3

РЕФЕРАТ

Отчет 53 с., 5 ч., 5 табл., 1 рис., 0 источников.

ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ, ОНКОЛОГИЯ,

ИММУНОЛОГИЯ, ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, ДИАГНОСТИКА РАКА, МЕТОД

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК, РАК

МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ УРОВНЯ

ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

Объект исследований: экспрессия маркерных генов, специфичных для

циркулирующих опухолевых клеток в крови у онкологических больных.

Цель работы: создание диагностической тест-системы по выявлению

циркулирующих опухолевых клеток в крови у онкологических больных.

В ходе четвертого этапа были проведены обобщение и оценка

полученных результатов, в т.ч. анализ зависимостей между тяжестью

клинической картины и числом обнаруживаемых ЦОК. Показана связь между

обнаружением ЦОК по итогам проведенной неоадъювантной терапии и крайне

неблагоприятным прогнозом для пациента. Также выявлен ряд корреляций

между уровнями экспрессии анализируемых в ЦОК генов и клиническими

показателями. Показано, что эффективно проведенная неоадъювантная терапия

приводит к исчезновению ЦОК из крови. Проведена технико-экономическая

оценка рыночного потенциала полученных результатов. Технико-

экономическая оценка рыночного потенциала полученных результатов НИР

показала, что предложенный метод определения ЦОК у онкологических

больных может обеспечить увеличение научно-технического потенциала

Российской Федерации в области лечения рака молочной железы. Он также

будет способствовать улучшению экономических показателей за увеличения

продолжительности активной жизни работоспособного населения.

Предлагаемый метод диагностики ЦОК, основанный на количественном

4

анализе экспрессионных маркеров ЦОК обладает конкурентоспособностью на

российском и мировом рынках.

Разработан проект методических рекомендаций по практическому

применению разработанной новой диагностической тест-системы для

определения ЦОК. Данный проект может быть использован для составления

рекомендаций для врачей и врачей-лаборантов клинико-диагностических

лабораторий онкологических центров РФ. Разработан проект технического

задания на проведение ОТР по теме «Разработка технологии производства

диагностической тест-системы определения ЦОК в крови онкологических

больных». Оформлена и подана заявка на изобретение.

Номер заявки № 2012145017, приоритет 23.10.2012 г.

Все полученные результаты четвертого этапа исследований соответствуют

поставленным задачам и свидетельствуют об успешном исполнении НИР.

5

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 9

1 Обобщение и оценка полученных результатов, в т.ч. анализ зависимостей

между тяжестью клинической картины и числом обнаруживаемых ЦОК 12

2 Проведение технико-экономической оценки рыночного потенциала

полученных результатов 39

3 Разработка проекта методических рекомендаций по практическому

применению разработанной новой диагностической тест-системы для

определения ЦОК 46

4 Разработка проекта технического задания на проведение ОТР по теме

«Разработка технологии производства диагностической тест-системы

определения ЦОК в крови онкологических больных» 47

5 Подготовка документации для оформления патента 50

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 51

6

НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ

В настоящем отчете о НИР использованы ссылки на следующие

стандарты:

- ГОСТ Р 51088-97 Наборы реагентов для клинической лабораторной

диагностики. Общие технические условия.

- ГОСТ Р 51352-99 Наборы реагентов для клинической лабораторной

диагностики. Методы испытаний.

- ГОСТ 15.101-98 Система разработки и постановки продукции на

производство. Порядок выполнения научно-исследовательских работ

- ГОСТ 15.011-96 Система разработки и постановки продукции на

производство. Патентные исследования.

- ГОСТ 7.32-2001 Система стандартов по информации, библиотечному и

издательскому делу. Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и

правила оформления

- ГОСТ 25661-83 Установки для финишной очистки воды. Общие технические

требования

7

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В настоящем отчете о НИР применяют следующие термины с

соответствующими определениями:

- научно-исследовательская работа (НИР): комплекс теоретических и (или)

экспериментальных исследований, проводимых с целью получения

обоснованных исходных данных, изыскания принципов и путей создания

(модернизации) продукции (ГОСТ 15.101 – 98);

- этап НИР: часть НИР, являющаяся объектом планирования и финансирования

(ГОСТ 15.101 – 98).

8

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

- ЦОК – циркулирующие опухолевые клетки,

- EpCAM – поверхностный антиген эпителиальных клеток.

- Muc-1 – ген муцина 1,

- GA733-2 – ген желудочно-кишечного опухолевого антигена 2,

- HER2 – ген человеческого эпителиального фактора роста 2,

- BRCA1 – ген-супрессор, ответственный за развитие рака молочной

железы,

- ESR1 – ген рецептора эстрогена,

- ALDH1 – ген альдегид дегидрогеназы,

- PGR – ген рецептора проэстрогена,

- GAPDH – ген глицеральдегидфосфат-дегидрогеназа,

- HPRT – ген гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы,

- ПЦР – полимеразно-цепная реакция,

- ACTA1 – ген актина 1,

- AKT2 – ген актина 2,

- FDA – аналог Министерства здравоохранения в США,

9

ВВЕДЕНИЕ Основанием для проведения НИР, выполняемой в рамках федеральной

целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным

направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-

2012 годы», является Государственный контракт 18 февраля 2011 г. №

16.512.11.2041.

В последнее время растет интерес к возможности использования

циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в качестве прогностических и

предиктивных маркеров. В нескольких исследованиях было показано, что ЦОК

могут обнаруживаться даже при ранних стадиях болезни, что ассоциируется с

высоким риском рецидива. Частота обнаружения ЦОК составила от 9,4 до

48,6%. В последнее время отмечается рост интереса к неоадъювантной терапии

при раке молочной железы, что позволяет изучить in vivo чувствительность

опухоли к проводимому лечению. Известно, что при достижении полной

патоморфологической регрессии на фоне проводимой терапии, выживаемость

больных тройным негативным раком молочной железы приближается к

выживаемости более благоприятных форм. Помимо определения степени

патоморфологической регрессии, определение ЦОК в крови до начала и по

завершению предоперационного лечения может стать дополнительным

маркером эффективности проводимой терапии.

ЦОК представляют собой гетерогенную популяцию клеток опухоли,

которые попали в кровеносное русло. По последним данным, ЦОК могут быть

представителями стволовых опухолевых клеток, а также могут претерпевать

фенотипические изменения, известные как эпителиально-мезенхимальная

трансформация, которая позволяет им распространяться к месту формирования

метастазов, и при этом быть нечувствительными к воздействию обычных

цитостатических агентов.

Уровень ЦОК в крови - динамично изменяющийся показатель, время

жизни ЦОК в кровотоке составляет 1-2 суток. Число выявляемых в крови ЦОК

зависит от используемых для их определения маркеров (прежде всего,

10

поверхностных антигенов) и составляет от 2 до нескольких тысяч на 7-10 мл

крови. Отсутствие уникальных маркеров ЦОК и единой номенклатуры их

определения приводит к разнообразию устанавливаемых норм. При

использовании некоторых методик выявления ЦОК допустимо их обнаружение

в крови здоровых людей. Это обусловлено тем, что некоторые комбинации

антигенов, характерных для ЦОК, встречаются на нормальных клетках.

Одними из основных маркеров ЦОК при раке молочной железы являются

поверхностные антигены, к которым относится молекула адгезии

эпителиальных клеток EpCAM и MUC-1, кодируемые, соответственно, геном

GA733-2 и Muc-1. Другим маркером ЦОК при раке молочной железы является

экспрессия гена Her2/neu, что особенно интересно, так как имеются сообщения

о различном статусе Her2/neu в первичной опухоли и ЦОК. Может

определяться экспрессия Her2/neu в циркулирующих опухолевых клетках, в то

время как первичная опухоль считается Her2-негативной по результатам ИГХ и

FISH метода.

Цель этапа: обобщение результатов работы и формирование

методических рекомендаций по использованию разработанной тест-ситсемы.

Задачи этапа:

- анализ полученных образцов крови на предмет наличия в них ЦОК и

изучена корреляция наличия и количества ЦОК с клинической картиной у

проходящих лечение больных;

- изучение характера генной экспрессии в ЦОК и исследование

возможных корреляции между экспрессией маркерных генов и клиническими

особенностями течения заболевания;

- разработка проекта методических рекомендации по использованию

тест-системы для определения ЦОК в крови онкологических больных;

- разработка проект технического задания на проведение ОТР по теме

«Разработка технологии производства диагностической тест-системы

определения ЦОК в крови онкологических больных»;- дать рекомендации и

предложения по использованию результатов НИР.

11

Выполнение цели и задач четвертого этапа позволяют обосновать

необходимость дальнейшего изучения роли ЦОК в многолетних клинических

исследованиях, как диагностических и прогностических факторов

онкологических заболеваний. Использование предлагаемой системы

определения ЦОК в крови больных раком молочной железы позволит улучшить

диагностику и лечение больных.

В ходе выполнения четвертого этапа работы были проанализированы

данные о наличии ЦОК и их характеристиках у 30 больных тройным

негативным раком молочной железы. Был проведен анализ возможных

корреляций между уровнями экспрессии маркерных генов и клиническими

признаками больных. Было установлено, что наличие ЦОК в крови пациентов

после проведения неоадъювантной терапии является неблагоприятным

прогностическим фактором.

На основании выполненных в ходе НИР работ подготовлен проект

методических рекомендаций по практическому применению разработанной

новой диагностической тест-системы для определения ЦОК и разработан

проект технического задания на проведение ОТР по теме «Разработка

технологии производства диагностической тест-системы определения ЦОК в

крови онкологических больных». Также оформлена заявка на изобретение №

2012145017, приоритет 23.10.2012 г.

Данный этап является заключительным этапом, обобщающим

проведенную работу.

12

1 Обобщение и оценка полученных результатов, в т.ч. анализ зависимостей между тяжестью клинической картины и числом обнаруживаемых ЦОК

Выполнение работ по запланированной теме «Разработка метода

определения циркулирующих раковых клеток в крови онкологических

больных» с целью создания диагностической тест-системы по выявлению

циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в крови у онкологических больных

проводили в четыре этапа.

Ниже представлено обобщение основных работ по всем пунктам

календарного плана нарастающим итогом. На первом этапе работ в срок с

февраля по июнь 2011 года были выполнены следующие работы:

1.1. Аналитический обзор информационных источников.

Подготовлен аналитический обзор на основе более 100 информационных

источников (Отчет о НИР за первый этап, раздел 1). Отмечена возможность

использования ЦОК в качестве прогностического фактора и фактора оценки

эффективности терапии. Данный обзор лег в основу обзорной статьи,

подготовленной в течение 3-его этапа работ и вышедшей в журнале «Труды

МФТИ» (Справка о числе публикаций, содержащих результаты

интеллектуальной деятельности за четвертый этап) и использован в подготовке

диссертации (Справка о числе диссертационных работ на соискание ученых

степеней за четвертый этап).

1.2. Исследования возможности определения ЦОК в крови

онкологических больных и их прогностической значимости при определении

эффективности противоопухолевой терапии и прогнозе заболевания. Отбор

генов-кандидатов, маркерных (характерных) для ЦОК.

Исследованы возможности определения ЦОК в крови онкологических

больных. Отобраны гены-кандидаты, маркерные (характерные) для ЦОК:

GA733-2, MUC-1, HER2, ER, PR, PI3Kα, BRСA1, Aktin, Twist 1, ALDH1 (Отчет о

НИР за первый этап, раздел 2). Данная панель генов применена на

последующих этапах работы для создания диагностической тест-системы по

13

выявлению ЦОК в крови у онкологических больных.

1.3. Экспериментальные исследования для разработки протокола оценки

экспрессии генов, специфичных для ЦОК.

Проведены экспериментальные исследование по выявления и

экспрессионной характеристике ЦОК, легшие в основу лабораторного

протокола оценки экспрессии генов, специфичных для ЦОК (Отчет о НИР за

первый этап, раздел 3; Лабораторный протокол оценки экспрессии генов,

специфичных для ЦОК в составе отчетной документации за второй этап).

1.4. Проведение патентных исследований по ГОСТ 15.011-96.

Проведены патентное исследование и дополнительно патентное

исследование (Отчет о НИР за первый этап, раздел 1; Патентные исследования

в составе отчетной документации за первый этап; раздел 5; Отчет о патентных

исследованиях в составе отчетной документации за четвертый этап). По

результатам обоих исследований заключено, что разрабатываемая методика

определения ЦОК является патентоспособной. Подана заявка на оформление

патента (Копия зарегистрированной заявки на получение охранных документов

в составе отчетности за четвертый этап). Более подробно результаты

выполненных работ за текущий этап отражены в разделе 5.

1.5. Проведение мероприятий по достижению технико-экономических

показателей.

Проведены мероприятия по достижению технико-экономических

показателей. Изучен опыт зарубежных компаний, создающих подобные

диагностические системы, а также проведена оптимизация разработанных

лабораторных протоколов и анализ экономических показателей применения

теста в клинике. (Отчет о НИР за первый этап, раздел 4; Отчет о НИР за третий

этап, раздел 2). Результаты проведения количественных и качественных

исследований фиксировались в протоколах экспериментальных исследований

по разработанной ПМ (Отчет о НИР за второй этап, раздел 3). В текущем

отчете дана оценка рыночного потенциала полученных в результате работы

данных (раздел 2). Проведенные мероприятия по достижению технико-

14

экономических показателей позволили в полной мере выполнить требование

основных пунктов технического задания – 8.1.1. и 8.1.2. А именно,

разработанная диагностическая тест-система для определения ЦОК в крови

онкологических больных позволяет использовать её при изучении патогенеза

онкологических заболеваний и механизмов метастазирования опухолей;

обеспечить более раннюю диагностику (по сравнению с существующими

диагностическими возможностями) прогрессии злокачественных

новообразований и раннюю оценку эффективности адъювантной

химиотерапии. Кроме того, тест-система является конкурентоспособной по

сравнению с зарубежными аналогами как в части числа оцениваемых генов в

ЦОК, чувствительности и специфичности, так и стоимости проведения анализа

(раздел 2; Отчет о НИР за первый этап, раздел 4).

1.6 Разработка анкеты для оформления подробной информации о

клинических и лабораторных показателях больных, участвующих на втором

этапе исследования в ограниченном клиническом исследовании.

Разработана анкета для оформления подробной информации о

клинических и лабораторных показателях больных, участвующих на втором

этапе исследования в ограниченном клиническом исследовании. Данная анкета

являлась основным документом для сбора, фиксации и обработки клинико-

лабораторных данных о пациентах, принявших участие в экспериментальном

исследовании (Отчет о НИР за первый этап, раздел 5).

На втором этапе работ в срок с июля по декабрь 2011 года были

выполнены следующие работы:

2.1. Разработка лабораторного протокола оценки экспрессии генов,

специфичных для ЦОК.

Разработан лабораторный протокол оценки экспрессии генов,

специфичных для ЦОК (Отчет о НИР за второй этап, раздел 1; Лабораторный

протокол оценки экспрессии генов, специфичных для ЦОК в составе отчетной

документации за второй этап). Данный протокол является основой выполнения

экспериментальных работ на всех последующих этапах. Также он в

15

совокупности с программой и методиками (ПМ) экспериментальных

исследований по оценке числа ЦОК в образцах крови онкологических больных,

методом выявления ЦОК в крови у онкологических больных и разработанными

стандартными операционными процедурами является основой формирования

проекта методических рекомендация (раздел 4) и проекта технического задания

на проведение ОТР по теме «разработка технологии производства

диагностической тест-системы определения цок в крови онкологических

больных» (раздел 4).

2.2 Разработка критериев перевода количественной оценки уровня

экспрессии в количественную оценку числа ЦОК.

Разработаны критерии перевода количественной оценки уровня

экспрессии в количественную оценку числа ЦОК по анализу стандартных

кривых (Отчет о НИР за второй этап, раздел 2; Отчет о НИР за третий этап,

раздел 1). Количественная оценка использована с целью выявления корреляций

между числом ЦОК/уровнем экспрессии характерных для них генов и

клиническим и лабораторными признаками у онкологических больных

(подробнее рассмотрено ниже в данном разделе).

2.3 Разработка программы и методики (ПМ) экспериментальных

исследований по оценке числа ЦОК в образцах крови онкологических больных.

Разработаны программы и методики экспериментальных исследований по

оценке числа ЦОК в образцах крови онкологических больных и метод

выявления ЦОК в крови у онкологических больных (Отчет о НИР за второй

этап, раздел 3). Данные работы необходимы для выполнения последующих

этапов (см. пояснения выше в п. 2.1).

2.4 Разработка метода выявления циркулирующих опухолевых клеток

(ЦОК) в крови у онкологических больных

Предложен метод выявления ЦОК в крови у онкологических больных. На

основании предложенного метода разработана методика определения

циркулирующих опухолевых клеток (Отчет о НИР за второй этап, раздел 4).

16

Данные работы необходимы для выполнения последующих этапов (см.

пояснения выше в п. 2.1).

2.5 Сбор образцов крови от онкологических больных до и на разных

сроках после начала адъювантной химиотерапии. Создание базы данных

Проведен сбор образцов крови от онкологических больных до и после

начала адъювантной химиотерапии. Создана база данных. Данные работы

необходимы для выполнения последующих этапов, в том числе результаты

экспериментального анализа собранных образцов и сведений из базы данных

изложены ниже в данном разделе и легли в основу статьи по итогам

проведенных работ. Статья принята в печать в журнал «Клеточные технологии

в биологии и медицине» (Справка о числе публикаций, содержащих результаты

интеллектуальной деятельности за четвертый этап).

2.6 Разработка стандартных операционных процедур для организации и

проведения исследований с момента подготовки забора крови до

статистической обработки экспериментальных данных.

В целях упорядочивания действий, выполняемых для организации и

проведения исследований с момента подготовки забора крови до

статистической обработки экспериментальных данных, были разработаны пять

стандартных операционных процедуры. Данные работы необходимы для

выполнения последующих этапов (см. пояснения выше в п. 2.1).

На третьем этапе работ в срок с января по июнь 2012 года были

выполнены следующие работы:

3.1 Проведение исследования разработанных тестов на образцах крови

больных с целью выявления корреляций между числом ЦОК/уровнем

экспрессии характерных для них генов и клиническим и лабораторными

признаками у онкологических больных

Проведены исследования разработанных тестов на образцах крови

больных с целью выявления корреляций между числом ЦОК/уровнем

экспрессии характерных для них генов и клиническим и лабораторными

признаками у онкологических больных. Анализ полученных результатов

17

подробно изложен ниже в данном разделе. По итогам проведенной работы

подготовлена публикация «Анализ циркулирующих опухолевых клеток при

проведении предоперационной химиотерапии больным тройным негативным

раком молочной железы». Статья принята в печать в журнал «Клеточные

технологии в биологии и медицине» (Справка о числе публикаций, содержащих

результаты интеллектуальной деятельности за четвертый этап).

3.2. Проведение мероприятий по достижению технико-экономических

показателей (дальнейшая оптимизация лабораторных протоколов, а также

анализ экономических показателей применения теста в клинике).

Обобщение проведенных работ приведено выше в текущем разделе (п

1.5).

3.3. Разработка лабораторного технологического регламента получения

диагностической тест-системы.

Разработанный лабораторный технологический регламент получения

диагностической тест-системы при раке молочной железы (Приложение 2.2 в

составе отчетной документации за третий этап) лег в основу проекта

технического задания на проведение ОТР по теме «разработка технологии

производства диагностической тест-системы определения цок в крови

онкологических больных» (раздел 4). Также с его помощью был создан

экспериментальный образец набора реагентов (см. следующий пункт).

3.4. Создание экспериментального образца набора реагентов

(диагностической тест-системы) предназначенного для определения

циркулирующих опухолевых клеток в крови онкологических больных.

По лабораторному технологическому регламенту получения

диагностической тест-системы создали экспериментальный образец набора

реагентов (диагностической тест-системы) предназначенного для определения

циркулирующих опухолевых клеток в крови онкологических больных при раке

молочной железы. По результатам был составлен акт создания образца тест-

системы (Приложение 2.3 отчетной документации за третий этап). Важно также

отметить, что созданная тест-система удовлетворяет требованиям технического

18

задания в части чувствительности, специфичности и числа анализируемых

генов (п.п. 6.1.2.1-6.1.2.3, и следовательно 8.1.1) что отражено в Приложении

13.1 отчетной документации за третий этап, в конце текущего раздела и в

разделе 2. Полученный опыт получения экспериментального образца

использован при подготовке проекта технического задания на проведение ОТР

по теме «разработка технологии производства диагностической тест-системы

определения цок в крови онкологических больных» (раздел 4).

Далее подробно изложены результаты работ, выполненных

непосредственно в ходе четвертого (заключительного) этапа НИР.

Проанализированы образцы крови 30 больных тройным негативным

раком молочной железы (HER2-, ER-, PR-), получающих лечение в отделении

клинической фармакологии и химиотерапии ФБГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина

РАМН. Критериями включения явились: женщины 28-75 лет с впервые

выявленным раком молочной железы, тройной негативный фенотип опухоли,

возможность выполнения core-биопсии и расширенного ИГХ исследования,

отсутствие серьезной сопутствующей патологии. Критериями исключения

являлись: предшествующая терапия рака молочной железы, онкологические

заболевания в анамнезе в течение последних 5 лет (за исключением базалиомы

кожи и рака in situ шейки матки), беременность и лактация. Возраст больных,

включенных в исследование, составил от 28 до 72 лет, медиана возраста – 44

года. Больные были поделены на две группы в зависимости от стадии

опухолевого процесса: группу раннего рака молочной железы (T1-2 N0-1 M0),

группу местно-распространенного рака молочной железы (Т2-4 N 2-3 M0).

Пациентки в группе раннего рака молочной железы получали

неоадъювантную химиотерапию по схеме: цисплатин 30 мг/м2, доксорубицин

25 мг/м2, паклитаксел 100 мг/м2 в/в капельно 1 раз в неделю 8 недель лечения с

поддержкой Г-КСФ 3-5 дней. В группе местно-распространенного рака

молочной железы проводилась индукционная химиотерапия по схеме:

карбоплатин AUC2, паклитаксел 60 мг/м2 в/в капель еженедельно 1-9 неделя

19

лечения, доксорубицин 25 мг/м2 в/в капель еженедельно, циклофосфамид 50 мг,

капецитабин 1500 мг внутрь ежедневно 10-18 неделя лечения. Неоадъювантная

терапия – вид химиотерапии, проводимой, в отличие от адъювантной терапии,

ДО хирургического лечения. Неоадъювантная терапия позволяет как минимум

уменьшить объем опухоли, и, следовательно, объем оперативного

вмешательства, а также снижает активность опухолевого процесса, что

снижает, в свою очередь, риск развития метастазов и прогрессирования

заболевания после операции. После проведения неоадъювантной терапии

проводят оценку патоморфологической регрессии опухоли по результатам её

биопсии с целью определения эффективности проведенной химиотерапии.

Оценку степени патоморфологической регрессии проводили с

использованием методики Chevallier, согласно которой 1 классу

соответствовало отсутствие опухоли как макроскопически, так и

микроскопически (Ch1); 2 классу – наличие карциномы in situ только в

молочной железе без инвазивной опухоли и опухолевых клеток в

лимфатических узлах (Ch2); 3 классу – наличие инвазивной карциномы со

стромальными изменениями, такими как фиброз и склероз (Ch3); 4 классу –

отсутствие или минимальные изменения структуры опухоли [4]. Сочетание

морфологических признаков лечебного патоморфоза 1 и 2 классов расценивали

как полную патоморфологическую регрессию.

Анализ крови на наличие ЦОК проводился на момент постановки

диагноза и после окончания неоадъювантной терапии (у 21 больной, ещё 9

больных продолжают получать терапию).

В группу раннего рака молочной железы включено 13 пациенток, в

группу местно-распространенного рака – 17 пациенток. В группе раннего рака

ЦОК в крови на момент постановки диагноза выявлены в 5 случаях из 13 (38%),

в группе местно-распространенного рака – в 7 из 17 (41,2%). Не выявлено

статистически значимых различий в частоте обнаружения ЦОК в двух группах.

В группе раннего рака молочной железы полная патоморфологическая

регрессия зарегистрирована у 9 пациенток из 12, 1 пациентка находится в

20

процессе проведения неоадъювантной химиотерапии. Из 9 пациенток, у

которых достигнута полная патоморфологическая регрессия, у 4 определялись

ЦОК в крови до начала лечения, у 5 больных ЦОК не определялись.

В группе местно-распространенного рака молочной железы полная

патоморфологическая регрессия зарегистрирована у 6 из 8 закончивших

неоадъювантную терапию, 8 больных находится в процессе проведения

неоадъваюнтной химиотерапии, 1 пациентка выбыла из исследования в связи с

прогрессированием заболевания. Из 6 пациенток, у которых достигнута полная

патоморфологическая регрессия, у 2 определялись ЦОК в крови до начала

лечения, у 4 больных ЦОК не были обнаружены.

Таким образом, на данной группе пациенток не удалось установить связь

между наличием ЦОК до начала неоадъювантной терапии степенью

патоморфологической регрессии, как меры эффективности терапии. До сих пор,

к сожалению, такого предсказательного показателя не имеется в арсенале

онкологов и заранее неизвестно, у каких пациенток будет ответ на

неоадъювантную терапию, а у каких было бы правильнее применить иные

схемы лечения. Несмотря на надежды использовать ЦОК в целях такого

маркера, следует признать, что результаты не являются неожиданными, так как

ЦОК являются ранними признаками метастазирования опухоли, и

прогрессирования заболевания в прочих органах и тканях – удаленных от

первичного очага. В то время как патоморфологическая регрессия оценивается

в первичной опухоли и близлежащих лимфоузлах. Действительно, различия в

природе ЦОК и породившей их опухолью велики и объясняют отсутствие

видимой связи между наличием ЦОК и ответом первичной опухоли на

химиотерапию, что становится очевидным из результатов, описанных ниже.

После прохождения неоадъювантной терапии у всех пациенток, кроме

одной из групп местно-распространенного рака, ЦОК в крови обнаружено не

было. В единственном случае, когда ЦОК выявлялись после лечения (при этом

на момент постановки диагноза ЦОК в крови обнаружено не было),

зарегистрировано прогрессирование заболевания в процессе проведения

21

неоадъювантной химиотерапии. В связи с прогрессированием заболевания

схема лечения была изменена, однако опухоль оказалась резистентной к

химиотерапии. Пациентка была выписана из стационара в терминальной стадии

заболевания и переведена в хоспис. ЦОК, выявленные в ее крови, были

положительны по экспрессии HER-2, несмотря на то, что первичная опухоль

была отрицательная по ER, PR, Her2/neu по данным ИГХ. Таким образом, этот

случай показывает, как ЦОК могут отличаться от первичной опухоли, и

насколько их появление связано с ухудшением клинической картины. Вместе с

тем эффективная неоадъювантная терапия приводит к полному исчезновению

ЦОК. Несомненно, для всесторонней оценки клинической значимости ЦОК

крайне важны многолетние (5 и более лет) исследования по оценке

безрецидивной и общей выживаемости.

Всего несколько исследований изучали ЦОК при проведении

неоадъювантной химиотерапии. В исследовании GeparQuattro изучали уровни

ЦОК при постановке диагноза и после проведения неоадъювантной

химиотерапии у 213 больных с операбельными опухоли большого размера и

местно-распространенными опухолями. Частота обнаружения ЦОК составила

21,6% до лечения и 10,6% после проведения неоадъювантной химиотерапии. У

15% больных изначально позитивных по ЦОК, после проведения лечения ЦОК

не определялись, в то время как 8,3% больных без наличия ЦОК на момент

постановки диагноза, оказались ЦОК-позитивными после лечения. Однако

каких-либо значимых корреляций между наличием ЦОК и ответом опухоли на

проводимое лечение выявить не удалось. Схожие результаты были получены в

исследовании, в которое были включены 118 больных РМЖ 2-3 стадий. У 23%

больных определялись ЦОК до начала проведения неоадъювантной

химиотерапии и у 17% - после проведения лечения. Изменения в статусе ЦОК

не коррелировали с ответом опухоли на химиотерапию. Однако было отмечено,

что при медиане наблюдения 18 мес., наличие ЦОК (р=0,017), отрицательный

рецепторные статус и большой размер опухоли были независимыми

негативными прогностическими факторами в отношении выживаемости без

22

отдаленных метастазов. Возможным объяснением отсутствия корреляции

между изменением статуса циркулирующих опухолевых клеток и ответом на

неоадъювантную химиотерапию является разные биологические

характеристики первичной опухоли и ЦОК, и, как следствие, различная

чувствительность к лечению. Например, имеются сообщения о различном

статусе Her2/neu в первичной опухоли и ЦОК: может определяться экспрессия

Her2/neu в циркулирующих опухолевых клетках, в то время как первичная

опухоль считается Her2-негативной. Возможно, такие больные могут

выигрывать от назначения анти-Her2 терапии.

Был также проведен анализ корреляций экспрессии генов в ЦОК и

разнообразными клиническими показателями. Учитывая специфический и не

вполне характерный для нормальных клеток организма антигенный состав

ЦОК, можно было ожидать корреляции ЦОК с изменением показателей

иммунной системы, или, учитывая их высокую биологическую активность, с

изменением каких-либо биохимических показателей. Для этого анализа

использовали уровни экспрессии изученных генов, нормализованных на

экспрессию референсных генов по формуле:

Er(GOI)=2Сt(HKG)-Ct(GOI), где Er – нормализованная экспрессия, GOI –

рассматриваемый ген, HKG – референсный ген, а Ct – номер цикла, на котором

уровень флуоресценции достиг экспоненциальной фазы роста. Такая

нормализация распространена в исследованиях по оценке экспрессии генов, т.к.

позволяет избегать при оценке влияния различных технологических факторов,

потенциально влияющих на результат, среди которых основную роль играют

колебания в количестве используемого для анализа материала. Начиная от

возможных разбросов в объеме забираемой крови и условий её

транспортировки до разбросов, связанных с пипетированием образцов на всех

этапах обработки образцов в лаборатории. Использование же для нормализации

референсных генов, имеющих постоянный уровень экспрессии в подавляющем

большинстве клеток независимо от условий их выделения/получения,

23

позволяет получать данные, менее зависящие в своих колебаниях от случайных

факторов в процессе проведения анализа.

Ниже представлена таблица уровней нормализованной экспрессии генов

(таблица 1).

Таблица 1 - Экспрессия генов, характерных для ЦОК Наличие

ЦОК BRCA TWIST ESR1 GA733-2 MUC-1 HER2 PI3

Ka ALDH1

PGR

1 Нет 0,59 0,46 - 0,00 0,00 0,00 - - - 2 Нет 0,80 0,48 0,17 0,00 0,00 - - - - 3 Нет 0,71 0,50 0,00 0,00 0,00 0,00 - - - 4 Да 63,12 0,46 1,21 - 8,17 0,00 1,12 0,47 - 5 - 0,59 51,57 2,34 0,00 0,00 - 1,15 0,00 0,00 6 Да 0,84 0,50 0,00 0,00 15,30 0,00 1,00 0,48 0,00 7 Нет 0,82 0,62 0,00 1,17 0,00 0,00 0,70 0,56 0,00 8 Да 0,60 0,00 - 1,29 0,00 0,00 1,07 0,81 0,00 9 Нет 0,97 0,51 0,09 0,01 0,00 0,00 0,98 0,35 0,00 10 Нет 0,87 0,46 0,19 0,00 0,00 0,00 1,12 0,06 0,00 11 Да 0,82 0,48 0,00 2,30 0,00 0,00 1,05 0,37 0,01 12 Нет 0,56 0,65 0,21 0,20 0,00 0,01 0,61 0,23 0,00 13 Нет - - 0,13 0,00 0,00 0,00 0,98 0,80 0,00 14 Нет 0,00 0,51 0,00 - 0,00 0,00 0,96 0,39 0,00 15 Да 0,00 0,00 0,00 0,00 23,20 0,00 0,00 0,00 0,00 16 Да 39,18 8,78 0,00 0,00 11,60 0,00 0,92 0,76 0,00 17 Нет 0,00 0,00 0,23 0,00 0,00 0,00 1,10 1,04 0,00 18 Нет 16,25 0,03 0,19 0,00 - 0,00 1,01 0,91 0,00 19 Нет 0,60 0,57 0,00 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 - 20 Да 1,50 0,90 0,00 1,09 0,00 0,00 1,00 0,74 0,00 21 Нет 0,32 0,00 - 0,00 0,00 0,00 0,77 0,51 0,00 22 Нет 1,15 0,94 0,29 0,00 0,00 0,00 0,55 0,15 0,01 23 Нет 102,13 32,54 2,13 0,00 0,00 0,00 0,76 0,14 0,00 24 Да 0,01 0,01 1,20 2,27 0,00 0,00 0,88 0,37 - 25 Нет 3,74 3,01 1,21 0,00 0,00 0,00 0,00 - - 26 Да 0,13 0,06 1,31 2,80 0,00 0,00 0,89 0,39 0,00 27 Нет 0,17 24,56 2,13 0,00 0,00 0,00 0,50 0,00 0,00 28 Нет 0,87 0,44 2,17 - 0,00 0,00 0,60 0,00 0,10 29 Да 0,92 0,51 0,92 0,00 7,50 0,00 0,95 0,00 0,00 30 Да 1,11 0,50 0,97 0,00 0,00 7,00 0,15 0,00 0,00

Как видно из таблицы 1, наблюдается значительный разброс значений в

уровне экспрессии изучаемых генов. В том числе не во всех случаях

24

обнаружения ЦОК удается зарегистрировать экспрессию всех изучаемых генов.

Особо следует подчеркнуть, что практически во всех образцах отсутствует

экспрессия гена PGR и HER2, что объяснимо для ЦОК при данном виде

опухоли. Выше уже отмечалась возможность наблюдения ЦОК, сильно

отличающихся от клеток первичной опухоли. Однако не следует забывать, что

происходят они, так или иначе, именно из нее. В данном случае – из опухоли

отрицательной по экспрессии данных маркеров. В то же время в некоторых

образцах, несмотря на отсутствие ЦОК, определяется экспрессия отдельных

генов. Наиболее вероятным объяснением является тот факт, что обогащение

клеток на первом этапе иммунной магнитной сортировки приводит к

неспецифической адгезии или экспрессии небольшого числа молекул-маркеров

и захвату отдельных нормальных клеток, в которых и наблюдается экспрессия

анализируемых генов. Данные факты подтверждают идею комбинирования

комбинаций маркеров и способов определения ЦОК. Т.к. исключительно

уникальных маркеров – ни антигенных, ни экспрессионных, ни метаболитов –

пока для ЦОК ни одного вида не обнаружено, и их обнаружение зависит от

использования целого ряда маркеров. Имеющийся вклад экспрессии клеток, не

специфически выделенных при магнитно опосредованном выделении,

затрудняет анализ возможных корреляций между экспрессией маркеров и

клиническими показателями. Тем не менее, удалось обнаружить корреляции

между уровнями экспрессии генов PI3Ka, ALDH1 и BRCA1 и некоторыми

клинико-лабораторными показателями (таблица 2).

Таблица 2 - Корреляция между уровнем экспрессии маркерных генов в ЦОК и

клинико-лабораторными показателями Тромбоциты Нейтрофилы Лимфоциты АЛТ BRCA -0,52 -0,58 PI3Ka -0,56 -0,56 -0,71 ALDH1 -0,61

В таблице указаны коэффициенты корреляции больше 0,5 по модулю.

Как видно из таблицы 2 обнаружены крайне слабые обратные

корреляции между тремя генами и показателями клеточного состава крови и

25

печеночным ферментом. С высокой вероятностью, обнаруженные корреляции

являются мало значимыми в клинической практике. Во всяком случае, на

данном этапе сложно давать интерпретацию данным находкам. Их

опровержение или подтверждение возможно только в многолетних

исследованиях, в которых возможно увязать находки на ранних этапах

диагностики и лечения с самыми важными показателями в лечении

злокачественных заболеваний – выживаемость общей и безрецидивной. Как

следует из анализа литературы, наличие ЦОК, как таковых, редко оказывается

связанным с какими бы то ни было клиническими показателями. Проведенное

исследование подтверждает, что маркеры ЦОК и само их наличие мало связано

с реакциями организма, проявляющимися изменением широко

распространенных клинических и биохимических признаков. Данное

обстоятельство неудивительно особенно в сочетании с многочисленными

свидетельствами отличия ЦОК даже от клеток исходной опухоли. Тем не

менее, наиболее ценным является то, что пока малочисленные исследования

показывают, что ЦОК являются независимыми негативными прогностическими

факторами в отношении общей выживаемости и безрецидивной выживаемости

без отдаленных метастазов. Многолетний анализ течения онкологических

заболеваний позволит не только ответить на вопрос о клинической значимости

обнаружения ЦОК, но и в случае выявления их отрицательной роли в прогнозе

заболевания будет способствовать выявлению корреляций между отдельными

характеристиками ЦОК и отдаленными результатами терапии онкологических

больных. На примере данной работы важно также подчеркнуть, что проводимая

неодъювантная терапия приводит к исчезновению ЦОК, а в случае сохранения

последних в крови можно с уверенностью предполагать неблагоприятный

исход заболевания.

В соответствии с требованием п. 6.2 ТЗ разработанная тест-система

удовлетворяет стандартам ГОСТ Р 51088-97 и ГОСТ Р 51352-99, что отражено

в подготовленных на третьем этапе и утвержденных исполнителем и

заказчиком лабораторном технологическом регламенте получения

26

диагностической тест-системы для определения циркулирующих опухолевых

клеток в крови онкологических больных и акте изготовления объектов

испытаний опытного образца тест-системы, выполненных в соответствии с

указанными стандартами. А также подтверждается примерами

экспериментальных данных (рис. 1), более развернуто представленных в отчете

о НИР за третий этап. Согласно п. 4.2.2 ГОСТ Р 51352-99 «Наборы для

микроанализа нуклеотидных последовательностей» экспериментальная

проверка качества наборов включает определение отрицательного

контрольного образца и использует маркер молекулярного веса ДНК.

1 2 3 4 5 6 7

Рисунок 1 – Пример оценки экспрессии генов BRCA1, GAPDH, HPRT в

ЦОК, выделенных у больной тройным негативным раком молочной железы,

согласно ГОСТ Р 51352-99. Обозначения: 1 - экспрессия гена BRCA1,

выделенного у пациента; 2 - отрицательный контроль экспрессии гена BRCA1; 3

- экспрессия гена GAPDH, выделенного у пациента; 4 - отрицательный

контроль экспрессии гена GAPDH; 5 - экспрессия гена HPRT, выделенного у

пациента; 6 - отрицательный контроль экспрессии гена HPRT; 7 - ДНК-маркер

(начинается со 100 по и через сотню доходит до 1000 по, самая верхняя полоса

– 1500 по).

В соответствии с требованием п. 6.3 ТЗ работы по диагностике ЦОК,

основанной, в том числе на ПЦР-технологии, проводились в соответствии с

требованиями безопасности, предъявляемым к диагностическим тест-системам

27

на основе использования реакции ПЦР, описанным в методических

рекомендациях МУ 1.3.1888-04. А именно, лаборатория имеет лицензию на

деятельность, связанную с возбудителями инфекционных заболеваний человека

и санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения

соответствующих работ в лаборатории, выданное в установленном порядке.

Таким образом, лаборатория удовлетворяет требованиям рекомендаций в части

организации работ, наличия помещений и рабочих зон и требований к ним,

организации освещения, водоснабжения и канализации, а также воздухообмена;

лабораторной мебели и оборудования, средств стерилизации и утилизации,

обеспечения средствами индивидуальной защиты и противопожарной

безопасности. Также в процессе разработки тест-системы и её применения

выполнялись требования МУ 1.3.1888-04 в части соблюдения правил

последовательной обработки, анализа, хранения и утилизации биологического

материала. Персонал обучен правилам поведения и стерилизации лаборатории

в случае возникновения контаминации. Условия создания и работы с тест-

системой позволили обеспечить безопасность жизни и здоровья людей и охрану

окружающей среды в соответствии с требованиями, описанными в

методических рекомендациях МУ 1.3.1888-04.

В соответствии с п. 8.1.1 ТЗ разработанная нами система позволяет

получать информацию о широком спектре генов, характеризующих опухолевые

клетки как минимум по трём важным параметрам: наличие маркера стволовых

опухолевых клеток (ALDH1); признаки эпителиомезенхимного перехода

(Twist1, PI3KA); наличие рецепторов к гормонам и химиотерапевтическим

препаратам (ESR1, PGR, ERBB2), а также часто вовлеченный в опухолевый

процесс, в особенности, при раке молочной железы BRCA1.

Разработанная тест-система рекомендуется к использованию при

выполнении работ по изучению патогенеза онкологических заболеваний и

механизмов метастазирования опухолей.

Более ранняя диагностика (по сравнению с существующими

диагностическими возможностями) прогрессии злокачественных

28

новообразований возможна благодаря не только высокой чувствительности

предлагаемой тест-системы, но и самой биологии и сути диагностируемых

ЦОК. ЦОК являются наиболее ранними признаками активного

метастазирования. Их циркуляция в крови возникает за несколько недель до

появления иных признаков, доступных для диагностики прочими

существующими методами (УЗИ, КТ, МРТ, и/или оценкой сывороточных

белковых маркеров активно растущих метастазов).

По этой же причине данная диагностическая технология позволяет

проводить раннюю оценку эффективности неоадъювантной или адъювантной

химиотерапии – появление/сохранение ЦОК на фоне химиотерапии

свидетельствует о её неэффективности и сопряжено со сниженной

выживаемостью таких пациентов по сравнению с пациентами, у которых ЦОК

не выявлялись или исчезали сразу (через 2-4 недели) после начала терапии.

В соответствии с требованиями п. 6.1 созданная тест-система

удовлетворяет требованиям технического задания в части чувствительности,

специфичности и числа анализируемых генов (п.п. 6.1.2.1-6.1.2.3, и

следовательно 8.1.1) что отражено в Приложении 13.1 отчетной документации.

А именно, чувствительность метода до 1 молекулы на 30 мкл образца, что

позволяет обеспечивать определение в образце единичных клеток. Учитывая,

что по различным данным (doi:10.1073/pnas.1019446108 PNAS August 23, 2011

vol. 108 no. 34 13999-14004; Exp Cell Res. 1990 Feb;186(2):236-44. Levels of

hypoxanthine phosphoribosyltransferase RNA in human cells. Steen AM, Luthman

H, Hellgren D, Lambert B.) уровень экспрессии изучаемых генов составляет от

нескольких десятков до 1000 и более молекул на клетку, разработанный нами

метод обеспечивается чувствительность согласно требованиям ТЗ.

Дополнительно были проведены эксперименты с анализом экспрессии в

контрольных образцах объемом 5 мл с известным количеством искусственно

введенных клеток опухолевой линии MCF7 (2, 5, 10, 50, 100 шт). По данным

этого анализа уровень экспрессии различных генов в контрольных клетках

опухолевой линии MCF7 колеблется от 6 молекул на клетку (PGR) до 208

29

молекул на клетку (HPRT). Последнее значение является особенно важным, т.к.

HPRT используется как референсный ген, т.к. экспрессируется в любых типах

клеток на практически постоянном (мало подверженном внешним

воздействиям) уровне, что, собственно, и позволяет использовать его как

референсный ген. Относительно высокий уровень его экспрессии позволяет

точно определять наличие опухолевых клеток в контрольном образце с 2

клетками.

Так же в соответствии с пунктом ТЗ 6.1.2.3 было продемонстрировано,

что разработанная диагностическая тест-система позволяет определять ЦОК

при колоректальном раке, так как перечень генов, используемых для

характеристики ЦОК, входит 8 генов, которые могут быть использованы также

и при выявлении и характеристике ЦОК из других типов рака, в том числе,

колоректального (Таблица 3).

Таблица 3 - Целесообразность анализа экспрессии генов при разных типах рака Ген Рак молочной железы Рак толстой кишки

GA733-2 антиген, маркер ЦОК + +

Twist1 – маркер эпителио-мезенхимного

перехода

+ +

PI3Ka – маркер эпителио-мезенхимного

перехода

+ +

ALDH1 – маркер стволовых опухолевых

клеток

+ +

ACTA1 ген домашнего хозяйства + +

AKT2 ген домашнего хозяйства + +

GAPDH ген домашнего хозяйства + +

HPRT ген домашнего хозяйства + +

Для подтверждения этой возможности использовали кровь от двух

больных колоректальным раком, у которых была обнаружена экспрессия

нескольких генов из предлагаемой панели (Таблица4).

Таблица 4 - Уровень экспрессии генов ЦОК у больных колоректальным раком.

30

Уровень экспрессии, тыс. молекул/мкл

Ген Пациент 1 Пациент 2

GA733-2 7,5 12,5

Twist1 1,2 1,7

ACTA1 29,3 3,3

AKT2 32,4 33,5

GAPDH 15,8 10,2

HPRT 5,98 7,6

Таким образом, циркулирующие опухолевые клетки могут являться

потенциальным маркером эффективности проводимой неодъювантной терапии

и прогноза течения заболевания. Фенотип ЦОК может отличаться от фенотипа

первичной опухоли. У пациенток с тройным негативным раком молочной

железы в кровотоке могут наблюдаться ЦОК, экспрессирующие HER2.

Необходимо проведение дальнейших исследований с целью выяснения роли

наличия и фенотипа ЦОК в крови больных тройным негативным раком

молочной железы при проведении предоперационной химиотерапии.

Выполненная работа удовлетворяет пунктам технического задания:

4.1. При выполнении НИР получены следующие научно-технические

результаты:

1) Отчет о НИР, содержащий в том числе:

а) обзор и анализ современной научно-технической, нормативной,

методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему,

исследуемую в рамках НИР (Отчет о НИР за первый этап, раздел 1);

б) обоснование выбора направления исследований (Отчет о НИР за первый

этап, раздел 1);

в) теоретическое исследование путей создания диагностической тест-системы

для определения циркулирующих опухолевых клеток в крови онкологических

больных (Отчет о НИР за первый этап, раздел 1);

д) результаты экспериментальных исследований (Отчет о НИР за третий этап,

раздел 1; Отчет о НИР за четвертый этап, раздел 1);

31

е) технико-экономическую оценку результатов НИР (Отчет о НИР за первый

этап, раздел 4; Отчет о НИР за третий этап, Отчет о НИР за четвертый этап,

раздел 2);

ж) обобщение и выводы по результатам НИР (Отчет о НИР за четвертый этап,

раздел 1);

и) рекомендации и предложения по использованию результатов НИР (Отчет о

НИР за четвертый этап, раздел 1; Рекомендации по использованию результатов

НИР в составе отчетной документации за четвертый этап)

2) экспериментальный образец набора реагентов (диагностической тест-

системы) предназначенный для определения циркулирующих опухолевых

клеток в крови онкологических больных (Отчет о НИР за третий этап, раздел

4);

3) методика определения циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в крови у

онкологических больных (Приложение 2.4 в составе отчетной документации за

второй этап);

4) лабораторный протокол оценки экспрессии генов, специфичных для ЦОК

(Отчет о НИР за второй этап, раздел 1; Приложение 2.1 в составе отчетной

документации за второй этап);

5) программа и методики экспериментальных исследований (ПМ) (Отчет о НИР

за второй этап, разделы 3; Приложение 2.3 в составе отчетности за второй

этап);

6) протоколы экспериментальных исследований по разработанной ПМ

(Приложение 2.1 в составе отчетной документации за третий этап).

4.2. При выполнении НИР создана следующая научно-техническая продукция:

1) проект методических рекомендаций по практическому применению

разработанной новой диагностической тест-системы для определения ЦОК

(Отчет о НИР за четвертый этап, раздел 3; проект методических рекомендаций

в составе отчетной документации за четвертый этап);

2) Проект технического задания на проведение ОТР по теме «Разработка

технологии производства диагностической тест-системы определения ЦОК в

32

крови онкологических больных» (Отчет о НИР за четвертый этап, раздел 4;

проект технического задания на ОТР в составе отчетной документации за

четвертый этап);

3) Лабораторный технологический регламент получения диагностической тест-

системы (Приложение 2.2 в составе отчетной документации за третий этап).

5 Основные требования к выполнению НИР

5.1 Требования к выполняемым работам

5.1.1 В ходе выполнения НИР разработан метод определения циркулирующих

опухолевых клеток, предназначенный для оценки прогноза и эффективности

лечения онкологических больных (Отчет о НИР за второй этап, раздел 4).

5.1.2 Выполнен аналитический обзор современной научно-технической,

нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую

проблему, исследуемую в рамках НИР, в том числе обзор научных

информационных источников: статьи в ведущих зарубежных и (или)

российских научных журналах, монографии и (или) патенты). В отчёт о НИР

вошли результаты анализа не менее 100 информационных источников включая

PubMed, оригиналы печатных работ, опубликованных в зарубежной печати,

сайты Национального Института Рака США (NCI) и клинических испытаний. В

качестве генов-кандидатов в первую очередь рассмотрены гены, экспрессия

которых характерна для ЦОК при раке толстой кишки (GA733-2, CEA, EGFR)

(Отчет о НИР за первый этап, раздел 1);

5.1.3 Исследованы, обоснованы и выбраны методы и средства, направления

исследований и способы решения поставленных задач (Отчет о НИР за первый

этап, раздел 1);

5.1.4 Проведена сравнительная оценка вариантов возможных решений

исследуемой проблемы с учетом результатов зарубежных исследований,

проводившихся по аналогичной тематике (Отчет о НИР за первый этап, раздел

1);

33

5.1.5. На основе теоретического анализа отобраны гены-кандидаты, оценка

экспрессии которых в выделенных из крови клеток позволит установить их

принадлежность к ЦОК (Отчет о НИР за первый этап, раздел 1);

5.1.6. Оптимизированы методы определения экспрессии выбранных генов в

условиях малого количества клеток и определены аналитические

чувствительность и специфичность метода, обеспечивающие точную

количественную оценку с учётом ограниченного материала для проведения

исследования, а для получения клинически значимых результатов выработаны

критерии перевода количественной оценки уровня экспрессии в

количественную оценку числа ЦОК (Отчет о НИР за третий этап, разделы 1 и 2;

Приложение 13.1 в составе отчетной документации за третий этап);

5.1.7. Сформированы выборки больных, проходящих адъювантную

химиотерапию по поводу оперированного рака толстой кишки, создана база

данных и отобраны образцы крови больных для анализа (Отчет о НИР за

первый этап, раздел 5; Отчет о НИР за второй этап, раздел 5; Отчет о НИР за

третий этап, раздел 1);

5.1.8. Проанализированы полученные образцы на предмет наличия в них ЦОК и

изучена корреляция наличия и количества ЦОК с клинической картиной у

проходящих лечение больных (Отчет о НИР за третий этап, раздел 1; Отчет о

НИР за четвертый этап, раздел 1);

5.1.9. Изучен характер генной экспрессии в ЦОК и исследованы возможные

корреляции между экспрессией маркерных генов и клиническими

особенностями течения заболевания (Отчет о НИР за четвертый этап, раздел 1);

5.1.10. Проведены патентное исследование и дополнительно патентное

исследование (Отчет о НИР за первый этап, раздел 1; Патентные исследования

в составе отчетной документации за первый этап; раздел 5; Отчет о патентных

исследованиях в составе отчетной документации за четвертый этап). По

результатам обоих исследований заключено, что разрабатываемая методика

определения ЦОК является патентоспособной. Подана заявка на оформление

патента (Копия зарегистрированной заявки на получение охранных документов

34

в составе отчетности за четвертый этап). Более подробно результаты

выполненных работ за текущий этап отражены в разделе 5;

5.1.11. Разработана тест-система и подготовлены методические рекомендации

по использованию разработанной тест-системы для определения ЦОК в крови

онкологических больных (Отчет о НИР за третий этап, разделы 3 и 4; Отчет о

НИР за четвертый этап, раздел 3; проект методических рекомендаций в составе

отчетной документации за четвертый этап).

5.1.12. Разработан проект технического задания на проведение ОТР по теме

«Разработка технологии производства диагностической тест-системы

определения ЦОК в крови онкологических больных» (Отчет о НИР за

четвертый этап, раздел 4; проект технического задания на ОТР в составе

отчетной документации за четвертый этап).

5.2 Требования к разрабатываемой документации

5.2.1 В ходе работы разработаны, согласованы и утверждены установленным

порядком следующие документы:

5.2.1.1 промежуточные и заключительный отчеты о НИР, оформленные в

соответствии с ГОСТ 7.32-2001;

5.2.1.2 отчет о патентных исследованиях, оформленный в соответствии с ГОСТ

Р 15.011-96 (Отчет о НИР за первый этап, раздел 1; Патентные исследования в

составе отчетной документации за первый этап; раздел 5; Отчет о патентных

исследованиях в составе отчетной документации за четвертый этап). По

результатам обоих исследований заключено, что разрабатываемая методика

определения ЦОК является патентоспособной. Подана заявка на оформление

патента (Копия зарегистрированной заявки на получение охранных документов

в составе отчетности за четвертый этап);

5.2.1.3. лабораторный технологический регламент получения диагностической

тест-системы, оформленный с учетом требований ОСТ 64-02-003-2002

(Приложение 2.2 в составе отчетной документации за третий этап);

35

5.2.1.4. методика определения циркулирующих опухолевых клеток в крови

онкологических больных (Приложение 2.4 в составе отчетной документации за

второй этап);

5.2.1.5. лабораторный протокол оценки экспрессии генов, специфичных для

ЦОК (Отчет о НИР за второй этап, раздел 1; Приложение 2.1 в составе отчетной

документации за второй этап);

5.2.1.6. программа и методики экспериментальных исследований (ПМ) (Отчет о

НИР за второй этап, раздел 3; Приложение 2.3 в составе отчетной

документации за второй этап);

5.2.1.7. протоколы экспериментальных исследований по разработанной ПМ

(Приложение 2.1 в составе отчетной документации за третий этап)

5.2.1.8 Проект технического задания на проведение ОТР по теме «Разработка

технологии производства диагностической тест-системы определения ЦОК в

крови онкологических больных» (Отчет о НИР за четвертый этап, раздел 4;

проект технического задания на ОТР в составе отчетной документации за

четвертый этап);

5.2.1.9 Проект методических рекомендаций по практическому применению

разработанной новой диагностической тест-системы для определения ЦОК

(Отчет о НИР за четвертый этап, раздел 3; Проект методических рекомендаций

в составе отчетной документации за четвертый этап).

5.2.2 Отчетные научно-технические документы, разрабатываемые в

соответствии с пунктами 5.2.1.2 - 5.2.1.9 технического задания, включены в

Отчет о НИР в качестве приложений или представлены в составе отчетной

документации в качестве отдельных документов.

5.2.3 Перечень отчетной документации, подлежащей оформлению и сдаче

Исполнителем Заказчику на этапах выполнения работ, определяется

требованиями технического задания и актами Заказчика.

5.2.4 Отчетная документация представляется Заказчику или уполномоченной

им организации на бумажном носителе в двух экземплярах и в электронном

виде на оптическом носителе в одном экземпляре.

36

6 Технические требования

6.1 Требования к номенклатуре параметров, к точности их определения и

точности воспроизведения внешних условий

6.1.1. Разрабатываемый метод определения ЦОК в крови онкологических

обеспечивает:

6.1.2.1. чувствительность не ниже 5 клеток на 5 мл крови больных

(Приложении 13.1 отчетной документации за третий этап, Отчет о НИР за

четвертый этап, раздел 1 и 2);

6.1.2.2. специфичность не ниже 90% (Приложении 13.1 отчетной документации

за третий этап, Отчет о НИР за четвертый этап, раздел 1 и 2);

6.1.2.3. оценку экспрессии не менее 3-х генов для каждого вида ЦОК

(Приложении 13.1 отчетной документации за третий этап, Отчет о НИР за

четвертый этап, раздел 1 и 2).

6.2 Требования по стандартизации, унификации, совместимости и

взаимозаменяемости:

Разрабатываемая диагностическая тест-система удовлетворяет стандартам

ГОСТ Р 51088-97 и ГОСТ Р 51352-99 (Отчет о НИР за четвертый этап, раздел

1).

6.3 Требования по обеспечению безопасности для жизни и здоровья людей и

охраны окружающей среды:

Создаваемая диагностическая тест-система для определения ЦОК в крови

онкологических больных удовлетворяет требованиям безопасности,

предъявляемым к диагностическим тест-системам на основе использования

реакции ПЦР, в частности, описанным в методических рекомендациях МУ

1.3.1888-04 (Отчет о НИР за четвертый этап, раздел 1).

7 Требования к патентной чистоте и правовой защите результатов

интеллектуальной деятельности:

7.1 На этапе 1 выполнения НИР проведены патентные исследования в

соответствии ГОСТ Р 15.011-96 (Отчет о НИР за первый этап, раздел 1;

Патентные исследования в составе отчетной документации за первый этап).

37

7.2 На остальных этапах НИР при разработке результатов интеллектуальной

деятельности (далее – РИД), способных к правовой охране (в соответствии со

ст. 1225 ГК РФ), проведены дополнительные патентные исследования в

соответствии с ГОСТ Р 15.011-96 (Отчет о НИР за четвертый этап, раздел 5;

Отчет о патентных исследованиях в составе отчетной документации за

четвертый этап).

7.3 Сведений об охранных и иных документах, которые будут препятствовать

применению результатов работ в Российской Федерации (и в других странах –

по требованию заказчика), и условия их использования не выявлено (Отчет о

патентных исследованиях в составе отчетной документации за четвертый этап).

7.4 РИД, полученные в ходе выполнения НИР, подлежат регистрации и охране

в соответствии с действующим законодательством Российской Федерации

(Копия зарегистрированной заявки на получение охранных документов и

Приложение 21 в составе отчветной документации за четвертый этап).

8 Технико-экономические показатели

8.1 Основные технико-экономические требования

8.1.1 Разрабатываемая диагностическая тест-система для определения ЦОК в

крови онкологических больных обеспечивает:

1) её использование в целях изучения патогенеза онкологических заболеваний и

механизмов метастазирования опухолей (Приложении 13.1 отчетной

документации за третий этап, Отчет о НИР за четвертый этап, раздел 1 и 2);

2) более раннюю диагностику (по сравнению с существующими

диагностическими возможностями) прогрессии злокачественных

новообразований (Приложении 13.1 отчетной документации за третий этап,

Отчет о НИР за четвертый этап, раздел 1 и 2);

3) раннюю оценку эффективности адъювантной химиотерапии (Приложении

13.1 отчетной документации за третий этап, Отчет о НИР за четвертый этап,

раздел 1 и 2).

8.1.2 Разрабатываемая диагностическая тест-система для определения ЦОК в

крови онкологических больных конкурентоспособна по сравнению с

38

разрабатываемыми за рубежом аналогами (Adnagen (Германия), CellSearch

(США)) в части:

1) числа оцениваемых генов, экспрессирующихся в ЦОК (Отчет о НИР за

четвертый этап, раздел 2);

2) стоимости проведения анализа (Отчет о НИР за четвертый этап, раздел 2);

3) чувствительности и специфичности (5 ЦОК на 5 мл крови и 90%,

соответственно) (Отчет о НИР за четвертый этап, раздел 2).

8.1.3 Проведена технико-экономическая оценка рыночного потенциала

полученных результатов (Отчет о НИР за первый этап, раздел 4; Отчет о НИР

за второй этап, раздел 3; Отчет о НИР за третий этап, раздел 2; Отчет о НИР за

четвертый этап, раздел 2).

8.1.4 По результатам НИР должен быть разработан проект технического

задания на проведение ОТР по теме «Разработка технологии производства

диагностической тест-системы определения ЦОК в крови онкологических

больных» (Отчет о НИР за четвертый этап, раздел 4; проект технического

задания на ОТР в составе отчетной документации за четвертый этап).

8.2 Достигнуты установленные техническим заданием программные

индикаторы и показатели (Приложение 18. Отчет об индикаторах в составе

отчетной документации за четвертый этап и приложения к нему)

Соответствие пунктам технического задания отражено в отдельном

документе – Приложение 6. Ведомость соответствия требованиям ТЗ.

Рекомендации и предложения по внедрению результатов НИР. Данная

тест-система рекомендуется к использованию при выполнении широкого

спектра научно-исследовательских работ как фундаментального, так и

прикладного характера. Спектр используемых в анализе генов позволяет

изучать особенности патогенеза онкологических заболеваний и механизмов

метастазирования опухолей на основе характеристик генной экспрессии в

различных видах ЦОК. Открытость системы позволяет дополнять её

самостоятельно разработанными анализами экспрессии тех или иных генов,

представляющих интерес для исследователей. Использование нового метода

39

изучения ЦОК позволит получить новую информацию об особенностях

канцерогенеза и найти пути совершенствования диагностики и лечения

опухолевых заболеваний, в т. ч.благодаря новым возможностям моиска целей

для таргетной терапии. Тест-система может быть применена в клинических и

доклинических исследованиях по оценке эффективности других

диагностических методов или по оценке эффективности хирургической, химио-

или радиотерапии опухолевых заболеваний. Данная тест-система может быть

применена для разработки и/или совершенствования диагностических и

прогностических схем, схем выбора терапии и схем наблюдения за пациентами

после успешного лечения опухолевых заболеваний. Кроме того, новые

сведения о природе ЦОК и об особенностях ЦОК при тройном негативном раке

молочной железы могут быть использованы при формировании

образовательных программ для студентов, ординаторов и аспирантов

медицинских ВУЗов, проходящих учебные циклы по онкологии. Подробнее

рекомендации по внедрений результатов НИР и оценка эффективности

внедрения отражены в приложении «Рекомендации по использованию

результатов НИР».

40

2 Проведение технико-экономической оценки рыночного

потенциала полученных результатов

Рак — второе по частоте заболевание (после сердечно-сосудистых

болезней) в структуре смертности мужчин и женщин работоспособного

возраста. Раку подвержены все возрастные категории людей, однако частота

возникновения многих видов опухолей повышается с возрастом. Статистика

показывает, что если смертность от злокачественной опухоли в 20-летнем

возрасте принять за единицу, то в 50-59 лет риск умереть от данной причины

увеличивается в 50 раз, а в 60 лет и старше вероятность возрастает еще больше:

для мужчин - в 119, для женщин - в 78 раз. Например, в США ежегодно

диагностируется около 1 млн. случаев рака, примерно 50% из них - с летальным

исходом. В среднем, количество летальных исходов злокачественных

заболеваний в мире ежегодно составляет более 2 млн.

На сегодняшний день Россия занимает первое место в мире по

онкологическим больным на душу населения. В России онкологические

заболевания уносят примерно 300000 человек ежегодно. Абсолютное

количество больных с впервые установленным диагнозом онкологического

заболевания за последние десять лет увеличилось на 11 % и составило более

500000 человек. На сегодняшний день общее число больных приближается к

трем миллионам. Сегодня рак является причиной смерти каждого четвертого

человека в возрасте 65-74 лет.

Население нашей страны стремительно стареет, следовательно, ожидается

дальнейший рост онкологических заболеваний. Действительно, опухолевые

заболевания дают ежегодный прирост на 1-2 %. Структура смертности от

раковых заболеваний в России следующая: рак легких (13,8 %), рак кожи (11,0

%, вместе с меланомой — 12,4 %), рак желудка (10,4 %), рак молочной железы

(10,0 %), рак ободочной кишки (5,9 %), рак прямой кишки (4,8 %), рак тела

матки (3,4 %), рак почки (3,1 %), рак поджелудочной железы (2,9 %), рак шейки

матки (2,7 %), рак мочевого пузыря (2,6%) и др. Мужчины в структуре смерти

41

от онкологических заболеваний составляют 55,0 %, женщины — 45,0 %, что

свидетельствует о половых различиях в смертности. Данная плачевная

ситуация складывается из-за многих факторов, в том числе из-за низкой

медицинской образованности населения России, плохого отношения к своему

здоровью, распространения курения, употребления алкоголя, а также позднего

обращения за медицинской помощью, что приводит к позднему выявлению

онкологических заболеваний, когда лечение уже может только облегчить

симптомы, но не излечить опухоль.

Своевременное применение современных методов диагностики и лечения

рака (хирургические, химиотерапевтические, лучевая и биологическая терапия)

приводит к выздоровлению примерно 50% онкологических пациентов.

Медицинская промышленность – одна из наиболее наукоемких

высокотехнологичных отраслей промышленности. Основная доля инвестиций

и, соответственно, интеллектуальных, производственных и временных ресурсов

направлены на создание новых лекарственных препаратов, в то время как

разработка и внедрение в практику новых диагностических систем также

требует инновационных подходов, финансирования и зачастую таких же

сложных по организации многолетних клинических исследований, как и

проводимые при внедрении новых лекарственных средств. Направление поиска

новых диагностических маркеров онкологических заболеваний получило новый

толчок для развития после открытия сначала диссеминированных опухолевых

клеток, а затем циркулирующих опухолевых клеток. Данные клетки, по всей

видимости, будучи ключевым звеном метастазирования опухоли одновременно

являются сложным для учета, но перспективным маркером онкологического

заболевания. Современные молекулярно-генетические технологии позволяют

учитывать и анализировать такие сложные объекты, как внеклеточные ДНК и

РНК в сыворотке крови, а также одиночные циркулирующие клетки. Во многом

благодаря одновременному развитию сходных технологических подходов в

области бурно развивающейся неинвазивной пренатальной диагностики и

диагностики опухолей становится возможным проводить выделение из

42

кровотока и анализ одиночных клеток. Первым тестом онкологических

заболеваний на основе анализа ЦОК является CEllsearch компании Veridex

(США), получившей в 2008 году разрешение FDA на использование теста для

оценки метастазов у больных раком простаты. С тех пор многие компании

разрабатывали и предлагали свои тест-системы для определения ЦОК в крови.

Однако до сих пор нет ни единого мнения о клинической значимости ЦОК, ни

«золотого стандарта» их определения. Тем не менее, важно подчеркнуть, что в

США и странах Западной Европы работают многочисленные коллективы

ученых и компании, занимающиеся разработкой тестов ЦОК. На выше

приведенном примере компании Veridex, являющейся дочерним предприятием

международного концерна Johnsons and Johnson, можно показать, что

заинтересованность в этом сегменте диагностических услугу чрезвычайно

высокая, в т.ч. среди крупнейших компаний. В связи с вышеизложенными

данными существует опасность, что уже в ближайшие годы РФ будет тратить

огромные средства на закупку импортных диагностических систем, некоторые

из которых уже стали поступать на рынок. Таким образом, учитывая научную и

практическую значимость, разработка технологий анализа редких клеток в

кровотоке пациентов может считаться очень перспективным и коммерчески

выгодным вложением серьезных капиталов.

Можно с уверенностью утверждать, что изобретение инновационных тест-

систем во многом идет по пути комбинирования различных молекулярно-

генетических и клеточных подходов и инновационных технических решений,

приближающих медицину к персонифицированной, и что дальнейший прогресс

медицины будет зависеть именно от возможности применения таких тест-

систем – более точных и чувствительных, позволяющих учитывать

индивидуальные особенности патологических процессов в организме. Таким

образом, созданная нами в ходе выполнения проекта диагностическая тест-

система определение ЦОК и их характеристик может быть использована для

проведения нового вида диагностики в российских онкологических

учреждениях. При этом тест-система обладает конкурентоспособностью на

43

мировом рынке и большим коммерческим потенциалом. Появление подобных

разработок на диагностическом рынке в конечном итоге внесет существенный

вклад в снижение смертности и инвалидизации населения России. Объекты

интеллектуальной собственности, созданные в ходе выполнения проекта, будут

способствовать активизации импортозамещения в сфере диагностики

опухолевых заболеваний. Ниже представлены более подробно конкурентное

сравнение с основными аналогами. Компания AdnaGen AG выпускает панели

тестов AdnaTest, в том числе для определения ЦОК при раке молочной железы.

Данный тест отсутствует на территории России, поэтому его стоимость можно

оценить лишь приблизительно, опираясь на информацию, полученную от

представителей компании, о цене теста в Германии и других странах Европы, в

18 000 – 20 000 рублей. При этом нужно учитывать, что регистрация теста в

России и таможенные расходы неминуемо приведут к увеличению стоимости

теста, ориентировочно на 25-30%, т.е. цена в России может составлять 22 500 –

26 000 рублей. По нашей оценке стоимость собственной разработки будет

составлять около 12 000 рублей при рентабельности порядка 30%. Также

целесообразно сравнить нашу разработку с достаточно широко используемым

на территории США тестом, разработанным компанией Veridex. Их

полуавтоматический комплекс CellSearch одобрен FDA для мониторинга

метастазов по крови больных раком молочной железы и кишечника и таким

образом является единственной одобренной тест-системой по определению

ЦОК в крови онкологических больных в США. Стоимость одного анализа на

данной системе составляет около 27 000 рублей (900 долларов). При этом

справедливо также ожидание роста цены при импорте тест-системы. Кроме

того, внедрение данной системы требует закупки специфического

дорогостоящего оборудования (стоимость в США 125 000 долларов),

применимого только для данного теста. Таким образом, отечественная

разработка по крайней мере в два раза дешевле ожидаемой стоимости

импортных аналогов. Кроме того, в работе продемонстрировано (Приложение

13.1 отчетной документации за третий этап), что отечественная разработка не

44

уступает или превосходит зарубежные аналоги по таким показателям как число

оцениваемых генов, экспрессирующихся в ЦОК и чувствительности и

специфичности тест-системы. Сравниваемые характеристики приведены в

таблице 5. Приведенные данные свидетельствуют о полном соответствии

разработки пунктам 8.1.1 и 8.1.2, а также 6.1.1 технического задания.

Таблица 5 – Конкурентное сравнение разработанной тест-системы с

аналогами. Наименование показателей

Собственная разработка

AdnaTest BreastCancer (AdnaGen AG, Германия)

CellSearch® Circulating (Veridex, США)

Число выявляемых генов

GA733-2 Muc-1 Her-2 ESR PGR ALDH1 BRСA1 Twist1 PI3Ka Actin AKTA GAPDH HPRT

GA733-2 Muc-1 Her-2 Actin

EPcam+ Cytokeratin 8 Cytokeratin 18+ Cytokeratin 19+ (определяют белки иммунологически)

Чувствительность <5 клеток на 5 мл 5 клеток на 5 мл 30 клеток на 7,5 мл Специфичность 100% (не выявляет

ЦОК в крови здоровых людей)

100% (не выявляет ЦОК в крови здоровых людей)

выявляет до 5 ЦОК в крови здоровых людей

Стоимость анализа 12 000 рублей 22 000 рублей 27 000 рублей

Основываясь на проведенной работе можно оценивать стоимость

внедрения теста в 500 000 рублей (в сумму включены стоимость оборудования

молекулярно-генетической лаборатории и обучения персонала клиники).

Однако необходимо учитывать, что редко тест внедряется изолированно в

лабораторию, которая не осуществляет более никаких анализов. Поэтому при

оценке стоимости внедрения теста необходимо также учитывать, что в

большинстве случаев (более 95%) его внедрение будет проходить на базе

лабораторий уже выполняющих другие молекулярно-генетические

исследования. Тогда в условиях наличия необходимого стандартного для

такого рода лаборатории оборудования и квалифицированных кадров

уменьшается стоимость внедрения теста до крайне незначительной суммы

45

5000-8000 рублей, которые окупятся уже после нескольких проведенных

диагностик. Стоимость одного анализа не превышает 12000 рублей, что на 6000

рублей ниже по сравнению с ближайшим импортным аналогом теста (или

примерно в два раза ниже ожидаемой стоимости аналога в России). При этом

нужно учитывать, что взятая для оценки стоимость импортного аналога,

несомненно, увеличится при проведении регистрации набора и организации его

импорта в РФ. Не следует забывать и проблему срока годности комплектующих

реагентов, редко превышающих 6 месяцев с даты производства. При этом

средний срок ввоза небольших партий реагентов в области биотехнологий

нередко составляет 2-3 месяца.

Предлагаемый анализ не может в настоящее время полностью заменить

такие методы, как КТ или МРТ, т.к. для столь серьезных изменений алгоритмов

диагностического обследования пациентов необходимо дождаться результатов

продолжительных (5 и более лет) наблюдений за пациентами, обследованных с

помощью методики выявления ЦОК. Однако в перспективе он может заменить

собой КТ и МРТ или изменить показания к их назначениям. Так, например,

отсутствие ЦОК свидетельствует в пользу НЕ назначения КТ/МРТ, в то время

как их выявление, напротив, является показателем к поиску метастазов с

помощью МРТ и КТ. Учитывая, что при раке молочной железы высока

вероятность метастазов не только в региональные лимфоузлы, но и в кости,

поисковые КТ/МРТ требуются фактически для всего тела. Проведение такого

полного скрининга невозможно при стоимости одной условной области

(брюшная полость, малый таз, кости конечностей, кости черепа, грудная

полость и т.д.) около 5000-5500 рублей (http://www.skliflab.ru;

http://www.travma24.ru). На практике ограничиваются КТТ/МРТ зон наиболее

вероятного появления метастазов, в том числе при клинически обоснованных

показаниях, т.е. в ситуациях, когда метастазы заведомо достигли значительных

размеров. Выявление ЦОК на этапе адъювантной терапии может внести

изменения в выбор лекарственных препаратов, что в первую очередь будет

46

выражаться в экономии самих лекарственных препаратов, а в результате

выбора правильного направления лечения спасет человеческую жизнь.

Ожидается, что внедрение нового теста повысит эффективность

противоопухолевой терапии различных видов метастатического рака.

Представить точные оценки, на наш взгляд, не возможно, так как зависеть они

будут не только от результатов тестирования, но и от эффективности

имеющихся альтернативных препаратов, и отпоявления новых лекарственных

средств. Однако для примера можно сказать, что при метастатическом раке

молочной железы выживаемость пациентов из группы носителей ЦОК

примерно в два раза меньше, чем у тех, у кого ЦОК выявлены не были. Если на

ранней стадии диагностики выявленные ЦОК послужат критерием

своевременного изменения терапия, то можно ожидать увеличения

продолжительности жизни части больных с ЦОК.

Использование отечественных инновационных технологических

разработок при создании новых диагностических средств повысит их

доступность не только для населения, но и для государства. Потенциальными

потребителями разработанной продукции, основываясь на данных статистики, в

России ежегодно могут стать около 500000 человек, заболевших раком. При

ожидаемом увеличения эффективности терапии рака хотя бы на 10% в

результате своевременного начала и/или коррекции лечения, благодаря данным

анализа ЦОК, положительный эффект для экономики Российской Федерации

может составить около 650 млн. руб. в год. Расчет приведен исходя из среднего

годового подоходного налога на душу населения, равного 13 тыс. руб. и 50 тыс.

человек (10% населения), вернувших трудоспособность из числа заболевших.

47

3 Разработка проекта методических рекомендаций по

практическому применению разработанной новой диагностической тест-

системы для определения ЦОК

По итогам выполненной работы разработан проект методических

рекомендаций по практическому применению разработанной новой

диагностической тест-системы для определения ЦОК. Данный документ входит

в состав отчетной документации по настоящему этапу НИР. Ниже приведены

основные положения по разработке рекомендаций.

Проект методических рекомендаций изложен на 11 страницах, содержит

следующие разделы: Введение; Цель исследования; Назначение методики;

Требования к проведению исследований; Приборы и оборудование; Материалы

и методы; Подготовка образца; Выделение клеток и подготовка к анализу;

Анализ результатов ПЦР; Интерпретация результатов; Заключение. Согласно

проекту методические рекомендации позволяют получить основную

информацию о ЦОК, цели анализа и методической базе, необходимой для

достижения цели, а также обо всех методических действиях, связанных с

выполнением анализа и содержат инструкции по интерпретации получаемых

результатов. Методические рекомендации позволяют провести выделение ЦОК

при раке молочной железы и оценить уровень экспрессии в выделенных

клетках, генов, характеризующих ЦОК (GA733-2, MUC1, ERBB2, Twist1,

PI3КA, ALDH1, ESR1, PGR, BRCA1), чей уровень экспрессии нормализуется к

определяемым в тех же ЦОК референсных генах (ACTA1, GAPDH, HPRT).

Проект методических рекомендации может быть использован как основа

инструкции к диагностической тест-системе для определения ЦОК в крови

онкологических больных, проект технического задания на разработку которой

представлен в следующем разделе. Такой проект технического задания на

опытно-технологические работы составлен подготовлен в целях получения

стандартных наборов реагентов, упомянутых в проекте методических

рекомендаций.

48

4 Разработка проекта технического задания на проведение ОТР

по теме «Разработка технологии производства диагностической тест-

системы определения цок в крови онкологических больных»

Подготовлен проект технического задания на проведение ОТР по теме

«разработка технологии производства диагностической тест-системы

определения ЦОК в крови онкологических больных».

Производство наборов реагентов для проведения диагностического

тестирования является самостоятельной технологической задачей, решение

которой не входило в задачи НИР. Однако для более широкого внедрения

результатов НИР целесообразно разработать технологию производства

стандартной тест-системы, которая может быть применена не только

организацией разработчиком тест-системы, но любыми другими

заинтересованными в тест-системе научно-исследовательскими, и клинико-

диагностическими организациями. С этой целью необходимо обеспечить

созданием масштабируемого процесса стандартизованного производства тест-

системы с соблюдением соответствующих нормативов.

Целью выполнения ОТР является разработка технологии производства

диагностической тест-системы определения ЦОК в крови онкологических

больных.

Основные требования к разрабатываемой технологии производства

диагностической тест-системы, устанавливаются с учетом результатов,

полученных в ходе выполнения данной НИР, а именно, требования:

5.2.2.1 Разрабатываемый Технологический процесс должен обеспечивать

следующие показатели:

1) допустимые колебания объемов жидких компонентов не более 1%.

5.2.3.1 Разрабатываемый технологический процесс должен обеспечивать

поддержание температуры подготавливаемых компонентов на уровне +4С на

этапах ТО2 и ТО3.

5.2.4.1 Разрабатываемый технологический процесс должен обеспечивать

49

следующие показатели качества:

1) Допустимый процент колебания объемов жидких компонентов – 1%,

не более;

2) Срок годности Изделия и его компонентов - не менее 6 месяцев;

5.3 Требования к сырью и материалам

5.3.1 Вода деионизованная согласно ГОСТ 25661-83.

Данные требования устанавливаются для поддержания наиболее важных

характеристик тест-системы, удовлетворяющих требованию п. 6.1.1.

технического задания на выполнение данной работы: чувствительность не ниже

5 клеток на 5 мл крови больных; специфичность не ниже 90%; оценку

экспрессии не менее 3-х генов для каждого вида ЦОК. По итогам НИР данные

требования исполнены (Приложении 13.1 отчетной документации за третий

этап, Отчет о НИР за четвертый этап, раздел 1 и 2) и должны быть сохранены

при производстве тест-системы.

В проекте технического задания на ОТР использованы ссылки на

документы нормативной документации в соответствии с рекомендациями

Заказчика и технологическими требованиями к продукции, процессам, сырью, а

также требования безопасности при выполнении соответствующих работ.

Основное назначение технологии – получение набора реагентов,

рассчитанных на проведение полного цикла выделения ЦОК и их

характеристики по генной экспрессии. Учитывая высокую чувствительность

технологий, основанных на ПЦР необходимо соблюдать высокую точность

дозирования компонентов наборов, чистоту условий сборки компонентов и

правила температурного хранения и транспортировки. Также важно проводить

указанные в ТЗ на ОТР контрольные операции для подтверждения чистоты и

работоспособности тест-системы. Получаемая тест-система должна сохранять

изначально разработанные характеристики чувствительности и специфичности

тест-системы, что возможно обеспечить благодаря установленным в ТЗ

требованиям к технологическому процессу.

50

Проект технического задания на проведение ОТР входит в состав

отчетной документации по настоящему НИР.

51

5 Подготовка документации для оформления патента

Были проведены дополнительные патентные исследования. Начало

дополнительных патентных исследований – сентябрь 2012 года; окончание –

октябрь 2012 года. В результате дополнительных патентных исследований

новых объектов интеллектуальной собственности, по сравнению с

результатами патентного исследования, проведенного с марта по май 2011 года,

обнаружено не было.

Была подготовлена заявка на получение патента на изобретение

«Комплексный способ определения циркулирующих опухолевых клеток в

крови больных раком молочной железы». Номер заявки № 2012145017,

приоритет 23.10.2012 г.

52

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. В ходе четвертого этапа были проведены обобщение и оценка

полученных результатов, в т.ч. проведен анализ зависимостей между тяжестью

клинической картины и числом обнаруживаемых ЦОК. Показана связь между

обнаружением ЦОК по итогам проведенной неоадъювантной терапии и

неблагоприятным прогнозом для пациента. Выявлен ряд слабых корреляций

между уровнями экспрессии анализируемых в ЦОК генов и клиническими

показателями. Показано, что эффективно проведенная неоадъювантная терапия

приводит к исчезновению ЦОК из крови. Высказаны предположения о

клинической значимости отдельных характеристик ЦОК и перспективах их

применимости в клинической практике. Разработаны рекомендации по

использованию разработанного метода определения ЦОК как в научно-

исследовательских, так и в практических (диагностических) целях.

2. Проведена технико-экономическая оценка рыночного потенциала

полученных результатов. Технико-экономическая оценка рыночного

потенциала полученных результатов НИР показала, что предложенный метод

определения ЦОК у онкологических больных может обеспечить ускорение

научно-технического потенциала Российской Федерации в области лечения

рака молочной железы. Предлагаемый метод диагностики ЦОК, основанный на

количественном анализе экспрессионных маркеров ЦОК обладает

конкурентоспособностью на российском и мировом рынках. Внедрение ЦОК в

практику может оказать значимые положительные социальные и

экономические эффекты.

3. Разработан проект методических рекомендаций по практическому

применению разработанной новой диагностической тест-системы для

определения ЦОК. Данный проект может быть использован для составления

рекомендаций для врачей и врачей-лаборантов клинико-диагностических

лабораторий онкологических центров РФ.

53

4. Разработан проект технического задания на проведение ОТР по теме

«Разработка технологии производства диагностической тест-системы

определения ЦОК в крови онкологических больных».

5. Выполнен дополнительный патентный поиск. Оформлена заявка на

изобретение диагностической тест-системы для определения ЦОК. Номер

заявки № 2012145017, приоритет 23.10.2012 г.

Все полученные результаты как четвертого этапа, так и работы в целом

соответствуют поставленной цели и отражают полноту решения поставленных

задач, а также свидетельствуют об успешном исполнении НИР.

В результате работы разработана диагностическая тест-система по

определению ЦОК в крови онкологических больных. Данная тест-система

обеспечивают высокую чувствительность (5 клеток на 5 мл крови) и

специфичность (>90%) обнаружения ЦОК, характеризует в ЦОК экспрессию 12

генов, что соответствует требованиям технического задания (п. 6.1.).

Приведенный характеристики позволяют считать данную разработку

выполненной на высоком научно-техническом уровне в сравнении с лучшими

достижениями в данной области, а проведенный детальный анализ показывает,

что вкупе с рассчитанной стоимостью применения разработанной тест-системы

она является конкурентноспособной по сравнению с разработанными за

рубежом аналогами (Adnagen, CellSearch), что также в полной мере

соответствует требованиям техническго задания (п. 8.1.2).

Выше перечисленные характеристики также позволяют рекомендовать и

использовать тест-системы для решения широкого круга научных и

прикладных задач, в том числе использовать её в целях изучения патогенеза

онкологических заболеваний и механизмов метастазирования опухолей, более

ранней диагностики (по сравнению с существующими диагностическими

возможностями) прогрессии злокачественных новообразований и ранней

оценки эффективности адъювантной химиотерапии онкологических больных,

что соответствует п. 8.1.1. технического задания.

54

По итогам выполнения работы проведены основные и дополнительные

патентные исследования, показавшие возможность патентования

разрабатываемой тест-системы и была подана заявка на получение патента.

Разработанная тест-система применена на выборке больных тройным

негативным раком молочной железы. Проведены исследования клинической

значимости находок ЦОК и анализ возможных корреляций между результатами

исследования ЦОК и клинико-лабораторными характеристиками больных

тройным негативным раком молочной железы.

Результаты проведенной работы использованы при подготовке успешно

защищенной диссертация на соискание степени кандидата медицинских наук.

Также результаты работы отражены в публикациях в журналах из списка ВАК.

К выполнению работы привлечены студенты, что позволило подготовить новые

научные кадры для работы в области молекулярной генетики. Проведение

совместных работ с врачами и научными сотрудниками лечебного

онкологического учреждения позволило не только установить сотрудничество с

высококвалифицированными специалистами-онкологами, чей

профессионализм позволил разработать тест-систему с характеристиками

актуальными для клинического применения. Кроме того, такое сотрудничество

обеспечило базу для проведения дальнейших совместных работ с целью

разработки актуальных для практической медицины диагностических

технологий.