=

Flux nur in Raumrichtung x:

⇒ Flux als Funktion des Konzentrationsgradienten

⇒ ungeladene Teilchen

⇒ stationäre Bedingungen, d.h. der Konzentrationsgradient ist räumlich und zeitlich konstant

Wiederholung fürFluxberechnung

iiiii gradcDkTgradcwJ −=−=r

mit Diffusionskoeffizienten Di: [ ]smDi

2

=

[ ] 2smmolJi =

eitBeweglichk =iw

12

Elektrolytflux I

)ln(~ 0 ψµµ FzcRTgradNwcgrad

NwcJ iii

L

iii

L

iii ++−=−=rFlux eines geladenen Teilchens (i) :

bei Flux nur in x-Richtung:

)ln( 0 ψµ FzcRTdxd

NwcJ iiL

iii i ++−=

eitBeweglichk

ion Konzentrat

==

=

kTDw

c

ii

i

bei isobarer sowie isothermen Bedingungen:

+−=−=

dxdFz

dxdc

cRT

Nwc

dxd

NwcJ i

i

i

iiiiii

ψµ~

Wiederholung fürFluxberechnung

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13

Elektrolytflux II

+−=−=

dxdFz

dxdc

cRT

Nwc

dxd

NwcJ i

i

i

iiiiii

ψµ~

:manerhält mit kTwD ii =

+−=

dxd

RTFcz

dxdcDJ iii

iiψ

Nernst-Planck-Gleichung

Wiederholung fürFluxberechnung

14

Nernst-Potential II

+−=

dxd

RTFcz

dxdcDJ iii

iiψ

Bedingungen:

cI = konstant bis xI

cII = konstant ab xII

∆c/ ∆ x = konstant zwischen xI und xII

als Spezialfall der Nernst-Planck-Gleichung

ψψ dRTFczdc

dxd

RTFcz

dxdcDJ ii

iiii

ii +=

+−== 0Gleichgewicht =>

Integration => II

Ii

i

III

icc

FzRT ln−=−=∆ ψψψ Nernst-

Potential

15

Einfacher Fall beim Nernstpotential (Gleichgewichtszustand):

=> Membran nur für eine Ionensorte (z.B. K) permeabel

In der Realität: => Membran für mehrere Ionensorten permeabel

Goldman-Gleichung

IIK

IKIII

cc

FRT ln−=−=∆ ψψψ

=> Goldman-Gleichung als Lösung der Nernst-Plank-Gleichungerforderlich

cKa

cKi ≠

cNaa

cNai ≠

cCli

cCla

=> kein echtes Gleichgewichtmehr möglich weil

16

+−=

dxd

RTFcz

dxdcDj ψυυυ

υυ

Herleitung Goldman-Gleichung INernst-Plank-Gleichung

x

Φ

0 d

V < 0m

innen aussen Menbran

Vm

0c ci a

Analytische Lösung der Differentialgleichung mit folgenden Randbedingungen möglich:

Die elektrische Feldstärke in der Membran ist konstant (gute Näherung bei kleiner Ionenkonzentration in der Membran)

dVE

dxd

NRkNFe

mit

m

LB

L

==

==

ψ//

:

⋅⋅

⋅⋅−−=

+−=

dTkVezc

xcD

dxd

RTFcz

dxdcDj

B

mυυ

υυ

υυυυυ ∂

∂ψ

• Membran ist in stationärem Zustand, d.h. bei konstanter Außenkonzentration ist die Innenkonzentration ebenfalls konstant

• Membran wird als homogene Phase aufgefasst, d.h. jede Ionensorte hat einen ortsunabhängigen Diffusionskoeffizienten und sie wandern unabhängig durch die Membran

17

Herleitung Goldman-Gleichung II

jυ = −Dυ∂cυ

∂x− cυ ⋅

zυe ⋅VmkB ⋅T ⋅d

Differentialgleichung:

Lösung der Differentialgleichung mit obigen Randbedingungen:

x

Φ

0 d

V < 0m

innen aussen Menbran

Vm

0c ci a

)1(

)(

TkVez

B

mTkVez

ia

B

m

B

m

eTdk

eVzDeccgj⋅⋅

⋅⋅

−⋅

⋅⋅−⋅=

υ

υ

υυυυυυ )()0(

:mitdcc

ccg

ai

υ

υ

υ

υυ ==

(Verteilungskoeffizient)

jυ = PυzυeVmkBT

(cυa − cυ

i ⋅ezυ e⋅VmkB ⋅T )

(1 − ezυ e⋅VmkB ⋅T ) d

DgP υυυ

⋅≡ :mit

(Permeabilitätskoeffizient)18

I = zυυ∑ jυ =

!0

jK + jNa − jCl =!0

PK ⋅eVmkBT

(cKa − cK

i ⋅ ee⋅VmkB ⋅T )

(1 − ee ⋅VmkB ⋅T )

+ PNa ⋅eVmkBT

(cNaa − cNa

i ⋅ ee ⋅VmkB ⋅T )

(1 − ee⋅VmkB ⋅T )

− PCl ⋅eVmkBT

(cCla − cCl

i ⋅ ee⋅VmkB ⋅T )

(1 − ee ⋅VmkB ⋅T )

= 0

PK (cKa − cK

i ⋅ ee⋅VmkB ⋅T ) + PNa (cNa

a − cNai ⋅ e

e ⋅VmkB ⋅T ) − PCl (cCl

a − cCli ⋅ e

e ⋅VmkB ⋅T ) = 0

PKcKa + PNacNa

a − PClcCla = (PKcK

i + PNacNai − PClcCl

i ) ⋅ ee ⋅VmkB ⋅T

Herleitung Goldman-Gleichung III

++++⋅

==

−+−+⋅

aClCl

iNaNa

iKK

iClCl

aNaNa

aKK

miClCl

iNaNa

iKK

aClCl

aNaNa

aKKB

cPcPcPcPcPcP

FTRV

cPcPcPcPcPcP

eTk lnln

Goldmann-Gleichung

x

Φ

0 d

V < 0m

innen aussen Menbran

Vm

0c ci a

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19

Ruhemembranpotential & Goldmann-Gleichung

Verallgemeinerte Goldmann-Gleichung

Einfluss einer bestimmten Ionenart um so stärker, jea) größer das Konzentrationsgefälleb) höher die Permeabilität

Ruhezustand: PK : PNa : PCl = 1 : 0,04 : 0,45

++++⋅

= aClCl

iNaNa

iKK

iClCl

aNaNa

aKK

m cPcPcPcPcPcP

FTRV ln

+

+⋅

=

∑∑

∑∑

Anionen

a

Kationen

i

Anionen

i

Kationen

a

m

cPcP

cPcP

FTRV

µµυυ

µµυυ

ln

20

Auftretende Potentiale

( ) ( ) ( )21.sin EaaiiEtrMesV ϕϕϕϕϕϕ −+−+−=Membran-potential

Diffusions-potential Elektrode 1

Diffusions-potential Elektrode 2

++++⋅

= aClCl

iNaNa

iKK

iClCl

aNaNa

aKK

m cPcPcPcPcPcP

FTRV lnMembranpotential

21

Einleitung zum Diffusionspotential I

© Adam, Läuger, Stark: "Physikalische Chemie und Biophysik"

Elektrische Potentialdifferenz durch unterschiedliche Beweglichkeit derIonen eines Salzes in einemKonzentrationsgradienten

Aufgebaute Spannung = Diffusionspotential

Elektrisches Feld behindert Diffusiondes „schnelleren“ Ions und beschleunigtdas Gegenion

Flüsse beider Ionen schließlich gleich groß

Auftreten in flüssiger Phase und Phasen,die von einer Membran getrennt sind

Aus Grundbedingungen der Elektro-neutralität zu berechnen

−+ > DD

22

Berechnung des Diffusionspotentials II

−+ = jjPositiver und negativer Fluß ist gleich

+=

+ −−−

−+++

+ dxd

RTFcz

dxdcD

dxd

RTFcz

dxdcD ψψEinsetzen der Nernst-Plank-

Fluxgleichungen

dxdccF

RTDDDD

dxd 1

−+

−+

+−

−=ψ( ) ( ) ( )

1 und 1 :sowie :mit

−===≈

−+

−+

zzxcxcxc

Integration über Membrandicke bzw. Kapillarlänge d ( ) ( ) ( )

( )0ln0cdc

FRT

DDDDdVDiff

−+

−+

+−

=−= ψψ

23

Auftretende Potenziale

( ) ( ) ( )21.sin EaaiiEtrMesV ϕϕϕϕϕϕ −+−+−=Membran-potenzial

Diffusions-potenzialElektrode 1

Diffusions-potenzialElektrode 2

++++⋅

= aClCl

iNaNa

iKK

iClCl

aNaNa

aKK

m cPcPcPcPcPcP

FTRV lnMembranpotenzial

Medium

ElektrDiff c

cFRT

DDDDV .ln

−+

−+

+−

=Diffusionspotenzial Bei KCL ist

−+ ≈ DD

Für Gesamtbetrachtung zusätzlich Elektrodenpotenziale beachten! 24

Ion Konzen trationim Axonc i (m Mo l/l )

Konzen trationim Bl utc a (m Mo l/l )

Ne rns t-P oten tial

V 0 (mV)

K+ 400 20 -75

Na + 50 440 +102

Cl- 40 ....150 560 -68. ...-33

Welches Ion bestimmt das Membranpotenzial?

++++⋅

= aClCl

iNaNa

iKK

iClCl

aNaNa

aKK

m cPcPcPcPcPcP

FTRV ln

Bei Gliazellen entspricht Ruhepotenzial dem Kaliumpotential

Bei Neuronen meist geringer (-55 bis – 65 mV) => geöffnete Natriumkanäle

Ruhezustand: PK : PNa : PCl = 1 : 0,04 : 0,45

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25

NervenerregungFunktion Ionenkanal

Verlauf Aktionspotenzial

Auslösung des Aktionspotenzials

26

Neuronen auf Elektroden(nach 3 Tagen auf dem Chip)

(REM Bild vom EM Zentrum Universität Rostock)

DAB gefärbte Zellen auf Neurochip (nach 4 Wochen auf dem Chip)

(DAB Bild von Simone Stüwe)

Neuronen auf Sensorchip

27

Messung Aktionspotenziale

Parallele Messung an verschiedenen Elektroden auf dem Neurosensorchip.

28

Native Aktivität

Blockade des GABAAReceptors

Nur NMDA-Rezeptor modulierte Aktivität

Substanzspezifische Antwort

29

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0.1 1 10 100

TMTC Konzentration [µM]

RückenmarkAuditory Cortex

Gewebespez. Dosis-Wirkungs-Kurve

30

Grundlage der Erregbarkeit

Lipiddoppelschicht undurchlässig für geladene Teilchen

Ungleiche Verteilung von Ionen: Kalium, Natrium, Chlorid

Verteilung durch Transporter aufrechterhalten

Mit ATPase pro ATP 3 Na+ nach außen und 2 K+ nach innen

Ion Konzen trationim Axonc i (m Mo l/l )

Konzen trationim Bl utc a (m Mo l/l )

Ne rns t-P oten tial

V 0 (mV)

K+ 400 20 -75

Na + 50 440 +102

Cl- 40 ....150 560 -68. ...-33

Aufbau von Konzentrationsgradienten

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31

Die Natrium-Kalium ATPase

In Nervenzellen muss Na+ von einer Konzentration von 143mM auf 14mM (im Zytosol) und K+ von 4 auf 157mM gebracht werden.

pro ATP 3 Na+ nach außen und 2 K+ nach innen

32

Funktionsweise eines Ionenkanals

Membranintegrale Proteine als hydrophile Pore:

o selektiv für Ionen

o i. d. R. regulierbar

Bindungsstellen und Energiemaximafür spezifisches Ion

o Bindungsstellen erleichtern den Durchtritt

o Energiemaxima oszillieren beim Durchtrittdes Ions

© Dudel, Menzel, Schmidt: "Neurowissenschaften"

33

Aufbau Ionenkanal

Spannungsabhängige Kanäle mitähnlicher Struktur

o gleicher genetischer Ursprung

Ionenkanäle aus mehreren Domänen:

o 4 hydrophobe Domänen verankern den Kanal in der Membran

o 4 hydrophile Sequenzen bilden hydrophile Pore (H5)

o Sequenz A4 in der hydrophobenDomäne besitzt ATP-Bindungsstelle

o Intrazelluläre Domänen

Kaliumkanal aus vier identischen Untereinheiten

© Dudel, Menzel, Schmidt: "Neurowissenschaften"34

Modell eines Natriumkanals

35

Struktur der K-Kanals

36

Wie kommt die Ionenselektivität zustande?

Chloridionen durch Ladung selektiert:

o Pore mit positiven Bindungsstellen

Kalium im hydratisierten Zustand klein

o Durchtritt nur mit Hydrathülle

Natrium im unhydratisierten Zustandklein

o Trennung von der Hydrathülle beimDurchgang

© Kandel, Jessell, Schwartz. "Principles of neuroscience"

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37

Was ist ein Aktionspotenzial?

Informationsvermittelndes Signal

Zusammenbruch des Ruhepotenzials biszu positiven Werten von ca. +40 mV=> Depolarisierung; in ca. 500 µs

Rückkehr zum Ruhepotenzial mitHyperpolarisierung=> Repolarisierung, in ca. 500 µs

Alles-oder-Nichts-Vorgang

absolute Refraktärzeit von 2 ms(keine Erregbarkeit)

38

Verlauf des Aktionspotenzials

Depolarisierung bis zum Schwellen-potenzial

Beim Schwellenpotenzial Öffnungspannungsabhängiger Na+-Kanäle

Natriumeinstrom => Depolarisierung

Deaktivierung der Natriumkanäle beendet Einstrom

Depolarisierung verstärkt Kaliumausstrom => Repolarisierung

Inaktivierung des Natriumkanals => Refraktärzeit

39

Ströme beim Aktionspotenzial

Aktionspotenzial mit verschiedenenStromkomponenten Natriumeinstromund Kaliumausstrom

Isolierung der Ströme durch selektiveBlockade

o Natrium => Tetrodoxin, TTX

o Kalium => Triethylamin, TEA

Nachweis der Spannungsabhängigkeit

Beschreibung mit Kanalleitfähigkeiten(Hogdgin-Huxley)

40

Aktionspotenzial Auslösung

Aktionspotenzial von spannungsabhängigenNatriumkanälen getragen

Anstieg zum Schwellenpotenzial aus verschiedenen Gründen:

o Potenzialänderung durch präsynaptische Zellebei elektrischen Synapsen

o Rezeptorpotenziale bei Sinneszellen

o Neurotransmitterbindung an ligandengesteuertenIonenkanälen

o Second-messenger-Bindung z. B. Ca2+, cAMP,DAG

Depolarisierung zum Schwellenpotenzial immerdurch Natrium- oder Calciumeinstrom© Kandel, Jessell, Schwartz.

"Principles of neuroscience"

41

Kanäle können unterschiedlich getriggert werden

42

Aktionspotenzial Ausbreitung

Ausbreitung der Aktionpotenziale über lange Strecken an Axonen

Passive Ausbreitung läßt Signal anWiderständen versiegen

Aktionspotenzial treibt benachbarteMembran über das Schwellenpotenzial

Aktive Fortleitung durch fortgesetzteAuslösung => „Zündschnureffekt“

Inaktivierung der Natriumkanäle verhindert Zurücklaufen desAktionspotenzials

© Dudel, Menzel, Schmidt: "Neurowissenschaften"

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43

Signal direction Dendrites

Cellbody

Cell body

Nucleus

Axon

Schwann cell

Signalpathway

Myelin sheath

Nodes ofRanvier

Synaptic knobs

Node of Ranvier

Myelin sheath

Schwann cell

Nucleus

Copyright © 2003 Pearson Education, Inc. publishing as Benjamin Cummings

Nervenzellen Signalleitung

44

Ausbreitung des Aktionspotentials

AP-Ausbreitungsgeschwindigkeiten in Nervenfasern (aus C.L.Schauf et al.)

2m/snein1µmNerven von Schmerzrezeptoren

50m/sja10µmNerven von Druck-rezeptoren der Haut

120m/sja20µmgroßer motorischer Nerv, Beinmuskel

25m/snein500µmRiesenaxon

vMyelin DurchmesserNerv

45

Patch-Clamp-Technik

Prinzip der Patch-Clamp-Technik

Patch-Clamp Mess-Modi

Beispiele Patch-on-Chip Systeme46

Prinzip der Patch-Clamp-Technik

von Neher und Sakmann Ende der70er erfunden (Nobelpreis 1991)

Zelle wird mit Glaselektrode angesaugt=> Gigaseal, d. h. mit > 1 GΩ

Danach entweder Herausreißen derMembran oder Öffnen der Membranunter der Elektrode

Im Membranfleck optimal nur einIonenkanal von jeder Sorte => Einzelkanalaufnahmen

Bei Öffnen der Membran: Whole-Cell-Aufnahmen

© Kandel, Jessell, Schwartz. "Principles of neuroscience"

47

Messapparatur von Neher/Sakmann

Deutsches Museum Bonn

48

Messung I

Universität Karlsruhe

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49

Mess-Schaltung

Operationsverstärker

50

Messaufbau

Charite, Berlin

51

Patch-Clamp Mess-Modi

Excised (inside-out):Zellmembraninnenseite weist nach außen;komplizierte Herstellung, Einzelkanalmessungen

Whole-Cell:Membrandurchbruch in Pipettenöffnung;Summe vieler Ionenkanäle

On-Cell:Einsaugen Zellmembranfleck ohne die Zelle zu zerstören; Einzelkanalmessungen

52

Einzelkanal-Aufnahmen

Im inside-out oder outside-out Modus

Einzelne Kanalöffnungen messbar

Gequantelter Charakter der Kanalöffnungensichtbar

Ströme zeigen immer die volle Amplitude

Kanäle können nur ganz geöffnet odergeschlossen sein

o z. B. Kaliumstrom im Inside-out-Modus

o kleine Amplitude ≈ 2 pA

© Numberger, Darguhn: "Patch-Clamp-Technik"

53

Whole-Cell-Aufnahmen

Summe aller Öffnungen eines Kanaltypenkönnen gemessen werden

Gesamtstrom über der Zellmembran

große Amplituden ≈ 800 pA

© Numberger, Darguhn: "Patch-Clamp-Technik" © Numberger, Darguhn: "Patch-Clamp-Technik"54

Ersatzschaltbild der Zelle im Patch-Clamp

Zellwiderstand R ≈ 1 GΩ

Zellkapazität C ≈ 1-10 pF

Pipettenwiderstand RS ≈ 10 MΩ(„rohe“ Elektroden mit 2 - 5 MΩ =>Zellkomponenten erhöhen Widerstand)

ER: Haltepotential

VP: Pipettenpotential (VP wird vomVerstärker angelegt bzw. gemessen, dabeimuss RS überwunden werden)

© Neher, Sakmann: "Single-channel-recording"

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55

Funktion Spannungsklemme (Voltage-Clamp)

von Cole und Curtis in den 30erJahren entwickelt

Prinzip: Spannung konstant =>Messung des Kompensationsstroms

Es wird ein Kompensationsstromerzeugt, der genauso groß ist wieder Strom der durch die Membranfließt

56

Current-Clamp-Technik

Umkehrung der Spannungsklemme

Strom wird vorgegeben und resultierende Spannung gemessen.

Gleicher Schaltkreis wie bei Voltage-Clamp mit zusätzlicherRückkopplung

57

Patch-on-Chip Systeme

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Realisierungsbeispiel AVIVA

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Realisierungsbeispiel Cytocentrics

Cytocentrics AG, Rostock60

Patch-on-Chip Gesamtsystem

© Taylor & Francis

Page 11: 1 2 4.4. 3 11.4. VL Grundlagen der Biophysik Mol. Struktur ... · 7 Auftretende Potentiale Membran für einfache Ionen permeabel und für eine geladene Proteinsorte nicht permeabel

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Einsatzgebiete

Einsatzgebiete:

Biomedizinische Forschung

Medikamentenentwicklung

Vorteile Patch-on-Chip Systeme:

geringer apparativer Aufwand (Platz, Kosten, ..)

Bedienung auch durch ungeübtes Personal

leichte Parallelisierbarkeit => hoher Durchsatz an Messungen

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LiteraturAdam – Läuger – Stark (2003), Physikalische Chemie und Biophysik , Springer Verlag

Erwin Neher und Bert Sakmann, Die Erforschung von Zellsignalen mit der Patch-Clamp Technik, Spektrum der Wissenschaft (Mai 1992)

NMI Natural and Medical Sciences Institute at University of Tuebingen, Germany

www.uni.kiel.de/zbm/forschung/patch.html

www.charite.de/gastroenterologie/Forschung/patbeisp.de

www.biologie.de/biowiki/Patch-Clamp-Technik

wwwwww.. ItbItb.uni.uni--karlsruhekarlsruhe.de.de