07/04/2016 · la maggior parte dei vettori di clonaggio derivano dal plasmide cole1 codificano per...

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Genetica dei Procarioti - 6

Dipartimento di Scienze della VitaCdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6)

Prof. Laura Marriricevimento: previo appuntamento telefonico o e-mail

A.A. 2015-16

correlato all’apparato della coniugazione che transloca DNA o substrati proteici attraverso la parete (spesso in relazione alla patogenesi)

Type IV – T4S

I batteri usano il sistema di secrezione di tipo IV (T4S) per due motivi fondamentali:

scambio genico

rilascio di molecole effettrici (EFFETTORI) a cellule eucariotiche bersaglio

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(b) transmission electron microscopic image showingT-pili and flagella on A. tumefaciens.

(a) a model for T-pilus assembly in Agrobacterium tumefaciens

VirB4–VirB8–VirB5–VirB2 interaction sequence leadto the formation of VirB2–VirB5 complexes followedby T-pilus assembly

Secretion pathway and structure of the T4S system

Ti è un esempio di plasmide batterico naturale

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secondary amine derivatives formed by condensation of an amino acid, either with a ketoacid or a sugar

Crown gall tumors

galla del colletto

Also, virulence plasmids from Salmonella, Shigella, Yersinia, Bacillus anthracis, E.coli, and others.

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PLASMIDI

Elementi genetici mobili

(mobile genetic elements,

MGEs)

MGEs: segmenti di DNA codificanti enzimi o altre proteine checonsentono lo spostamento di questi elementi nel genoma (mobilitàintracellulare) o tra cellule batteriche (mobilità intercellulare)

nella maggior parte dei casi sono molecole di DNA circolari

(1 - 1000 kb) ma anche lineari o integrati nel cromosoma

batterico (episomi)

PLASMIDI

dal 1977

Bacterium releasing DNA with plasmids

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plasmide superavvoltosupercoiled

plasmide circolare rilassato

plasmide linearizzato

nick

Le forme molecolari circolari superavvolte durante le

manipolazioni sperimentali possono rilassarsi o linearizzarsi

in seguito a rotture a singolo o a doppio filamento.

PLASMIDI

forma rilassataforma lineareforma superavvolta

forma linerizzata ( tagliata con un enzima di restrizione in un sito unico)

In un gel di agarosio e bromuro di etidio le tre forme migrano a velocità diverse e possono essere distinte

Three forms of plasmid DNA

Large-scale purification of plasmids by cesium chloride density gradient centrifugation

“old school method of purifying plasmid”since the 1950s

72-96 hrsduring this time, the CsCl forms a gradient and the molecules migrate according to their density until they float at their individual isopycnic points (the point in the gradient that equals the buoyant density of the molecule).

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un plasmide deve contenere un’origine per la replicazione del DNAun plasmide deve contenere un’origine per la replicazione del DNA

Replicazione plasmidica Replicazione plasmidica

La capacità di replicarsi autonomamente è conferita loro dalla presenza di una origine di replicazione, ori (oriV, “ori vector”)

host protein

P1

richiedono proteine plasmidiche e/o dell’ospite batterico

replicazione

(uni o bi-direzionale)

circolo rotante

REPLICONI Plasmid replication

1. Plasmid replication requires host DNA replication machinery.

2. Most wild plasmids carry genes needed for transfer and copy number control.

3. All self replication plasmids have a oriV: origin of replication

4. Some plasmids carry and oriT: origin of transfer.

5. There are 5 main “incompatibility” groups of plasmid replication. Not all plasmids can live with each other.

6. Agents that disrupt DNA replication destabilize or cure plasmids from cells.

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Funzioni dell’origine di replicazione

Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l’origine di replicazione oriV controlla:

Il numero di copie

La specificità d’ospite

I gruppi di incompatibilità

NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE

I plasmidi si replicano con due modalità diverse

Alcuni, generalmente quelli di grandi dimensioni, si replicano in

maniera coordinata con la replicazione del cromosoma batterico

e si dicono sottoposti a

controllo stringente

In genere sono presenti in una o poche copie per batterio.


Altri, in genere di piccole dimensioni, si replicano in maniera

indipendente dalla replicazione batterica e si dicono sottoposti a

controllo rilassato

Sono presenti in molte copie - fino a 1000 - per batterio.

Plasmidi ori N. di copie

PUC e derivati ColE1 500-700

pACYC e derivati p15A 10-12

pSC101 e derivati Psc10 1-5


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HIHG

COPY

NUMBER

Sistema di ripartizioneLOW

COPY

NUMBER

Sistema di ripartizione

Bacterial plasmids encode partitioning (par) loci that ensure ordered plasmid segregation prior to cell division

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Plasmid R1 was first isolated from Salmonella paratyphiPlasmid R1-encoded ParMRC plasmid segregation system.

The parMRC operon.

parC is composed of two blocks of five short repeats, which are interrupted by a 39 bp region containing the promoter for parM and parR (PMR).

ParR, an adaptor protein, binds to parC and represses transcription.

ParR, an adaptor protein, binds to parC and represses transcription.

PlasmidsParRParM

undergo catastrophic disassembly following ATP hydrolysis to ADP plus inorganic phosphate (Pi),

or

become capped by a ParR–parC complex and undergo stable bipolar elongation.

ParM forms short filaments in the presence of ATP, which either

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(A) Formation of MinD filament bundles in the presence of MinE, and ATP

In vitro polymerization of cytoskeletal proteins of the MinD/ParA superfamily

(B) Formation of a ParA (ParM) filament bundle in the presence of ParB (ParR), and ATP

Actina-omologo

Controllo del numero di copie

I plasmidi possono controllare il numero di copie regolando l’inizio della replicazione plasmidica

inibizione mediante RNA + proteina dell’inizio della replicazione

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Plasmidi Col:

conferiscono un vantaggio al batterio portatore nei confronti di batteri della stessaspecie o specie affini

La maggior parte dei vettori di clonaggio derivano dal plasmide ColE1

codificano per le batteriocine (scoperte daAndré Gratia nel 1925) capaci dipermeabilizzare le membrane o degradaregli acidi nucleici

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Controllo del numero di copie

ori

RNA IIRnasi H

la replicazione è innescata da un primer (RNA II), trascritto da un promotore situato 550 bp a monte di oriV.

Gli ibridi DNA:RNA formati dal filamento di DNA e dall’RNA II nascente, costituiscono un substrato per la Rnasi H che taglia l’ibrido e fornisce l’OH al 3’ per la replicazione del DNA.

oriRNA I rop

RNA II è controllato da RNA I, trascritto sul filamento opposto della stessa regione di DNA e, quindi, complementare a RNA II .

RNA I-RNA II compete con l’appaiamento tra RNA II e il filamento stampo, riducendo la frequenza di inizio della replicazione.

Il prodotto del gene rop stabilizza il complesso RNA I-RNA II , riducendo ulteriormente la frequenza di inizio.

RNA II origin

P-II

P-I

Replicazione del plasmide ColE1

RNA I

RNA II

RNA I (108 b)

RNA II is required for priming DNA synthesis at the origin. Positive regulation.

P-I & P-II: promotori

-555 -20

RNA polimerasi

RNA I è complementare a RNA II

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Funzioni dell’origine di replicazione


Il numero di copie

Lo spettro d’ospite


Alcuni plasmidi sono in grado di replicare in un numero limitato di

specie batteriche e si dicono a specificità d'ospite limitata : narrow

host range

Altri sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie

batteriche e si dicono a largo spettro d'ospite: broad host range, BHR

I plasmidi BHR derivano questa loro proprietà dal possesso di

funzioni per il riconoscimento dell' origine di replicazione, dipendono

meno, quindi, dall'apparato replicativo dell'ospite batterico

SPETTRO D’OSPITEFunzioni dell’origine di replicazione


Il numero di copie

La specificità d’ospite


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Plasmidi con la stessa origine di replicazione sono incompatibili tra

loro.

Se in uno stesso batterio entrano due plasmidi con la stessa origine

di replicazione, questa compete per componenti proteici comuni.

Come risultato nel giro di poche generazioni uno dei due plasmidi

verrà perso.

GRUPPI DI INCOMPATIBILITA’

Plasmidi con la stessa origine di replicazione sono incompatibili tra

loro.

Se in uno stesso batterio entrano due plasmidi con la stessa origine

di replicazione, questa compete per componenti proteici comuni.

Come risultato nel giro di poche generazioni uno dei due plasmidi

verrà perso.

Possono invece coesistere plasmidi con origine di replicazione

diverse che appartengono a diversi gruppi di incompatibilità

GRUPPI DI INCOMPATIBILITA’INCOMPATIBILITA’ PLASMIDICA

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MARCATORI SELEZIONABILI

I plasmidi naturali a volte veicolano uno o più geni non

essenziali capaci di conferire loro un vantaggio selettivo in

alcune situazioni.

Per es. possono codificare per tossine o resistenza agli

antibiotici

Plasmidi coniugativi e non coniugativi

Per essere coniugativo un plasmide deve possedere:

Una specifica regione di riconoscimento chiamata Ori T (origine di trasferimento)

I prodotti genici, agenti in trans, specificati dal locus tra (trasferimento)

una delle funzioni tra: sintesi del pilo coniugativo

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plasmidi privi di queste funzioni geniche non sono trasmissibili

Tuttavia . . .


se un plasmide possiede un Ori T può essere trasferito per coniugazione utilizzando funzioni helper che forniscono, in trans, i prodotti genici mancanti

Distribution of conjugative, mobilizable, and nonconjugative plasmids according to plasmid size

Smillie C et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010;74:434-452

Schematic view of the genetic constitution of transmissible plasmids.

Smillie C et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010;74:434-452

MPF: mating pair formation T4CP: Type IV coupling proteins

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Escherichia coli S17-1 λpir è in grado di mobilizzare plasmidinon coniugativi in batteri Gram-negativi grazie all’integrazionestabile nel proprio cromosoma dei geni codificanti per lefunzioni di trasferimento derivate dal plasmide RP4 cheagiscono sulla sequenza oriT presente sui plasmidimobilizzabili

Escherichia coli S17.1 λpir

geni tra

Ricevente

plasmide

coniugazione

oriT

MGEs: segmenti di DNA codificanti enzimi o altre proteine checonsentono lo spostamento di questi elementi nel genoma (mobilitàintracellulare) o tra cellule batteriche (mobilità intercellulare)

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1. Plasmid replication requires host DNA replication machinery.

2. Most wild plasmids carry genes needed for transfer and copy number control.

3. All self replication plasmids have a oriV: origin of replication

4. Some plasmids carry and oriT: origin of transfer.

5. Plasmid segregation is maintained by a par locus-a partition locus that ensures each daughter cells gets on plasmid. Not all plasmids have such sequences.

6. There are 5 main “incompatibility” groups of plasmid replication. Not all plasmids can live with each other.

7. Agents that disrupt DNA replication destabilize or cure plasmids from cells.

Sistemi di cattura di MGE dagli ambienti naturali

Metodo endogeno

ricerca di plasmidi in batteri coltivabili

etc., etc., etc.


Metodo esogeno

sfrutta il potenziale di trasferimento degli MGE

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metodo esogeno

A: INCROCI BIPARENTALI

B: INCROCI TRIPARENTALI

SISTEMI DI CATTURA DI MGE

metodo esogeno

A

INCROCI BIPARENTALI

comunità microbicadonatrice di

MGE

marcatore selezionabile

ceppo ricevente


metodo esogeno

B

INCROCI TRIPARENTALI ceppo donatore conun plasmide mob +

marcatoreselezionabile

comunità microbicadonatrice di

MGE

ceppo ricevente

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se un plasmide possiede un Ori T può essere trasferito per coniugazione utilizzando funzioni helper che forniscono, in trans, i prodotti genici mancanti

III

III

plasmidemobilizzabile

plasmideconiugativo

??

ricevente

marcatoreselezionabile


Metodo esogeno

sfrutta il potenziale di trasferimento degli MGE

PCR


PCRmetodo esogeno che individua sequenzespecifiche di un MGE in DNA provenienteda comunità microbiche

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Various reporter genes have been used to examine HGT,including the luciferase genes luxAB, the β-galactosidasegene lacZ and genes encoding fluorescent proteins such asgreen fluorescent protein (GFP).

Studying Plasmid Horizontal Transfer In Situ

Only fluorescence genes have been used for the in situdetection of HGT in natural environments, as no substrate hasto be added to detect the product of the expressed reportergene

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GFPLacI repressiblepromoter

gene reporterPlasmide

coniugativo

confocal scanning laser micrographs showing green fluorescenttransconjugant cells in the interstices of epidermal cells (a) and insidea stoma (b) of a bean leaf.

Horizontal gene transfer (HGT) in the phyllosphere

I biofilms offrono una nicchia ideale per lo scambio di DNA extracromosomico (plasmidi)

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