Ферментные препараты в...

Иван Зоров МГУ 1

ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ В КОРМОПРОИЗВОДСТВЕ

Области применения и методы анализа

Иван ЗОРОВ

Московский Государственный

Университет им. М.В Ломоносова

Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН

МИНСК, 9 СЕНТЯБРЯ, 2015


Механико-математический факультет

Ф-т вычислительной математики и кибернетики

Физический факультет

Химический факультет Факультет наук о материалах

Биологический факультет

Факультет фундаментальной медицины

Факультет почвоведения

Геологический факультет

Географический факультет

Исторический факультет

Филологический факультет

Философский факультет

Экономический факультет

Социологический факультет …

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

Химический факультет

17 кафедр, включая:

Кафедра химической энзимологии

Химии природных соединений

Физической химии

Аналитической химии

Химической технологии …


ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. Баха РАН Старейший Российский институт в области наук о жизни

Около 25 лабораторий и исследовательских групп

Более 300 человек, из них 206 научных сотрудников, 175 докторов и кандидатов наук

>30 аспирантов

>180 студентов

>80 федеральных и международных программ и грантов

Июль 2015 года

ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР

БИОТЕХНОЛОГИИ РАН

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ ЦЕНТР БИОИНЖЕНЕРИИ


ПРОМЫШЛЕННАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ лаборатория биотехнологии ферментов

Целлюлозо-бумажная промышленность:

Биоотбеливание бумаги, удаление красок и тонеров, рефайнинг целлюлозы, наноцеллюлоза, переработка целлюлозосодержащих отходов .

Пищевая и кормовая промышленность:

Ферменты для обработки кормов на основе зерновых, сои, кукурузы;

ферменты для получения спиртов;

ферменты в хлебопечении;

ферменты для получения соков;

ферменты в производстве вин;

ферменты для переработки белковых отходов.

Ферменты для моющих средств.

Ферменты для получения жидкого топлива и продуктов тонкой химии на основе растительной биомассы.


Создание штаммов микроорганизов - продуцентов ферментов

Скрининг диких

микроорганизмов

Мутагенез

и селекция мутантов

Генетическая инженерия

штаммов


Лабораторные исследования

- Изучение каталитических свойств ферментных препаратов;

- Хроматографическое выделение индивидуальных ферментов и

определение их биохимических, адсорбционных, каталитических и

прочих характеристик с использованием современных

аналитических методов;

- Оптимизация условий получения и использования ферментов;

- Разработка, оптимизация и миниатюризация методов скрининга;

- Моделирование / имитация стадий технологических процессов в

лабораторных масштабах.

Прикладные испытания

- Оптимизация дозировок, условий, схем применения ферментных

препаратов в производственных условиях

Исследование свойств и функций ферментов


Питательные вещества кормов

Белки растительного и животного происхождения – источник аминокислот, строительного материала для организма;

Жиры (преимущественно растительные) – источник энергии и базовые элементы для синтеза многих гормонов;

Сахара и растительные полисахариды в т.ч. - простые сахара (глюкоза, галактоза и пр., а также сахароза) - крахмал и амилопектин – источники энергии для функционирования клеток организма


Антипитательные факторы кормов

Ингибиторы протеаз растительного

происхождения (напр. соевый ингибитор)

Ингибиторы карбогидраз (ингибиторы

ячменя, ржи, кукурузы)

Некрахмальные полисахариды в т.ч.

- целлюлоза

- ксиланы, маннаны и b-глюканы, частично

пектины

Фитин


Структура некоторых НПС

Арабиноксилан

b-глюкан

O

H

OHH

H

O

OH

H H

OH

CH2OH

O

H

O

HH

OOH

H H

CH2OH

O

H

OHH

H

O

OH

H H

CH2OH

O

H

O

HH

O

OH

H H

CH2OH

O

H

OHH

H

OH

OH

H H

CH2OH

O

H

HH

OH

H

OH

H OH

CH2OH

O

H

HH

OH

H

OH

H OH

CH2OH

Галактоманнан


Некрахмальные полисахариды

Арабиноксилан b-глюкан Целлюлоза Пектин

Пшеница 6.0-6.6 0.7-0.8 ~2.5 -

Ячмень ~4.4 5.7-7.0 4.3 -

Рожь ~8.7 2.2-2.8 ~3.0

Соя 3.6 - 4.6 9.3-14.0

Кукуруза 4.9 - 2.6

Пшеничныеотруби

22.0-26.0 1.9-2.4 н/д н/д

Соеваяшелуха

~35.0 ~9 ~12 н/д


Типы и функции основных ферментов для использования в кормах

ПРОТЕАЗЫ – расщепление белков на полипептиды и аминокислоты

КАРБОГИДРАЗЫ

Целлюлазы – разрушение молекул целлюлозы

Гемицеллюлазы (ксиланазы, b-глюканазы, пектиназы)

расщепление ксилана, b-глюкана и пектина

соответственно

Амилазы – для расщепления крахмала

Фитаза – для высвобождения растительного фосфора,

связанного в фитине


отщепление по концевым связям

Механизмы ферментативного гидролиза

полисахаридов на примере гидролиза целлюлозы

ЭНДОДЕПОЛИМЕРАЗЫ

“статистическая” деполимеризация по внутренним связям

ЭКЗОДЕПОЛИМЕРАЗЫ

Субстраты: кристаллические и низкомолекулярные

(авицел, олигосахариды)

Эффект: образование простых сахаров – гексоз и пентоз

Субстраты: высокомолекулярные (КМЦ, b-глюкан, галактоманнан)

Эффект: снижение вязкости растворов полисахаридов


Ферментативный гидролиз полисахаридов клеточной стенки

O

OH

OH

O

OH

OH

OH

O O

O

OH

OH

OH

OHm (m


Метод определения активности ферментов в кормах при помощи окрашенных субстратов


Принцип метода измерения ферментативной активности по окрашенным субстратам

Окрашенный полисахарид, растворимый в буфере,

нерастворимый в органическом “осадителе”

Е

Олигосахарид, раство-

римый в “осадителе”

Полисахарид, нераство-

римый в “осадителе”


Окрашенные субстраты

Окрашенные

активным

оранжевым

карбоксиметилцеллюлоза

аморфная целлюлоза

арабиноксилан

галактоманнан

лихенан

Окрашенные

бриллиантовым

голубым

карбоксиметилцеллюлоза

арабиноксилан

b-глюкан

крахмал


Схема проведения эксперимента

Раствор окрашенного

субстрата

Измерение оптической

плотности супернатанта

Осаждение

Центрифугирование

Гидролиз окрашенного

субстрата экстрактом корма

Центрифугирование

Отбор супернатанта

Экстракция

Приготовление

суспензии корма

Условия: рН 5,0 ацетатный буфер,

температура 42оС,

перемешивание


Анализ активности ферментов в кормах

на примере ROD-КМЦ

Окрашенная КМЦ

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

Соя 1 Соя 2 Корм №1 Корм №4 Корм №5 Корм №7 Корм №8 Корм

№10

А490


1 Премикс 1 с ФП1

2 Комбикорм с ФП1 престартер после

миксера

3 Комбикорм с ФП1 престартер в

гранулах

4 Премикс 2 в ФП2

5 Комбикорм Стартер с ФП2 до

гранулирования

6 Комбикорм Стартер с ФП2 крупка

7 Премикс 3 с ФП1

8 Комбикорм с ФП1 Стартер до

гранулирования

9 Комбикорм с ФП1 Стартер гранулы

ОБРАЗЦЫ ПРЕМИКСОВ И КОМБИКОРМА

ДО И ПОСЛЕ ГРАНУЛИРОВАНИЯ

Ксиланазная активность в кормах

0,0000

0,2000

0,4000

0,6000

0,8000

1,0000

1,2000

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Образец

А485

Эндоглюканазная активность в кормах

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

0,3000

0,3500

0,4000

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Образец

А4

85


Оборудование и материалы, необходимые для проведения анализа

Окрашенные субстраты

Корма чистые и с добавлением

ферментов для калибровки

Термостат (водяной или контактный)

Лабораторный фотометр

Центрифуга (или микроцентрифуга)

Лабораторная посуда (или микропосуда)

Мерные пипетки (или микропипетки)


Метод определения активности ферментов в кормах вискозиметрическим методом


Оборудование для определения вязкости


Оборудование и материалы, необходимые для проведения анализа

Корма, дающие высоковязкие экстракты

Водяной термостатируемый шейкер или

термостатируемая магнитная мешалка

Капиллярный вискозиметр

Секундомер

Центрифуга (или микроцентрифуга)

Лабораторная посуда (или микропосуда)

Мерные пипетки (или микропипетки)


Вязкость экстрактов муки (100 г/л)

Время

истечения, сек

Относительная

вязкость

Рожь, №1 155 6,3

Рожь, №2 127 5,2

Ячмень 97 4,0

Пшеница 33,5 1,4

Кукуруза 25 1,0

вода 24,5 1,0

Время истечения экстракта

Относительная вязкость =

Время истечения воды


Схема проведения эксперимента

ДОБАВЛЕНИЕ

ФЕРМЕНТА

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАДЕНИЯ

ВЯЗКОСТИ ОТ ВРЕМЕНИ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЯЗКОСТИ

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ

ОТБОР ЖИДКОЙ ФРАКЦИИ

ЭКСТРАКЦИЯ

ПРИГОТОВЛЕНИЕ

СУСПЕНЗИИ МУКИ


Анализ активности ферментов

на примере экстракта ржи

Г20Х

90

100

110

120

130

140

0 500 1000 1500

Г20Х

0,95

1,05

1,15

1,25

1,35

1,45

1,55

0 250 500 750 1000 1250 1500 1750t'

Fr

t ист., сек

t реакции, сек

Пример высокой

активности и

стабильности

фермента


PentoХ

80

85

90

95

100

105

110

0 500 1000 1500

Анализ активности ферментов на примере экстракта ржи

t ист., сек


PentoХ

0,95

1,05

1,15

1,25

1,35

0 250 500 750 1000 1250t'

Fr

Пример высокой

активности фермента, но

малой стабильности

фермента


GrinХ

107

108

109

110

111

112

113

0 200 400 600 800 1000

Анализ активности ферментов на примере экстракта ржи

t ист., сек


0,95

1

1,05

1,1

1,15

1,2

1,25

1,3

0 200 400 600 800 1000

Пример низкой

активности фермента


Ингибирование ксиланаз экстрактами зерновых культур

Ин

гиб

ир

ов

ан

ие

бо

лее,

чем

на

90%

Ин

гиб

ир

ов

ан

ие

на 5

0%

Ин

гиб

ир

ов

ан

ие

бо

лее,

чем

на

90%

Ин

гиб

ир

ов

ан

ие

на 5

0%

Ин

гиб

ир

ов

ан

ие

бо

лее,

чем

на

90%

Ин

гиб

ир

ов

ан

ие

на 5

0%

Ин

гиб

ир

ов

ан

ие

бо

лее,

чем

на

90%

Ин

гиб

ир

ов

ан

ие

на 5

0%

Кси

лан

азн

ая

акти

вн

ость

,

Ед

/мг

Bio ACE Dyadic 0.95

ЦелловиридинАрсенал

Гольджи +- +- +- +- 1.9

Cellustar XL Dyadic X + X + + X + 36

Xylanase 2 XP Dyadic X + X + + X + 63

Cellustar XL Dyadic X + X + + X + 36

NCE L600 Dyadic + X + + 5.4

C1, dry Dyadic + X + + 4.6

Pentopan, Mono BG Novozymes X + + X + + 129

Econase HCP 4000 AB Enzymes X + + + X + 164

Provimi feed enzyme Provimi X + + +- 52

Avizyme 1200 Finnfeeds X + X + + X + 12

Porzyme PT 100 Finnfeeds X + X + + X + 60

Rovabio Excel, UF Aventis + 19

Allzyme PT , A.niger, Alltech X + + + +- 6

Sumizyme X, dryShin-Nihon

(Bioshigen) X + +- + + 92

Genencor Xylanase Genencor X + X + + + 134

Endopower, dryHyndaifeed

(Eazy

Biosystems)X + + + 7

Рожь КукурузаЯчменьПшеница


БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ!

ЗОРОВ Иван Никитич

[email protected]

Ферментные препараты в...

Documents