微生物研究法微生物研究法 DD 組組

報告者：曾仁志報告日期： 2005/9/19

題目： (1)CO2 、 Sodium bicarbonate 和 HEPES buffer 對培養基 pH 值的調控。

(2) 成立一個細胞學實驗室需要什麼需求。

培養基 pH 值的變動對細胞造成的影響

哺乳動物細胞最適生長的 pH 範圍為 7.2~7.4 ，過酸或過鹼都會對細胞生長不良或造成傷害，故讓培養基的 pH 值穩定是相當重要。

For example ： Articular Chondrocytes( 關節軟骨細胞 ) ，主要的能量

來源是透過糖解作用之無氧代謝， Pyruvate 轉換成 lactic acid ，會迅速酸化培養基而導致抑制細胞生理及代謝。Glucose

Glycolysis

Glucose-6-phosphate

Pyruvate Lactic acid pH↓

Cell

CO2 、 Sodium bicarbonate 和 HEPES buffer 對培養基 pH 值的調控

培養基的 pH buffer system 最常用 NaHCO3 加入培養基中，以 CO2 來調整 pH 在適當之範圍 (HCO3

- + H+ H2CO3 CO2 + H2O) 。

※ 細胞生長需要 CO2 的環境，然而在 CO2 incubator 不斷的補充 CO2 下，培養基會越來越酸。加 sodium bic

arbonate 進去，使 HCO3- 去抓住 H+ 來平衡 pH 值。

然而在細胞生長快速及 carbonic anhydrase 的存在下，培養基會酸化的更快，故以添加 HEPES 來穩固細胞生長最適之 pH 的環境。

CO2 、 Sodium bicarbonate 和 HEPES buffer 對培養基 pH 值的調控

以 HEPESHEPES 當培養基之緩衝液之優缺點當培養基之緩衝液之優缺點

優點：對細胞毒性較小，適用於多種類型細胞的培養。 ( 參見表一 )

盡可能避免光照缺點：長期暴露於光照下，會產生具細胞毒性之自由基。( 但是只要避光保存便可避免，此問題較易解決。 )

參考資料參考資料表一、各種常用緩衝液及其使用範圍

緩衝液 適用 pH 值 使用上注意Formate 3.0~4.5 會溶解細胞膜上的蛋白質。Citrate 3.0~6.2 小心會與二價金屬離子結合。Acetate 3.7~5.5 容易揮發，可用冷凍乾燥除去。Phosphate 5.8~8.0 小心會與鈣離子結合沉澱，低溫下易結晶。HEPES 6.5~8.5 毒性較小多用在細胞培養。Tris 7.1~8.9 pH 值受溫度影響很大。Carbonate 9.7~10.7 小心會與金屬離子結合沉澱。

Phosphate buffer with or without Phosphate buffer with or without CaCa2+2+

• Phosphate buffer without Ca2+ ： 多應用於細胞培養之沖洗。

• With or without Ca2+ ? Why ?

Phosphate buffer with or without Phosphate buffer with or without CaCa2+2+

Phosphate buffer 與鈣離子結合沉澱的原因： 溶液的 pH 值 在溶液中，磷酸鹽是以三價的磷酸根（ PO4

3- ）、二價的磷酸氫根（ HPO4

2- ）和一價的磷酸二氫根（ H2PO4- ）存在，這三個離

子會維持一個平衡的狀態，但是 PO43- 要在強鹼（ pH 值很大

時）的情況下才會存在，所以在 phosphate buffer 溶液中只可能以 HPO4

2- 及 H2PO4- 存在。

HPO42- 較會和鈣離子產生沉澱。在 pH 值 7.4 時會有 80% 的 HP

O42- 存在，較會和鈣離子產生沉澱；若 pH 值下降至 5.4 時，則有

96% 的 H2PO4- 的存在，這樣一來就減少產生磷酸鈣沉澱的機會。

所以溶液 pH 值影響鈣磷沉澱很大， pH 值較低時，發生沉澱的機會也較低。

Phosphate buffer with or without Phosphate buffer with or without CaCa2+2+

成立一個細胞學實驗室的基本需求• 設計細胞實驗室之基本考量1. 細胞培養最害怕的就是污染的問題，因此提供一個無

菌的設備、環境及無菌操作技術是十分重要的。

UV殺菌燈

設計細胞實驗室之基本考量設計細胞實驗室之基本考量

無菌操作臺 滅菌器

設計細胞實驗室之基本考量設計細胞實驗室之基本考量

2. 細胞培養室與其他工作室隔離，需有 2~3道門，要有緩衝區來更換鞋子與實驗衣。

Air shower

設計細胞實驗室之基本考量設計細胞實驗室之基本考量

3. 細胞培養箱、冰箱、桌上型離心機、顯微鏡等設備 。Incubator 冰箱

細胞實驗室之基本配備細胞實驗室之基本配備

                                        

離心機 顯微鏡

細胞實驗室之基本配備細胞實驗室之基本配備

其他設備 1.水浴槽 2. 液態氮 3.-20℃ 、 -80℃ 、 4℃ 等冰箱。 4. 其他的視實驗需求而定。

參考文獻參考文獻 Fisk A., Pathak S., (1969) HEPES-buffered medium

for organ culture. Nature. 224, 1030-1031. Waldman S.D., Couto D.C., Omelon S.J., Kandel R.

A., (2004) Effect of sodium bicarbonate on extracellular pH, matrix accumulation, and morphology of cultured articular chondrocytes.

Tissue Engineering. 10, 1633-1640.