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JOURNAL OF BIOENGINEERING AND BIOMEDICINERESEARCH

Volume 5 Number 1

January April

Mexico2021

Is a multidisciplinary journal, edited by Colegio Mexicano de Ingenieros Bioquímicos, A.C, that publishes relevant and recent knowledge of elds of interest in Biochemical Engineering and Biomedical Research.

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ISSN: 2594-052X, ambos otorgados por el Instituto Nacional del Derecho de Autor.

Responsable de la última actualización de este Número, José Alberto Romero León

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JOURNAL OF JOURNAL OF

BIOENGINEERING AND BIOMEDICINERESEARCH

BIOENGINEERING AND BIOMEDICINERESEARCH

Technical editor:José Alberto Romero LeónProlongación de Carpio y Plan de Ayala s/n, Col. Santo Tomás, Alcaldía Miguel Hidalgo, C.P. 11340, Ciudad de México

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Volume 5 Number 1

January April

Mexico2021

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MICROBIOLOGY

Bacterial isolates from mucus of corals cultured ex-

situ as resource of enzymes and potential

probiotics

Salvador Embarcadero-Jiménez, Flor

N. Rivera-Orduña, En Tao Wang

1-21

Bacterias provenientes de la mucosa de corales

cultivados ex-situ como fuente de enzimas y

potenciales probióticos

ENVIRONMENTAL

AND SUSTAINABILITY

Degradación de ácido cianúrico por una

comunidad microbiana en un reactor de lecho

empacado

Silva-Lemus Irvin Alfonso, Sandoval-

Carrasco Carlos Alberto, Salmerón-

Alcocer Angélica, Ahuatzi-Chacón

Deilia

22-34

Cyanuric acid degradation by a microbial

community in a packed bed reactor

FOOD SCIENCE

Effect of probiotic microorganisms on strains of

Helicobacter pylori

Gonzalez-Magallanes B., Avilés-

Jiménez, F., Hernández-Sánchez H.

35-42

Efecto de microorganismos probióticos sobre

cepas de Helicobacter pylori

BIOMEDICINE AND

HEALTH

Assessment of broblasts inside dermal substitute

for use skin tissue engineering

Barrera-Chong Alex, Garciadiego-

Cazares David, Porras-Zamora

Karla, Márquez Erick, González-

Torres Maykel, Ibarra Clemente,

Velasquillo Cristina, Ruvalcaba-

Paredes Erika

43-52

Copyright ©2021 COLEGIO MEXICANO DE INGENIEROS BIOQUIMICOS 1

JOURNAL OF BIOENGINEERING AND BIOMEDICINE RESEARCH (2020) Vol. 5 No. 1 1-21

Research article

Bacterial isolates from mucus of corals cultured ex-situ as resource of enzymes and potential probiotics Bacterias provenientes de la mucosa de corales cultivados ex-situ como fuente de enzimas y potenciales probióticos Salvador Embarcadero-Jiménez1*, Flor N. Rivera-Orduña2, En Tao Wang2

1 Laboratorio de Corrosión Microbiológica, Instituto Mexicano del Petróleo, Mexico City, Mexico.2 Laboratorio de Ecología Microbiana, Departamento de Microbiología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, Mexico City, Mexico.

*Corresponding author: [email protected]

Recibido: 6 de octubre de 2020 / Aceptado: 24 de noviembre de 2020 / Publicado en línea: 31 de enero de 2021

Abstract.Focused on exploring the diversity and bioengineering potential of the cultivable bacteria associated with propagated corals in captivity, 63 bacterial strains were isolated from the external mucus of 5 coral species: Discosoma sp., Fungia sp., Xenia sp., Ricordea florida, and Seriatopora hystrix. Phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene classified these strains into the phyla Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes and Proteobacteria, and some of them represented potential novel taxa. The genera Vibrio, Alteromonas and Pseudoalteromonas were isolated from all the five coral species, while many others were isolated from only one or two species. In the phenotypic characterization, fourteen strains (22%) showed antimicrobial activity against at least one indicator pathogenic bacteria. The strains of Pseudoalteromonas ruthenica inhibited 6 of the 7 indicator bacteria, including the corals and fish pathogens Aeromonas bestiarum, Serratia marcescens, and Vibrio fortis. Starch hydrolysis and nitrate reduction were the common metabolic activities among the strains, suggesting that the coral-associated bacteria may be involved in the nutrient C and N recycling. All the results indicate that the corals harboured valuable bacteria with potential for biotechnological applications and potential probiotics, which may reduce the breakdown of coral reefs. As far as we know this is the first report about the culturable microbiota of Discosoma sp. and R. florida, which enlarges our knowledge about the coral-associated microorganisms and their beneficial interactions.

Keywords. Cultured corals, coral-associated bacteria, antimicrobial activity, enzymatic activities.

Resumen. Con el objetivo de explorar la diversidad y potencial biotecnológico de las bacterias cultivables asociadas a corales propagados en cautividad se aislaron 63 cepas bacterianas a partir de la mucosa externa de 5 especies de coral: Discosoma sp., Fungia sp., Xenia sp., Ricordea florida y Seriatopora hystrix. El análisis filogenético con base en las secuencias del gen 16S rRNA permitió clasificar a estas cepas en los phyla Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacteria, donde algunas de las secuencias representan potenciales nuevos taxa. Las cepas clasificadas en los géneros Vibrio, Alteromonas y Pseudoalteromonas fueron aisladas en las 5 especies de coral, mientras que otras solo fueron recuperadas a partir de uno o dos especies de coral. La caracterización fenotípica mostró que 14 cepas (22 %) mostraron actividad antimicrobiana contra al menos una bacteria patógena indicadora. Las cepas de Pseudoalteromonas ruthenica inhibieron 6 de las 7 bacterias indicadoras probadas, incluyendo Aeromonas bestiarum, Serratia

Copyright ©2021 COLEGIO MEXICANO DE INGENIEROS BIOQUIMICOS2


marcescens y Vibrio fortis, los cuales son patógenos de corales y peces. La hidrólisis de almidón y la reducción de nitrato fueron las actividades metabólicas más comunes entre las cepas, lo cual sugiere que las bacterias recuperadas podrían estar involucradas en el reciclaje de C y N. Todos los resultados indican que los corales estudiados albergan valiosas bacterias con potencial biotecnológico y como agentes de control biológico. Hasta donde sabemos este es el primer reporte sobre la microbiota cultivable de los corales R. florida y Discosoma sp., lo cual aumenta nuestro conocimiento sobre los microorganismos asociados a los corales y sus interacciones benéficas. Palabras clave. Corales cultivados, bacterias asociadas al coral, actividad antimicrobiana, actividades enzimáticas.

INTRODUCCIÓN

Los corales (phylum Cnidaria) han sido considerados holobiontes modelo al estar constituidos por animales (pólipos de coral), dinoflagelados fotosintéticos (Symbiodinium spp.), hongos filamentosos, levaduras, bacterias, arqueas y virus.1 Estos microorganismos son indispensables en el crecimiento, salud y evolución de sus hospederos, al mismo tiempo que generan una intrincada red de relaciones biológicas cuya máxima expresión son los arrecifes de coral, los cuales son ecosistemas altamente productivos con una gran diversidad biológica. La gran mayoría de los corales formadores de arrecifes se desarrollan en aguas pobres en nutrientes, por lo que la fotosíntesis, fijación del nitrógeno, y el reciclaje de nitrógeno y carbono mediados por microorganismos son procesos clave que permiten la existencia de estos ecosistemas.2 Las comunidades microbianas asociadas al coral se encuentran localizadas en numerosos sitios, tales como el esqueleto calcáreo, gastrodermis, epidermis y la capa externa de mucosa que protege al coral de la desecación y de ataques químicos y físicos.3 Los microorganismos que establecen asociaciones con los corales desarrollan la fijación de nitrógeno,4 regulan la cantidad de nitrógeno biodisponible,5 sintetizan vitaminas esenciales como B126 y desarrollan actividades antimicrobianas en contra de bacterias patógenas a través de mecanismos como la competencia por espacio físico, secuestro

de nutrientes, disrupción de señales quorum-sensing y producción de metabolitos con actividad antimicrobiana. 2,3,7,8,9 En general, todos aquellos microrganismos capaces de promover la salud de los corales pueden considerarse como probióticos.10 Por otra parte, los corales pueden representar una interesante fuente de cepas bacterianas con potencial biotecnológico al producir enzimas hidrolíticas, compuestos antimicrobianos, fungicidas, moléculas con actividad inhibidora de bioensuciamiento (biofouling), entre otras. 7,9,11,12

Así mismo, algunos compuestos activos obtenidos a partir de los tejidos del coral, como toxinas o antimicrobianos son realmente sintetizados parcial o totalmente por microorganismos asociados a los corales.13 Aunque una limitada proporción de los microorganismos asociados a los corales pueden ser cultivados en el laboratorio, este enfoque es atractivo para investigar su eco-fisiología, variación genética, evolución y potencial biotecnológico. En la mayoría de los estudios se han caracterizado los microorganismos presentes en corales colectados directamente en el mar. En contraste existe información limitada acerca de las comunidades bacterias de corales mantenidos en cautiverio dentro de sistemas cerrados sin comunicación con el océano (ex situ). Esta práctica ha derivado en la acuacultura de corales en cautiverio, la cual es una creciente actividad que permite la restauración de arrecifes en coral que han sufrido daño por las



actividad humana o por el cambio climático. Al mismo tiempo representa una fuente de organismos ornamentales para la industria de los acuarios marinos, con lo que se reduce la depredación de corales salvajes.14 Al mismo tiempo, la acuacultura de corales ha permitido la obtención de biomasa para el descubrimiento y producción industrial de fármacos.14 Aunque la composición de las comunidades microbianas puede cambiar cuando los corales son transferidos de su ambiente natural a un sistema cerrado,15 existe evidencia que sugiere que los grupos bacterianos que son específicos para cada especie de coral se establecen desde los primeros estadios de desarrollo y persisten durante el ciclo de vida del organismo.4, 16 Por lo tanto el estudio de los microorganismos asociados a corales mantenidos en cautiverio permite conocer sus relaciones simbióticas con los corales, por ejemplo al prevenir enfermedades infecciosas, al mismo tiempo que se puede explorar su potencial biomédico y biotecnológico.7, 11, 12

Con base a lo anterior, el objetivo de este trabajo fue llevar a cabo un estudio descriptivo para estimar el papel ecológico y potencial biotecnológico de las bacterias cultivables asociadas a cinco especies de corales acuacultivados. Para ello, los aislados fueron identificados mediante la secuenciación del gen 16S rRNA; se evaluó su capacidad para producir exo-enzimas, desnitrificar y evaluó su potencial antagónico sobre bacterias patógenas indicadoras.

MATERIALES Y MÉTODOS

Descripción del tanque y recolección de muestras

Los corales empleados en este trabajo fueron mantenidos en un sistema constituido por un tanque principal de 45 L y un refugio (tanque secundario) de 10 L. El sistema ha estado funcionando por más de 6 años consecutivos, y ha sido empleado como acuario de exhibición y propagación de corales mediante fragmentación manual y reproducción

asexual espontánea. El sistema de filtración consiste en roca viva (esqueletos de coral cubiertos por alga coralina incrustante e invertebrados sésiles) la cual actúa como filtro biológico. El 5 % del volumen de agua es cambiado cada semana empleando la mezcla de sal marina artificial Red Sea Coral Pro (Red Sea Aquatics Ltd, Israel). El sistema de iluminación está integrado por una lámpara con tubos fluorescentes T5 HO, uno de ellos de luz actínica (temperatura de color de 12,000 K) y otro de luz diurna (6500 K) El ciclo de iluminación al que estaba sometido el tanque fue de 8 h de luz y 16 h de oscuridad. Los especímenes de coral muestreados fueron 3 individuos clonales de Xenia sp. (Alcyonacea: Xeniidae), una colonia de 5 individuos de Ricordea florida (Corallimorpharia: Ricordeidae), 3 individuos clonales de Discosoma sp. (Corallimorpharia:Discosomidae), 3 fragmentos clonales de Seriatopora hystrix (Scleractinia: Pocilloporidae), y un espécimen de Fungia sp. (Scleractinia: Fungiidae). Estos organismos fueron seleccionados debido a que previamente se documentó su asociación con bacterias cultivables.17,18 Estas especies de coral son relativamente robustas, su reproducción asexual no es complicada y son de gran interés entre los acuaristas. La identificación de cada organismo se llevó a cabo con la guía taxonómica de Borneman19.

Al momento de realizar el muestreo, las características fisicoquímicas del agua eran las siguientes: temperatura 26 °C, gravedad específica 1.026, alcalinidad 107 ppm como CaCO3, pH 8.4, nitrato y fosfato indetectables mediante métodos colorimétricos. La mucosa de cada espécimen fue recuperada con la ayuda de una micropipeta, recolectando entre 100 a 500 μL de muestra. Adicionalmente, se emplearon asas microbiológicas desechables para recolectar la muestra al raspar ligeramente la superficie del coral. Una vez recolectada la muestra cada asa fue sumergida y agitada en tubos con 1 mL de agua marina artificial estéril (AMA), la cual fue preparada con la mezcla



de sales Red Sea Coral Pro. Adicionalmente se recuperaron 15 mL de agua del tanque con la finalidad de determinar el número de bacterias cultivables presentes en la columna de agua.

Cuantificación y aislamiento de los microorganismos

Para cuantificar las bacterias presentes en la mucosa colectada y en la columna de agua se prepararon diluciones seriadas de las muestras con un factor de 10 hasta la dilución 10-5, empleando para ello AMA como diluyente. Se tomaron alícuotas de 50 μL de cada dilución y se sembraron por triplicado mediante el método de dispersión en Agar Marino 2216 (AM 2216), el cual se preparó siguiendo la formulación de Difco. El medio estaba suplementado con glicerol al 1 % (v/v) como fuente complementaria de carbono. Cada dilución se sembró por triplicado.

Las placas se incubaron a 28 °C y se mantuvieron en observación hasta por 96 h. Para el aislamiento de los microorganismos, 50 a 100 μL de cada muestra de mucosa fueron inoculadas mediante la técnica de dispersión en superficie y estría cruzada en cajas Petri con medio AM 2216. Este medio se suplementó con glicerol al 1 % (v/v). Las cajas fueron incubadas a 28 °C hasta por 96 h. Al mismo tiempo se inocularon cajas con medio Gause17 (sin antibióticos), las cuales se incubaron hasta por 10 días. Este medio está diseñado para el aislamiento de bacterias filamentosas del phylum Actinobacteria. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se seleccionó una colonia bacteriana de cada morfotipo identificado, la cual se volvió a sembrar mediante estría cruzada en placas con AM 2216, esto con la finalidad de obtener cultivos axénicos, los cuales fueron conservados mediante criopreservación.

Extracción del ADN, amplificación por PCR y secuenciación del gen 16S rRNA bacteriano

Para la extracción del ADN genómico, se procedió a cultivar cada cepa en un vial con 5 mL de medio caldo marino 2216 (CM 2216). Las cepas se incubaron a 28 °C por 24 - 48 h. Enseguida se recuperó el paquete celular mediante centrifugación (7155 ×g por 5 min). La extracción del ADN se realizó de acuerdo al protocolo descrito por Hoffman y Winston.20

La integridad del ADN total se verificó por medio de electroforesis en un gel de agarosa al 1 % (p/v), empleando regulador TAE 1×. Para observar las bandas de ADN los geles se tiñeron en bromuro de etidio y se observaron bajo luz UV en un transiluminador AlphaImager (Alpha Innotech, EE. UU.), equipado con una cámara digital. El gen 16S rRNA de cada cepa fue amplificado con los iniciadores 27F (5 -́AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 )́ y 1492R (5 -́TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACTT-3 ́).21 La amplificación se llevó a cabo en un volumen de 25 μL de reacción, con 25 a 50 ng de ADN molde, 10 pMol de cada iniciador y 1 U de la polimerasa DreamTaq (ThermoFisher Scientific, EE.UU.). La amplificación se llevó a cabo en un termociclador Veriti de 96 pozos (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, EE. UU.). La calidad e integridad de los productos de PCR se verificó mediante electroforesis. Los productos de PCR fueron purificados empleando el kit GeneJET (ThermoFisher Scientific, EE. UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los amplicones fueron enviados a Macrogen Inc. (Seul, Corea del Sur), para su secuenciación.

Análisis filogenético

Las secuencias obtenidas fueron comparadas en la base de datos del NCBI GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), mediante búsqueda BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).



A continuación se realizó un alineamiento múltiple con el programa CLUSTAL X versión 2.122 de las secuencias problema y de las secuencias de referencia que mostraron los mayores porcentajes de identidad.

A continuación se eliminaron sitios ambiguos en el alineamiento empleando el software Seaview versión 4.4.2.23 Con este conjunto de datos se realizó un análisis de inferencia filogenética por Máxima Verosimilitud en la plataforma PhyML (http://atgc.lirmm.fr/phyml/),24 y el modelo de sustitución nucleotídica se estimó con el software jModeltest versión 2.1.7 con base en el criterio de información de Akaike (AIC).25 El modelo seleccionado para el árbol filogenético fue el GTR+I+G, con una proporción de sitios invariantes (I) de 0.340, y una distribución gamma (Γ) de 0.777; con A=0.250, C=0.230, G=0.315, T = 0.205. La robustez de cada nodo del árbol fue probada por el método de bootstrap a través de 1000 pseudo-réplicas. Como grupo externo se empleó a Anabaena variabilis ATCC 29413 (Figura 1). Las similitudes entre las secuencias fueron calculadas con el software MatGAT versión 2.01.26 La asignación taxonómica fue determinada siguiendo los criterios de Roselló-Mora.27 Todas las secuencias del gen 16S rRNA fueron depositadas en el GenBank del NCBI bajo los números de acceso KP843663-KP843722 y KR108215-KR108217.

Ensayo de inhibición microbiana

Debido a que los microorganismos marinos son considerados potencialmente productores de nuevos antibióticos, y no solo para patógenos de animales acuáticos, la actividad antibacteriana y antifúngica de cada aislado fue probada en contra de los siguientes microorganismos indicadores de importancia clínica: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Kocuria rhizophila ECOM1, Serratia marcescens DZM, Escherichia coli

ECOM3, Pseudomonas aeruginosa ECOM2 y Candida albicans ATCC 10231. Asimismo, se incluyeron dos cepas de patógenos potenciales para animales acuáticos: Aeromonas bestiarum D12 y Vibrio fortis VSP. Para evaluar la actividad inhibidora o antagónica se empleó el método de la gota.28 Para ello cada aislado y microorganismo indicador fue cultivado por separado en viales conteniendo 5 mL de CM 2216 e incubado por 24 h a 28 °C en cultivo sin agitación hasta alcanzar una DO600=1.0. Entonces cada bacteria indicadora fue sembrada empleando un hisopo estéril en cajas con AM 2216 (se añadieron 100 μL por placa).

Posteriormente, se colocaron gotas de 5 μL de cada aislado por triplicado sobre el medio sólido previamente inoculado con el microorganismo indicador, y enseguida fueron incubadas por 24 a 36 h a 28°C. Como control negativo se colocaron gotas del medio CM 2216 estéril. Una zona libre de crecimiento bacteriano alrededor de cada aislado fue considerada como inhibición positiva (Figura 2).

Los índices de inhibición fueron calculados al dividir el diámetro de la zona de inhibición entre el diámetro de la colonia formada por cada cepa probada. Subsecuentemente se preparó un medio de cultivo libre de células y extractos orgánicos con los aislados que presentaron halos de inhibición sobre los microorganismos indicadores. Para ello, cada aislado fue cultivado sin agitación en un matraz con 30 mL de CM 2216, los cuales fueron incubados por 2 a 4 días a 28 °C, hasta que alcanzaron una densidad óptima (DO600=1.0).

Transcurrido el tiempo, 5 mL del cultivo fue centrifugado a 10,000 ×g y pasado a través de un filtro estéril desechable CORNING con poros de 0.22 μm de diámetro (Corning Inc, Alemania), esto con la finalidad de remover las células bacterianas. La actividad antibacteriana del sobrenadante libre de células fue evaluada



Fig. 1. Árbol filogenético de las secuencias del gen 16S rRNA de las cepas recuperadas a partir de la mucosa externa de los corales. El árbol fue construido mediante el método de máxima verosimilitud. A) Filogenia de los phyla Actinobacteria, Firmicutes y Bacteroidetes. B) Filogenia de las secuencias clasificadas en el phylum Proteobacteria. Los valores de Bootstrap mayores al 50 % fueron indicados en los nodos. Las secuencias acompañadas con el triángulo negro corresponden a las cepas que presentaron actividad antimicrobiana contra una o más bacterias indicadoras. La barra inferior representa 20 sustituciones pro cada 100 nucleótidos.



Firmicutes Actinobacteria

Bacteoidetes FunM7 (KP843710)

Labrenzia aggregata HNS063 (JQ738393) Stappia conradae MIO (NR_115950)

Labrenzia alba 5OM6 (NR_042378) Tropicibacter phthalicus KU27E1 (AB636139)

Rf17 (KP843678) Ponticoccus litoralis CLGR66 (NR_044174) Rf5 (KP843666)

Tropicibacter naphthalenivorans C02 (NR_041596) Tropicibacter mediterraneus M17 (NR_125557) ShZ3 (KP843700)

Tropicibacter multivorans MD5 (NR_108509) ShZ1 (KP843699)

Ruegeria mobilis NBRC 101030 (NR_116521) Sh2 (KP843693)

Ruegeria atlantica NBRC15792 (NR_112615) Paracoccus stylophorae KTW16 (NR_117275)

Rf16 (KP843677) Paracoccus carotinifaciens E-396 (NR_024658) Paracoccus marcusii MH1 (NR_044922)

Alcanivorax dieselolei B-5 (NR_043106) Alcanivorax venustensis ISO4 (NR_025145)

Rf17-1 (KP843679) Microbulbifer variabilis Ni-2088 (NR_041021)

Microbulbifer mediterraneus UST040317-067 (DQ096579) Rf9 (KP843670)

Microbulbifer epialgicus F_104 (NR_041493) Spongiibacter tropicus CL-CB22 (NR_116117) Sh4 (KP843695) Spongiibacter marinus HAL40b (NR_042454) X14 (KP843689)

Halomonas subterranea ZG16 (NR_044116) Halomonas janggokensis M24 (NR_042489) FunM2 (KP843705) Halomonas venusta GSP24 (AY553074)

X13 (KP843688) Halomonas variabilis NY-10 (JN903904) Halomonas arcis AJ282 (NR_044115)

Chromohalobacter nigrandesensis LTS-4N (NR_042011) Chromohalobacter israelensis (NR_025431) Chromohalobacter salexigens DSM (NR_074225) Rf6 (KP843667)

Marinobacter mobilis CN46 (NR_044456) Rf13 (KP843674)

Marinobacter xestospongiae UST0904181611 (NR_109066) Idiomarina abyssalis KMM 227 (NR_024891)

Idiomarina fontislapidosi F23 (NR_029115) Idiomarina baltica OS145 (NR_027560)

Rf3 (KP843665) Alteromonas sp. S89 (JN654450)

Sh5 (KP843696) Rf1 (KP843663) Fun3 (KP843714)

Alteromonas sp. KU27F1 (AB636144) Alteromonas sp. AKA07-1 (AB571941)

Aestuariibacter halophilus L-08 (HG315013) Fun4 (KP843715)

Alteromonas marina MR32c (HQ439507) Alteromonas tagae BCRC 17571 (NR_043977)

Alteromonas macleodii 107 (NR_037127), FunM4 (KP843707), FunM6 (KP843709), Sh3 (KP843694), Disc3 (KP843718), Rf10 (KP843671), Sh6 (KP843697) Sh7 (KP843698), FunM1 (KP843704), Rf11 (KP843672)

Pseudoalteromonas arabiensis k53 (NR_113230)

Pseudoalteromonas ruthenica KMM300 (NR_025140) Rf2 (KP843664)

Sh1 (KP843692)

Disc4 (KP843719) X11 (KP843687)

Photobacterium lutimaris DF42 (NR_043902) Photobacterium rosenbergii CC1 (NR_042343) X7 (KP843685)

Photobacterium damselae NBRC15633 (NR_113783) Photobacterium leiognathi L1 (NR_029253)

XLum (KP843691) Vibrio halioticoli HDD1-2 (AY426978)

Vibrio ezurae HDS1-1 (NR_ 025779) Vibrio owensii DY05 (NR_117424) Fun2 (KP843713)

Vibrio aestivus M22 (NR_108873) Vibrio sp. JZ08ML52 (HM117125)

Rf7 (KP843668) Vibrio nigripulchritudo (NR_121769) X10 (KP843686)

X15 (KP843690) Vibrio harveyi BTD O111 (JN871700)

Disc1 (KP843716) Disc2 (KP843717) Vibrio maritimus R-40493 (NR_117551)

Vibrio nereis ATCC 25917 (NR_118092) Vibrio xuii R15052 (NR_025478)

X4 (KP843682) Vibrio atypicus HHS02 (NR_116535)

Vibrio tubiashii ATCC 19109 (NR_118093) X6 (KP843684)

X5 (KP843683) X1 (KP843680) Fun1 (KP843712)

Marinomonas brasilensis R-40503 (NR_40503) Marinomonas arenicola KMM3893 (NR_112826)

FunM5 (KP843708) Marinomonas pollencensis IVIA-Po-185 (NR_116231)

Amphritea atlantica VSD616 (KC534278) Amphritea sp. Ap52 (HE818222)

Amphritea sp. MEBiC05461T (GU289646) Rf12 (KP843673)

Anabaena variabilis ATCC 29413 (NR_074300)

100

10097

52

89

81

100

92100

8975

76

87

10099

10097

99

100

100

100

6167

100

66

99

100

58

65

7764

100

100100

96

100

96

100

100

100

71100

100

100

82

89

86

100

98

95

10066

82

99

100

99

100

83

100

81

67

71

907068

92

55

89

100

82

59

100

6971

100

100100

100

75

99

100

91

100

0.2

Alphaproteobacteria

Gammaproteobacteria

Pseudoalteromonas flavipulchra NCIMB 2033 (NR_025126) Pseudoalteromonas luteoviolacea NCIMB 1893 (NR_026221)

FunVF5 (KR108216) RfVR18 (KR108217)97

100

73

100

8061

100

Disc 5 (KR108215)

B)



como se describió previamente. Por otro lado, para extraer posibles moléculas con actividad antimicrobiana, 25 mL del medio restante fueron mezclados con un volumen de acetato de etilo,29 el cual se dejó evaporar a temperatura ambiente. A continuación, el residuo se resuspendió en 500 μL de una mezcla de agua y etanol (7:3). Se depositaron 10 μL de cada extracto sobre discos de papel filtro esterilizado (6 mm de diámetro). Los discos húmedos se dejaron secar a temperatura ambiente y se colocaron por triplicado sobre placas de medio AM 2216 donde se inoculó por dispersión cada cepa indicadora. Después de 24 h de incubación se realizaron las observaciones.

Caracterización fenotípica y perfil exoenzimático de los aislados

A todos los aislados se les realizó tinción Gram para determinar su morfología celular y afinidad por los colorantes. La actividad desnitrificadora fue probada en tubos de ensayo con 10 mL de caldo nitratos para bacterias marinas, el cual contenía peptona de caseína 5 g/L, extracto de levadura 1 g/L, FeSO4 0.01 g/L, tioglicolato de sodio 0.05/L g, KNO3 0.5, g/L. Todos los componentes se agregaron a 1 L de AMA. Cada tubo contenía una campana de Durham con la finalidad de capturar las especies de nitrógeno producidas durante la desnitrificación.

Los tubos fueron incubados a 28 °C por hasta 7 días. Para observar la reducción de nitratos fue empleado el reactivo de Griess.30 Para la degradación de enzimática de los sustratos se empleó un medio basal (KH2PO4 0.3 g, Na2CO3 0.25 g, MgSO4.7H2O 0.275 g, extracto de levadura 0.1 g, agar 15 g, AMA 1 L, con pH ajustado a 8.2). Los sustratos probados en el medio basal fueron carboximetil-celulosa (CMC) a una concentración de 5 g/L, almidón, 10 g/L y quitina coloidal, 10 g/L.31 Para observar la degradación del CMC y el almidón los medios de cultivo se suplementaron

con rojo Congo (0.01 g/L). Cada cepa fue inoculada por triplicado. La degradación positiva de estos carbohidratos fue identificada como un halo amarillo pálido alrededor de la colonia.32 En el caso de que la degradación de almidón fuera poco visible se empleó una solución de Lugol para poner de manifiesto los halos transparentes de hidrólisis alrededor de la colonia bacteriana. Para observar la degradación de quitina, las placas fueron inoculadas por el método de picadura e incubadas a 28 °C hasta por 7 días.

La observación de una zona clara alrededor de la colonia fue considerada como degradación positiva.31 Todos los índices de degradación fueron calculados al dividir el diámetro de la zona de hidrólisis entre el diámetro de la colonia. Finalmente, se investigó la producción de sideróforos entre las cepas que mostraron inhibición en contra de al menos uno de los microorganismos indicadores. Esto se realizó en medio AM 2216 suplementado con el reactivo Chromo Azurol.33 Las cepas se inocularon las cepas por triplicado y se incubaron a 28 °C por 24 a 72 h. Se consideró que la cepa era productora de sideróforos al observar un halo amarillo o naranja alrededor de la colonia bacteriana.

RESULTADOS

Cuantificación e identificación de los microorganismos

El número de bacterias viables recuperadas a partir de la mucosa de los corales estuvieron en el intervalo de 6.0 × 103 en Xenia sp. a 1.33 × 105 UFC/mL en R. florida. La cuenta viable de las muestras del coral Fungia sp. fue de 1.0 × 104; para Discosoma sp. fue de 3.08 × 104, y S. hystrix presentó 3.33 × 104 UFC/mL. En contraste la cuenta viable en la columna de agua fue de 2.92×103 UFC/mL. El número bacterias cultivables presentes en la mucosa externa de los corales fue más grande que en la columna de agua.



Un total de 63 cepas bacterianas fueron recuperadas a partir de las cinco especies de coral, incluyendo 18 cepas de la capa mucosa de R. florida, 12 de Xenia sp., 12 de S. hyxtrix, 13 de Fungia sp. y 8 de Discosoma sp. (Tabla 1 y Figura 1). A partir del análisis de las secuencias del gen 16S rRNA las bacterias aisladas fueron asociadas con miembros de 27 géneros situados dentro de los phyla Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacteria. Dentro de este último phylum la clase Gammaproteobacteria fue predominante (44 aislados, 69.8 %), incluyendo 13 aislados (20.6 %) clasificados en el género Vibrio, 2 (3.2 %) en Photobacterium, 9 (14.3 %) en Alteromonas y 6 (9.5 %) dentro del género Pseudoalteromonas. En la clase Alphaproteobacteria destacan 3 (4.8 %) cepas del género Tropicibacter, 1 de Ruegeria mobilis y 1 de Ponticoccus litoralis. Por otra parte, dentro del phylum Actinobacteria sobresalen dos aislados de la especie Rhodococcus equi, uno de Mycobacterium poriferae, uno de Microbacterium oxydans y uno clasificado dentro del género Streptomyces. Este último aislado fue recuperado en el medio Gause.

En el phylum Bacteoridetes se recuperaron cuatro aislados, mientras que en el phylum Firmicutes solo se recuperaron dos. A partir de la muestra proveniente del coral R. florida se aisló el mayor número de especies bacterianas (16 especies y 18 cepas), incluyendo dos aislados (Rf14 y Rf15) que por su secuencia del 16S rRNA representan un nuevo género putativo relacionado con el género Luteibaculum, dentro del phylum Bacteroidetes (esto fue deducido debido a que sus secuencias tuvieron menos del 90 % de similitud con respecto a la secuencia de referencia). Las otras cuatro especies de corales tuvieron entre 7 a 11 especies de bacterias representadas por 8 a 13 aislados.

La mayoría de las especies de bacterias fueron recuperaras a partir de un solo coral, pero algunas pudieron aislarse a partir de diferentes hospederos. Entre ellas destacan los aislados de Alteromonas

macleodii, los cuales se recuperaron a partir de 4 de las especies de coral (excepto de Xenia sp.), Pseudoalteromonas ruthenica se recuperó a partir de 4 corales (excepto de Fungia sp.), y Pseudoalteromonas luteoviolacea que se recuperó a partir de los corales Fungia sp. y Ricordea florida.

Caracterización enzimática

Los resultados en la Tabla 1 muestran que 30 de los aislados (47.6 %), los cuales están distribuidos en 17 géneros fueron capaces de reducir nitrato. La hidrólisis de almidón se detectó en 29 (46 %) de los aislados, donde las especies con mayor índice de degradación fueron A. macleodii, P. ruthenica, Microbulbifer epialgicus, M. oxydans, Halomonas arcis, Vibrio tubiashii y Vibrio owensii. La cepa con el mayor índice fue P. ruthenica Sh1, al presentar un valor de 5.5 (Figura. 2 y Tabla 2). Solo 5 aislados mostraron una discreta actividad quitinolítica, mientras que 2 cepas presentaron débil actividad al degradar CMC. Adicionalmente Persicobacter diffluens ShZag mostró actividad agarolítica después de 48 h de incubación.

Fig. 2. Ensayo de inhibición bacteriana realizado con 4 cepas recuperadas a partir de la mucosa del coral S. hystrix. La cepa indicadora empleada en esta prueba fue S. aureus ATCC 25923. 1) P. ruthenica Sh1. 2) R. mobilis Sh2. 3) Alteromonas macleodii Sh3. 4) Alteromonas sp. Sh5.



Cepa Identidad taxonómicaPorcentaje de similitud (%) con la secuencia más cercana del 16S rRNA calculado con MatGat

Hidrólisis de quitina

Hidrólisis de almidón

Hidrólisis de CMC

Actividad desnitrifi-cante

Aislados de Ricordea floridaRf1 Alteromonas sp. Alteromonas sp. KU27F1 (97.0) + - - -Rf2 Pseudoalteromonas ruthenica -97 - + - -Rf3 Idiomarina fontislapidosi -97.3 - - - -Rf5 Ponticoccus litoralis -97.1 - - - +Rf6 Chromohalobacter salexigens -99.6 - - - +Rf7 Vibrio sp. Vibrio sp. JZ08ML52 (95.7) - + - +Rf8 Microbacterium oxydans -97.4 + + - -Rf9 Microbulbifer epialgicus -98.8 - + - +Rf10 Alteromonas macleodii -97.4 - + - -Rf11 Alteromonas macleodii -97.1 - + - -Rf12 Amphritea sp. Amphritea sp. Ap52 (96.4) - + - +Rf13 Marinobacter xentospongiae -98.5 - - - -Rf14 Flavobacteriales bacterium Luteibaculum oceani (84.7) - - - -Rf15 Flavobacteriales bacterium Luteibaculum oceani (87.3) - - - -Rf16 Paracoccus marcusii -97.2 - - - +Rf17 Tropicibacter phthalicus -97.8 - - - +Rf17-1 Alcanivorax sp. Alcanivorax venustensis (96.1) - - - +RfVR18 Pseudoalteromonas luteoviolacea -99.5 - + - +Aislados de Xenia sp.X1 Vibrio tubiashii. -99.5 - - - +X3 Staphylococcus epidermidis -98.6 - - - +X4 Vibrio atypicus -98.4 - - - +X5 Vibrio tubiashii -97.5 - - - +X6 Vibrio tubiashii -99.6 - - - +X7 Photobacterium rosenbergii -97.8 - - - +X10 Vibrio nigripulchritudo -97 - + - +X11 Pseudoalteromonas ruthenica -97.2 - + - -X13 Halomonas arcis -98.8 - + - +X14 Spongiibacter marinus -98.5 - - - -X15 Vibrio nigripulchritudo -99.8 - + - +XLum Photobacterium leiognathi -97.6 - - - -Aislados de Seriatopora hystrixSh1 Pseudoalteromonas ruthenica -99 - + - -Sh2 Ruegeria mobilis -97.4 - - - -Sh3 Alteromonas macleodii -98.3 - + - -Sh4 Spongiibacter marinus -98.2 - - - -Sh5 Alteromonas sp. Alteromonas sp. S89 (97.9) - + - -Sh6 Alteromonas macleodii -97.2 - + - -Sh7 Alteromonas macleodii -98.6 - - - -ShZ1 Tropicibacter multivorans -97.5 - - - -ShZ3 Tropicibacter multivorans -97.7 - - - -ShZ4 Micrococcus luteus -97.3 - - - -ShZ7 Planococcus rifietoensis -97.7 - - - -ShZAg Persicobacter diffluens -97.1 - - + +Aislados de Fungia sp.FunM1 Alteromonas macleodii -97.9 - + - -FunM2 Halomonas janggokensis. -99.9 - - - +FunM3 Zunongwangia profunda. -97 - + - -FunM4 Alteromonas macleodii -99 - - - -FunM5 Marinomonas sp. Marinomonas pollencensis (94.5) - - - +FunM6 Alteromonas macleodii -98 - + - +FunM7 Labrenzia aggregata -98.1 - - - +FunMAct Streptomyces sp. Streptomyces griseoplanus (96.3) + + + -Fun1 Vibrio tubiashii -99.6 - + - +Fun2 Vibrio owensii -99.9 - + - +Fun3 Alteromonas sp. Alteromonas sp. KU27F1 (97.2) - + - -Fun4 Aestuariibacter sp. Aestuariibacter halophilus (95.9) - - - -FunVF5 Pseudoalteromonas luteoviolacea -99.3 - + - +Aislados de Discosoma sp.Disc1 Vibrio harveyi -98.6 - + - +Disc2 Vibrio maritimus -97.1 - + - +Disc3 Alteromonas macleodii -97.2 - + - -Disc4 Pseudoalteromonas ruthenica -99.5 - + - -Disc5 Vibrio sp. Vibrio tubiashii (94.0) - + - +DiscAct2 Mycobacterium poriferae -99 - - - -DiscAct3 Rhodococcus equi -97.3 + - - +DiscAct4 Rhodococcus equi -97.2 + - - -

Tabla 1. Caracterización e identificación de las bacterias aisladas a partir de la mucosa externa de los corales.



Cepa Identidad taxonómica Degradación de quitina Degradación de almidón Degradación de CMC

Aislados de Ricordea florida

Rf1 Alteromonas sp. 1.1 (±0.0) - -

Rf2 Pseudoalteromonas ruthenica - 2.5 (±0.12) -

Rf7 Vibrio sp. - 1.9 (±0.38) -

Rf8 Microbacterium oxydans 1.2 (±0.0) 2.5 (±1.0) -

Rf9 Microbulbifer epialgicus - 2.1 (±0.23) -

Rf10 Alteromonas macleodii - 2.2 (±0.28) -

Rf11 Alteromonas macleodii - 2.3 (±0.0) -

Rf12 Amphritea sp. - 1.2 (±0.0) -

RfVR18 Pseudoalteromonas luteoviolacea - 1.5 (±0.0) -

Aislados de Xenia sp.

X10 Vibrio nigripulchritudo - 2.1 (±0.14) -

X11 Pseudoalteromonas ruthenica - 2.7 (±0.14) -

X13 Halomonas arcis - 2.3 (±0.45) -

X15 Vibrio nigripulchritudo - 1.3 (±0.0) -

Aislados de Seriatopora histrix

Sh1 Pseudoalteromonas ruthenica - 5.5 (±0.4) -

Sh3 Alteromonas macleodii - 3.2 (±0.14) -

Sh5 Alteromonas sp. - 1.6 (±0.0) -

Sh6 Alteromonas macleodii - 1.5 (±0.0) -

ShZAg Persicobacter diffluens - - 1.3 (±0.0)

Aislados de Fungia sp.

FunM1 Alteromonas macleodii - 1.5 (±0.0) -

FunM3 Zunongwangia profunda - 2.0 (±0.0) -

FunM6 Alteromonas macleodii - 1.7 (±0.0) -

FunMAct Streptomyces sp. 1.1 (±0.0) 1.1 (±0.0) 1.3 (±0.0)

Fun1 Vibrio tubiashii - 3.1 (±0.18) -

Fun2 Vibrio owensii - 3.3 (±0.58) -

Fun3 Alteromonas sp. - 1.2 (±0.0) -

FunVF5 Pseudoalteromonas luteoviolacea - 1.2 (±0.0) -

Aislados de Discosoma sp.

Disc1 Vibrio harveyi - 2.8 (±0.49) -

Disc2 Vibrio maritimus - 3.0 (±0.2) -

Disc3 Alteromonas macleodii - 1.7 (±0.23) -

Disc4 Pseudoalteromonas ruthenica - 3.6 (±1.24) -

Disc5 Vibrio sp. - 3.2 (±0.0) -

DiscAct3 Rhodococcus equi 1.1 (±0.0) - -

DiscAct4 Rhodococcus equi 1.1 (±0.0) - -

Tabla 2. Índices degradativos desarrollados por los microorganismos aislados a partir de los corales. Lo valores entre paréntesis corresponden a la desviación estándar de los índices de degradación.



Actividad inhibidora de los aislados

Entre los 63 aislados, 14 (22 %) mostró inhibición en contra de una o más bacterias indicadoras, aunque ninguna inhibió a C. albicans ATCC 10231 (Tabla 3). Una amplia actividad inhibidora fue observada en los aislados Rf2, X11, Sh1 y Disc4 de P. ruthenica, los cuales inhibieron 6 de las 7 bacterias indicadoras, incluyendo los patógenos humanos S. aureus ATCC. 25923 y los patógenos de especies acuáticas A. bestiarum D12 y V. fortis VSP. Por otro lado, los aislados R. mobilis Sh2 y M. oxydans Rf8 inhibieron a 3 de las 7 bacterias. Finalmente los aislados Tropicibacter phtalicus Rf17, Photobacterium leiognathi XLum, P. litoralis Rf5 y Vibrio maritimus Disc2 inhibieron solamente una de las bacterias indicadoras.

Es importante mencionar que la bacteria indicadora P. aeruginosa ECOM2 fue inhibida solamente por P. luteoviolacea RfVR18. En contraste, K. rhizophila ECOM1 fue inhibida por 12 de las cepas probadas. No se observó actividad antimicrobiana en los ensayos con caldo de cultivo libre de células o en los extractos obtenidos con acetato de etilo. Exceptuando a los dos aislados de P. luteoviolacea, el resto de las bacterias con actividad inhibitoria presentaron una discreta producción de sideróforos, con índices no mayores a 1.5 (datos no mostrados).

DISCUSIÓN

La microbiota bacteriana cultivable de diversas especies de coral ha sido estudiada en años recientes en ambientes naturales,7,18,28,34,35,36,37 sin embargo el conocimiento sobre los microorganismos cultivables presentes en corales mantenidos en sistemas cerrados es escaso.17 En el presente estudio reportamos 63 aislados bacterianos recuperados a partir de la mucosa superficial de cinco especies de

coral propagadas y mantenidas ex situ, lo cual proporciona información novedosa acerca de las interacciones entre corales y bacterias en sistemas artificiales, al mismo tiempo que se exploró su potencial como fuente de enzimas y posible fuente de compuestos con actividad antimicrobiana, por lo que podrían emplearse como probióticos en la acuacultura e industria de los acuarios marinos. El gran número de bacterias cultivables presentes en la mucosa externa de los corales, comparado con el número de bacterias en la columna de agua se atribuye a la presencia de polisacáridos, proteínas, lípidos y otros nutrientes secretados por los corales.18,28,37

En la literatura se ha descrito que la mucosa externa de los corales puede presentar una concentración de carbono y nitrógeno 2 a 4 veces más alta que el agua circundante,38 por lo que estos nutrientes permitirían el desarrollo de un gran número de bacterias capaces de formar una compleja biopelícula, donde los microorganismos desarrollan diversas actividades como la fijación de nitrógeno,4 brindan protección a su hospedero a través de la producción de metabolitos con actividad antimicrobiana e inhiben la colonización de microorganismos patógenos.7,9,34 La identificación de las 63 cepas aisladas genera invaluable información acerca de las comunidades bacterias presentes en la mucosa de corales mantenidos en un ambiente cerrado y artificial.

La predominancia de bacterias de la clase Gammaproteobacteria fue similar a la observada en la mucosa de corales como Fungia scutaria,18 Mussismilia hispida,40 Acropora millepora,34 corales de la familia Pennatulidae,28 entre otros. En contraste, es importante mencionar que en otras especies de corales los grupos dominantes cultivables fueron miembros del phylum Firmicutes, siendo Bacillus el género más abundante en corales del orden Alcyonacea como Alcyonium digitatum36 y Sarcophyton glaucum,41 así como en corales



Tabla 3. Índices de inhibición desarrollados por de las bacterias aisladas a partir de la mucosa de los corales.

Coral hospedero Cepa

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Kocuria rhizophila ECOM1

Pseudomonas aeruginosa ECOM2

Escherichiacoli ECOM3

Serratia marcescens DZM

Aeromonas bestiarum D12

Vibrio fortis VSP

Candida albicans ATCC 10231

R. florida

Alteromonas sp. Rf1 - 2.2±0.34 - - - - - -

Pseudoalter-omonas rutheni-ca Rf2

2.3±0.25 5.0±0.0 - 2.38±0.19 2.32±0.13 1.65±0.05 1.93±0.11 -

Ponticoccus litoralis Rf5 - - - - 2.44±0.19 - - -

Microbacterium oxydans Rf8 2.36±0.26 5.0±0.0 - 2.15±0.01 - - - -

Tropicibacter phthalicus Rf17 - 2.2±0.34 - - - - - -

Pseudoal-teromonas luteoviolacea Rf VR18

2.0±0.0 - 1.19±0.05 - - - - -

Xenia sp.

Pseudoalter-omonas rutheni-ca X11

2.16±0.28 5.44±0.76 - 1.21±0.1 2.83±0.28 2.36±0.22 2.0±0.0 -

Photobacteri-um leiognathi XLum

- 1.16±0.0 - - - - - -

S. hystrixPseudoalter-omonas rutheni-ca Sh1

2.55±0.09 5.0±0.0 - 2.33±0.28 2.5±0.0 2.64±0.27 1.11±0.0 -

Ruegeria mobil-is Sh2 - 2.38±0.09 - 1.5±0.11 1.88±0.19 - - -

Fungia sp.

Streptomyces sp. FunMAct - 2.33±0.0 - - - - - -

Pseudoal-teromonas luteoviolacea Fun VF5

- 1.2±0.0 - - - - - -

Discoso-ma sp.

Vibrio mariti-mus Disc2

- 1.41±0.14 - - - - - -

Pseudoalter-omonas rutheni-ca Disc4

2.14±0.0 2.66±0.28 - 2.5±0.0 3.66±0.57 2.13±0.13 1.37±0.39 -



negros del género Antipathes.42 Esto podría ser efecto de la composición particular de las comunidades microbianas que albergan estas especies de coral, aunque también podría estar influenciado por los medios de cultivo empleados durante el aislamiento. En este trabajo la mayoría de los aislados corresponden a géneros clasificados dentro del phylum Proteobacteria, (Figura 1) siendo los géneros Alteromonas, Pseudoalteromonas y Vibrio los que englobaron al mayor número de cepas.

Estos microorganismos han sido caracterizados en otros trabajos como parte de la microbiota de la mucosa externa de los corales. A. macleodii es un microorganismo capaz de consumir diversos compuestos orgánicos en la mucosa de los corales,38 mientras que algunas especies de Pseudoalteromonas han sido identificadas como productoras de compuestos antibacterianos, toxinas y enzimas de interés biotecnológico.8,43,44 Por otra parte, los miembros del género Vibrio son ubicuos en ambientes marinos y pueden desarrollar actividades benéficas y negativas al interactuar con corales y otros invertebrados. Entre los aislados destaca V. owensii (cepa Fun2), un patógeno que ha causado brotes infecciosos y alta mortalidad de corales silvestres del género Montipora.45. También destaca Vibrio nigripulchritudo (aislados X10 y X15), el cual es un patógeno que produce pérdidas en granjas camaroneras.46

En contraste, Vibrio harveyi (cepa Disc1) ha sido identificado como un microorganismo fijador de nitrógeno asociado a corales,40 y también como patógeno cuando forma consorcios con otras especies de Vibrio.47 El género Ruegeria se caracteriza por englobar diversas especies de bacterias productoras de metabolitos secundarios con actividad antagónica en contra de microorganismos patógenos para ciertas especies de peces, por lo cual tienen potencial como microorganismos probióticos para la industria

acuícola.48 En el phylum Actinobacteria destaca el aislamiento de la cepa de Streptomyces sp. FunMAct, la cual desarrolló inhibición contra una de las cepas indicadoras. La búsqueda de Actinomicetos asociados a corales y otros invertebrados se ha visto favorecida en los últimos años debido a que pueden sintetizar un gran número de metabolitos con actividad antimicrobiana.35

Entre los corales empleados en este trabajo, los del género Fungia han sido los más estudiados en acuarios y ambientes naturales. Este género se encuentra distribuido en amplias regiones de los océanos Índico y Pacífico.49 Debido a su atractivo, es popular entre los aficionados a los acuarios marinos. Es notable que a partir de su mucosa se recuperaron cepas de A. macleodii, V. tubiashii, V. owensii y género Marinomonas, todos ellos aislados previamente en diversas especies de Fungia colectadas en el mar.18,38,50 Nuestros resultados sugieren que Fungia podría conservar diversas especies de su microbiota nativa en condiciones de cautiverio. Por otro lado, S. hystrix es un importante coral constructor de arrecifes, el cual está ampliamente distribuido en el océano Pacífico.19 Por su rápido crecimiento en cautiverio, la especie ha sido empleada como un organismo modelo en el estudio del ciclo de vida de los corales que depositan CaCO3 al formar su esqueleto.51

En la literatura existe un reporte donde se analizó mediante métodos moleculares la microbiota de esta especie, y se observó que los grupos dominantes estaban agrupados dentro de las clases Alpha y Gammaproteobacteria.52 En el presente trabajo la mayoría de aislados fueron del género Vibrio, así como también se recuperaron cepas de P. rhuthenica y P. leiognathi que mostraron actividad antimicrobiana (Tabla 3). Por otro lado, los corales del género Xenia además de que hasta hace poco tenía cierta demanda dentro de la industria de los acuarios marinos, son una importante fuente de moléculas con actividad



anticancerígena;53 en cambio su microbiota ha sido pobremente estudiada. Existe el reporte de una cepa de Stenotrophomonas aislada a partir de Xenia, la cual presentó actividad antimicrobiana.7

Hasta donde sabemos, este el primer estudio referente a la microbiota cultivable de R. florida, y Discosoma sp., ambos clasificados dentro del orden Corallimorpharia. R. florida es endémica del Mar Caribe,54 mientras que el género Discosoma está ampliamente distribuido en los Océanos Atlántico, Índico y Pacífico.19 Además de su importancia dentro de la industria de los acuarios marinos, estos corales representan una fuente de proteínas fluorescentes con aplicaciones biomédicas y biotecnológicas.55 Los resultados de este estudio mostraron que ambas especies comparten especies como A. macleodii y P. ruthenica. En cuanto al número de especies, R. florida tuvo 16, mientras que Discosoma presentó 7 (Tabla 1).

La detección de cepas capaces de degradar almidón, quitina, y CMC indica que los microorganismos obtenidos a partir de los corales estudiados representan una fuente de enzimas hidrolíticas con una potencial aplicación biotecnológica, y contribuye a confirmar la creciente importancia de las bacterias marinas como fuente de novedosas enzimas.56 Se observó que entre los 29 aislados que mostraron actividad amilolítica (Tabla 2), los que presentaron un mayor índice de degradación fueron P. ruthenica, A. macleodii y diversas especies de Vibrio. En la literatura se ha descrito la caracterización y expresión heteróloga de la amilasa de una cepa de A. macleodii, cuya estabilidad térmica y halotolerancia la vuelve prometedora para su uso en bioprocesos.57

Por otro lado, la habilidad para reducir nitrato en nitritos observada en 30 de las cepas tiene importancia como posible mecanismo de respiración anóxica durante las fluctuaciones de oxígeno que ocurren en la mucosa externa

de los corales. Al mismo tiempo este proceso de desnitrificación ha sido planteado como un mecanismo que controla la concentración del nitrógeno biodisponible.

Se ha documentado que estas bacterias transforman el nitrato en amonio, el cual puede ser aprovechado por las microalgas zooxantelas simbiontes del coral. Por otro lado, cuando existe un exceso de nitrógeno, estas bacterias pueden realizar la desnitrificación completa hasta nitrógeno molecular.5 Debido a esto, las bacterias marinas desnitrificantes ha cobrado importancia biotecnológica tanto en acuarios marinos particulares como en sistemas de crianza a gran escala, en donde se promueve su crecimiento agregando fuentes de carbono como alcoholes y carbohidratos simples para fomentar proliferación, o se inoculan cepas seleccionadas para que se incorporen al filtro biológico encargado de regular la cantidad de nitrógeno presente en los sistemas cerrados.58

En este estudio se observó que las especies P. ruthenica, A. macleodii y V. tubiashii estaban presentes en dos o más especies de coral, lo cual podría deberse a que estas bacterias forman parte del microbioma central de estos organismos, los cuales han sido transferidos a lo largo de generaciones. Otra posibilidad es que las bacterias recientemente han migrado y colonizado a otros hospederos como consecuencia de su vida en cautiverio dentro de un sistema cerrado. Para aclarar esto, se requiere un estudio más exhaustivo, donde se pueda comparar la microbiota de estas mismas especies de coral recolectadas en su hábitat natural.

Considerando el impacto negativo que las actividades humanas han provocado a los arrecifes de coral, ha sido necesario documentar y comprender las interacciones benéficas entre microorganismos y sus corales hospederos, esto con la finalidad de mitigarlas o revertirlas. Al



mismo tiempo, la evolución de cepas bacterianas de importancia clínica resistentes a diversos antibióticos ha provocado la búsqueda de compuestos antimicrobianos en ambientes marinos.12,36 Diversas investigaciones han documentado la actividad antimicrobiana por parte de la microbiota de los corales, 7,17,28,34 al mismo tiempo que se ha propuesto inocular cepas nativas con actividad probiótica en los arrecifes afectados por enfermedades bacterianas.

59

En el presente estudio se encontró que 14 cepas presentaron actividad antibacteriana contra al menos una de las bacterias indicadoras. Es remarcable que los aislados de P. ruthenica tuvieron los mayores índices de inhibición en contra de las bacterias indicadoras, así como también es importante destacar que P. luteoviolacea RfVR18 fue el único aislado capaz de inhibir a P. aeruginosa ECOM2. Al respecto, los miembros del género Pseudoalteromonas han sido previamente reconocidos por sus actividades antimicrobianas,8.43 y por formar parte de la microbiota de numerosas especies de invertebrados marinos.60 Así mismo, P. luteoviolacea ha sido una de las especies más estudiadas del género debido a que puede producir numerosos compuestos con actividad antimicrobiana.61 En cuanto a la especificidad de la inhibición microbiana, se observó que los 4 aislados de P. ruthenica, P. litoralis Rf5 y R. mobilis Sh2 inhibieron a S. marcescens DZM (Tabla 3).

Esta observación es importante, ya que diversas cepas de S. marcescens han sido reportadas como agentes causales de la enfermedad “White-pox” o viruela blanca, una agresiva enfermedad que provoca la muerte masiva de corales alrededor del mundo.62 Así mismo, los aislados de P. ruthenica presentaron antagonismos contra A. bestiarum D12 y V. fortis VSP. Estos microorganismos se emplearon en este trabajo ya que han sido identificados como microorganismos patógenos de peces.63,64 Para combatir a estos bacterias

patógenas tanto en sistemas cerrados como en el océano, se ha sugerido el empleo de microorganismos probiticos, aislados a partir de sus hospederos naturales y que tengan actividad antimicrobiana comprobable,59 sobre todo en aquellas cepas donde los metabolitos producidos sean difíciles de aislar e identificar, tal como ocurrió con las 14 cepas de este trabajo los cuales presentaron actividad antimicrobiana en cultivo activo, mientras que en los caldos de cultivo libres de células y en los extractos orgánicos no se observó actividad antimicrobiana.

Es posible que los metabolitos responsables estén unidos a la estructura celular tal como lo sugieren algunos autores,7,28 o que se encuentren localizados al interior de las células bacterianas. En una investigación previa61 se encontró la enzima L-aminoácido oxidasa en extractos obtenidos por sonicación de células de P. luteoviolacea. El producto de la reacción catalizada por esta enzima fue peróxido de hidrógeno, el cual presenta actividad antimicrobiana. Es importante mencionar que P. luteoviolacea presenta vistosas colonias debido a la presencia de violaceína, un compuesto color violeta poco soluble en agua que se acumula en el lado interno de las membranas celulares y que ha demostrado tener actividad antimicrobiana.65.

Otra posibilidad que explica la ausencia de actividad microbiana en los ensayos con extractos es que la síntesis de los metabolitos es inducida solamente en presencia de bacterias antagónicas, o que los compuestos son en extremo volátiles y lábiles.43 Por lo tanto sería necesario optimizar las condiciones para la producción y extracción de los compuestos. Recientemente, se han planteado estrategias como la minería genética para la búsqueda rápida de los genes que intervienen en la síntesis de metabolitos de importancia biomédica.66



Finalmente, es importante mencionar que algunos compuestos son sintetizados en muy baja concentración pero pueden inhibir el crecimiento de bacterias patógenas a través del secuestro de nutrientes claves como el hierro. En el presente estudio observamos la producción de sideróforos en 12 de las cepas con actividad antagónica. La síntesis de sideróforos por bacterias benéficas es una característica deseable que puede ayudar a la prevención y control de patógenos en sistemas de crianza acuícola,67 por lo que algunas de las cepas recuperadas en este trabajo tendrían potencial para ser empleadas como probióticos. Por supuesto, sería necesaria una mayor investigación al respecto.

CONCLUSIONES

El presente trabajo permitió realizar el estudio prospectivo de las bacterias cultivables asociadas a 5 especies de coral propagadas y mantenidas en cautiverio. Nuestros resultados revelaron la presencia de diversos grupos bacterianos capaces de desarrollar actividad antimicrobiana contra bacterias indicadoras de importancia biomédica. Los microorganismos que presentaron esta actividad pertenecen a los géneros Pseudoalteromonas, Alteromonas, Vibrio, Photobacterium, Ruegeria, Tropicibacter, Ponticoccus y Streptomyces. Diversos aislados desarrollaron actividades exo-enzimáticas, siendo la más interesante la actividad amilolítica.

Los resultados de este trabajo contribuyen al conocimiento de las bacterias asociadas al coral y sus posibles roles ecológicos en especies de coral escasamente estudiadas. Al mismo tiempo estos resultados inspiran a la realización de futuros estudios con el objetivo de buscar aplicaciones biotecnológicas de estos microorganismos, tales como la obtención de enzimas y probióticos. De manera similar a los corales obtenidos de ambientes naturales

los corales mantenidos y reproducidos en cautiverio también son una importante fuente de recursos biotecnológicos.

FINANCIACIÓN Y AGRADECIMIENTOS

Los autores desean agradecer a los profesores de los laboratorios de Ecología Microbiana y Micología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional por proporcionar las bacterias indicadoras S. aureus ATCC 25923, K. rhizophila ECOM1, Pseudomonas aeruginosa ECOM2, E. coli ECOM3 y la levadura C. albicans ATCC 10231 empleadas en las pruebas de inhibición. Durante el desarrollo de este trabajo S.E.J. recibió beca doctoral por parte del CONACyT (beca 230841).

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Review

Cyanuric acid degradation by a microbial community in a packed bed reactor Degradación de ácido cianúrico por una comunidad microbiana en un reactor de lecho empacado

Silva-Lemus Irvin Alfonso, Sandoval-Carrasco Carlos Alberto, Salmerón-Alcocer Angélica, Ahuatzi-Chacón Deifilia*

Departamento de Ingeniería Bioquímica, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, Mexico City, Mexico.

*Corresponding author: [email protected]

Abstract. Cyanuric acid is a key intermediate in the metabolic pathway of triazine herbicides and a com-mon byproduct of their chemical or photochemical degradation. It has been shown behavioral perturba-tions on aquatic organisms because of their toxicity and is included, in the priority list of environmental pollutants of the European Commission (EC). Besides the high stability of the N-heterocyclic ring, the cyanuric acid biodegradation is problematic because the low carbon to nitrogen ratio in the molecule. However, although not always possible, this compound can be completely degraded by microbial action. In this work, a biological process for the complete degradation of the stable N-heterocyclic ring of cyanuric acid, using a bacterial community that uses it as the unique carbon and nitrogen source, is described. The bacterial were Variovorax paradoxus (AF209469.1,96%), Burkholderia cepacea (FJ969840.1, 93%), Stenotrophomonas maltophilia (FJ888386.1, 95%), Stenotrophomonas sp. (EU864329.1, 96%), Burkh-holderia sp (EU418711.1, 95%), Hymenobacter sp. (DQ223662.1, 95%), Acinetobacter sp. (FN435916.1, 97%). Of these strains only Acinetobacter and Variovorax had the capability to grow in cyanuric acid as the unique carbon and nitrogen source, other strains required glucose as supplementary carbon and energy source. The community selected, immobilized in a packed bed reactor operating in continuous, was capable of remove 50 ppm cyanuric acid with removal efficiencies approaching 100% when 125 ppm of added glucose as supplementary carbon source for increasing the carbon: nitrogen ratio.

Keywords. Cyanuric acid, biodegradation, packed bed reactor.

Resumen. El ácido cianúrico es un intermediario clave en la ruta metabólica de los herbicidas triazíni-cos y un subproducto de su degradación química. Se ha demostrado que provoca perturbaciones en los organismos acuáticos debido a su toxicidad y está incluido, en la lista de contaminantes de prioridad ambiental de la Comisión Europea (EC). Además de la alta estabilidad del anillo N-heterocíclico, la biodegradación del ácido cianúrico es problemática debido a la baja relación carbono-nitrógeno de la molécula. Sin embargo, aunque no siempre es posible, este compuesto puede ser totalmente degradado por acción microbiana. En este trabajo se describe un bioproceso para la degradación del anillo N-he-terocíclico de gran estabilidad del ácido cianúrico, usando una comunidad bacteriana que lo utiliza

Recibido: 23 de diciembre de 2020 / Aceptado: 14 de enero de 2021 / Publicado en línea: 31 de enero de 2021



como única fuente de carbono y nitrógeno. Las cepas cultivables más abundantes fueron identificadas como Variovorax paradoxus (AF209469.1, 96%), Burkholderia cepacea (FJ969840.1, 93%), Stenotro-phomonas maltophilia (FJ888386.1, 95%), Stenotrophomonas sp. (EU864329.1, 96%), Burkhholderia sp. (EU418711.1, 95%), Hymenobacter sp. (DQ223662.1, 95%) y Acinetobacter sp. (FN435916.1, 97%). Sólo los géneros Acinetobacter y Variovorax crecieron en ácido cianúrico como única fuente de carbono y nitrógeno, los demás géneros requirieron glucosa como fuente complementaria de carbono y energía. La comunidad seleccionada, inmovilizada en un reactor de lecho empacado operando en continuo, fue capaz de remover 50 ppm de ácido cianúrico con eficiencias de remoción cercanas al 100% cuando se adicionaron 125 ppm de glucosa como fuente complementaria de carbono para incrementar la relación carbono:nitrógeno.

Palabras clave. Ácido cianúrico, biodegradación, reactor de lecho empacado.

INTRODUCCIÓN

El ácido cianúrico es un intermediario clave y central en la vía de degradación biológica,1 química2 o fotoquímica3,4 de los herbicidas triazínicos. Se produce naturalmente como contaminante en fertilizantes de urea y se utiliza como estabilizador del cloro en piscinas. Este compuesto se acumula frecuentemente en el suelo o agua cuando hay ausencia de fuente de carbono durante su biodegradación.5

La fotodegradación directa bajo luz solar o atenuación natural tiene pocos efectos en la remoción de este compuesto, y su completa mineralización no puede ser lograda por ozonación, sonólisis, fotólisis o fotocatálisis. El uso de tratamientos biológicos para la degradación de contaminantes se encuentra en aumento, debido a que este método es más económico que los tratamientos físicos y químicos. Sin embargo, la biodegradación del ácido cianúrico es difícil no sólo por la alta estabilidad del anillo N-heterocíclico, aunado a esto, el compuesto tiene una baja relación carbono-nitrógeno (C/N = 0.857), inferior al valor de los propios herbicidas triazínicos, razón por la cual los microorganismos suelen emplearlo como fuente de nitrógeno y se considera necesaria la adición de fuentes de carbono asimilables por los microorganismos para su biodegradación. Algunos autores señalan

que la relación carbono-nitrógeno de entre 2.0 y 3.0 son ideales para el crecimiento bacteriano y la secreción extracelular de polisacáridos.6

Los genes responsables de la degradación de ácido cianúrico fueron identificados y secuenciados a partir de una cepa de Pseudomonas, aislada de suelo en 19917 y en 1999 se describió y purificó la enzima responsable del rompimiento del anillo s-triazina, codificada por el gen trzD, la enzima ácido cianúrico amidohidrolasa.8 En 2001 se purificó y caracterizó una enzima homóloga al ácido barbitúrico capaz de abrir el anillo.9

La biodegradación y regulación del ácido cianúrico se ha estudiado en Pseudomonas sp cepa ADP. La vía de degradación ocurre secuencialmente vía ruptura del anillo triazínico catalizada por AtzD homólogo de TrzD,10 desaminación por AtzEG,11 decarboxilación por AtzH,12 y finalmente una reacción hidrolítica catalizada por AtzF.13 En esta vía una molécula de ácido cianúrico se transforma en tres moléculas de dióxido de carbono y tres moléculas de amoniaco. Los genes están organizados en un operon y son regulados por nitrógeno y por ácido cianúrico.14,15 En el operon se encuentra codificado un sistema de transporte de alta



afinidad que permite el crecimiento a bajas concentraciones de ácido cianúrico.16 Aukema y colaboradores publicaron una nueva vía de degradación del ácido cianúrico, vía biuret, que presenta mayor incidencia que la encontrada para Pseudomonoas sp.17

Galíndez-Nájera y colaboradores, aislaron dos cepas bacterianas: Agrobacterium tumefaciens y Acinetobacter sp. a partir de suelo de cultivo de maíz de Teotihuacán, Estado de México, que fueron capaces de degradar ácido cianúrico con una eficiencia del 99%, utilizando un reactor de doble etapa empacado con roca volcánica (tezontle).18

Llamas realizó estudios cinéticos de la acumulación intracelular del enzima ácido cianúrico amidohidrolasa, en 2008, utilizando el consorcio bacteriano integrado por Agrobacterium sp. y Acinetobacter sp. en cultivo por lote, lote alimentado y lote repetido, encontrando que en cultivo por lote alimentado se produjo la mayor cantidad y productividad de enzima.19 En 2010, utilizando una comunidad conformada por Acinetobacter sp GPC, Agrobacterium tumefaciens GPA y Serratia marcescens nima, inmovilizada en un reactor de biopelícula, logró una eficiencia de remoción de ácido cianúrico superior al 90% cuando se alimentó medio con 50 ppm de ácido cianúrico y 125 ppm de glucosa como fuente adicional de carbono y energía; durante la operación identificó dos bacterias que no había detectado previamente, Ralstonia sp y Burkholderia sp.20

En este trabajo se seleccionó una comunidad microbiana, que inmovilizada en un reactor de lecho empacado operando en continuo, fue capaz de remover 50 ppm de ácido cianúrico con eficiencias de remoción cercanas al 100% cuando se adicionaron 125 ppm de glucosa como fuente complementaria de carbono para incrementar la relación carbono:nitrógeno.


Microorganismos

La comunidad microbiana empleada en este trabajo se aisló de suelos agrícolas de los poblados de Tarímbaro y Álvaro Obregón, en el Estado de Michoacán, México, utilizando el método de transferencias sucesivas en cultivos por lote y posteriormente un quimiostato para ejercer una presión de selección sobre los microorganismos, utilizando 50 ppm de ácido cianúrico.

Medio de cultivo

El medio de cultivo utilizado fue un medio mínimo mineral que contenía, en g/L: K2HPO4, 0.4; KH2PO4, 0.2; MgSO4.7H2O, 0.2; NaCl, 0.1; CaCl2, 0.02. El medio se complementó con los siguientes oligoelementos, obteniendo una concentración final (en mg/L) de FeSO4.7H2O, 2.75; MnSO4.7H2O, 1.70; ZnSO4.7H2O, 1.15; CoCl2.6H2O, 0.325; Na2MoO4.2H2O, 0.17.

Selector continuo

El reactor que operó como selector continuo (quimiostato) estaba conformado por un matraz Erlenmeyer de 1 litro de capacidad, modificado con dos ojivas, una para toma de muestra y otra para salida del medio, el volumen de operación fue de 600 mL, la alimentación se realizó por la parte superior al igual que la aireación, el matraz se encontraba en una parrilla con agitación constante.

Reactor de lecho empacado

El reactor de lecho empacado utilizado consta de dos etapas separadas mediante difusores de vidrio poroso con diámetro de poro de 40 a 100 µm, las partes del reactor se sellaron con empaques de neopreno. La alimentación y la aireación se



proporcionaron de forma paralela y ascendente. Cada etapa se llenó con el material seleccionado como soporte, previamente esterilizado y caracterizado.

Material de soporte

Se utilizaron fragmentos de piedra volcánica (tezontle en México) como material de soporte. El volumen de partícula se calculó determinando el diámetro equivalente (dp).18 El valor promedio dp fue de 2.14+0.12 cm3. El volumen de lecho fue de 22.85 mL.

Operación del reactor de lecho empacado

Inicialmente se trabajó en condiciones abióticas, para la saturación del material de soporte, alimentando en forma continua medio mínimo mineral con ácido cianúrico a 50 ppm. Se consideró que la saturación se alcanzó cuando la concentración de ácido cianúrico del efluente se igualó con la concentración del medio de suministro. Se realizó la preparación del inóculo propagando la comunidad seleccionada en un matraz Erlenmeyer de 1L con 250 mL de MMM con 50 ppm de ácido cianúrico y 125 mg/L de glucosa como fuente de carbono adicional, durante 48 h en agitación a temperatura ambiente. El proceso de inmovilización se realizó adicionando el contenido del matraz con la comunidad seleccionada al interior del reactor. El reactor se trabajó en cultivo por lote durante 120 h con lo cual se permitió la colonización del soporte por la comunidad microbiana.

Después de la inmovilización se reanudó la alimentación, inicialmente a una velocidad de dilución de 0.323 d-1. Cuando el reactor llegó al estado de equilibrio dinámico, indicado por ya no presentar variación en la concentración de ácido cianúrico con el paso del tiempo, se tomó una muestra para posteriores análisis y se cambió el flujo de alimentación hasta alcanzar nuevamente el estado de equilibrio dinámico.

Métodos analíticos

Determinación de ácido cianúrico

Por espectrofotometría UV

Las muestras se centrifugaron durante un tiempo de 7 min a 13 000 rpm para retirar cualquier tipo de partícula en suspensión, posteriormente se obtuvo el sobrenadante y se realizó una dilución acorde a la curva tipo de ácido cianúrico realizada, por último, se leyeron cada una de las muestras en el espectrofotómetro (Beckman DU® 650) a 213 nm, que es la longitud de onda a la cual el ácido cianúrico presenta la máxima absorción.

Por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

Se utilizó un equipo marca Beckman®, modelo System Gold, con un detector 168 (detector UV a l=22 nm) y módulo de bombas 126. Columna Nova Pack C18, 4 mm DI, 150/3.9 mm. La separación cromatográfica se llevó a cabo usando un gradiente lineal de un regulador de fosfatos 10mM (pH=7.0) con acetonitrilo, incrementando de 30% a 70% en 12 min, a una longitud de onda de 225 nm.21

Determinación de concentración celular

Se determinó por cuenta viable calculando el número de unidades formadoras de colonias (UFC/mL).

Determinación de proteínas

Se realizó utilizando el método de Lowry.22

Determinación de glucosa

A 200 µL de muestra libre de células, diluida apropiadamente, se le adicionaron 2 mL de una solución reguladora de fosfatos pH 7 conteniendo 1



UI de glucosa oxidasa, 10 µg de peroxidasa y 600 μg de o- 14 dianisidina. Después de 10 a 20 minutos de incubación, a temperatura ambiente, se detuvo la reacción por la adición de 2 mL de HCl 6N. El color desarrollado se leyó a 540 nm. Paralelamente se prepararon dos testigos de concentración conocida, con 200 µL de una solución de glucosa de 0.2 g/L en lugar de la solución problema y un testigo de reactivos para ajustar el espectrofotómetro.

Actividad del enzima ácido cianúrico hidrolasa

Primeramente, se prepararon los extractos enzimáticos recuperando las células de la muestra de cultivo por centrifugación, se lavó el paquete celular con agua destilada y se resuspendió en 3 mL de regulador de fosfatos pH 8.23 La suspensión celular se sometió a una ruptura mecánica con perlas de vidrio (Glass beads 150-212 microns), durante 20 min (30 s en baño de hielo, 30 s en vortex). Los restos celulares se separaron por centrifugación y el sobrenadante se utilizó para el ensayo enzimático.

Para la determinación de la actividad de la enzima, se colocó en una celda de cuarzo 1 mL de regulador de fosfatos a pH de 8, 50 µL de extracto enzimático crudo, 1934.5 µL de agua destilada para llegar a un volumen total de 3 mL, la reacción se inició agregando 15.5 µL de una solución de ácido cianúrico de 1500 mg/L.10 La velocidad de la actividad enzimática se midió como la disminución en absorbencia a 220 nm, referido a una curva tipo de unidades de absorbencia a 220 nm en función de la concentración de ácido cianúrico (mM). La actividad enzimática específica se reportó como los mmoles de ácido cianúrico degradados en 1 min, referidos a 50 µL de extracto enzimático (U/mL), entre la cantidad de proteína total cuantificada en mg/mL por el método de Lowry.8,24 Una unidad de actividad se definió como: la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 mMol de ácido cianúrico en un minuto.

Identificación de los microorganismos por PCR-secuenciación del 16S rDNA

Se amplificó el 16S rDNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR se realizó con los iniciadores 8FPL forward (5’—GCG GAT CCG CGG CCG CTG CAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG—3’) y 1492-RPL reverse (5’—GGC TCG AGC GGC CGC CCG GGT TAC CTT GTT ACG ACT T—3’). La secuenciación de los amplificados de DNA se realizó en el Instituto de Biología de la UNAM y las secuencias se compararon con secuencias de bases conocidas de la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) en el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).25

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aislamiento y enriquecimiento de la comunidad microbiana con capacidad de degradar ácido cianúrico

Durante el proceso de enriquecimiento por transferencias sucesivas, utilizando las muestras de suelo de los poblados de Tarímbaro y Álvaro Obregón, en el Estado de Michoacán, México, se observó un crecimiento apreciable de microorganismos; después de aproximadamente 3 semanas, se obtuvo un cultivo microbiano con capacidad para degradar ácido cianúrico con una eficiencia cercana al 60%.

Después de este proceso, se decidió emplear un quimiostato para ejercer una presión de selección sobre los microorganismos aislados manteniendo un flujo de alimentación de 6 mL/h. Las condiciones de este proceso permitieron que al paso de 15 días se seleccionaran aquellos microorganismos que formando parte de una comunidad tuvieran la capacidad de degradar el ácido cianúrico, logrando una eficiencia de



remoción con muy poca variación a lo largo del cultivo, del 65% en promedio, lo que indicó que se contaba con una comunidad estable para la degradación del ácido cianúrico.

Evaluación de la degradación de ácido cianúrico por la comunidad seleccionada en cultivo por lote

En cultivo por lote, utilizando medio mínimo mineral con 50 ppm de ácido cianúrico como única fuente de carbono y nitrógeno, la comunidad seleccionada fue capaz de remover 60% de ácido cianúrico, en un periodo de 30 días.

La biodegradación del ácido cianúrico se dificulta debido a la alta estabilidad del anillo triazínico y a la baja relación carbono-nitrógeno de la molécula (C:N=0,857), la cual es mucho menor a la relación carbono-nitrógeno de los herbicidas clorotriazínicos que varía desde 1.2 para simazina hasta 1.89 para clorazina, por lo que para mejorar la eficiencia de remoción generalmente se requiere la adición de otras fuentes de carbono asimilables.18 Aunque una relación carbono-nitrógeno de 2 a 3 se considera conveniente para el crecimiento bacteriano y la secreción extracelular de polisacáridos,6 Atkinson y Mavituna, estimaron una relación ideal C:N de 5.4.26 Tomando en cuenta lo anterior, se evaluó la degradación de 60 ppm de ácido cianúrico, adicionando 150 ppm de glucosa como fuente de carbono adicional, para lograr una relación carbono-nitrógeno igual a 4.

En la Figura 1 se observa que la velocidad de degradación de ácido cianúrico fue mayor de las 0 a las 25 h (Rv=1.03 mg L-1 h-1), donde disminuyó alrededor del 50 % de la concentración inicial. Posteriormente, la velocidad de degradación disminuyó hasta llegar a una velocidad (Rv) de 0.308 mg L-1 h-1 a las 128 h de incubación.

Fig. 1. Concentración del ácido cianúrico en función del tiempo durante el cultivo por lote por la comunidad aislada utilizando glucosa como fuente de carbono.

En la Figura 2, se muestra el crecimiento bacteriano medido como turbidez a 600 nm, así como el consumo de glucosa realizado por la comunidad durante la degradación de ácido cianúrico en cultivo por lote.

Fig. 2. Crecimiento celular y consumo de glucosa en función del tiempo durante el cultivo por lote.

Puede observarse un aumento en la densidad celular, congruente con la disminución de la concentración de glucosa hasta las 26 h de cultivo, después de este tiempo la concentración de biomasa disminuyó al agotarse la fuente de carbono proveniente de la glucosa; al mismo tiempo, también disminuyó la velocidad de degradación del ácido cianúrico (Figura 1), lo que pudiera estar indicando la presencia de un proceso co-metabólico. Con este proceso, compuestos



xenobióticos pueden ser degradados en presencia de otro sustrato primario adicional, de fácil asimilación (co-sustrato).27 Los resultados cinéticos obtenidos de este cultivo por lote fueron: una velocidad específica de crecimiento µmáx = 0.072 h-1 y una eficiencia de remoción, medida espectrofotométricamente, del 67%. Estos resultados son comparables con lo obtenido por Shiomi y colaboradores en 2006, que utilizando Pseudomonas sp. NRRL B-12227 obtuvieron una eficiencia de remoción del 70% en las primeras 24 h, utilizando medio mínimo mineral con 129 ppm de ácido cianúrico y 1000 ppm de glucosa como fuente de carbono adicional.28

Evaluación de la biodegradación de ácido cianúrico en un reactor de lecho empacado

Se probaron diferentes cargas volumétricas de alimentación, en la Figura 3 se muestra el comportamiento del reactor durante su operación a las diferentes velocidades de dilución.

Fig. 3. Variación de la concentración de ácido cianúrico, medido espectrofotométricamente, a la salida del reactor, en función de las velocidades de dilución probadas a lo largo del cultivo continuo.

El reactor de lecho empacado estuvo en funcionamiento durante 100 días, los cálculos realizados para las velocidades de dilución utilizadas fueron en base al volumen drenado del reactor el cual fue de 731 mL.

En la Figura 3 se destaca que con la primera velocidad de dilución empleada tardó 41 días en estabilizarse el reactor, mientras que con las velocidades posteriores su período de estabilización fue menor (14 días). El ácido cianúrico residual fue medido por HPLC, en todos los casos siempre fue menor a 5 ppm.

En la Tabla 1 se presentan las velocidades y las eficiencias de remoción del ácido cianúrico para cada velocidad de dilución empleada.

Se observó que a medida que se incrementa la velocidad de dilución, la eficiencia de remoción disminuyó, esto puede deberse a un efecto de la velocidad de dilución, ya que los microorganismos cuentan con menor tiempo de contacto con el ácido cianúrico, por lo cual no todo el compuesto está siendo utilizado; sin embargo, la velocidad de degradación siguió aumentando a mayores velocidades de dilución.

Tabla 1. Condiciones de operación y comportamiento global de las dos etapas del reactor de lecho empacado.

Al emplear el reactor de lecho empacado, la eficiencia de remoción y la velocidad volumétrica de degradación fueron incrementadas de manera considerable en comparación con el cultivo por lote. Esto puede deberse a que los cultivos por lote se trabajaron con las células en suspensión y el cultivo continuo se trabajó con las células inmovilizadas en tezontle; los sistemas inmovilizados permiten contar con una mayor concentración de masa celular reactiva dentro del reactor, protegida por la misma biopelícula formada por la comunidad adsorbida en el soporte.18

D(d-1)

BV-OOOT(mg L-1 d -1)

RV-OOOT(mg L-1 d -1)

ηOOOT(%)

0.323 16. 13+0.26 16.05+0.35 99.5+0.01

0.465 23.22+0.18 22.68+0.11 97.7+0.03

0.578 28.90+0.08 26.81+0.23 92.8+0.15

0.726 36.30+1.10 33.57+1.42 92.5+0.05



La Figura 4 muestra la gráfica de las velocidades volumétricas de remoción RV (mg L-1 d -1) en función de las cargas volumétricas de alimentación BV (mg L-1 d -1) comparándolo con el ideal RV = BV, en el cultivo continuo, la pendiente de la curva de los resultados es cercana a la ideal debido a que las eficiencias de remoción son próximas al 100 %.

Fig. 4. Velocidad volumétrica de degradación (RV) en función de la velocidad de carga volumétrica (BV).

En la Figura 5 se observa que en la primera etapa del reactor se encuentra una mayor cantidad de microorganismos como células libres en el efluente que en la segunda etapa, estos resultados pudieron deberse a que la glucosa es consumida rápidamente en la primera etapa, lo que provoca que en la segunda etapa haya menor o nula disposición de la fuente de carbono primaria y por lo tanto un menor crecimiento bacteriano.

Este efecto también se observa en la eficiencia de remoción de la segunda etapa del reactor (Tabla 2), la cual no presenta una diferencia significativa con la primera etapa, porque ya no existe una fuente de carbono que ayude cometabólicamente en la mineralización del compuesto.

Tabla 2. Comparativo de la eficiencia de remoción entre las etapas del reactor.

Actividad enzimática

Se determinó la actividad del enzima ácido cianúrico amidohidrolasa por triplicado, siguiendo la metodología descrita en el capítulo de materiales y métodos, y la concentración de proteína por duplicado utilizando el método de Lowry (metodología descrita en métodos analíticos). En la Figura 6 se muestra la actividad específica del enzima ácido cianúrico amidohidrolasa, obtenida en cultivo por lote con la comunidad aislada, donde se observa que alrededor de las 10 h de cultivo se presentó la máxima actividad de la enzima.

Fig. 6. Actividad enzimática específica del ácido cianúrico amidohidrolasa en función del tiempo del cultivo por lote de la comunidad seleccionada.

D (h-1) Eficiencia de remoción (%)Etapa 1 Etapa 2

0.323 97.5+0.42 99.5+0.010.465 97.0+0.15 97.7+0.030.578 91.1+0.13 92.8+0.150.726 91.0+0.07 92.5+0.05

Fig. 5. Concentración celular en el efluente de cada etapa del reactor para cada velocidad de dilución manejada.



Para este trabajo la mayor producción de enzima fue de 24.5 U/mg de proteína, valores similares a los encontrados por Llamas en 2008,19 el cual reporta una máxima actividad 31 U/mg en cultivo por lote para un consorcio bacteriano conformado por Agrobacterium sp. y Acinetobacter sp.; sin embargo, obtuvo valores de hasta 44 veces más de actividad empleando otros sistemas de cultivo diferentes al cultivo por lote, como el lote repetido y el cultivo Fed-batch.

La expresión del operon atzDEF está sujeta a una regulación dual involucrando dos distintas señales; el estatus de nitrógeno de la célula y la presencia del sustrato específico, el cual es el ácido cianúrico, como inductor. La expresión de atzDEF puede ser activada por la concentración limitante de la fuente de nitrógeno, en ausencia de ácido cianúrico, o por el ácido cianúrico bajo condiciones de suficiencia de nitrógeno, pero la máxima actividad sólo puede ser lograda cuando el ácido cianúrico ésta presente y no hay una fuente mejor de nitrógeno disponible, como es el caso de este estudio.14

Identificación de los microorganismos integrantes de la comunidad seleccionada, mediante técnicas de biología molecular

En la Tabla 3, se presenta el género más cercano de cada una de las especies identificadas por amplificación del 16S DNAr y posterior secuenciación, mostrando el porcentaje de similitud y su clave de acceso en el Genebank.

Tabla 3. Identificación de los microorganismos aislados de la comunidad microbiana

En 2005, Smith y col.,29 aislaron a Variovorax paradoxus de una comunidad de 8 integrantes capaz de mineralizar atrazina en cultivo por lote. Encontraron que Variovorax paradoxus contiene el gen trzD, el cual codifica al enzima ácido cianúrico amidohidrolasa encargada del rompimiento del anillo triazínico. También mostró una leve actividad de ureasa, lo cual significa que la ruta de degradación del ácido cianúrico mediante esta cepa es a través de biuret y no alofanato como metabolito, ya que no encontraron el gen atzD en este microorganismo. Variovorax paradoxus tiene la capacidad de formar biopelícula, ya sea en cultivo por lote o continuo. La cantidad y grosor de la biopelícula depende de la fuente de carbono y se ve incrementada por el suministro continuo de nutrientes, es común observar dicho incremento cerca de la fuente de aireación a la que es sometida la bacteria en un cultivo continuo.30 Jamieson y colaboradores mencionaron que la glucosa es una de las fuentes de carbono preferidas por Variovorax paradoxus para la formación de biopelícula, la cual está compuesta por exopolisacáridos principalmente; además, que la película forma una matriz abundante y pegajosa sobre superficies inertes.30

Rousseaux y col.,31 en 2001 reportaron por primera vez que Stenotrophomonas maltophillia estaba involucrada en la degradación de atrazina, después de analizar los genes codificados para la degradación de dicho compuesto, encontraron únicamente el gen atzA el cual codifica para la declorinización de la atrazina, pero no encontraron el gen trzD descrito por Karns en 1999,8 implicado en el rompimiento del anillo triazínico. Galíndez y col. en 2011 encontraron que Stenotrophomonas maltophillia no sólo contiene el gen atzA, sino que también cuenta con el gen atzB, atzC y el gen atzD,32 como ya lo habían reportado Binks y col. en la degradación de hexahidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina (RDX) por Stenotrophomonas maltophilia PB1.33

Clave de acceso

Similitud (%)

Microorganismo más cercano

FN435916.1 97 Acinetobacter sp.

EU864329.1 96 Stenotrophomonas maltophilia

EU418711.1 95 Burkholderia sp

DQ223662.1 95 Hymenobacter sp

AF209469.1 96 Variovorax paradoxus



En el caso del género Acinetobacter, se ha reportado la capacidad de degradar ácido cianúrico en cocultivo con Agrobacterium tumefaciens en un reactor de lecho empacado.18 Sánchez en 2011 encontró que Acinetobacter es capaz de degradar una mezcla de herbicidas triazínicos (atrazina-terbutrina) y ácido cianúrico como integrante de una comunidad microbiana en un reactor air-lift de lecho empacado.34

Se tienen referencias que mencionan las propiedades de los géneros Hymenobacter y Acinetobacter para adherirse a las superficies de soportes porosos, facilitando la formación de biopelícula,35,36 la formación de biopelícula protege a los microorganismos de compuestos tóxicos y disminuye efectos inhibitorios.37

Para conocer la capacidad que tienen cada uno de los aislados bacterianos de crecer en ácido cianúrico, se inocularon cada uno independientemente, en medio líquido con ácido cianúrico complementado con glucosa como fuente de carbono adicional y en medio líquido con ácido cianúrico como fuente de carbono y nitrógeno, el crecimiento fue observado de forma cualitativa. Todos los microorganismos mostraron capacidad de crecer en medio líquido con ácido cianúrico y glucosa como fuente de carbono adicional y sólo las bacterias de los géneros Acinetobacter y Variovorax tienen la capacidad de crecer en medio líquido con ácido cianúrico como única fuente de carbono y nitrógeno.

CONCLUSIONES

Se logró aislar una comunidad microbiana con capacidad de utilizar el ácido cianúrico como única fuente de carbono y nitrógeno con una eficiencia de remoción cercana al 60% en cultivo por lote y del 65% en cultivo continuo. Se requiere de una fuente de carbono y energía adicional para aumentar la velocidad y la eficiencia de remoción

del ácido cianúrico. La comunidad seleccionada, inmovilizada en un reactor de lecho empacado operando en continuo, fue capaz de remover 50 ppm de ácido cianúrico con eficiencias de remoción cercanas al 100% cuando se adicionaron 125 ppm de glucosa.


SIP-IPN: 20201418Salmerón-Alcocer, becaria COFAA y EDD-IPN; Ahuatzi-Chacón becaria COFAA y EDI-IPN.

REFERENCIAS

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Research article

Effect of probiotic microorganisms on strains of Helicobacter pyloriEfecto de microorganismos probióticos sobre cepas de Helicobacter pylori*Gonzalez-Magallanes1, B., Avilés-Jiménez, F.2, *Hernández-Sánchez H.1

1Laboratorio de Biotecnología de alimentos, Departamento de Ingeniería Bioquímica. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN. Av. Wilfrido Massieu 399, Nueva Industrial Vallejo, Gustavo A. Madero, 07738, Ciudad de México, México. Tel: 5567664594, 5557296000 ext. 57866.2Hospital de pediatría, Centro Médico Nacional Siglo XXI, Av. Cuauhtémoc 330, Doctores, Cuauhtémoc, 06720, Ciudad de México, México. Tel. 56276900 ext. 22408.

*Corresponding author: [email protected], [email protected]

Abstract. Probiotic microorganisms promote a wide range of health benefits including the stimulation of the immune response and the inhibition of the growth of pathogenic bacteria. Probiotics can be used in the prevention and treatment of some gastric diseases caused by Helicobacter pylori. This bacterium is one of the most important pathogens for humans since it is currently infecting more than 50% of the world’s population. It is responsible for diseases such as gastritis, peptic ulcer, and gastric cancer. Some novel therapies consider the use of probiotics along with antibiotics to treat this infection. The objective of this work was to observe the effect of four probiotic strains on H. pylori strains isolated from clinical cases of non-atrophic gastritis and gastric cancer in an in vitro model. The well agar diffusion method was used, where supernatants with or without viable cells from probiotic strains (Lactobacillus plantarum 299v, Lb. plantarum DGIA, Lb. casei Shirota and Saccharomyces boulardii) were added to wells made in blood agar plates inoculated with H. pylori strains. It was shown that the supernatants containing viable cells of the Lactobacillus probiotic strains had an inhibitory effect on the growth of the H. pylori strains. The supernatants without viable cells also showed inhibition but to a lesser extent. When the supernatants were exposed to proteolytic enzymes, the inhibitory effect was lost, so it was concluded that the substance through which H. pylori is inhibited is of protein nature, possibly a bacteriocin or a BLIS.

Keywords. Lactobacillus, Saccharomyces, Helicobacter pylori, inhibition.

Resumen. Los microorganismos probióticos promueven una amplia variedad de beneficios para la salud incluyendo la estimulación de la respuesta inmune y la inhibición del crecimiento de bacterias patógenas. Los probióticos pueden usarse en la prevención de algunos padecimientos gástricos causados por Helicobacter pylori. Esta bacteria es uno de los patógenos más importantes para humanos ya que en la actualidad infecta a más de la mitad de la población mundial. Es responsable de enfermedades como gastritis, úlcera péptica y cáncer gástrico. Algunas terapias novedosas recomiendan el uso de probióticos junto con antibióticos para tratar esta infección. El objetivo de este trabajo fue el de observar el efecto de cuatro cepas probióticas sobre cepas de H. pylori aisladas de casos clínicos de gastritis no atrófica y cáncer gástrico en un modelo in vitro.

Recibido: 22 de diciembre de 2020 / Aceptado: 14 de enero de 2021 / Publicado en línea: 31 de enero de 2021



Se usó el método de difusión en pozos en el cual se agregaron sobrenadantes con y sin células viables de cepas probióticas (Lactobacillus plantarum 299v, Lb. plantarum DGIA, Lb. casei Shirota y Saccharomyces boulardii) a pozos en placas de Agar Sangre inoculadas con cepas de H. pylori. Se pudo observar que los sobrenadantes que contenían células viables de Lactobacillus tuvieron un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de H. pylori. Los sobrenadantes sin células viables también mostraron inhibición, pero en un menor grado. Cuando los sobrenadantes se expusieron a enzimas proteolíticas, este efecto inhibitorio se perdió por lo que se concluyó que la sustancia inhibitoria debía ser de naturaleza proteica, posiblemente una bacteriocina o una BLIS.

Palabras clave. Lactobacillus, Saccharomyces, Helicobacter pylori, inhibición.

INTRODUCCIÓN

De cada diez personas que son infectadas por la bacteria Helicobacter pylori, sólo una desarrolla enfermedad y nueve nunca la desarrollan. La infección se asocia etiológicamente con la presencia de úlceras pépticas (gástrica o duodenal), y con el desarrollo de un tipo especial de linfoma gástrico denominado MALToma, de igual manera, participa en la cadena multicausal etiológica del desarrollo de cáncer gástrico. En 1994 la Organización Mundial de la Salud (específicamente, la IARC-International Agency for Research on Cancer) clasificó a dicho patógeno como agente biológico carcinógeno para el hombre categoría 1, donde la incidencia más alta de infección tiene lugar durante la infancia en países en vías de desarrollo y parece estar relacionada con condiciones económicas e higiénico-sanitarias desfavorables.1

Los principales problemas en la terapia de erradicación de H. pylori son la tasa de fracaso de más del 20% y el alto porcentaje de efectos secundarios de la terapia con antibióticos. Además, debido a los eventos adversos del tratamiento, hay como resultado una mayor resistencia de cepas bacterianas a los antibióticos. La terapia triple estándar ya no puede recomendarse para su uso empírico, debido al alto nivel de resistencia a los dos antibióticos clave: claritromicina y metronidazol.2 Por ello se están implementando estrategias alternativas en la práctica clínica para

tratar cepas resistentes de H. pylori, como el uso de probióticos. Los estudios publicados hasta la fecha sugieren que los probióticos pueden tener un doble papel en la lucha contra la infección por H. pylori: disminuyen la frecuencia de eventos adversos gastrointestinales causados por la terapia con antibióticos y aumenta la tasa de erradicación.3 Se ha observado que, al administrar probióticos junto con el tratamiento correspondiente para tratar la infección con H. pylori, aumenta su eficacia y/o reducen efectos secundarios que éste provoca, además de prevenir infecciones y ser usados como posible profilaxis. Los probióticos pueden selectivamente inhibir el crecimiento de bacterias patógenas por muchos mecanismos como: desplazamiento físico, producción de substancias antimicrobianas como ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno, bacteriocinas, etc.4

Las bacteriocinas son categorizadas como péptidos antimicrobianos (AMP por sus siglas en inglés) o proteínas producidas por bacterias. Los escasos nutrimentos en el ambiente desencadenan la producción microbiana de una variedad de bacteriocinas para la competencia por espacio y recursos.5 Se ha informado que la nisina A y algunas mutacinas inhiben el crecimiento de H. pylori en modelo in vitro, por lo tanto, estas sustancias podrían considerarse para su desarrollo como un tratamiento de úlcera péptica.6




Cepas bacterianas. Se emplearon cuatro cepas probióticas comerciales: Lb. plantarum 299v aislada de Protransitus LP®, Lb. plantarum DGIA la cual es una cepa aislada de un queso mexicano (doble crema) elaborado con leche cruda y fabricación mediante técnicas tradicionales en Chiapas, México, Lb. casei Shirota aislada de la bebida láctea fermentada Yakult®, y Saccharomyces boulardii aislada del suplemento Floratil®. Se utilizaron cuatro cepas de H. pylori obtenidas de aislamientos clínicos, dos cepas de cáncer gástrico: H. pylori 2006-46, H. pylori 2003-250 y dos de gastritis no atrófica: H. pylori 2010-8, H. pylori 2008-31. Se usó como cepa de referencia a H. pylori 26695 (ATCC® 700392™). Las cepas de lactobacilos se incubaron en caldo de Man Rogosa Sharpe (MRS) a 37°C durante 24 h y la levadura en caldo de Extracto de Levadura Peptona Dextrosa (YPD) a 37ºC por 48 h. Las cepas de H. pylori se sembraron en placas de agar base sangre con 5% de sangre de cordero desfibrinada estéril, a partir de crioviales almacenados en nitrógeno. Las placas se incubaron en condiciones de microaerofilia (con 10% de CO2) a 37°C durante 2-3 días. Se observaron características de las colonias sobre el medio de cultivo. Se realizaron pruebas de esterilidad a todos los sobrenadantes.

Obtención de sobrenadantes.

Después del tiempo de incubación de las cepas probióticas, se procedió a separar los distintos tipos de sobrenadantes: a) sobrenadantes con células viables. Se tomó una alícuota de 1 mL de cada cepa después del tiempo de incubación. Estos sobrenadantes se utilizaron el mismo día en que se obtuvieron. b) Sobrenadantes sin células viables. Los sobrenadantes se centrifugaron a 6000 rpm, durante 20 min a 20 °C y se esterilizaron por

filtración utilizando una membrana de ésteres de celulosa (MF-Millipore) con poro de 0.45 μm de diámetro. c) Sobrenadantes sin células viables neutralizados. De los sobrenadantes esterilizados por filtración, se tomaron alícuotas independientes y se ajustaron a pH 6.5 con NaOH 5N para neutralizar el efecto inhibitorio del ácido láctico y se le adicionó catalasa (1 mg/mL). d) Para demostrar la naturaleza proteica de los posibles agentes antimicrobianos producidos por las cepas probadas en esta investigación, se trató por separado los sobrenadantes (pH 6.5) con tres enzimas proteolíticas: proteasa tipo VIII de Bacillus licheniformis (1μL/mL), tripsina tipo III de páncreas bovino (1 mg/mL) y pronasa de Streptomyces griseous (1 mg/mL).7

Efecto de los probióticos sobre cepas de H. pylori.

La actividad de los sobrenadantes se evaluó mediante un ensayo de difusión en agar en pozos. Del crecimiento de las cepas de H. pylori se obtuvo una turbidez igual a la del tubo 0.5 de la escala de McFarland en solución salina y se sembraron por estría masiva sobre placas con agar sangre. Sobre el agar se hicieron pozos de 0.85 cm de diámetro, se agregaron 80 μL de cada uno de los distintos sobrenadantes en cada pocillo y se incubaron a 37 °C en microaerofilia (con 10% de CO2) durante 72 h. La actividad antimicrobiana se evaluó midiendo la formación de zonas de inhibición alrededor de los pozos. Se utilizaron medios MRS y YPD, como controles negativos. También se probó ácido láctico al 0.7% con un pH de 3.7 sobre las cepas de H. pylory. Esto se hizo con la finalidad de ver el efecto que tiene sobre las cepas y la relación con la presencia de ácido láctico en los sobrenadantes de los probióticos.

Para cada una de las réplicas de los experimentos, se calculó la media aritmética y la desviación estándar mediante MS-Excel. Para detectar diferencias en la susceptibilidad de las cepas de



H. pylory a las diferentes cepas de probióticos se utilizó un análisis de varianza de dos factores también mediante MS-Excel con un nivel de significancia α=0.05.

RESULTADOS

En la Figura 1 se presenta la gráfica del diámetro de los halos de inhibición obtenidos a partir de los sobrenadantes que contenían células viables de las cuatro cepas probióticas, mientras que en la Figura 2, se puede observar la formación de los halos de inhibición sobre el agar donde se sembró H. pylori y el efecto de los mismos sobrenadantes con células viables.

Fig. 1. Tamaño de los halos de inhibición de H. pylori con sobrenadantes de probióticos con células viables. Halos de H. pylori, con sobrenadantes probióticos que contenían células viables. Cada experimento se realizó por triplicado.

Fig. 2. Halos de inhibición de H. pylori con sobrenadantes de probióticos con células viables. Imágenes obtenidas de la formación de halos sobre cepas de H. pylori con sobrenadantes que contenían células viables de cepas probióticas. En cada uno de los pozos; a) Lb. plantarum DGIA, b) Lb. plantarum 299v, c) Lb. casei Shirota y d) MRS.

En todos los casos se puede observar que sólo las bacterias lácticas tuvieron efecto mientras que la levadura no mostró inhibición alguna. Las cepas menos susceptibles de H. pylori fueron la 26695 y 2006-46 aunque también mostraron inhibición.En las Figuras 3 y 4 se muestra la misma información, pero para los sobrenadantes que se esterilizaron por filtración (sin células viables).

Fig. 3. Tamaño de los halos de inhibición de H. pylori con sobrenadantes de probióticos sin células viables. Tamaño de los halos obtenidos sobre las cepas de H. pylori, con sobrenadantes probióticos que fueron esterilizadas por filtración. No se observó algún tipo de inhibición por parte de S. boulardii, ni de los medios. Cada experimento se realizó por triplicado

Fig. 4. Halos de inhibición de H. pylori con sobrenadantes de probióticos sin células viables. En la figura se observan las imágenes obtenidas de la formación de halos sobre cepas de H. pylori con sobrenadantes esterilizados por filtración de a) sobrenadante de Lb. plantarum DGIA, b) sobrenadante de Lb. plantarum 299v, c) sobrenadante de Lb. casei Shirota y d) MRS.

En cuanto a los resultados obtenidos a partir de los sobrenadantes a los cuales se les realizó un tratamiento con NaOH y catalasa, y con las enzimas proteolíticas para ver si la actividad

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H. pylori26695

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MRS s/t S. boulardii YPD

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H. pylori26695

H. pylori2010-8

H. pylori2008-31

H. pylori2006-46

H. pylori2003-250

Diá

metr

o d

e l

os h

alo

s (

mm

)

L. plantarum 299v L. plantarum DGIA L. casei Shirota

MRS s/t S. boulardii YPD



anti-H. pylori, en caso de existir, era de naturaleza proteica, se observó que no hubo inhibición del crecimiento de las cepas de H. pylori.

En cuanto a la prueba de ácido láctico al 0.7% con un pH de 3.7 sobre las cepas de H. pylori, el producto comercial (Sigma-México) que se utilizó, no produjo inhibición alguna sobre las cepas de H. pylori.

DISCUSIÓN

Se puede ver una mayor actividad de inhibición en los sobrenadantes que tienen células viables, comparada con la de los sobrenadantes esterilizados por filtración. Este es un fenómeno que ha llamado mucho la atención y que se ha observado mucho en bacterias lácticas y que se ha denominado síntesis de bacteriocinas controlada por quorum sensing, en el cual la bacteriocina sólo se produce cuando se detecta la presencia de un microorganismo potencialmente competitivo. Este mecanismo se ha observado en Streptococcus thermophilus9

y en diferentes especies de los géneros Lactococcus y Lactobacillus. Se ha demostrado que este mecanismo tiene una relación costo-beneficio mayor que la síntesis constitutiva de bacteriocinas10 por lo que es muy probable que este sea el escenario que se presenta en este estudio y que los probióticos estén produciendo bacteriocinas reguladas por quorum sensing.

Por otra parte, se realizó una prueba con ácido láctico comercial al 0.7% a un pH de 3.7, para ver si este era uno de los componentes que provocaban la inhibición. Se eligió ese pH ya que es el obtenido posterior a la incubación (fermentación) de las cepas probióticas en su medio de crecimiento. Sin embargo, no se observó inhibición de H. pylori, ya que como se sabe, esta bacteria resiste el pH gástrico. Se ha visto que una posible causa de la inhibición

del crecimiento de H. pylori por probióticos (específicamente Lb. casei Shirota), se debe a la inhibición de la actividad de la ureasa provocada, por el ácido láctico producido por el probiótico y la posterior incapacidad de H. pylori de crecer a pH bajo en ausencia de ureasa.11 Es posible que haya una diferencia en el tipo de ácido láctico comercial y el producido por las cepas probióticas.

Se sabe que todos las BAL, por definición, producen lactato a partir de la fermentación de carbohidratos. El lactato existe en dos formas enantioméricas, un enantiómero dextrorrotatorio (D-lactato) y un enantiómero levorrotatorio (L lactato).12 En el caso de Lb. plantarum 299v, éste produce una mezcla de lactato L y D, y este último representa aproximadamente el 61.9% de la producción total de lactato. Todas las BAL producen una cierta cantidad de D-lactato, que varía del 1 al 97% de todo el lactato producido, dependiendo de la cepa, siendo el 40% una cantidad típica.12 A pesar de que no se tiene evidencia del tipo de ácido láctico que produce la cepa Lb. plantarum DGIA, por el simple hecho de pertenecer a esta especie, se sabe que produce una mezcla de lactato L y D como se mencionó anteriormente.

Se ha demostrado que el ácido láctico participa en la actividad antibacteriana de las cepas probióticas de Lactobacillus. Cabe destacar que el ácido láctico L muestra una mayor actividad antibacteriana que el ácido láctico D o una combinación de ácido láctico L y D. Es por ello, que la mayor actividad antibacteriana de las cepas probióticas de Lactobacillus que producen ácido láctico L, se cree que podría estar relacionada en parte con la mayor proporción de lactato L en los sobrenadantes libres de células que en las cepas que producen ácido láctico D y L.13 También, pueden estar produciéndose otras sustancias que provocan la inhibición de H. pylori.



En el caso de los sobrenadantes sin células viables, el ANOVA de dos factores demostró que en general, la cepa de H. pylori 2006-46 es la más susceptible a la acción de los probióticos (p≤0.05). No hubo diferencia significativa en susceptibilidad entre las otras cuatro cepas de H.pylori (p≥0.05). En el caso de las BAL probióticas las dos cepas de L.plantarum fueron significativamente más inhibitorias (p≤0.05) que L. casei Shirota.

En el caso de los sobrenadantes con células viables, las cepas de H. pylori 2008-31 y 2003-250 fueron significativamente más susceptibles que las demás (p≤0.05). En este caso, no hubo diferencia significativa (p≥0.05) entre la actividad inhibitoria de las tres cepas probióticas de BAL.

a) Respecto a los sobrenadantes obtenidos a partir del crecimiento de los probióticos, que fueron tratados con catalasa para descomponer al peróxido de hidrógeno, neutralizados e hidrolizados con proteasas, no se observó algún efecto de inhibición sobre H. pylory. El hecho de que no haya inhibición de las cepas del patógeno utilizadas en esta investigación, indica que posiblemente el efecto inhibitorio se deba a bacteriocinas o BLIS que al ser de naturaleza proteica se hidrolizan con las proteasas perdiendo su actividad y a un posible efecto bactericida del peróxido de hidrógeno.

b) En cuanto a los sobrenadantes neutralizados a los cuales se les agregó enzimas proteolíticas pero que no se trataron con catalasa, se observó que tampoco hubo inhibición del crecimiento de las cepas de H. pylori. Lo cual nos indica que definitivamente es muy probable que la actividad inhibitoria se deba exclusivamente a moléculas de naturaleza proteica como bacteriocinas o substancias inhibidoras parecidas a bacteriocinas (BLIS por sus siglas en inglés) y que no haya efecto alguno del H2O2. A diferencia de las bacteriocinas, las BLIS son compuestos antimicrobianos que

pueden inhibir tanto a bacterias Gram positivas como negativas. Se ha observado su presencia en diferentes microorganismos probióticos. Dado todo lo anterior, es muy probable que en el caso de los probióticos utilizados en este estudio se tenga la producción de BLIS sintetizados vía regulación por “quorum sensing” y activos contra H. pylori.

Respecto a la levadura S. boulardii, como se puede ver en los resultados, no inhibió el crecimiento de ninguna de las cepas de H. pylori. Se tienen evidencias de que en modelos animales o en modelos celulares, esta levadura puede tener efecto benéfico contra distintas cepas patógenas como Clostridioides difficile, Vibrio cholerae, Salmonella sp., Shigella sp. y Escherichia coli. Aparentemente actúa a través de dos mecanismos principales: producción de factores que neutralizan toxinas bacterianas y la modulación de las vías de señalización de las células hospederas involucradas en la respuesta proinflamatoria durante la infección bacteriana. También se ha visto que puede sintetizar fosfatasa que puede desfosforilar endotoxinas, así como lipopolisacáridos de E. coli O55B5.14

El hecho de que no se haya observado inhibición de las cepas de H. pylori por parte de S. boulardii, puede deberse a que además de que los productos secretados no tengan ningún efecto sobre la cepa patógena, el tipo de modelo usado en este trabajo no haya sido el más adecuado, ya que se ha visto que la levadura es capaz de reducir la colonización de H. pylori en el sistema humano gastrointestinal, donde se usó un estudio in vivo con niños de Irán.15

CONCLUSIONES

Tanto los sobrenadantes con y sin células viables de las cepas de lactobacilos inhibieron el crecimiento de H. pylori. Sin embargo, se produjo una mayor inhibición en los sobrenadantes que



contienen células viables, lo que pudiera implicar un mecanismo de inducción del compuesto inhibitorio del tipo de “quorum sensing”. Utilizando el mismo modelo, los sobrenadantes con y sin células viables de la levadura probiótica S. boulardii, no inhibieron el crecimiento de las cepas de H. pylori. Los sobrenadantes de las cepas probióticas neutralizadas y tratadas con enzimas, no inhibieron el crecimiento de las cepas de H. pylori. Por lo tanto, se puede inferir que la naturaleza de los componentes inhibitorios es proteica, posiblemente una bacteriocina o BLIS ya que, además, se comprobó que el ácido láctico al 0.7% no inhibe el crecimiento de las cepas de H. pylori utilizadas en este estudio, en un modelo de difusión en agar.


Los autores agradecen al Instituto Politécnico Nacional el financiamiento parcial de la investigación mediante el proyecto SIP-20195505. La autora González Magallanes agradece el apoyo de CONACyT por la Beca para estudios de Maestría y al IPN por el apoyo BEIFI.

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Research article

Assessment of fibroblasts inside dermal substitute for use skin tissue engineering Barrera-Chong Alex1,4, Garciadiego-Cazares David2, Porras-Zamora Karla1, Márquez Erick3, González-Torres Maykel1, Ibarra Clemente1,2 , Velasquillo Cristina1 , Ruvalcaba-Paredes Erika*1

1Laboratorio de Biotecnología, CENIAQ, Instituto Nacional de Rehabilitación. Calz México-Xochimilco 289, Coapa, Arenal Tepepan, Tlalpan, 14389 México, CDMX. 2Unidad de Ingeniería de Tejidos, Terapia Celular y Medicina Regenerativa, Instituto Nacional de Rehabilitación. 3Cirugía Plástica y Reconstructiva, CENIAQ. Instituto Nacional de Rehabilitación. 4Universidad Autónoma Metropolitana, Departamento de Biotecnología, Laboratorio de Biopolímeros. Av. San Rafael Atlixco 186, Leyes de Reforma 1ra Secc, Iztapalapa, 09340 México, CDMX.

*Corresponding author: [email protected]; [email protected]

Received: December 17, 2020 / Accepted: January 23, 2021 / Published online: January 31, 2021

Abstract. Burns are skin injuries, which constitute a public health problem at the national level. Skin tissue engineering offers new alternatives for the treatment of burn injuries. This work is aimed at investigating the dermal fibroblast’s interaction with a commercial dermal substitute (DS) meant for the treatment of burns. Dermal fibroblasts were obtained from human samples. Cell viability and proliferation assays were performed, and the presence of Ki-67 and collagen type III by immunofluorescence to evaluate cell interaction with the DS. The results showed that the cells seeded in the DS remain viable in 90%. MTT assay indicated that the cells proliferate in the substrate from day 3 to 7, appearing to have better growth. The positive presence of Ki67 confirmed cell proliferation in DS. Also, the appearance of Col III supported the fibroblast preservation of the dermal phenotype. Our findings suggested that the DS can be used in skin tissue engineering (STE) as a promising approach towards effective wound coverage to improve burn injury healing.

Keywords. Skin, fibroblast, burns, tissue engineering, scaffold.

Resumen. Las quemaduras son lesiones cutáneas, que constituyen un problema de salud pública a nivel nacional. La ingeniería de tejidos de la piel ofrece nuevas alternativas para el tratamiento de las quemaduras. En este trabajo, se propone evaluar la interacción celular de un DS con fibroblastos dérmicos, para ser utilizado como andamio en el tratamiento de quemaduras. Se obtuvieron fibroblastos dérmicos a partir de muestras humanas. Se realizaron ensayos de viabilidad celular y proliferación, así como la presencia de Ki-67 y Col III por inmunofluorescencia para evaluar la interacción celular con el DS. Se observó que las células sembradas en la DS permanecen viables en un 90%, mientras que con el ensayo MTT, se demostró que las células proliferan en el sustrato del día 3 al 7, pareciendo tener un mejor crecimiento. La proliferación celular en el DS se corroboró con la presencia positiva de Ki67, así como la presencia de Col III, lo que indica la conservación del fenotipo dérmico de los fibroblastos en el material. Nuestros resultados sugieren que la DS puede utilizarse en la ingeniería de tejidos cutáneos (STE) como un enfoque prometedor hacia la cobertura eficaz de las heridas para mejorar la curación de las lesiones por quemaduras.

Palabras clave. Piel, fibroblastos, quemaduras, ingeniería de tejidos, andamios.



INTRODUCTION According to the SINAVE, from January 2016 to April 2017, a total of 29,112 cases of patients with burns were registered and treated at public hospitals.1 With the advance of bioengineering, different alternatives have been developed to replace transient or permanent skin. These have been called dermal substitutes, which are protein matrices oriented to dermal regeneration.2,3

Several studies have revealed the use of dermal substitutes as standard practice in the last decade. The dermal substitutes, commercially manufactured and used in clinical practice, have provided an acellular scaffold designed to be repopulated by host cells’ migration in vivo.4,5 Skin substitutes have been classified into biological or synthetic depending on their composition and duration.6 The most widely accepted classification has been the three-category system (Chart 1).7,8,9

Skin substitutes play an essential role in burns healing. However, none covers all the necessary qualities to fulfill skin functions. Tissue engineering research has been essential in developing new skin substitutes that can meet all expectations. Several dermal substitutes could be valuable in generalized dermal therapy.6 One of them is IntegraTM, a commercial product that has been used in Latin America since 2007, like a dermal regeneration template for small or medium defects.10 Recently, the practical technique in covering wounds with IntegraTM post-burn eschar excision and post-burn scar contracture release resulting in reasonable graft take11 has been used. The use of IntegraTM as a dermal regeneration template in patients with diabetic foot ulcers promoted and directed revascularization in skin grafts. The above dermal substitute has proved to be a useful option in limb salvage program.12

Earlier works showed clinical evidence of the role of IntegraTM in the repair of wounds and burns. Other works contributed to the knowledge of the cellular and molecular mechanisms that occur when cells interact with the molecular components of IntegraTM to promote tissue repair. Currently, some investigations used dermal substitutes as scaffolds for skin regeneration. In 2012 Hamrahi et al. investigated stem cell lines in a mouse burn model using IntegraTM as a scaffold release matrix. They confirmed that the stem cells could be cultured on IntegraTM and then placed on burn injuries. The experiment was controlled non-invasively in an in vivo model.13 Also, Leonardi et al. investigated autologous stem cells’ effect on the integration and vascularization of a dermal substitute in full-thickness skin wounds in a murine model, indicating that stem cells with artificial dermal substitutes may represent a significant potential for the treatment of full-thickness burns.4 It was found that the combination of autologous cells with IntegraTM facilitates the skin’s reconstruction in full-thickness wounds.14 Stem cells derived from skin cultured in dermal substitutes were seeded by Jeremias’s group. The research showed that IntegraTM and PelnacTM dermal substitutes allow adhesion, propagation, and cell growth of stem cells derived from skin and maintain the characteristics of stem cells’ multilineage marker expression. Therefore, they concluded that dermal substitutes could preserve stem cell growth, as they provide an efficient in vitro environment, which is promising as a useful tool for tissue engineering and regenerative technology.15

As mentioned earlier, several works have dealt with commercial products such as scaffolding with excellent results. IntegraTM is one of the proposals for commercial dermal substitutes as scaffolds for their clinical practice application in Mexico. However, the preparation of IntegraTM constructs with autologous human dermal fibroblasts (HDF) has not been researched.



This work aims to investigate the feasibility of IntegraTM to be used as a scaffold for skin tissue engineering. Here, the feasibility of the use of IntegraTM as a scaffold for the maintenance of cell viability, proliferation, and cell differentiation of HDF was assessed. The potential of using IntegraTM/ HDF constructs containing autologous fibroblast to improve the quality of the scars of burned patients was discussed.

MATERIALS AND METHODS

Isolation and culture of fibroblasts.

Skin remnants were obtained from 5 donor patients subjected to abdominoplasties, and they were all Mexican. Next, a cell isolation protocol was carried out under sterile conditions. Adipose tissue was removed from the skin with the help of a scalpel after were mechanically fragmented, and then it was washed with PBS-10% antibiotic-antimycotic (penicillin/ streptomycin; GibcoTM). Skin fragments were incubated on dispase (3 mg/mL; Gibco TM) for 90 min. After incubation, the epidermis and dermis layers were separated with tweezers and processed independently. For fibroblast isolation, the dermal layer was mechanically disaggregated and placed on type II collagenase (3 mg/mL) for 2 h. After inactivation, the cell suspension was centrifuged, and the isolated fibroblasts were counted and cultured in a culture flask at a 10,000-cell/cm2 density, using DMEM F12 medium supplemented with Fetal Bovine Serum FBS (GIBCOTM) 10% and 1% penicillin/streptomycin (Anti-Anti 100X, GibcoTM). The medium was changed every third day and cultured at 37°C on a 95% humidity atmosphere at 5% CO2.

HDF cells culture on IntegraTM”

DS was donated by Instrumed-Int®. Before cell seeding, DS was cut in pieces 1x1 cm2, over 24 well culture dishes, the fragments washed with PBS (Phosphate Buffer Saline; GibcoTM). Fibroblasts were trypsinized, centrifuged, and counted. Cells were seeded (a cell

density of 5000 fibroblasts) onto DS fragments, using DMEM F12 medium supplemented with FBS 10% and 1% penicillin/streptomycin (Anti-Anti 100X, GibcoTM). The medium was changed every third day and incubated at 37ºC on a 95% humidity atmosphere at 5% CO2. All assays were carried out in triplicate.

Viability Assay.

The fibroblasts’ cell viability was performed using the live/dead viability/cytotoxicity assay kit for mammalian cells (molecular probes, InvitrogenTM), following manufacturer recommendations. Cell cultures were briefly incubated with 2 µM ethidium homodímero-1 (EthD-1) and 1 µM calcein-AM were diluted in Hank’s medium. This solution was used to incubate DS with fibroblast for 45 min at 37°C. As a control, fibroblasts seeded in monolayer were used. Next, cells were washed with PBS (Gibco), and analyzed using a confocal microscope LSM 780 and ZEN 2010 Carl Zeiss software (Zeiss, Jena-Thuringia, Germany). Ethidium homodimer (EthD-1) exhibits non-viable cells (stained in red), and calcein-AM represents cell viability (stained in green). The positive cells and the total number of cells were counted using the Image J software. Three fields were analyzed for each experiment. All experiments were independently performed by triplicate.

MTT assay.

Two thousand five hundred cells were seeded on DS fragments at different times (3, 5, and 7 days) to determine the proliferation assay. Colorimetric MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide; Sigma-Aldrich) assay was performed. The well plates were cultured and incubated with MTT: DMEM solution (1:10) for 3 h at 37°C. The cells metabolized formazan crystals were solubilized in 2-propanol: dimethyl sulfoxide (1:1). Subsequently, the solution absorbance was measured at 570 nm in the Synergy HTX spectrophotometer. All experiments were independently performed by triplicate for each selected time.



Immunofluorescence assay.

Twenty-five thousand cells were seeded in DS for the immunofluorescence assay. The experiment was carried out over 24 well culture dishes for 7 days at 37°C on a 95% humidity atmosphere at 5% CO2. Cultures were washed with PBS (GibcoTM) and fixed with methanol/acetone (Merck) for 2 min at 4 °C. Afterward, it was washed four times with PBT (PBS-Triton al 0.1%) for 2 min. Then, it was passed to the immuno-reaction with the first antibody. Ki-67 allowed evaluating cell proliferation (1:100, BioLegend, 350501, San Diego, CA). CoL-III was used to assess the new extracellular matrix (1:100, Santa Cruz Sc-8781). Besides, ALEXA FLUOR 488 and/or 594 nm antibodies for double labeling was used as the secondary antibody. The samples were contrasted with DAPI (Invitrogen D1306) to determine the nuclei’s presence and were analyzed in an Axio-observer microscope (Karl-Zeiss). All experiments were repeated at least three times.

RESULTS

Cell culture

Fibroblasts obtained from skin samples were used to evaluate the interaction of the dermal fibroblasts with the DS. HDFs were successfully isolated from abdominoplasties, as seen in Figure 1A. Cells adhered to culture dishes’ plastic surface exhibited round, spindle, or elongate shape morphologies. The tissue fragments that were not wholly digested enzymatically were placed in the culture dish, as observed in Figure 1B. The surface adhesion and growth of most explant peripheral cells verified that dermal fibroblasts were obtained.

Cell viability

LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Assay Kit (Invitrogen®) was used to determine HDF viability after being seeded in the DS. The above assay measured known parameters of cell viability

through intracellular esterase activity and plasma membrane integrity. This experiment provided a two-color fluorescence, essentially based on live and dead cells’ simultaneous determination with two probes, Calcein AM and EthD-1. Cells seeded on the DS showed a fluorescence pattern similar to the control (Figure 2). A high percentage of viability (more than 95%) was observed. The cells seeded on DS had green fluorescence and were homogeneously distributed in the 3D platform. Also, elongate shape morphologies and a low percentage of mortality (less than 5%) were achieved by the cultured cells. These results indicated that DS keeps the fibroblasts live up to 7 days. Conversely, the cells grown in the control sample did not show a three-dimensional morphology.

Proliferation assay

Figure 2 shows that once the cells were detached and cultured on DS, they continued displaying an extended spindle-shaped morphology, similar to in vitro, and remained viable after 7 days. The DS potential as a scaffold for the culture and growth fibroblast was confirmed by MTT assay. The amount of metabolically active cells increased from day 5 to 7 in DS compared to the monolayer. These results demonstrated that the fibroblast could be attached to the DS, and DS supports the fibroblast proliferation for seven days (Fig. 3).

Phenotype maintenance

The immunofluorescence-based analysis was performed to evaluate the expression of typical markers. It was confirmed that in vitro-cultured fibroblasts expressed Ki-67 is a marker for determining cell proliferation. The expression of nuclear protein Ki-67 in fibroblast was assessed in the monolayer and onto the DS. The presence of ki-67 in monolayer cells in green was observed. However, it was challenging to follow this protein



in the DS due to the sample’s three-dimensional structure. Therefore, the protein was followed by a microscope. However, some Ki-67 positive nuclei were observed. The expression of these proteins was found in the monolayer and the DS. The cell proliferation in the monolayer and onto the DS for seven days was verified (Fig. 4-5).

Here, collagen type III (Col III) was determined in the fibroblasts seeded on the DS and monolayer. Fibroblast cultured on DS maintained the expression of Col III. The presence of Col III in monolayer cultured fibroblasts outside the nucleus of the cell in red was observed (Figure 4C). The existence of this positive protein in the DS was hard to identify because of the auto-fluorescence. However, some areas could be lively indicative of the presence of cells expressing this signal (Figure 5). Cells were labeled with DAPI to identify their presence in the DS, as seen in Figure 5C. The merged image showed Col-III (red), the double labeling positive for COL-III with DAPI. Ki-67 (green) was challenging to identify in this experiment.

Figures

Chart. Chart. Classification of skin substitutes.

Fig. 1. Fibroblasts Cells. Phase-contrast micrographs of the cell cultures from remnants of abdominoplasties. A) Fibroblast Explant, B) Monolayer fibroblast before being seeded on the DS, indicating primary fibroblasts’ morphology. The cells exhibited a long fusiform shape—scale bar 100um, original magnification, x100. All assays were carried out in triplicate.

A

100 μm

B

100 μm

A

100 μm



Monolayer day 3

DS with fibroblasts day 3.

Monolayer day 7.

DS without Fibroblasts, until day 7.

B

100 μm

C

100 μm

D

100 μm

E

100 μm

A

100 μm

Ki-67

Fig. 3. Analysis of proliferative activity of Fibroblasts. The MTT assay results demonstrated that Fibroblast exhibited logarithmic growth. The amount of metabolically active cells increased from day 5 to 7 in DS compared to the monolayer.

Fig. 2. Representative fluorescence micrographs of Fibroblasts viability assays. Live/dead staining to show cell viability. The viability assay with calcein and ethidium homodimer-1 was performed in A) monolayer day 3 B) DS with fibroblasts day 3. C) monolayer day 7. D) DS with fibroblasts on day 7. E) DS without Fibroblasts, until day 7. Green fluorescence represented live cells, and red fluorescence indicated dead cells—scale bar 100 um, original magnification, X100.



B

100 μm

C

100 μm

D

100 μm

Fig. 4. Immnunofluorescent staining of fibroblasts. The fibroblasts expressed Ki67 stained in fluorescent green A), also expressed COL-III in red B). The nuclei were stained in fluorescent blue with DAPI C). Finally, the position D is the merged image of fibroblasts cells positive double immunofluorescent staining—scale bars: 100 µm, original magnification, X100.

COL-III

DAPI

MERGED

A

100 μm

B

100 μm

C

100 μm

Ki-67

COL-III

DAPI



DISCUSSION

The DS is composed of two membranes, an internal one formed by a mesh of bovine collagen fibers attached to the glycosaminoglycan chondroitin 6-sulfate, allowing DS’s manipulation once it was hydrated with PBS and it was handled in sterile conditions. A viability test was performed in vitro with fibroblast cultures on day 14 of expansion to determine DS’s potential as a scaffold for the cell culture. It is proved that the live cells are metabolically active and were stained with a green fluorescent for calcein, and the nuclei of the dead cells that have their membrane compromised were stained in red for EthD-1 (Fig 2). We observed a high percentage of viability (more than 95%) and a low mortality percentage (less than 5%). These results show that DS keeps the fibroblasts live up to 7 days. We consider that DS provide a mesh that allows dermal fibroblasts to proliferate and remain metabolically active, furthermore we suggest that DS components (collagen and chondroitin 6-sulfate) help maintain the phenotype of dermal fibroblasts.

Deep burns may be treated temporarily with synthetic and biological dressings or permanently with a skin autograft, the gold standard of treatment.16 Most times, donor sites are insufficient for providing complete coverage in extensive burns.17 Several biological skin substitutes are currently employed as temporary dressings, including human skin, xenografts, and amnion allografts.16 Information on biomaterials seeded with fibroblast for tissue engineering can be found in the literature.18

It offers cutting-edge treatment with better aesthetic results for people with burn injuries. However, scaffolding design with excellent results requires several trials (clinical, preclinical assays: phase I-IV, approval, and commercialization), which can take considerable time until it can be used in clinical practice. Patients who suffer extensive burns sometimes have little time left. With the results obtained, we demonstrate that a DS is suitable for use as a scaffold since it preserves the dermal phenotype of fibroblasts, and we demonstrate that it maintains cell proliferation.

We propose to continue with this research and study in clinical practice the combination of DS with autologous or heterologous fibroblasts in deep burns. We are hoping that they help to cover the burned areas, avoiding complications, and improving the re-epithelialization processes, obtaining better aesthetic and functional results, as an alternative for patients with extensive burns, especially for injuries of the neck, folds of arms, legs, or mammary gland, where patients require effective treatments with better functional results.

CONCLUSIONS

We conclude that SD can be used as a scaffold for tissue engineering and potential application to repair deep dermal burns with heterologous or autologous fibroblast.

D

100 μm

MERGED

Fig. 5. Phenotype maintenance of fibroblasts. The fibroblasts seeded on DS fragments expressed Ki67 stained in fluorescent green (A). However little autofluorescence is observed in areas positivity. COL III and autofluorescence were expressed in red (B). The nuclei were stained in fluorescent blue with DAPI and it also showed autofluorescence (C). Merged image demonstrated the presence of fibroblasts cells on DS (D). Scale bars: 100 µm, original magnification, X100.



FUNDING AND ACKNOWLEDGMENTS

The authors acknowledge the technical support of Martínez Karina, Guerrero Xochitl from Instituto Nacional de Rehabilitación Luis Guillermo Ibarra Ibarra. Also, we would like to thank to Instituto Nacional de Rehabilitación Luis Guillermo Ibarra Ibarra, for the financial support conceded for these researches.

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