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- Depurtumento de Nología VegetalUniversidud Politécicu de Mudrid

La crioconservación comprende una serie de técnicas que per-miten conservar material vegetal vivo a temperaturas muy bajas, esdecir, a temperaturas próximas a -196 “C. Esta es la temperatura a laque se encuentra el nitrógeno líquido (NL), que se usa como refrige-rante debido a su facilidad de manejo y su coste asequible (Figura 1)Generalmente la conservación a largo plazo se realiza en vapor denitrógeno líquido, a una temperatura de aproximadamente -150 OC.Actualmente existen en el mercado congeladores eléctricos quealcanzan esa temperatura.

La crioconservación presenta una serie de ventajas sobre otrosmétodos, com,o la conservación de semillas mediante procedimien-tos tradicionales o la conservación in vii-ro. El principal beneficio queaporta la crioconservación es el hecho de que el metabplismo separa por completo a esas temperaturas tan bajas, evitando así puo-cesos de deterioro del material conservado. Ademas, las técnicas decrioconservación pueden ser utilizadas, en principio, con materialque sería difícil de conservar mediante otros procedimientos. Dentrode este grupo se encuentran las especies con semillas recalcitrantes.Otro grupo de especies con las que no se puede utilizar la conserva-ción de semillas son aquellas que se reproducen vegetativamente,que no suelen producir semilla o que presentan altos niveles de hete-rogeneidad. Estas especies deben ser conservadas en forma vegeta-tiva, y la crioconservación permite conservar a argo’ plazo materia

116 IU. ELENA GONZÁLEZBENITO

Figura 1.9 Contenedorde nitrógeno líquido.

previamente cultivado GI vitre sin la necesidad de realizar subculti-vos.

En resumen, la conservación a temperaturas ultra-bajas para porcompleto el metabolismo, pudiéndose recuperar posteriormente lascélulas, los tejidos o los órganos vegetales, siempre que seamosLcapaces de evitar los daños que por congelación o por desecación seproducen al bajar las temperaturas por debajo de 0 “C.

Veamos a continuación qué sucede en una célula expuesta abajas temperaturas. Al bajar la temperatura rm..y lentamente se lle-gará a %a temperatura

CRIOCONSERVACIÓN DE RECURSOS FITOGENÉTICOS 117

calor (el enfriamiento) no es un proceso muy rápido, al aumentar laconcentración de la solución extracelular (por congelación del agua),la célula (por ósmosis) pierde agua. Con esta deshidratación se con-centra la solución intracelular, bajando así su temperatura de conge-lación Con el descenso gradual de la temperatura la célula se va des-hidratando, y se llegan a producir daños irreversibles que originan lamuerte celular.

Si el enfriamiento es rápido, no hay tiempo para que el agua salgadel interior celular, y el punto de congelación del líquido intracelularse alcanza, se producirán cristales de hielo, con el consiguiente dañomecánico para la célula.

Si la velocidad del descenso de temperatura es intermedia se pro-ducirá una desecación gradual de la célula y se llegará a un punto enque las soluciones celulares estén muy concentradas y no se formencristales de hielo sino que las soluciones adquieren un estado vítreo(amorfo), o se formen cristales de hielo de muy pequeño tamaño.

Por otro lado, si el enfriamiento es muy rápido (inmersión direc-ta en nitrógeno líquido) y las soluciones intra y extracelulares estánmuy concentradas éstas se vitrifican, no produciéndose daños.

Los daños debidos a la deshidratación están en relación con unamayor concentración de solutos y con efectos mecánicos sobre lasmembranas.

.

Hasta ahora hemos considerado una sola célula. Aunque el com-portamiento de cultivos celulares frente a la congelación se parecebastante a este modelo ideal, al desarrollar una estrategia de crio-conservación de recursos fitogenéticos se debe utilizar otro tipo dematerial vegetal. Por ejemplo, en el caso de semil1a.s recalcitrantes, sepueden congelar los ejes embrionarios, o para las especies en las quees necesaria la micropropagación, se crisconservarán 5pices cauli-nares, yemas o segmentos nodales de vástagos procedentes de culti-vo in vii-ro. Es decir, se van a conservar sistemas multicelulares concélulas de distintas características por lo que serán necesarios estu-dios empíricos para cada caso para determinar el mejor método deenfriamiento.

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Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores se puedendistinguir dos grupos de métodos de crioconservacion según la velo-cidad de enfriamiento:

0 Enfriamiento rápido (inmersión directa en NL): se requiereque haya una baja disponibilidad del agua para que no se for-men cristales de hielo, bien porque los tejidos se hayandesecado previamente, o se hayan concentrado las solucio-nes intra y extracelulares. n

0 Enfriamiento lento (descenso lento de la temperatura hastaaproximadamente 40 “C y después inmersión en NL): se pro-duce la desecación de los tejidos al formarse hielo extracelular.

Como se ha comentado anteriormente el material vegetal a emple-ar para la crioconservación cuando el fin es laxonservación de recur-sos fitogenéticos, será aquel que pueda,mantener la variabilidad inicialde la población natural y, especialmente importante en el caso de con-servarse determinados genotipos de especies cultivadas, que impli-quen el menor riesgo de cambio genético. Así, como se ha visto en elcapítulo anterior, los tipos de cultivo in d-ro que empleemos seránaquellos con menor riesgo de que se produzcan cambios genéticos. Encuanto al material vegetativo se utilizarán yemas, ápices caulinares 0meristemos. También se pueden crioconservar polen, semillas, o ejesembrionarios. La crioconservación de material vegetativo y de ejesembrionarios implicará la utilización de una fase de cultivo in oifro pre-via y posterior al proceso de crioconservación. De estas técnica.s decrioconservación hablaremos fundamentalmente en este capítulo.

Al utilizar las técnicas de crioconservación se evita el posibledeterioro del material conservado y el que se produzcan cambiosgenéticos. Y este objetivo debe tenerse en cuenta al desarrollar unprocedimiento de crioconservación para un material determinado.Del mismo modo, hay que evitar una selección de los genotipos a con-servar, ya que éstos pueden tener una supervivencia diferente frenteal mismo protocolo de crioconservación.

CRIOCONSERVACIÓN DE RECURSOS FITOCENÉTICOS 119

miento para su recuperación del material vegetal, pero será necesa-rio optimizar cada fase para obtener la mayor supervivencia posible(siempre superior al 60X), para evitar la selección de genotipos.

Fases de un protocolo de crioconservación.Para una más fácil comprensión de los procesos que implican la

puesta a punto de un protocolo de crioconservación, éste se ha divi-dido en distintas fases, que deberán optimizarse para cada tipo dematerial vegeta.1 y genotipo:

?? Precrecimiento* Crioprotección. Enfriamiento0 Almacenamiento?? Recalentamiento y tratamientos posteriores?? Recuperación?? Test de viabilidad

En los siguientes apartados se comentarán los procedimientosutilizados más habitualmente. Posteriormente se describirán algunosprotocolos concretos desarrollados por diversos autores.

Precrecimiento

En ocasiones el cultivo dell material vegetal bajo ciertas condi-ciones previamente al enfriamiento puede mejorar la supervivenciadel mismo. Con esta fase del protocolo se pretende aumentar la resi&tencia a la congelación 0 aumentar la tolerancia al tratamiento crio-protector. Además este periodo de crecimiento permitirá tomar losexplantos en un momento óptimo. Los tratamientos varían conside-rablemente segun el tipo de explanto. Uno de los más utilizados es elendurecimiento all frío de los vástagos cultivados in uifro,mediante sucultivo a bajas temperaturas (por ejemplo 4 OC).

La adición al medi e cultivo en ese periodo de precrecimientode sustancias relacion os de estrés en las plantas (porejemplo prolina, litina, betaína) también parece mejorar la su.pervi-vencia despubs to y de8 calentamiento. Estas sustan-cias también se utilizan en ezclas crioprotectoras (ver más adelan-

tancias consi

L 120 IVI. ELENA GONZÁLEZ BENITO

(dimeltil sulfóxido -DIVISO- y glicerol) pueden utilizarse también enla fase de precultivo, aunque a concentraciones inferiores.

En ciertos casos una determinada composición del medio utiliza-do en el precultivo, especialmente en su composición de reguladoresde crecimiento, también puede favorecer la supervivencia. El uso desacarosa o manito1 en el medio de cultivo para inducir estrés osmóti-co con anterioridad a la congelación también ha sido utilizado conéxito.

Conviene tener en cuenta, asímismo, el tipo de explanto utilizadoy las condiciones fisiológicas en las que se encuentra. En el caso de lacrioconservación de meristemos o ápices caulinares suele ser con-veniente un periodo de cultivo después de su excisión de, por ejem-plo, uno o dos días.

Crioprotección

A la hora de seleccionar los tratamientos crioprotectores, esdecir, tratamientos a los que se somete a los tejidos para evitar dañospor formación de cristales de hielo, hay que tener en cuenta, en primerlugar, la velocidad de enfriamiento que se va a utilizar. Si el descensode temperatura es gradual, lo que implica la desecación celular, sesuele utilizar la crioprotección química. Si el enfriamiento es rhpido(inmersión directa en nitrógeno líquido) suelen utilizarse otros proce-dimientos como pueden ser la vitrificación o la desecación. La mayorparte de los protocolos desarrollados siguen este esquema básico,aunque existen algunos en los que se utiliza cualquier procedimientode crioprotección, tanto con enfriamiento lento como rápido.

Crioprotección químicaExisten una serie de sustancias que tras embeber el material vege-

tal en ellas, hacen que disminuyan los daños producidos en la conge-lación. Dentro de estas sustancias, denominadas crisprotectoras, exis-ten dos grandes grupos, las que penetran al interior celular y las queno. Por ello los mecanismos de actuación de las sustancias crioprotec-. !r

ielo. Al aumentar

CRIOCONSERVACIÓN DE RECURSOS FITOGENÉTICOS 121

tanto los daños producidos por desecación Sin embargo, los que nopenetran al interior celular producirían la deshidratación osmótica,bajando así la temperatura de congelación de las soluciones intra y-:.extracelulares. Muchos de esos compuestos también parecen estabili-zar las membranas celulares y de los diversos orgánulos.

Los crioprotectores también deben poseer otra característica: queno sean tóxicos a las concentraciones utilizadas. Los más utilizadosson el DMSO y el glicerol, en concentraciones de 545%. La combinaciónde distintos compuestos parece más efectiva con el enfriamiento lento,mientras que el DMSO es más efectivo en el rápido. También se sueleutilizar junto con estas sustancias crioprotectoras una alta concentra-ción de sacarosa (por ejemplo 0.41 M). Otras sustancias crioprotecto-ras son el polietilenglicol (PEC) y la polivinilpirridoxona (PVP).

Los crioprotectores se preparan en el medio que se haya utilizado .en el precultivo 0 se vaya utilizar en el cultivo posterior en la recupe-ración. La solución se debe esterilizar por filtración. Si el espécimen esrelativamente grande puede ser transferido sucesivamente a una seriede soluciones con una concentración ascendente del crioprotector.

El tiempo de aplicación suele estar en relación con la temperatu-ra. A temperatura ambiente se reduce el tiempo de aplicación conrespecto a la aplicación en frío (1-2 OC), que suele ser de 30-60 min,para evitar problemas de toxicidad.

.

Vitrificación

Se utiliza el mismo tipo de sustancias que en el caso anterior peroen concentraciones mucho más elevadas. Al descender la temperaturalas soluciones adquieren un estado amorfo (vítreo), no formándose cris-tales de hielo. Por ejemplo, una mezcla ampliamente utilizada es la deno-minada PVS2, desarrollada por Sakai & al. (1990): 15% (p/v) DMSQ + 30%(p/v) glicerol + 15% (p/v) etilenglicol + O74 M sacarosa. El tiempo deinmersión del tejido en la solución crioprotectora debe controlarse conmucho cuidado y debe hacerse a baja temperatura (sobre hielo picado).

DesecaciónEn ocasiones es suficiente esecar el materia

seguir una alta su ervivencia del mismo ués de su co

122 M. ELENA GONZÁLEZ BENITO

Esto sucede con gran parte de las semillas, en especial de la ortodo-xas, que pueden desecarse a contenidos de humedad muy bajos sinsufrir daños. Algunos ejes embrionarios de semillas recalcitrantestambién pueden ser desecados de forma que no sufran daños al con-gelarlos en nitrógeno líquido. La desecación se puede conseguir congel de sílice o en la cámara de flujo laminar.

La desecación de los tejidos también puede ser osmótica. Se uti-lizan sustancias como sacarosa 0 manito1 (por ejemplo concentracio-nes de 0.3-0.8 M). En ocasiones también se han combinado los dostipos de desecación. Después de pasar un periodo de cultivo en unmedio con una alta concentración de un osmótico (por ejemplo de 12a 48 h), los explantos se desecan físicamente.

Encapsulación-desecaciónLos tejidos vegetativos son más delicados frente a la desecación.

Para protegerles frente a este tratamiento se les encapsula en cuen-tas de alginato antes de su desecación física (Figura 2). La cuenta dealginato evita que la pérdida de humedad sea demasiado rápida. Elcultivo de los explantos, antes Q después de la encapsulación, en unmedio con una alta concentración de sacarosa mejora la superviven-cia después de la desecación y del enfriamiento.

Enfriamiento

El descenso gradual y controlado de la temperatura se consiguede forma muy precisa con un congelador programable. Existen otrosprocedimientos que exigen mayor manipulación, pero que no pre-sentan la desventaja del elevado precio. Por ejemplo, suspendiendolos viales sobre el nitrógeno líquido y reduciendo paulatinamente ladistancia a éste. Por otro lado, colocando el espécimen en un frascoal vacío en el interior e un congelador a -70 “C, se obtienen descen-sos de aproxima amente OJ “C/min.

irecta en nitriè-“C/min. Las velo-

‘&IOCONSERVACIóN DE RECURSOS FITOGENÉTICOS 123

Figura 2.- Respuesta de segmentos nodales de Antirrhinum microphyllumdespués de la crioconservación mediante encapsulación-desecación: (A) ala semana de cultivo, (B) a las cuatro semanas de cultivo.

Almacenamiento

En esta fase es muy importante asegurarse de que no se va a pro-ducir la descongelación del material conservado. Por lo tanto se reco-mienda conservar a -196 “C (en nitrbgeno liquido) o a -150 “C (envapor de nitrógeno o en un congelador eléctrico). Para un almacena-miento a corto plazo se pueden ut i l izar congeladores de-70 “C o -78 “C, pero evitando sacar los crioviales cuando se quieraretirar alguna muestra.

Recalentamiento

Qtro factor a tener en cuenta es Ila velocida e calentamiento.Las células deshidratadas pasarán el punto de descongelación de lassoluciones intra y extracelulares y se hidratarán posteriormente.

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Puede que la velocidad no sea un factor crítico, pero si hay cristalespequeños de hielo en el interior de la célula, el calentamiento rápidoes más aconsejable.

Por el contrario, si la deshidratación ha sido muy extrema(enfriamiento lento) una rehidratación muy rápida puede producirdaños por excesiva turgencia.

Los tejidos que puedan tener pequeños cristales de hielo debenser descongelados rápidamente para evitar que estos cristales sedescongelen momentáneamente y se recristalicen de nuevo con unmayor tamaño. La temperatura a la que se pueden recristalizar puedeser tan baja como -80 “C, y puede persistir a temperaturas relativa-mente altas, demandando, por lo tanto, una rápida aportación decalor a lo largo de toda la descongelación. .

Como ya se ha indicado anteriormente, la descongelación rápidapuede ser beneficiosa para muchos especímenes, no habiendo des-ventajas para otros. Se realiza con la inmersión del vial en un baño deagua estéril a 40 *C. La descongelación lenta se suele realizar a tem-peratura ambiente.

Recuperación

En el caso de que se hayan utilizado sustancias crioprotectoras,después de recalentar es necesario retirarlas ya que pueden resultartóxicas. Un procedimiento consiste en pasar los especímenes porsoluciones cada vez más diluidas del crioprotector o de sacarosa. 0simplemente se puede pasar a medio fresco después de uno o dosdías de cultivo.

Se han estudiado poco cómo afectan las condiciones de cultivo enla recuperación del material vegetal. Existen evidencias de que unaintensidad luminosa baja favorece la recuperación. También será con-veniente estudiar los reguladores de crecimiento que promuevan elcrecimiento organizado del explanto, evitando la formación de callo.

Test de viabilidad

@RIOCONSERVACIóN RE RECURSOS FITOGENÉTICOS 125

es quizás la observación del crecimiento organizado, es decir, el obte-ner una planta completa a partir de un eje embrionario, o un vástagoa partir de un ápice caulinar o meristemo. Con suspensiones celula-res pueden utilizarse otras pruebas más rápidas (pero que hay querealizarlas al menos un día después del recalentamiento) como es,por ejemplo, el test de diacetato de fluoresceína.

Test de variabilidadDeben realizarse pruebas bioquímicas (isoenzimas...), genéticas

(conteo de cromosomas...) o moleculares (RFLP, PCR . ..) para asegu-rar la estabilidad genética del material crioconservado.

Ejemplos de protocolosEn este apartado se presentan resumidamente una serie de pro-

tocolos de crioconservación en los que se utilizan distintos procedi-mientos. Para ver los detalles de los mismos consultar la publicaciónoriginal.Crioconservación de ápices de patata mediante enfriamiento lento(Harding & al., 1991).

. Separar ápices caulinares de cultivos in vitre de vástagos depatata (Solanum tuberosum).

? Precultivar los ápices durante 1 día en medio NIS.. Embeber los ápices en 110% DMS0 urante 1 h a temperatura

ambiente.? Meter los ápices en un criovial y mantenerlo a 4 “C durante

unos minutos. IBajar la temperatura a 0,4 “C/min hasta -35 “C(por ejemplo en un congelador programable).

0 Rápidamente sumergir el criovial en nitrógeno líquido.Mantener durante unas horas.

* Sacar el crisvial del nitrógeno líquido y dejarlo a temperaturaambiente.

0 Cultivar los ápices en medio MS e inckltbar con baja intensidadBumínica (10 E~-‘s-~) durante una scxnana.normales de incu ación (50 lEnY2su1).

126 M. ELENA GONZÁLEZ BENITO

Crioconservación de ápices de plátano mediante vitrificación (Thinh &al., 1999).

0 Separar ápices caulinares de cultivos in vitre de vástagos deplátano (Musa sp.).

0 Embeber los ápices durante 20 min en una solución prepara-da con medio MS líquido de 2M glicerol + Q,4 M sacarosa.

0 Meter los ápices en un criovial y embeberlos en solución vitri-ficante PVS2 durante 20 min sobre hielo picado.

0 Sumergir el criovial rápidamente en nitrógeno líquido.Mantener durante unas horas.

?? Sacar el criovial del nitrógeno líquido y descongelar en unbaño de agua a 40 OC.

0 Retirar la solución vitrificante con una pipeta y añadir al crio-vial una solución de 1,2 M sacarosa. Embeber durante 15 min.

0 Cultivar los ápices en medio MS con 0,3 M sacarosa durantedos días. Cultivar los ápices en medio MS con 3% sacarosa.

Crioconservación de segmentos nodales de Antirrhinurn microphyllummediante encapsulación-desecación (Zonzález-Benito et al., 1998’.

0 Separar segmentos nodales de cultivos in vitre de vástagos deAntirrhinum microphyllum.

? Cultivar los segmentos durante 1 día en medio MS.

?? Proceder a la encapsulación de los explantos en cuentas dealginato.

? Cultivar los explantos encapsulados en medio MS líquido conQ,75 M sacarosa durante 19 h.

0 Sacar las cuentas del medio y desecarlas con gel de sílicedurante 4 h (28% contenido de humedad sobre peso fresco).

9 Meter las cuentas en un criovial y sumergir el criovial rápida-mente en nitrógeno líquido. Mantener durante unas horas.

0 Sacar el criovial el. nitrógeno líquido y descongelar en un

&IOCONSERVACIóN DE RECURSOS FITOGENÉTICOS 127

Crioconservación de ejes embrionarios cie quejigo median te desecación(González-Benito & al., 1992).

. Pelar loc; frutos cle Quercus faginea, cortarlos transversalmen-te y proceder a la asepsia de la mitad que contiene el ejeembrionario.

0 Separar el eje embrionario.

0 Proceder a la desecación de los ejes embrionarios en la cáma-ra de flujo durante 3 h (21% contenido de humedad sobre pesofresco).

e Meter los ejes en un criovial y sumergir el criovial rápidamen-te en nitrógeno líquido. Mantener durante unas horas. ? .

?? Sacar el criovial del nitrógeno líquido y descongelar en unbaño de agua a 40 “C.

0 Cultivar los ejes en medio WPNI + 1,5 mg/l BAP.

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