การถอดรหัส (transcription) expression.pdf · 36 การถอดรหัส...

36 การถอดรหัส

3. การถอดรหัส (Transcription)

องค์ประกอบส าคัญที่สุดของจีโนมก็คือ ยี น (Gene) ซึ่งหมายถึง หน่วยพืน้ฐานของข้อมูล

พันธุกรรม ตามนิยามความหมายของค าว่า “ยีน” ทางสาขาชีวเคมี จะหมายถึง สว่นของดีเอ็นเอ (หรอื

อาร์เอ็นเอ ในบางกรณี ) ที่เป็นรหัสข้อมูลพันธุกรรมส าหรับสร้างสารชีวโมเลกุล โดยสารชีวโมเลกุล

ดังกล่าวจะ มีบทบาทและหนา้ที่ส าคัญในสิ่งมีชีวติ สารชีวโมเลกุลที่เป็นผลิต ภัณฑ์ ของ ยีน (Gene

products) ส่วนใหญ่จะหมายถึง โปรตนีชนิดตา่ง ๆ ที่เซลล์สร้างขึ้น นอกจากนีผ้ลติผลของ ยีนยังรวมถึง

โมเลกุลของ อาร์เอ็นเอบางชนิด เชน่ Ribosomal RNA และ Transfer RNA ซึ่งเป็นผลิตผลจากการ

ถอดรหัสของยีน (Transcription) แล้วสามารถท าหนา้ที่ในเซลล์ได้ โดยตรงในรูปของอาร์เอ็นเอ โดยไม่

จ าเป็นต้องมีการแปลรหัส (Translation) เพื่อสร้างเป็นโปรตนี

การแสดงออกของยนี (Gene expression) หมายถงึ การเปลี่ยนถ่ายข้อมูลพันธุกรรมที่เก็บไว้

ในรูปของดีเอ็นเอ (หรอือาร์เอ็นเอ ในสิ่งมชีีวติบางชนิด) เพื่อสร้างเป็นสารชีวโมเลกุลที่สามารถท าหนา้ที่

และมีบทบาทต่อการด ารงชีวติของสิ่งมชีีวติ

การแสดงออกของยนี ประกอบด้วยกระบวนการส าคัญหลักๆ 2 กระบวนการได้แก่

1) การถอดรหัส (Transcription) เป็นกระบวนการสังเคราะห์ อาร์เอ็นเอ โดยมีการถอดรหัสข้อมูล

พันธุกรรมจากดีเอ็นเอ มาเก็บในรูปของอาร์เอ็นเอ เชน่ ribosomal RNA (rRNA) transfer RNA

(tRNA) และ messenger RNA (mRNA)

2) การแปลรหัส (Translation) เป็นกระบวนการสังเคราะหโ์ปรตนีโดยแปลรหัสข้อมูลพันธุกรรม

ซึ่งอยู่ในรูปของล าดับนิวคลีโอไทด์บนสาย mRNA ไปเป็นล าดับกรดอะมิโนในโมเลกุลของ

โปรตนี

3.1 การถอดรหัส (Transcription)

การถอดรหัสเป็นกระบวนการเปลี่ยนถ่ายข้อมูลพันธุกรรมที่เก็บในรูปของ ดีเอ็นเอเกลียวคู่ ไปอยู่

ในรูปของอาร์เอ็นเอสายเดี่ยวซึ่งมีล าดับเบสเป็นสายองคป์ระกอบ (Complementary chain) หรอืสายที่มี

นิวคลีโอไทด์เข้าคู่กันได้ดี กับสายดีเอ็นเอที่ใชเ้ป็นแมแ่บบ โดยอาร์เอ็นเอที่สังเคราะหจ์ากกระบวนการ

ถอดรหัส มีอยู่ 3 ชนิดใหญ่ๆ คือ

1) Messenger RNA (mRNA) เป็นอาร์เอ็นเอซึ่งได้จากการถอดรหัสของยีนส าหรับสังเคราะหเ์ป็น

โปรตนีจ าเพาะ ชนิดตา่งๆ โดยอาร์เอ็นเอชนิดนี้ท าหน้าที่เป็นตัวกลางในการเปลี่ยนถ่ายข้อมูล

พันธุกรรมจากล าดับนิวคลีโอไทด์ของดเีอ็นเอ ไปเป็นล าดับกรดอะมิโนของโปรตนี


2) Transfer RNA (tRNA) เป็นอาร์เอ็นเอที่มลีักษณะเฉพาะ และท าหน้าที่เสมอืนเป็นเครื่องมอื

อ่านข้อมูลพันธุกรรมหรอืล าดับเบสบนสาย mRNA พร้อมกับน ากรดอะมโินที่ สอดคล้องกับ

รหัสพันธุกรรมมาต่อกันเป็นสายพอลิเพปไทด์ (Polypeptide)

3) Ribosomal RNA (rRNA) เป็นอาร์เอ็นเอซึ่งได้จากการถอดรหัสของยีนส าหรับสังเคราะห ์ rRNA

โดยอาร์เอ็นเอ ชนิดนี้จะรวมอยู่กับ Ribosomal protein ซึ่งประกอบกันเป็น “ไรโบโซม

(Ribosome)” มีบทบาทส าคัญในการสังเคราะหโ์ปรตนีชนิดตา่งๆ ของสิ่งมชีีวติ

นอกจากนีย้ังมี อาร์เอ็นเอชนิดอื่นๆ อีก ที่ท าหนา้ที่จ าเพาะแตกต่างกันไป เช่น บางชนิดท าหน้าที่

เสมือนเป็นเอนไชม ์จึงเรียกว่า ไรโบไซม์ (Ribozyme) เป็นต้น

กลไกการถอดรหัสหรอืการสังเคราะห์ อาร์เอ็นเอ จะคล้ายกับการถ่ายแบบ ดีเอ็นเอ ในแงข่อง

ปฏิกิรยิาเคมีที่เกิดขึ้น รวมทั้งทิศทางของการสังเคราะห ์และความตอ้งการ สายดีเอ็นเอส าหรับใช้ เป็น

แมแ่บบในการสังเคราะห ์แต่ การถอดรหัส จะต่างไปจากการถ่ายแบบ ดีเอ็นเอ คือ การถอดรหัสไม่

ต้องการ RNA primer แต่จะใช้สายดีเอ็นเอเพียงสายเดียวเท่านั้นเป็นแมแ่บบ

3.2 เอนไซมท์ี่ใช้ในการถอดรหัส

เอนไซม์ ที่ใชใ้นการถอดรหัส เรียกว่า เอนไซม์ RNA polymerase หรอื DNA-directed RNA

polymerase เพราะใช้ดเีอ็นเอเป็นแมแ่บบในการสังเคราะหอ์าร์เอ็นเอ เอนไซม์นี้สังเคราะห์อาร์เอ็นเอ

โดยน าไรโบนิวคลีโอไทด์ (Ribonucleoside triphosphate; NTP) ทั้ง 4 ชนิด คือ ATP, GTP, CTP และ UTP

มาเชื่อมตอ่กันด้วยพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์โดย -Phosphate ของ NTP ตัวใหมจ่ะถูกต่อเข้าที่ปลาย

3-OH ของสายอาร์เอ็นเอที่ก าลังสร้าง ดังนั้นทิศทางของการสังเคราะหจ์งึเป็น ในทิศ 53 เสมอ

เชน่เดียวกับทิศทางของการสังเคราะห์ ดีเอ็นเอ และปฏิกิรยิาการสังเคราะห์ อาร์เอ็นเอมีการปล่อยไพโร

ฟอสเฟต (PPi) ออกมาเชน่กัน ดังแสดงในปฏิกิรยิาข้างลา่ง

(NMP)n + NTP (NMP)n+1 + PPi สายอาร์เอ็นเอท่ีก าลังสรา้ง สายอาร์เอ็นเอยาวขึน้

1 นิวคลโีอไทด์

เอนไซม์ RNA polymerase ต้องการดีเอ็นเอ เกลียวคู่ (Double-stranded DNA) ส าหรับการ

สังเคราะห์อาร์เอ็นเอโดยจะใช้แค่ 1 สายของดีเอ็นเอเกลียวคู่ที่วางตัวในทิศ 3 5 เป็นแมแ่บบ ซึ่งดี

เอ็นเอสายที่ท าหนา้ที่เป็นแม่แบบนี้ เรียกว่า “Template strand” ส่วนสายที่ไม่ได้ท าหนา้ที่เป็นแม่แบบ

เรียกว่า “Non-template strand” และเนื่องจากล าดับเบสของ Non-template strand จะเหมอืนกับ

ล าดับเบสของสาย อาร์เอ็นเอที่สังเคราะหข์ึน้ ตา่งกันที่สาย อาร์เอ็นเอจะมีเบส U แทนเบส T จงึเรียก

Mg2+

RNA polymerase e


Non-template strand นีว้่า “Coding strand” หรอื “Sense strand” และเรียก Template strand ว่า

“Non-coding strand” หรอื “Antisense strand” (รูปที ่3.1)

รูปที่ 3.1 อาร์เอ็นเอท่ีสร้างขึน้จะมีล าดับเบสเหมอืนกับ Coding strand (Non-template strand หรือ Sense

strand)

(ท่ีมา: Lewin, 2000; p. 233)

ในการสังเคราะห์ อาร์เอ็นเอ เอนไซม์ RNA polymerase ไม่ต้องการ RNA primer เพราะสามารถ

เริ่มตน้การสังเคราะหอ์าร์เอ็นเอได้ โดยการน าไรโบนิวคลีโอไทด์ 2 หนว่ยแรก มาเชื่อมตอ่กันด้วยพันธะ

ฟอสโฟไดเอสเทอร์ได้โดยตรง ซึ่งเอนไซม์ RNA polymerase มคีุณสมบัติที่แตกต่างจากเอนไซม์ DNA

polymerase คอื ม ีPolymerase activity อย่างเดียว ไม่มทีั้ง 5 3 Exonuclease activity และ 3

5 Exonuclease activity ดังนัน้ความผิดพลาดในการสังเคราะห์ อาร์เอ็นเอจงึมโีอกาสเกิดขึ้นได้สูงกว่า

การสังเคราะห์ ดีเอ็นเอ แตค่วามผิดพลาดในการสังเคราะห์ อาร์เอ็นเอในเซลล์จะไม่ส่ง ผลเสียหายต่อ

เซลล์มากเหมอืนความผิดพลาดที่เกิดขึ้นในการสังเคราะหด์ีเอ็นเอ เพราะเซลล์สามารถสังเคราะห์ อาร์

เอ็นเอที่ถูกต้อง ขึน้ใหม่ได้ อีกหลายโมเลกุลจา กกระบวนการถอดรหัส และอาร์เอ็นเอที่สรา้งขึ้นนี้จะ มี

การสลายและการสร้างทดแทนอยู่เสมอ แต่การสังเคราะหด์ีเอ็นเอในกระบวนการถ่ายแบบดีเอ็นเอ

เกิดขึ้นครัง้เดียวเท่านั้นก่อนการแบ่งตัวของเซลล์ ดังนั้นถ้าเกิดขอ้ผดิพลาดขึน้ จะส่งผลกระทบต่อเซลล์

มากกว่า

ในเซลล์โพรแคริโอต เชน่ E. coli นั้นจะมีเอนไซม์ RNA polymerase เพียงชนดิเดียวแต่สามารถ

สังเคราะห์อาร์เอ็นเอได้ทั้ง mRNA tRNA และ rRNA ซึ่งเอนไซม์ RNA polymerase ของ E. coli ประกอบ

ไปด้วยหน่วยย่อย 5 ชนิด (ตารางที่ 3.1) โดยมีหนว่ยย่อย 4 ชนิด ประกอบกันเป็นเอนไซม์หลัก (Core

enzyme) (รูปที่ 3.2) ที่ประกอบด้วยสายพอลิเพปไทด์ 5 โมเลกุล (2) ซึ่งเป็นหนว่ยย่อย 2

โมเลกุล หน่วยย่อย 1 โมเลกุล หนว่ยย่อย 1 โมเลกุล และหนว่ยย่อย 1 โมเลกุล (2)

(Antisense)

(Sense) 3

5

5

3

3

3

5

5

5 3

สายอาร์เอ็นเอที่สังเคราะห์ขึ้นจะมลี าดับเบสเป็นคู่สม

กับ Template strand และเหมือนกับ Coding strand การถอดรหัส

(Transcription)


ส าหรับหนว่ยย่อย (Sigma subunit) เป็นหนว่ยย่อยที่ จะจับกับ Core enzyme เพียงระยะสั้นๆ เท่าน้ัน

ในช่วงแรกของการถอดรหัส โดยท าหนา้ที่ในการจดจ าส่วนของ ดีเอ็นเอ ที่เรยีกว่า “ โปรโมเตอร์

(Promoter)” ซึ่งมีล าดับเบสจ าเพาะและอยู่หนา้ยนีที่จะท าการถอดรหัส โดยเมื่อหน่วยย่อย มารวมกับ

Core enzyme จะเรียก โมเลกุลของเอนไซม์ที่มหีนว่ยย่อย จับกับ Core enzyme แล้วนี้ ว่า

“Holoenzyme (2)”

รูปที ่3.2 (ก) หนว่ยยอ่ยท้ัง 5 ชนิดของเอนไซม์ RNA polymerase ใน E. coli และ (ข) Core enzyme ของ

Thermus aquaticus ซึ่งคล้ายกับของ E. coli

(ท่ีมา: Lehninger et al., 1993, p. 859; Nelson and Cox, 2013, p. 1060)

ตารางที่ 3.1 หนว่ยยอ่ยของเอนไซม์ RNA polymerase ของ E. coli

หน่วยย่อย น้ าหนักโมเลกุล

(Dalton)

จ านวนหน่วยย่อย

ต่อ 1 โมเลกุลของ

เอนไซม์

หน้าที่

36,500 2 เริ่มต้นการสังเคราะห์อาร์เอ็นเอโดยจับกับโปรตีนควบคุม

(Regulatory proteins) และสว่นของดเีอ็นเอท่ีอยู่หน้าต าแหน่งโปร

โมเตอร ์(Upstream promoter elements)

151,000 1 เริ่มต้นการสังเคราะห์อาร์เอ็นเอและเพิ่มความยาวของสายอาร์เอ็น

เอ

155,000 1 จับกับดเีอ็นเอ

70,000a 1 จดจ าต าแหน่งโปรโมเตอร์

11,000 1 ช่วยน า มาประกอบเป็น Core enzyme และช่วยท าให้โครงรูป

มคีวามเสถียร a นอกจากหนว่ยย่อย 70 ท่ีมีน้ าหนักโมเลกุล 70 kDa แลว้ เซลล์ E. coli ยังมหีน่วยย่อย อีกหลายชนดิซึ่งมน้ี าหนักโมเลกุล

แตกต่างกันและจ าเพาะต่อโปรโมเตอรต่์างชนดิกัน ได้แก่ 54, 38, 32, 28,24และ 18

(ท่ีมา: Mathews et al., 2013, p. 1131; Mathew and Chatterji, 2006)

(ก) (ข)

Core enzyme Core enzyme

subunit


3.3 กลไกการถอดรหัสใน E. coli

การถอดรหัส (Transcription) หรอืการสังเคราะห์ อาร์เอ็นเอ (RNA synthesis) มี 3 ขัน้ตอน คือ

ขั้นตอนเริ่มตน้การสังเคราะห์ อาร์เอ็นเอ (Initiation step) ขั้นตอนการเพิ่มความยาวของสายอาร์เอ็นเอ

(Elongation step) และ ขัน้ตอนสิน้สุดการสังเคราะห์อาร์เอ็นเอ (Termination step)

3.3.1 ขั้นตอนเริ่มต้นการสังเคราะห์อาร์เอ็นเอ (Initiation step)

การถอดรหัสจะเกิดขึ้นอย่างจ าเพาะ โดยเอนไซม์ RNA polymerase จับกับดีเอ็นเอ ที่ต าแหน่ง

โปรโมเตอร์ (รูปที่ 3.3) เพื่อเริ่มตน้การสังเคราะหส์าย อาร์เอ็นเอ โดยใช้ดีเอ็นเอในต าแหน่งถัดไปจาก

โปรโมเตอร์ เป็น แมแ่บบในการสังเคราะหอ์าร์เอ็นเอ จากการเปรียบเทียบล าดับเบส ต าแหน่งโปรโม

เตอร์ของยี นหลายชนดิพบว่าล าดับเบสของ โปรโมเตอร์ มีลักษณะจ าเพาะร่วม (Consensus) อยู่ 2

ต าแหน่ง คอื ต าแหน่งแรกอยู่หนา้จุดเริ่มต้นการถอดรหัส (Upstream transcription start site) ไป

ทางด้านปลาย 5 ของสายCoding strand ประมาณ 10 คู่เบส ต าแหน่งนีเ้รียกว่า “-10 region” หรอื

“Pribnow box” ซึ่งมีล าดับเบสจ าเพาะร่วมเป็น 5 TATAAT 3 ส่วนต าแหน่งที่สองอยู่หนา้จุดเริ่มต้นการ

ถอดรหัสไปทางด้านปลาย 5 ของสาย Coding strand ประมาณ 35 คู่เบส ต าแหน่งนี ้เรยีกว่า “-35

region” ซึ่งมีล าดับเบสจ าเพาะ ร่วมเป็น 5 TTGACA 3 ส าหรับไรโบนิวคลีโอไทด์ตัวแรกของสาย อาร์

เอ็นเอ ที่สังเคราะหข์ึน้จะอยู่ทางดา้นปลาย 5 ของสายอาร์เอ็นเอที่สังเคราะหข์ึน้เสมอ โดยต าแหนง่

ของนวิคลีโอไทด์ตัวแรกที่ ตรงกับจุดเริ่มต้นการสังเคราะห์ อาร์เอ็นเอ จะให้สัญลักษณ์เป็น +1 บนเส้นดี

เอ็นเอสาย Coding (nontemplate) strand (รูปที่ 3.3)

หนว่ยย่อย ใน Holoenzyme จะท าหนา้ที่จดจ าดีเอ็นเอบริเวณโปรโมเตอร์ท าให้เอนไซม์ RNA

polymerase เข้าจับกับดีเอ็นเอ บริเวณดังกล่าวอย่างจ าเพาะ จากนั้น DNA เกลียวคู่จะแยกออกจากกัน

ประมาณ 17 คู่เบสโดยเริ่มแยกที่บริเวณ “-10 region” จากนั้น เอนไซม์ RNA polymerase จะจับสายดี

เอ็นเอ บริเวณที่แยกออกจากกัน (Open-promoter complex) แนน่ขึน้ และน าไรโบนิวคลีโอไทด์ตัวแรก

ซึ่งส่วนใหญ่จะเป็นพิวรีนนิวคลีโอไทด์ (ATP หรอื GTP) มาจับกับ DNA สายที่เป็นแมแ่บบด้วยพันธะ

ไฮโดรเจน ตามกฎการจับคู่ของเบสแบบ Watson-Crick จากนั้น ไรโบนิวคลีโอไทด์ตัวถัดไป จะถูกน ามา

เชื่อมตอ่กับนิวคลีโอไทด์ตัวแรกด้วยพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์ระหว่าง 5--phosphate ของ NTP ตัวที่

เข้ามาใหม่กับ 3OH ของ NTP ตัวแรก ดังนัน้ที่ปลาย 5 ของสาย RNA จะมีหมู่ฟอสเฟต 3 หมู ่

(triphosphate; 5-ppp) เกาะติดอยู่เสมอ (รูปที่ 3.4)


รูปที่ 3.3 (ก) บริเวณ Promoter ของยนีในเซลล์ E. coli และ (ข) ล าดับเบสจ าเพาะร่วม (Consensus

sequence) ของล าดับเบสบริเวณโปรโมเตอร์ของยีนตา่งๆ ในเซลล์ E. coli (ล าดับเบสท่ีแสดงเป็นของ

Coding (nontemplate) strand)

(ท่ีมา: (ก) Murray et al., 1990, p. 386 และ (ข) Voet and Voet, 2004, p. 1223)

สายอาร์เอ็นเอที่สรา้งขึ้นใหมจ่ะจับหลวมๆ กับสายดีเอ็นเอที่เป็นแม่แบบ และจะหลุดออกเมื่อ

สายอาร์เอ็นเอ ถูกสร้างยาวขึ้นเรื่อยๆ โดยสาย อาร์เอ็นเอ จะถูกสร้างให้ยาวออกในทิศทาง 53

เชน่เดียวกับการสังเคราะห์ ดีเอ็นเอ และในขณะที่สาย อาร์เอ็นเอ มีความยาวประมาณ 7-10 นวิคลีโอ

ไทด์ หนว่ยย่อย ใน Holoenzyme จะแยกตัวออกไป เหลอืเฉพาะ Core enzyme ท าหนา้ที่สรา้งสาย

อาร์เอ็นเอต่อไปจนเสร็จ หนว่ยย่อย ที่แยกตัวออกไปสามารถเข้ารวมกับ Core enzyme โมเลกุลอื่นได้

อีก เพื่อท าหนา้ที่เริ่มการสังเคราะห์อาร์เอ็นเอโมเลกุลใหมไ่ด้ตอ่ไป

ขั้นตอนเริ่มตน้การสังเคราะห์ อาร์เอ็นเอใน E. coli จะถูกยับยั้งดว้ยยาปฏิชีวนะ Rifampicin ซึ่ง

ยานี้จะจับกับ หนว่ยย่อย ของเอนไซม์ RNA polymerase ท าให้เอนไซม์ไมส่ามารถท าหนา้ที่ได้ แต่ยานี้

ไม่มผีลตอ่การท างานของเอนไซม์ RNA polymerase ของยูแคริโอต

(ข)

(ก)


รูปที่ 3.4 ขั้นตอนเร่ิมตน้การสังเคราะห์อาร์เอ็นเอใน E. coli

(ท่ีมา: Mathews et al., 2013, p. 1134)

3.3.2 ขั้นตอนการเพิ่มความยาวของสายอาร์เอ็นเอ (Elongation step)

เอนไซม์ RNA polymerase จะเคลื่อนตัวไปบนสายดีเอ็นเอในทิศทาง 35 ของสายแม่แบบ

โดยดีเอ็นเอเกลียวคู่บริเวณที่เอนไซม์เคลื่อนตัวผา่น จะมีการแยกตัวออกจากกันเพื่อท าการสังเคราะห์

อาร์เอ็นเอในทิศทาง 53 (รูปที่ 3.5) เมื่อสายอาร์เอ็นเอถูกสร้างยาวขึ้น ส่วนของสายอาร์เอ็นเอ

ทางดา้น 5 จะหลุดออกจากสายดีเอ็นเอแมแ่บบเหลือเฉพาะทางดา้น 3 เท่านั้นที่ยังคงจับอยู่กับสายดี

เอ็นเอแมแ่บบ เพื่อให้เอนไซม์ RNA polymerase ท าการเติมไรโบนิวคลีโอไทด์ และเพิ่มความยาวของ

สายอาร์เอ็นเอต่อไป สว่นบริเวณที่สายอาร์เอ็นเอหลุดออกไปจากสายดีเอ็นเอแมแ่บบแล้ว ดีเอ็นเอทั้ง 2

สายจะกลับมาจับกันใหม่ คืนสูส่ภาพเกลียวคู่ดังเดิม

RNA polymerase จับที่ต าแหน่งโปรโมเตอร์ เกิดเป็น “closed-promoter complex”

ถ้าเร่ิมต้นส าเร็จ จะมกีารเพิ่มความยาวของสายอาร์เอ็นเออีก

ประมาณ 8 นิวคลีโอไทด์ ก่อนที่หน่วยย่อย จะหลุดออกไป

RNA polymerase เปิดเกลียว DNA ที่ต าแหน่ง โปรโมเตอร์ เกิดเป็น “open-promoter complex”

เร่ิมสังเคราะห์ mRNA โดยไรโบนิวคลีโอไทด์ตัวแรกที่น า

มาจับกับสาย DNA แม่แบบมักจะเป็นพิวรนีนิวคลีโอ

ไทด์ P

การเร่ิมต้นสังเคราะห์อาร์เอ็นเอส่วนใหญ่จะล้มเหลว โดยมักจะได ้oligonucleotide แค่ 2-9 หน่วย

หน่วยย่อย หลุดออกไป เหลือเพียงเอนไซม์หลัก (Core

enzyme) ท าหน้าที่สังเคราะห์อาร์เอ็นเอต่อไป

RNA polymerase เคล่ือนที่ไปจับที่ต าแหน่งโปรโมเตอร์ อย่างจ าเพาะ ด้วยการท างานของหน่วยย่อย

RNA polymerase

Promoter DNA template

100 µM pppPu

10 µM rNTPs

Promoter

P P P

P P P

P P P

P P P

5 3 5

3

5


ขั้นตอนการสังเคราะหส์ายอาร์เอ็นเอนีจ้ะถูกยับยั้งดว้ยยาปฏิชีวนะ “Actinomycin D” โดยยานี้

จะเข้าไปแทรกอยู่ระหว่างคู่เบส G-C ของดีเอ็นเอเกลียวคู่ท าให้เอนไซม์ RNA polymerase ไม่สามารถ

เคลื่อนตัวไปบนสายดีเอ็นเอได้ เป็นผลใหก้ารสังเคราะหส์ายอาร์เอ็นเอยุติลง

3.3.3 ขั้นตอนสิ้นสุดการสังเคราะห์สายอาร์เอ็นเอ (Termination step)

ใน E. coli การสิน้สุดการสังเคราะห์อาร์เอ็นเอมี 2 แบบ คอื แบบที่ตอ้งการโปรตีนโร () (Rho

factor-dependent) และ แบบที่ไม่ตอ้งการโปรตีน โร (Rho factor-independent) ซึ่งโปรตนีโรนี ้ถือวา่

เป็น “ปัจจัยยุติ (Termination factor)”

รูปที่ 3.5 ขั้นตอนการเพิ่มความยาวของสาย RNA (Elongation step) โดยเอนไซม์ RNA polymerase (ก)

ตอ้งการ Mg2+ เป็น Cofactor (ข) Transcription bubble (ค) เกิด Positive supercoils ด้านหนา้ และ Negative

supercoils ด้านหลังการเคลื่อนท่ีของ RNA polymerase

(ท่ีมา: Nelson and Cox, 2013, p. 1058)

(ก)

(ข)

(ค)


3.3.3.1 แบบที่ต้องการโปรตีนโร (Rho factor-dependent)

การสิน้สุดการสังเคราะห์ อาร์เอ็นเอ แบบนี้ ต้องการโปรตนี โร เมื่อเอนไซม์ RNA

polymerase หยุดเคลื่อนที่ โปรตนี โรจะเข้าจับกับสาย RNA ตรงบริเวณจ าเพาะ (C-rich site:

recognition site) ซึ่งใกล้กับจุดยุติ (รูปที่ 3.6) และเคลื่อนตัวไปตามสาย อาร์เอ็นเอจนถึงจุดยุติ โดย

โปรตนีโรมีคุณสมบัติของเอนไซม์ “ATP-dependent RNA-DNA Helicase” ดังนัน้อาจจะช่วยในการแยก

สายอาร์เอ็นเอออกจากสายดีเอ็นเอแมแ่บบ และท าใหเ้อนไซม์ RNA polymerase หลุดออกจากสายดี

เอ็นเอ ส่งผลใหก้ารสังเคราะหอ์าร์เอ็นเอยุติลง แตก่ลไกที่แท้จริงในการท างานของโปรตนี โร ยังไม่เป็นที่

เข้าใจอย่างชัดเจน

รูปที่ 3.6 ขั้นตอนการสิน้สุดการสังเคราะห์ RNA แบบท่ีต้องการโปรตนีโร ()

(ท่ีมา: Mathews et al., 2013, p.1142)

3.3.3.2 แบบที่ไม่ต้องการโปรตีนโร (Rho factor-independent)

การสิน้สุดการสังเคราะห์ อาร์เอ็นเอ แบบนี ้ไม่ตอ้งการโปรตีน โร แตอ่าศัยลักษณะ

โครงสรา้งพิเศษของสายอาร์เอ็นเอที่ก าลังสังเคราะหข์ึน้ ก็ท าให้สามารถยุติการสังเคราะห์ อาร์เอ็นเอได้

โดยส่วนของอาร์เอ็นเอที่ห่างจากด้านปลาย 3 ของสายอาร์เอ็นเอประมาณ 15-20 นิวคลีโอไทด์นัน้ จะ

mRNA

โปรตีนโรเคลื่อนที่ไปทางด้าน

ปลาย 3 ของอาร์เอ็นเอเพื่อไป

แทนที่ต าแหน่งของดีเอ็นเอสาย

แม่แบบ

โปรตีนโรจับกับโมเลกุล

เชิงซ้อนของ DNA-RNA-

Polymerase

โปรตีนโรท าให้อาร์เอ็นเอที่สรา้ง

ขึน้กับดีเอ็นเอสายแม่แบบ แยก

ออกจากกัน โดยโปรตีนโร และ

RNA polymerase ก็แยกออกไป

ด้วย

RNA polymerase

protein

recognition site

protein mRNA

RNA polymerase

5 5

5

5

3 ADP + Pi


มีล าดับเบสที่ เป็นเบสคู่สมกัน 2 บริเวณซึ่งเต็มไปด้วยเบส G และ C (Symmetrical GC-rich segments)

โดยล าดับนิวคลีโอไทด์ 2 บริเวณนี ้สามารถมาจับคู่กัน เกิดเป็นโครงสรา้งคล้ายบ่วงหรอืเข็มปักผม ที่

เรียกว่า “Stem-loop structure” หรอื “Hairpin structure” ได้ และล าดับเบสถัดจากโครงสรา้งนี้ไป

ทางดา้น 3 ของสายอาร์เอ็นเอนั้น พบว่าเป็นเบส U เรียงตดิกันประมาณ 4-8 หนว่ย (รูปที่ 3.7) ซึ่ง

การจับคู่กันระหว่างล าดับเบส U ที่เรยีงติดกันบนสายอาร์เอ็นเอกับล าดับเบส A ของสาย ดีเอ็นเอที่เป็น

แมแ่บบนั้น จับกันได้ไม่มั่นคง ท าให้สายอาร์เอ็นเอที่สรา้งขึ้นหลุดออกจากสายดีเอ็นเอแมแ่บบได้ง่ายขึ้น

เชื่อกันว่าการเกิดโครงสรา้ง Hairpin structure นี้ท าให้เอนไซม์ RNA polymerase หยุดท างานและท าให้

สายอาร์เอ็นเอ แยกออกจากสาย ดีเอ็นเอแมแ่บบได้ การสิน้สุดการสังเคราะห์ อาร์เอ็นเอ แบบนี ้พบได้

บ่อยกว่า แบบที่ตอ้งการโปรตีนโร แตก่็ยังไม่ทราบกลไกที่แน่ชัดเช่นกัน

รูปที่ 3.7 ขั้นตอนการสิน้สุดการสังเคราะห์อาร์เอ็นเอแบบท่ีไม่ต้องการโปรตนีโร () (ท่ีมา: Mathews et al.,2000, p.996; Mathews et al.,2013, p.1141)

3.4 กลไกการถอดรหัสในเซลลยู์แคริโอต

ในเซลล์ยูแคริโอตมีเอนไซม์ RNA polymerase 3 ชนิดในนิวเคลียสโดยแต่ละชนิดท าหน้าที่

สังเคราะห์อาร์เอ็นเอต่างชนิดกัน (ตารางที่ 3.2) นอกจากนีย้ังพบเอนไซม์ RNA polymerase ในไมโท

Stem-loop structure


คอนเดรีย (Mitochondria) และคลอโรพลาสต์ (Chloroplast) อีกด้วย โครงสรา้งของเอนไซม์ RNA

polymerase ในยูแคริโอต ประกอบไปด้วยหน่วยย่อยหลายหนว่ย เช่นเดียวกับ RNA polymerase ของ

โพรแคริโอต และแตล่ะชนิดจะมีจ านวนหนว่ยย่อยแตกต่างกันไป

ตารางที่ 3.2 เอนไซม์ RNA polymerases ในเซลล์ยูแครโิอต

ชนิดของ RNA polymerases ต าแหนง่ท่ีพบใน

เซลล์

ชนิดของอาร์เอ็นเอท่ีสังเคราะห์

RNA polymerase I นิวเคลยีส

(นิวคลโีอลัส)

Pre-rRNA (ไม่รวม 5S RNA)

RNA polymerase II นิวเคลยีส Pre-mRNA และ small nuclear RNAs บางชนิด

RNA polymerase III นิวเคลยีส Pre-tRNA 5S rRNA และ small RNAs ชนดิอ่ืนๆ

Mitochondrial RNA polymerasea ไมโทคอนเดรีย Mitochondrial RNA

Chloroplast RNA polymerasea คลอโรพลาสต์ Chloroplast RNA a มลีักษณะคลา้ยกับเอนไซม์ RNA polymerase ของโพรแครโิอตอย่างมาก

(ท่ีมา: Mathews et al., 2000, p. 1086)

กระบวนการสังเคราะห์ อาร์เอ็นเอ ในยูแคริโอตมีลักษณะคล้ายคลึงกับในโ พรแคริโอตแตจ่ะมี

ความซับซ้อนมากกว่า โดยล าดับเบสบริเวณโปรโมเตอร์ของยีนของยแูคริโอตจะมีความแตกต่างกันมาก

ระหว่างสิ่งมชีีวติต่างชนิดกัน โดยเฉพาะล าดับเบส โปรโมเตอร์ของยีน ที่ถูกจดจ าด้ วยเอนไซม์ RNA

polymerase I ซึ่งท าหนา้ที่สังเคราะห ์Pre-ribosomal RNA

ส าหรับล าดับเบสโปรโมเตอร์ของยีนที่ถูกจดจ าโดยเอนไซม์ RNA polymerase II ซึ่งสังเคราะห ์

mRNA พบว่าโปรโมเตอร์ของยีนจ านวนหนึ่งในเซลล์ ยูแคริโอตมีลักษณะจ าเพาะร่วม คือ มีล าดับเบส

เป็น A และ T จ านวนมาก (AT-rich) ที่บริเวณ “–30 region” ของโปรโมเตอร์ เรยีก ต าแหน่งนี้ว่า “TATA

box” และนอกจากนี ้จะ มี “Initiator (Inr) sequence” ที่อยู่ใกล้หรือครอบคลุมต าแหนง่ 1

(Transcription start site หรอื RNA start site) (รูปที่ 3.8) โดยต าแหนง่เหล่านี ้มบีทบาทส าคัญในการ

เริ่มตน้การถอดรหัสเพื่อสังเคราะห ์mRNA ในยูแคริโอต แต่อย่างไรก็ตามโปรโมเตอร์ของยีนจ านวนมาก

ในเซลล์ยูแคริโอตที่ถูกจดจ าด้วยเอนไซม์ RNA polymerase II ก็ไม่มีลักษณะจ าเพาะร่วมดังกล่าว

รูปที่ 3.8 ลักษณะจ าเพาะร่วม ของล าดับนวิคลีโอไทดท่ี์ต าแหนง่โปรโมเตอร์ ซึ่งจดจ าโดยเอนไซม์ RNA

polymerase II ของยูแคริโอต

(ท่ีมา: Nelson and Cox, 2013; p. 1065)

TATA box Inr Various

regulatory

sequences

30 1

3 5


เอนไซม์ RNA polymerase II เป็นเอนไซม์ที่มบีทบาทส าคัญส าหรับการแสดงออกของ ยีนต่างๆ

ส าหรับสร้างโปรตนี ในเซลล์ยูแคริโอต พบว่าเอนไซม์นี้มีขนาดใหญ่กว่า RNA polymerase ของโพรแคริ

โอตมาก โดยประกอบด้วย หนว่ยย่อยถึง 12 หนว่ย และในการท างานของเอนไซม์ RNA polymerase II

ยังต้องการโปรตนี ชนิดอื่นๆ ที่จ าเป็น ในการถอดรหัส ซึ่งเรียกโปรตนีที่จ าเป็นส าหรับการถอดรหัสนีว้่า

“ปัจจัยการถอดรหัส ( Transcription factors)” อีกหลายชนดิมาช่วยในขั้นตอนเริ่มตน้การถอดรหัส

รวมถึงขั้นตอนการสังเคราะห์ สายอาร์เอ็นเอ (รูปที่ 3.9 และ ตารางที่ 3.3) อย่างไรก็ตาม สามารถ

ยับยั้งการท างานของเอนไซม์ RNA polymerase II ได้ดว้ยสาร α-amanitin ซึ่งสังเคราะหโ์ดยเห็ด

Amanita phalloides

รูปที่ 3.9 RNA polymerase II ของยูแคริโอตต้องการ “Transcription factors” หลายชนิดมาชว่ยท างานใน

ขั้นตอนเร่ิมตน้การถอดรหัส

(ท่ีมา: Devlin, 2011; p. 189)


ตารางที่ 3.3 โปรตนีท่ีจ าเป็นส าหรับการถอดรหัสโดยเอนไซม ์RNA polymerase II ของยูแคริโอต

ปัจจัยการถอดรหัส

(Transcription factors)

จ านวน

หน่วยย่อย

น้ าหนักโมเลกุล

ของหน่วยย่อย

(Dalton)

หน้าที่

(Function)

ขั้นตอนเร่ิมต้นการ

ถอดรหัส

RNA polymerase II

TBP (TATA-binding

protein)

TFIIA

TFIIB

TFIIE

TFIIF

TFIIH

ELL

pTEFb

SII (TFIIS)

Elongin (SIII)

12

1

3

1

2

2

12

1

2

1

3

10,000-220,000

38,000

12,000, 19,000, 35,000

35,000

34,000, 57,000

30,000, 74,000

35,000-89,000

80,000

43,000, 124,000

38,000

15,000, 18,000, 110,000

เร่งปฏิกิริยาการสังเคราะห์ RNA

จับจ าเพาะที่ต าแหน่ง TATA box

ท าให้เกิดความเสถียรในการจับกับโปรโมเตอร์ของ

TFIIB และ TBP

จับกับ TBP และ เป็นตัวพาโมเลกุลของ RNA

polymerase-TFIIF complex มายังโปรโมเตอร์

เป็นตัวพา TFIIH มาที่โปรโมเตอร์ ; มีคุณสมบัติของ

เอนไซม ์ATPase และ Helicase

จับได้อย่างแน่นกับ RNA polymerase II; จับกับ

TFIIB และป้องกันไม่ให ้RNA polymerase II จับกับ

DNA บรเิวณอื่นอย่างไม่จ าเพาะ

คลายเกลียว DNA ที่ต าแหน่งโปรโมเตอร์; เติมหมู่

ฟอสเฟตให้กับ RNA polymerase II บรเิวณ CTD

(Carboxyl-terminal domain); เป็นตัวพาโปรตีนที่

จ าเป็นส าหรับ Nucleotide-excision repair มาที่

DNA

เติมหมู่ฟอสเฟตให้กับ RNA polymerase II บรเิวณ

CTD

* ปัจจัยในขั้นตอนการเพิ่มความยาวของสายอาร์เอ็นเอ (Elongation factors) ทุกชนิด จะมีท าหน้าที่ยับยัง้การหยุดถอดรหัสอันเนื่องมาจาก

RNA polymerase II-TFIIF complex ย่อมาจาก Eleven-nineteen Lysine-rich Leukemia โดยยีนส าหรับ ELL เป็นต าแหน่งที่มีการเกิด Chromosomal recombination บ่อย ซึ่ง

สัมพันธ์กับการเกิดมะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิด Acute myeloid leukemia

(ท่ีมา: Nelson and Cox, 2013; p. 1066)

ขั้นตอนการเพิ่มความยาวของสายอาร์เอ็นเอ*


3.5 การตัด-แต่งอาร์เอ็นเอหลังกระบวนการถอดรหัส (Post-transcriptional RNA

processing)

3.5.1 การตัด-แต่ง mRNA

โมเลกุลของ mRNA ที่ได้หลังจากเสร็จสิน้กระบวนการถอดรหัส เรียกว่า “Primary transcript”

ซึ่งในโพรแคริโอตไม่จ าเป็นต้องมีการตัด -แตง่ก็สามารถท าหนา้ที่เป็นแม่แบบส าหรับการสังเคราะห์

โปรตนีได้ทันที โดยพบว่ากระบวนการแปลรหัสหรอืการสังเคราะหโ์ปรตนีของโ พรแคริโอตนั้น มักจะ

เกิดขึ้นก่อนที่การถอดรหัสจะเสร็จสิน้อย่างสมบูรณ์ แตใ่นยู แคริโอตพบว่า Primary transcript ที่ได้

จะต้องผา่นกรรมวิธีการตัด-แตง่ก่อน ถึงจะสามารถใช้เป็นแม่แบบส าหรับการสังเคราะหโ์ปรตนีได้

Primary transcript ของ mRNA ในเซลล์ยูแคริโอต หรอื เรียกอีกชื่อหนึ่งว่า “Heterogeneous

nuclear RNA (hnRNA)” นั้น จะมีการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างเกิดขึ้นกับโมเลกุลของอาร์เอ็นเอ ได้แก่ (1)

การตัด-ต่อ (splicing) (2) การเติม 5cap และ (3) การเติม poly A ทางปลาย 3 ก่อนจะได้เป็น mRNA

ที่สมบูรณ์พร้อมท าหน้าที่ เป็นแมแ่บบ (Mature mRNA) ส าหรับการสังเคราะหโ์ปรตนีต่อไป ในไซโทพลา

ซึม (Cytoplasm)

3.5.1.1 RNA splicing

เนื่องจาก Primary transcript ของยูแคริโอต ประกอบด้วยส่วนที่เรยีกว่า “Intron” ซึ่งเป็น

ส่วนที่ไม่ได้บรรจุขอ้มูลพันธุกรรมส าหรับแปลรหัสเป็นโปรตนี แทรกอยู่ระหว่างสว่นที่เรยีกว่า “Exon”

ซึ่งเป็นส่วนที่บรรจุข้อมูลพันธุกรรมส าหรับแปลรหัสเป็นโปรตนี ซึ่งส่วน intron นี ้คั่นอยู่ระหว่างสว่น

Exon จงึเรียกอีกชื่อหนึ่งว่า “Intervening sequence” โดยยีนส่วนใหญ่ของ เซลล์ยูแคริโอตโดยเฉพาะ

สัตว์มกีระดูกสันหลังจะมี Intron แทรกอยู่ ยกเว้นยีนของโปรตนีฮิสโทน ส่วนในยูแครโิอตชนดิอื่น การม ี

Intron แทรกในยีนจะมีลักษณะแตกต่างกันไป เช่น ในยีสตส์่วนใหญ่ จะมี Intron แทรกอยู่ในยีน แต่

พบว่ายีนหลายยีนของยีสต์ Saccharomyces cerevisiae ไม่ม ีIntron เป็นต้น ปัจจุบันพบว่ายีนบางชนิดใน

เซลล์โพรแคริโอตก็มี Intron อยู่เชน่กัน แตพ่บได้นอ้ยมาก ดังนัน้ก่อนที่จะมีการแปลรหัส (Translation)

จงึตอ้งมกีารตัดเอาสว่น Intron ที่ไม่ได้บรรจุข้อมูลพันธุกรรมออกไปก่อน แล้วค่อยน าเอาเฉพาะส่วน

Exon มาต่อกันเพื่อใช้เป็น แม่แบบ (Template) ส าหรับการแปลรหัสต่อไป กระบวนการในการตัดเอา

ส่วน Intron ออก และน าเอาเฉพาะส่วน Exon มาต่อกันนี ้เรยีกว่า “RNA splicing” (รูปที่ 3.10)


รูปที่ 3.10 การตัด-แตง่ Primary transcript ของ mRNA ในเซลล์ยูแคริโอต


นอกจากพบ Intron ใน Primary transcript ของ mRNA ในเซลล์ยูแคริโอตแล้ว ยังสามารถ

พบ Intron ใน Primary transcript ของ rRNA และ tRNA ของทั้งโพรแคริโอตและยูแคริโอต ด้วย ทั้งนี้

สามารถจ าแนกชนดิของ Intron ตามกลไกการตัด Intron ออกจาก Primary transcript ได้เป็น 4 กลุ่ม

คือ กลุ่ม 1-4 (Groups I-IV)

กลุ่มที่ 1 (Group I Introns) ได้แก่ Intron ที่พบในยีนส าหรับสังเคราะห ์ rRNA mRNA และ

tRNA บางชนิดในนิวเคลียส ไมโทคอนเดรีย และ คลอโรพลาสต์

กลุ่มที่ 2 (Group II Introns) พบได้ทั่วไปใน Primary transcript ของ mRNA ในไมโทคอนเด

รีย หรอื คลอโรพลาสต์ ของเชือ้รา สาหรา่ย และ พชื นอกจากนี้ Intron กลุ่ม I และกลุ่ม II ยังสามารถ

พบได้ในยีนบางชนิดของแบคทีเรยีแต่พบได้นอ้ย

กลไกในการตัด Intron กลุ่มที่ 1 และกลุ่มที่ 2 สามารถเกิดขึ้นได้เอง (Self splicing) โดยไม่

ต้องอาศัยโปรตนีหรอืเอนไซม์อื่นมาเกี่ยวข้อง กลไก ในการตัด เอา Intron ออกแบบนี้ จะอาศัย

ความสามารถในการเป็นไรโบไซม์ (Ribozyme) ของ Primary transcript เอง ปฏิกิรยิาการตัด Intron จะ

ใช้ปฏิกิรยิา “Transesterification” และไม่ต้องการ ATP ในการเกิดปฏิกิรยิา (รูปที่ 3.11 และ รูปที่ 3.12)

โดยปฏิกิรยิาดังกล่าวจะคล้ายกับปฏิกิรยิาการท างานของเอนไซม์ Topoisomerase ที่มกีารตัดสายดีเอ็น

เอแล้วน ามาเชื่อมตอ่กันใหม ่


รูปที่ 3.11 ปฏกิิริยา Esterification ส าหรับการเกิด Self Splicing ของ Group I Introns โดยใช ้3-hydroxyl

group ของ Guanosine เป็น “Nucleophile” ในขัน้ตอนแรก


รูปที่ 3.12 ปฏกิิริยา Esterification ส าหรับการเกิด Self Splicing ของ Group II Introns


Primary

transcript

2 OH ของ Adenosine เป็น Nucleophile สร้างพันธะเอสเทอร ์

ด้าน 5 ของ Splice site ท าใหเ้กิดโครงสร้างโมเลกุล คล้ายบ่วง (Lariat structure)

2,5-Phosphodiester bond

Adenosine ใน Lariat structure มีพันธะ phosphodiester 3 พันธะ 3 OH ของ 5Exon เป็น Nucleophile

สร้างพันธะเอสเทอร์ด้าน 3 ของ Splice site ท าให ้Lariat structure

หลุดออกไป

Intermediate

Spliced RNA

5’ 3’ OH(3’)

5’ 3’


กลุ่มที่ 3 (Group III Introns) พบใน Primary transcript ของ mRNA ของยีนในนิวเคลียส ซึ่ง

เป็น Intron กลุ่มที่พบมากที่สุด กลไกการเกิด Splicing ของ Intron กลุ่มนี้ ตอ้งการ Small nuclear

ribonucleoprotein particle (snRNP; อ่านว่า “snurps”) ในการท าหนา้ที่ โดย snRNP ประกอบด้วยโปรตนี

จ าเพาะหลายชนดิและอาร์เอ็นเอขนาดเล็กซึ่งพบในนิวเคลียส (small nuclear RNA, snRNA) ประกอบ

กันเป็น “Spliceosome” ท าให้เรียก Group III Introns วา่ “Spliceosomal Introns” โดยมี snRNA ที่

เกี่ยวข้องกับการเกิด Splicing อยู่ 5 ชนิด คือ U1, U2, U4, U5 และ U6 ซึ่งโดยทั่วไปพบมากใน

นิวเคลียสของเซลล์ยูแคริโอต ขัน้ตอนการประกอบ Spliceosome ต้องการ ATP (รูปที่ 3.13) แตข่ั้นตอน

การตัดและต่อสายอารเ์อ็นเอ ไม่ต้องการ ATP

ส าหรับ Intron กลุ่มสุดท้าย คือ กลุ่มที่ 4 (Group IV Introns) พบใน tRNA บางชนิด ซึ่งการ

ตัด Intron ในกลุ่มนี้ ต่างจากกลุ่ม 1 และกลุ่ม 2 คือ ต้องการ ATP เอนไซม์ Endonuclease และ เอนไซม์

Ligase ในปฏิกิรยิาการตัด Intron ออกจาก Primary transcript

รูปที่ 3.13 กลไกการเกิด Splicing ของ Group III Introns ตอ้งการ snRNA ชนิด U1, U2, U4, U5 และ U6


U1 snRNP

U2 snRNP

U4-U6 + U5

Inactive Spliceosome

ADP + Pi

ADP + Pi

ADP + Pi U1, U4

Active Spliceosome

Lariat formation

Intron release


3.5.1.2 การเติม 5 cap

การเติม 5 cap หมายถึง การเติมนวิคลีโอไทด์ “7-methylguanosine” ที่ปลาย 5 ของ

สาย mRNA โดยเชื่อมต่อกับนิวคลีโอไทด์ตัวแรกของสายอาร์เอ็นเอด้วยพันธะ 5,5-triphosphate และ

เรียกโครงสรา้งนี้วา่ “ 5-cap”

การเติม 5 cap จะเกิดขึ้นขณะการถอดรหัสก าลังด าเนินอยู่หรือเกิดขึน้ทันทีหลังการ

ถอดรหัสสิน้สุดลงก็ได้ โดยโมเลกุลของ GTP จะเข้าไปเชื่อมตอ่กับปลาย 5 ของ Primary transcript

และจากนั้นจะมีการเติมหมู่เมทิล (Methylation) เข้าที่ต าแหน่งอะตอม ไนโตรเจนต าแหน่งที่ 7 (N-7)

ของเบส Guanine นอกจากนีย้ังพบว่าที่ต าแหน่ง 2-OH ของนวิคลีโอไทด์ตัวแรกและ บางครัง้รวมถึงนิ

วคลีโอไทด์ตัวที่ 2 ที่อยู่ถัดจาก 7-methyl guanosine จะถูกเติมหมู่เมทิล (Methyl group; -CH3) เข้าไป

ด้วยเช่นกัน (รูปที่ 3.14)

รูปที่ 3.14 (ก) โครงสร้าง 5-cap และ (ข) ขั้นตอนการเตมิ 5-cap ของ mRNA ของยูแครโิอต


(ก) (ข)


3.5.1.3 การเติม poly (A) tail

การเติม poly A ทางดา้นปลาย 3 จะเกิดขึ้นหลังการเตมิ 5cap แตจ่ะก่อนหรอืหลังการ

ตัด-ต่อ (Splicing) ก็ได้ ท าให้ปลาย 3 ของ mRNA มีนิวคลีโอไทด์ A ประมาณ 80-250 หนว่ย ซึ่ง

เรียกว่า “Poly (A) tail หรอื 3tail” ในการเติม Poly (A) เอนไซม์ Riboendonuclease ซึ่งเป็น

องค์ประกอบในกลุ่มเอนไซม์ขนาดใหญ่ (Enzyme complex) จะท าการตัด Primary transcript ที่ต าแหน่ง

จ าเพาะ ซึ่งต าแหน่งนีจ้ะอยู่ถัดจากล าดับเบส 5 AAUAAA 3 ไปทางดา้นปลาย 3 ของ mRNA

ประมาณ 10-30 นิวคลีโอไทด์ (รูปที่ 3.15) จากนั้นเอนไซม์ “Polyadenylate polymerase” ใน Enzyme

complex จะเติมนิวคลีโอไทด์ A เข้าที่ปลาย 3-OH ของสาย mRNA

รูปที่ 3.15 การเตมิ Poly (A) tail ให้แก ่Primary transcript ของยูแคริโอต


AAUAAA

AAUAAA

AAUAAA

AAUAAA


หนา้ที่ของ 5-Cap และ Poly A tail ยังไม่ทราบแนชั่ด แต่เข้าใจว่าทั้ง 5-Cap และ Poly

(A) tail มีบทบาทป้องกัน mRNA ไม่ให้ถูกท าลายได้งา่ย นอกจากนี ้ 5-Cap อาจจะมีสว่นชว่ยในการจับ

กันระหว่าง mRNA กับไรโบโซม (Ribosome) เพื่อเริ่มตน้กระบวนการแปลรหัสส าหรับการสังเคราะห์

โปรตนี

3.5.2 การตัด-แต่ง rRNA

Primary transcript ของ rRNA เรียกว่า “pre-ribosomal RNA (pre-rRNA)” กระบวนการตัด-

แตง่ rRNA จะเริ่มตน้ด้วยการเติมหมู่เมทิลเข้าที่เบสหลายต าแหนง่ และมีการเปลี่ยนแปลงของเบสยูริดีน

(Uridine; U) บางต าแหน่งไปเป็น Pseudouridine และDihydrouridine จากนั้นจงึมกีารตัดด้วยเอนไซม์

Endonuclease ที่ต าแหน่งจ าเพาะ โดยใน E. coli พบว่า rRNA ชนิด 23S, 16S และ 5S เป็นผลิตภัณฑ์

จากการตัด-แตง่ 30S pre-ribosomal RNA และพบว่า tRNA บางชนิดก็เป็นผลิตภัณฑจ์ากการตัด -แตง่

30S pre-ribosomal RNA เชน่กัน (รูปที่ 3.16)

รูปที่ 3.16 กรรมวธีิการตัด-แตง่ Pre-ribosomal RNA ใน E. coli


ในยูแคริโอต Pre-ribosomal RNA มีขนาด 45S ซึ่งให้ผลิตภัณฑเ์ป็น rRNA ชนิด 28S 18S และ

5.8S แตพ่บว่า tRNA และ rRNA ชนิด 5S ของยูแคริโอตไม่ได้เป็นผลิตภัณฑจ์ากการตัด-แตง่ 45S Pre-


ribosomal RNA (รูปที่ 3.17) กรรมวิธีการตัด-แตง่ Pre-ribosomal RNA ของยูแคริโอต จะเกิดขึ้นที่

บริเวณนิวคลีโอลัส (Nucleolus) ในนิวเคลียส

รูปที่ 3.17 กรรมวธีิการตัด-แตง่ Pre-ribosomal RNA ในยูแครโิอต (ตัวอยา่งที่แสดงเป็นกลไกในสัตวม์กีระดูกสันหลัง)


3.5.3 การตัด-แต่ง tRNA

เซลล์ส่วนใหญ่จะมี tRNA อยู่ประมาณ 40-50 ชนิด โดยนอกจากชนิดที่เป็นผลิตภัณฑจ์าก

การตัด-แตง่ 30S pre-ribosomal RNA ดังกล่าวแล้ว tRNA ชนิดอื่นๆ จะเป็นผลิตภัณฑท์ี่ได้จากการ

ตัด-แตง่ Primary transcript ขนาดใหญ่ส าหรับสังเคราะห ์ tRNA โดยตรง โดยในโพรแคริโอตพบว่า

Primary transcript 1 โมเลกุล ประกอบด้วย tRNA ประมาณ 2-7 โมเลกุล โดยอาจจะเป็น tRNA ชนิด


เดียวกันหรือต่างชนิดกันก็ได้ แตล่ะโมเลกุลจะแยกออกจากกัน ด้วยการตัดของเอนไซม์ตัดจ าเพาะ การ

ตัด-แตง่ tRNA เริ่มต้นโดย การตัดด้านปลาย 5 ของ tRNA ออกด้วยเอนไซม์ “Ribonuclease P (RNase

P)” ซึ่งเป็น Endonuclease และปลาย 3 จะถูกตัดออกด้วยเอนไซม์ “Ribonuclease D (RNase D)” ซึ่ง

เป็น Exonuclease จากนั้นจะมีการเติมล าดับนิวคลีโอไทด์ -CCA เข้าที่ปลาย 3 ของ tRNA ที่ไม่มีล าดับ

นิวคลีโอไทด์ดังกล่าวอยู่ (รูปที่ 3.18)

ส าหรับ tRNA บางชนิดจะมีล าดับนิวคลีโอไทด์ -CCA อยู่ที่ปลาย 3 เรียบร้อยแลว้ ดังนัน้ที่

ปลาย 3 ของ tRNA ทุกชนิดจะมีล าดับนิวคลีโอไทด์เป็น -CCA เสมอ การเติม -CCA เข้าที่ปลาย 3 จะ

อาศัยเอนไซม์ “tRNA Nucleotidyltransferase” ซึ่งสามารถสร้างพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์ได้ 3 พันธะ

อย่างตอ่เนื่องในเวลาเดียวกัน

ส่วน Intron ที่พบได้ในโมเลกุลของ tRNA จะต้องถูกตัดออกด้วยวิธี Splicing และ นอกจากนี้

พบว่ามีการเปลี่ยนแปลง ของเบสในโมเลกุลของ tRNA ด้วย เชน่ มีการเติมหมู่เมทิลเข้าที่เบสบางตัว

และ มกีารเปลี่ยนแปลงของเบสยูริดีน (U) บางต าแหน่งไปเป็น Pseudouridine () และ Dihydrouridine

(D) หรอื Ribothymidine (T) เป็นต้น (รูปที ่3.18)

รูปท่ี 3.18 กรรมวิธีการตัดแต่ง tRNA ในแบคทีเรยีและยแูคริโอต


กรรมวิธีการตัด -แตง่อาร์เอ็นเอ ชนิดตา่งๆ ของยูแคริโอตจะเกิดขึ้นภายในนิวเคลียสหรอื

อาจจะเกิดขึ้นในระหว่างการล าเลียงโมเลกุลของ อาร์เอ็นเอออกจากนิวเคลียสไปยังไซโทพลาซึม ซึ่ง

กรรมวิธีการดัดแปลงอาร์เอ็นเอเหล่านี ้จะท าให้ได้โมเลกุลของอาร์เอ็นเอชนิดตา่งๆ ในสภาพที่พร้อมจะ


ท าหนา้ที่ใน ไซโทพลาซึม ได้อย่างสมบูรณ์ นอกจากนีย้ังชว่ยท าให้ อาร์เอ็นเอ ไม่ถูกท าลายได้งา่ยด้วย

เอนไซม์ Nucleases อีกด้วย

3.6 สรุป

การถอดรหัสเป็นกระบวนการสังเคราะหอ์าร์เอ็นเอ ซึ่งอาร์เอ็นเอถือว่าเป็นผลิตภัณฑข์องยีน

(Gene product) เช่นเดียวกับโปรตนี โดย rRNA และ tRNA เป็นผลิตภัณฑข์องยีนที่สามารถท าหนา้ที่ได้

เลยในเซลล์ สว่น mRNA จะถูกใช้เป็นแม่แบบ (Template) ส าหรับการสังเคราะหโ์ปรตนีในกระบวนการ

แปลรหัส (Translation) ซึ่งจะได้กล่าวในบทถัดไป ในการสังเคราะหอ์าร์เอ็นเอของเซลล์แบคทีเรยีและ

เซลล์ยูแคริโอตโดยทั่วไปต้องการเอนไซม์ RNA polymerase (DNA-dependent RNA polymerase)

ส าหรับเร่งปฏิกิรยิาการสังเคราะหอ์าร์เอ็นเอ เอนไซม์ RNA polymerases ต้องการไรโบนิวคลีโอไทด์

ส าหรับการสังเคราะหอ์าร์เอ็นเอที่มลี าดับเบสเป็นสายองคป์ระกอบกับสายดีเอ็นเอที่ใชเ้ป็นแมแ่บบ การ

ถอดรหัสประกอบด้วยหลายขั้นตอน ได้แก่ การจับของเอนไซม์ RNA polymerase กับดีเอ็นเอเกลียวคู่

บริเวณโปรโมเตอร์ ขัน้ตอนเริ่มต้นการสังเคราะหอ์าร์เอ็นเอ (Initiation) ขั้นตอนเพิ่มความยาวสายอาร์

เอ็นเอ (Elongation) และขั้นตอนยุติการสังเคราะหส์ายอาร์เอ็นเอ (Termination) เอนไซม์ RNA

polymerase ต้องการหนว่ยย่อย ในการจดจ าต าแหน่งโปรโมเตอร์ของยีน เอนไซม์ RNA polymerases

ในเซลล์ยูแคริโอตมี 3 ชนิดในนิวเคลียส โดย RNA pol I และ RNA pol III ท าหนา้ที่สังเคราะห ์ rRNA

primary transcript และ tRNA primary transcript ตามล าดับ สว่น RNA pol II ท าหนา้ที่สังเคราะห ์

mRNA และต้องการปัจจัยการถอดรหัส ( Transcription factors) อีกหลายชนดิมาช่วยท างาน อาร์เอ็นเอ

ที่สังเคราะหไ์ด้เกือบทุกชนิดตอ้งผ่านกระบวนการตัด-แตง่หลังการถอดรหัส ยกเว้น mRNA ของโพรแค

ริโอต ซึ่งไม่จ าเป็นต้องผา่นกระบวนการตัด-แตง่หลังการถอดรหัส ก็สามารถใช้เป็นแม่แบบส าหรับการ

สังเคราะหโ์ปรตนีได้เลย สว่น mRNA ของเซลล์ยูแคริโอตต้องผา่นขั้นตอน การเกิด Splicing เพื่อตัดเอา

Introns ออกไป การเติม 5Cap (7-methylguanosine) ด้านปลาย 5 และการเติม Poly (A) tail ด้าน

ปลาย 3 ส าหรับการตัด-แตง่ rRNA และ tRNA ของทั้งโพรแคริโอตและยูแคริโอต พบว่า rRNA และ

tRNA ที่ท าหน้าที่ได้ในเซลล์ จะได้จากการตัด -แตง่สาย Primary transcript ที่ยาวกว่า และมีการ

เปลี่ยนแปลงเบสบางตัวในสายอาร์เอ็นเอโมเลกุล

การถอดรหัส (transcription) expression.pdf · 36 การถอดรหัส...

Documents