Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

„SCAFFOLD”-OK ELŐÁLLÍTÁSA

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Dr. Pongrácz JuditHáromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 9. Előadás

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

„Scaffold” előállítás - Alapvető kritériumok I.• Biokompatibilitás – immunreakciók elkerülése• Felszíni kémia – sejtfunkciók támogatása• Egymással összeköttetésben lévő pórusok

kialakítása – sejtek egyenletes eloszlásának és erek képződésének támogatása

• Ellenőrzött biodegradáció – az új szövet kialakulásának lehetővé tétele

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

„Scaffold” előállítás - Alapvető kritériumok II.• Mechanikai tulajdonságok – a szerkezet és

funkció stabilitása a beültetés után illetve a szöveti újraképződés során

• Lehetőség különböző gyógyszermolekulák illetve bioaktív anyagok beágyazására és szabályozott felszabadulására

• ECM interakció – beültetés után az ECM kialakulásának támogatása

• Beültetés után az ECM helyettesítése

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A „scaffold”-ok tulajdonságainak jelentősége• Biztosítják a sejtek számára a 3D környezetet• Beültetés után átmenetileg az ECM-t

helyettesíti• Közvetlenül irányítják a sejtek

differenciálódását • Szerkezetük meghatározza az előállított

szövetkonstrukciók tápanyagellátását

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Öntéses-kioldásos módszer (SCPL) I.• Az oldószerben feloldott „scaffold”-anyagot

pórusképző részecskékkel töltött öntőformába öntik• Oldószer elpárologtatása• Pórusképző részecskék kioldása• „Scaffold” bevonat: az öntőformát a feloldott

„scaffold” anyagba mártják• Egyszerű, könnyű, olcsó technika• Nem igényel speciális laboratóriumi felszerelést• A használt szerves oldószerek gyakran mérgezőek,

maradványaik nehezen eltávolíthatóak

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Öntéses-kioldásos módszer (SCPL) II.

Oldószerelpárologtatása

Porogénkioldása

Oldószer

Polimer PorogénÖntőforma

Porózus szerkezetetkapunk

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Fázis szeparációs módszerek• A polimert két, egymással nem elegyedő

oldószer keverékében oldják fel• A telített oldatot melegítik• A magas illetve alacsony polimer-tartalmú

fázisok elkülönülnek egymástól• A hőmérséklet csökkentésével a polimer

kiválik a fázishatáron a túltelített oldatokból• Az oldószert eltávolítják (kivonás,

elpárologtatás, szublimáció)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Magasszintű technikákGázhabosítás• Speciális felszerelést

igényel• A „scaffold” anyagát

nyomásálló kamrába töltik

• A „scaffold” anyagát szuperkritikus állapotú széndioxidban „oldják” fel

• A hőmérséklet csökkentésével gáz halmazállapotúvá válik

• A fázishatáron kicsapódik a feloldott polimer

10 000

1 000

100

10

1200 250 300 350 400

HőmérsékletT (K)

Nyom

ásP

(bar

)

szilárd

folyadék

gáz

kritikus pont

szuperkritikusállapot

hármas pont

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Elektroszövés I.

V

Injektor

Gyűjtőlemez

Fémtű

Polimer vagy kompozit oldat

Elektromosan töltött szálMagasfeszültségűáramforrás

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Elektroszövés II.• Speciális felszerelést igényel• Sokoldalú, flexibilis technika• Nincs szükség extrém körülményekre (hő,

koaguláció)• Többféle polimer használható, pl.: PLA, PLGA,

selyem fibroin, chitosan, kollagén• Szálvastagság, pórusméret, szálorientáció

könnyedén szabályozható

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Magasszintű technikákSzövött biotextíliák• Speciális felszereltséget igényel• Az így előállított „scaffold” szabályos, szövött

szálakat tartalmaz • 2D illetve 3D „scaffold” szerkezet is

előállítható• A pórusméret könnyen szabályozható • Sokoldalú technika, a „scaffold” anyag széles

körben alkalmazható és kombinálható

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Szövött biotextília

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Magasszintű technikák Spontán „összeszerelődés”• Spontán „összeszerelődés” a molekulák

spontán összeállása rendezett struktúrává• Oldott állapotban az amfofil peptidek nem-

kovalens kötésekkel összekapcsolódnak

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Amfofil peptidek tervezése• Foszfoszerin-csoport serkenti a mineralizációt

(csontszövet előállításánál)• RGD motívumok segítik az adhéziót (integrin-

kötőhelyek biztosítása)• Ciszteinek a molekulák közötti keresztkötések

létrejöttét teszik lehetővé• GGG összekötő-motívumok a feji és farki rész

között növelik a molekuláris szerkezet rugalmasságát

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011Magasszintű technikák Automatikus gyártási technológiák• „Rapid prototyping”: adott szerkezetű tárgy

automatizált előállítása additív technológia felhasználásával

• Gyors technológia, mely azonos minőségű, szerkezetű, mintázatú „scaffold”-ot eredményez

• Drága módszer, számítógép vezérelt készüléket igényel

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011Magasszintű technikákFused deposition modeling (FDM)• Robotikusan vezérelt

készülék • Polimer vagy más

anyagból készült szálat tesz le a lerakófejen keresztül több rétegben

• Szilárd felületre vagy • „Vonalkázva”: ekkor a

később eltávolításra kerülő részekhez más anyagot használnak

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

• A kicsivel az olvadáspontja alatt tartott, por vagy granulátum formájú „scaffold” anyagból egy réteget terítenek le (előreprogramozott minta szerint)

• A számítógép-vezérelt lézersugár felmelegíti az anyagot, amely ennek hatására összeáll (összeolvad anélkül, hogy megolvadna)

• Újabb réteget fektetnek le és olvasztanak össze

• A tárgy 3D szerkezete így rétegenként épül fel

Magasszintű technikák Selective laser sintering (SLS)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

75

3

Selective laser sintering (SLS)

4

Lézer

„Scaffold” réteg Éppen készülőtárgy

Szkenner1

Dugattyú

Roller

Dugattyú

Dugattyú

„Scaffold” anyagotmozgató rendszer

2

6

BIOKOMPATIBILITÁS

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Dr. Pongrácz JuditHáromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 10. Előadás

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Biokompatibilitás - DefinícióAz anyag azon képessége, hogy a befogadó szervezetben az alkalmazásának megfelelő választ vált ki.

A biokompatibilitás a TE termékek előállításához használt „scaffoldok” vagy mátrixok azon képessége, hogy olyan szubsztrátként viselkednek, amely támogatja a megfelelő sejtműködést, vagyis megkönnyíti a molekuláris és mechanikai jelátviteli rendszerek működését az optimális szövetregeneráció érdekében, DE sem az adott sejtekben, sem pedig lokálisan vagy szisztémásan nem idéz elő nem kívánt válaszreakciót.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Biokompatibilitás - Jelenlegi nézetekRégi koncepció: olyan bioanyagok használata, melyek nem lépnek interakcióba a befogadó szervezet („host”) szöveteivelA bioanyag-tervezés új célkitűzései: • A bioanyagok aktív módon interakcióba

lépnek a „host” szöveteivel• Pozitív élettani választ váltanak ki• Támogatják a sejtek növekedését és

differenciálódását

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Bioanyagok biokompatibilitása• A természetből származó anyagok természetüknél

fogva biokompatibilisek (pl.: kollagén, fibrin, hyaluronsav)

• A xenogén bioanyagokat a biokompatibilitás eléréséhez módosítani kell (pl.: borjúkollagén humán felhasználása előtt az immunogén szekvenciákat el kell távolítani emésztéssel)

• Már rekombináns humán kollagén is kapható• Más xenogén anyagok (pl.: növényi eredetű

poliszacharidok) biokompatibilitását tesztelni kell• Szintetikus anyagoknál szintén ellenőrizni kell azok

biokompatibilitását

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Biokompatibilitás - TerminológiaBiodegradálhatóság: in vivo makromolekuláris degradáció; a lebomlási termékek nem eliminálódnak a szervezetbőlBioabszorbeálhatóság: a makromolekuláris komponensek az anyagcsere megváltozása nélkül jutnak be a szervezetbeBiológiai felszívódóképesség: a makromolekuláris alkotóelemek lebomlása és metabolizálódása, a molelulatömeg csökkenése, a végtermék kiválasztása

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Biokompatibilitás tesztelése• A vér/anyag vagy szövet/anyag határfelületnek a lehető legkisebbnek

kell lennie• Álljon ellen a biodegenerációnak• Fontos, hogy a bioanyag természetes anyagként viselkedjen vér és

szövet jelenlétében. • A beültethetőséget kizárja, ha az anyag:

– Vérrögképződést indít el (Trombózisveszély)– Károsítja vagy szenzitizálja a vér sejtes elemeit– Megváltoztatja vérplazma fehérjéit (köztük enzimeket) nem kívánt

reakciókat előidézve– Káros immunreakciót indít el– Rákot okoz– Teratogén– Toxikus vagy allergiás választ vált ki– Elektrolitvesztést okoz– Sterilizálás hatással van rá

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Inkompatibilitás miatt fellépő komplikációk• A beültetett anyag elleni immunreakció • Krónikus gyulladás• Hegszövet képződés• Fokozott véralvadás (érgraft inkompatibilitás)• Graft elégtelenség• Kilökődés

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Normál sebgyógyulásA sebgyógyulás több fázisra osztható, az egyes szakaszokra a bennük szerepet játszó sejtpopulációk illetve sejtfunkciók egyaránt jellemzőek:1. Véralvadás2. Gyulladás3. Sejtek inváziója és szöveti újraképződés

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Idegentest reakció I.Az implantátum jelenléte megváltoztatja a gyógyulási folyamatot, ez az un. idegentest reakció (Foreign Body Reaction, FBR), részei:

• Fehérje adszorpció• Makrofágok• Sokmagvú idegentest óriássejtek• Fibroblasztok• Érképződés

Az implantátum folyamatos jelenléte egy végső készenléti állapot eléréséhez vezethet (resolution).

Az implantátum sorsa ezután a következő 3 folyamat egyike lehet:• Reszorpció• Integráció• Enkapszuláció (fibrózis)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Idegentest reakció II.

Bioanyag

Monociták

Makrofágok

Ér

Endotél

Sejt-vándorlás

Fibroblasztokatés kollagént tartalmazó réteg

Makrofágokattartalmazó réteg

Bioanyag

Idegentest típusúóriássejtek

A frusztrált fagocitózis a makrofágok aktivációjáhozés óriássejtek képződéséhez vezet

Az abszorbeált plazmafehérjék granulocitaés makrofág választ indítanak el

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

BioanyagokIdeiglenes implantátumok:• A szöveti regeneráció és gyógyulás átmeneti

segítése• Csont graftok, biológiailag felszívódó

sebészeti varratok

Állandó implantátumok: • Hosszú távú fizikai integritás és mechanikai

teljesítmény• Szervműködés hosszú távú helyettesítése• Műbillentyűk, ízületek, stb.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Biológiailag inert anyagokPoli-tetrafluor-etilén (PTFE, Teflon®):• A szervezet számára inert• Rendkívül alacsony súrlódási együttható

(0,05-0,10 a polírozott acélhoz képest)• Biológiailag inert, az élő szövetekkel nem lép

interakcióba• Ízületi protézisek valamint műbillentyűk

felszínének borítására használják

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Szilikon származékok• A szilikonok olyan polimerek, amelyek a

biokompatibilis polimerek által általánosan tartalmazott C, H, N, O elemek mellett Si-t is tartalmaznak

• A szilikonok gyógyászati osztályozása: nem beültethető, rövid- illetve hosszútávra beültethető szilikonok

• Katéterek, csövek, mellimplantátumok, óvszerek előállításához

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Biokompatibilis fémek• Titánium ötvözetek ízületi protézisekhez és

fogpótlásokhoz• Kitűnő mechanikai sajátságok• Nem toxikusak, és nem lökődnek ki• Egyedülálló osseointegrációs képesség• A beültetést megelőzően alkalmazott

hidroxiapatit borítás elősegíti az osseointegrációt

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Hidroxiapatit kerámiák• A hidroxiapatit (HA) természetes állapotban a

csontokban és a fogakban megtalálható• HA kristályokat gyakran más polimerekkel

kombinálják a „scaffold” előállítás során• Mikrokristályos HA táplálékkiegészítőként is

kapható a csontritkulás megelőzésére • Jobb, mint a CaCO3 az oszteoporózis

megelőzésében

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Poli-a-hidroxi-savak: bioabszorbeálható polimerek• Leggyakrabban használt bioanyagok• Fő felhasználási terület: felszívódó varratok,

gyógyszerhordozó „scaffold”-ok, ortopédiai protézisek

• Poliészter láncok• Egyszerű hidrolízissel történő biodegradáció • A keletkező a-hidroxi-savak különböző

anyagcsereutakon át eliminálódnak (pl.: citromsav ciklus) vagy módosítás nélkül a vizelettel távoznak

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Poli-a-hidroxi-savak biodegradációja I.

Leggyakrabban használt poli-a-hidroxi-savak:• Poli-tejsav (PLA)• Poli-glikolsav (PGA)• Poli-kaprolakton (PCL)Degradációs termékeik a citrátkörbe lépnek be

Poliészter Hidroxi-terminális Karboxi-terminális

H2O(CH2)nCO(CH2)n CO O

HO(CH2)n COO

(CH2)COHO

+

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Poli-a-hidroxi-savak biodegradációja II.

PGA

PLA

H2OGlikolsavGlicinSzerin

TejsavPiruvát

CO2

Acetil-KoA

Citromsav

Citrátkör

Oxidatív foszforiláció

CO2

b-Hidroxi-butirát

Acetoacetát

H2O

H2O

PDS

PHB Észteráz

Vizelet

H2O

ATP

PGA = poli-(glikolsav)PLA = poli-(tejsav)PDS = poli-(d-dioxán)PHB = poli-(hidoroxi-butirát)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Poli-a-hidroxi-savak felhasználásaTípus Polimer Jelenlegi felhasználás

Poliészter

Politejsavak

Poli-(L-tejsav), [PLLA]

Poli-(D, L-tejsav), [PDLLA]

• Felszívódó varratok • Csontprotézisek • Csont-, máj- és idegszövet

konstrukció számára „scaffold”-ként • Gyógyszerhordozóként (többféle)

PoliészterTejsav-glikolsav kopolimer, [PLGA]

• Szabályozott hatóanyag-leadási rendszerként (fehérjék és kismolekulájú gyógyszerek)

• TE „scaffold”• Gyógyszerhordozóként (többféle) • Génátvitel

Poliészter Poli-( -ε kaprolakton), [PCL]

• Lassú szabályozott hatóanyag-leadási rendszerként – gyógyszerhordozóként (pl.: > 1 év)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Poli-(Glikolsav), (PGA)• PGA merev, erősen kristályos anyag • Kizárólag erősen apoláros szerves

oldószerekben oldódik• Főként felszívódó varratokban használják

(Dexon®)• SCPL technikával „scaffold” előállítás • Tömeg-degradáció• Természetes lebomlási termék (glikolsav)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Poli-(tejsav), PLA és PGA kopolimerek• D, L izoformák és racémek keverékei• Leggyakrabbab az L izoformát használják

együtt PGA-val: PLGA kopolimer• PLGA egyike azon kevés polimernek, amelyet

humán felhasználásra fejlesztettek ki• PGA és PLLA kopolimerjei széles körben

felhasználhatóak• A degradáció sebessége illetve típusa a

kopolimer összetételétől függ

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Politejsavak biodegradációja• Általános lépés az észterkötések random

hidrolízise• A degradáció típusa és sebessége az

összetételtől függ• A lebomlási termékek nem toxikusak, nem

váltanak ki gyulladást• Nagyméretű ortopédprotézisek esetén azok

savas degradációja toxikus termékeket eredményezhet

• Kisebb darabok törhetnek le az implantátumról, melyek gyulladást okozhatnak

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Poli-(kaprolakton), (PCL)• Szemikristályos polimer• Nagyon lassú degradáció (a tiszta PCL 3 év

alatt bomlik le, más kapronokkal alkotott kopolimerjei könnyebben degradálódnak)

• Hosszabb távú gyógyszerhordozásra használják

• A PCL-t biokompatibilis, nem toxikus anyagként tartják számon

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Polimer erózió• A víz beszivárog az anyagba, a polimer amorf

fázisának kémiai kötéseit hasítja, így a hosszú polimerláncokat rövid vízoldékony darabokra bontja.

• Ennek következtében a molekulatömeg csökken, a fizikai tulajdonságok viszont nem változnak, hiszen a kristályos fázisok összetartják a polimert. A víz átjárja az anyagot, és a fragmensek metabolizálódását és tömegerózióját indítja el.

• A polimer felületi eróziójáról akkor beszélünk, ha a polimer gyorsabban alakul át vízoldékony anyagokká, mint ahogy a víz beszivárog a konstrukcióba.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Bioanyagok degradációjának típusai

IdőDegradáció

TömegerózióFelületi erózió

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Degradáció I. • Biológiailag lebomló hidrogélek: a

vízoldékony polimerláncok közötti kémiai keresztkötések hasítása

• Felületi erózió a jellemző• A tömegveszteség lineáris a degradáció

során

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Degradáció II. A polimerlánc hasítása vízoldékony monomereket eredményez

−(CH − C − O − CH − C − O −)x−(CH2 − C − O − CH2 − C − O)y−−HO − CH − C − OH + OH − CH2 − C − OH

CO2 + H2O

H2O

Krebbs ciklusO

CH3

O

CH3

O O

CH3

O O

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Degradáció III.• Polimer hidrofóbicitás: a hidrofóbicitás

növekedése nagyobb stabilitást eredményez• Bulky szubsztitúciós csoportok (pl.: metil-

csoport PLA esetén) növeli a degradációs időt (PGA<PLA)

• Üvegesedés: Az üvegesedési hőmérséklet (Tg) felett a rugalmassá váló polimerek láncai mozgékonyabbak, így a víz számára könnyebben hozzáférhetőek

• Kristályos szerkezet csökkenti, az amorf struktúra növeli a degradáció időtartamát