生化實驗參訪：

台灣動物科技研究所ATIT- Animal Technology Institute Taiwan

主講者：

李坤雄/研究員生物科技組

美國普渡大學 博士

林志鴻/副研究員生物科技組

臺灣大學獸醫所 博士.

王仕蓉/副研究員生物科技組

清華大學生命科學系 博士生科二; 第二組972004206; 林駿晏2009/11/9

摘要：

報告主要以李博士演講的幹細胞研究為主軸，介紹幹細胞與其發展歷史。右邊側欄為一些名詞解

釋，配合左邊寬欄介紹，發展史後整理幾點iPSC目前尚未解決之問題並於報告最後附上心得與參考資料。

另外報告內之研究發展圖為參考李博士上課ppt所附之參考文獻與自己查詢資料過程所嘗試建構出來的，並非完整的發展史。學生希望藉由提供幹細胞研究這個日漸龐大領域的冰山一角，對這

次演講內容做一個對照和整理。

台灣動物科技研究所：

1970年設立、於2001年正式更名為台灣動物科技研究所，所上直接與科學研究相關部門有應用動物、動物醫學、生物科技組三個組。

應用動物主要著重在動物飼育到屠宰產生的環境與人道問題，例如素食飼料、豬隻的致昏屠宰、和利用生物工程來改善牲畜飼養過程產生之環境壓力（廢水、排泄物）。動物醫學以豬隻為主，著重在疾病檢測防治。最後生物科技組研究方向

為本次參訪三位講者所演講之內容。報告重點放在李坤雄博士主講關於

李博士研究與幹細胞研究有關，聽過後並不是十分了解，因此以這次報告的機會就幹細胞研究和常識，回顧從1962年JB Gurdon所作Xenopus核轉移實驗到最新2009的iPSC和piPSC的歷史發展。

幹細胞的研究回顧（附圖上的主線發展）：從非洲爪蟾(African clawed tadpoles, Xenopus laevis)到piPSC

見歷史發展之附圖，先介紹中間1962, JB Gurdon到2009, Zhou et al.的部份。其分支部份留在後面介紹。

第一次將完全分化細胞的細胞核放回egg細胞內，而且成功又長成一隻成體是1962年John Gurdon對非洲爪蟾做的nuclear transplant實驗。他把這種兩棲類的蝌蚪階段的腸道表皮細胞”核”移植回卵(egg)細胞中，另外做一個對照組是把blastula, gastrula階段的endoderm細胞”核”移回去，看是否已經分化的前者可以再度發育回tadpole。見下圖(JB Gurdon, 1962)

後來2003時JB Gurdon又用老鼠跟人的胸腺(thymus)細胞核注射到Xenopus oocytes（不確定是不是X. laevis，paper只寫Xenopus oocytes）時，oct-4這個基因會被強烈表現。但為什麼把以分化的細胞核放到去核的oocytes中會產生這樣結果，卻沒有完全了解。

一直到2006年京都大學的日本學者Shinya Yamanaka的研究，他們發現原來Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4這四個基因與nuclear 的reprogramming(指以分化又長成新的個體)有關。只要把這四個基因用retroviral的方式移到小鼠的fibroblast中，用hES medium培養，最後再用生化實驗用過的抗生素方法選擇出成為幹細胞的colony。這樣產生的的第一代iPSC幹細胞被Yamanaka團隊稱為Fbx15 iPSC。

iPSC:induced pluripotent stem cells，2006由Shinya Yamanaka團隊提出。

piPSC:protein-induced Pluripotent Stem Cells。2009由Hongyan Zhou團隊提出。這兩者就是李博士提到

的”piPSC打死iPSC”，因為後者更簡單而且少了許多

問題。

Sir John Bertrand Gurdon:

英國劍橋大學發育生物學

家，最有名的是nuclear transplantation和cloning的成就。因為他在1950晚期開始做的nuclear transplantation和幹細胞研究剛得到2009的Albert-Lasker Basic Medical Research Award。（研究內容與本報告內容有重大關

連，左邊提到的1962年那篇paper是幹細胞研究重大的里程碑）

oct-4一個調控細胞是否要分化

的基因，有表現表示細胞

會被控制在不分化的階段

（大意是這樣但實際情形

比較複雜，太多太少都不

可以）。oct-4 knockout會促進分化。oct-4 transcription factor又稱POU5F1，是POU family的一員。

台灣動物研究所與李博士之幹細胞演講

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但這樣的幹細胞有一些特性和問題：

1. 和ES cell的形態、生長、teratoma形成、表面抗原一樣2. 但DNA methylation、基因表現不太一樣3. 不能和成體形成chimera4. 這裡用的四個factor中，c-Myc本身是oncogene，這樣就限制他在臨床上的用途，因為對有可能有致癌的問題

幾個月之後，2007年Yamanaka團隊又發表新的論文解決這個iPS cell跟實際ES cell有差距的問題。他們以Nanog的表現來當selection marker，捨棄之前用的Fbx15，做出來發現在DNA methylation、基因表現、chimera的問題都得到解決。

但今年Hongyan Zhou團隊用recombinant protein做的piPSC，卻更驚人。因為，過去的iPSC都牽涉到目標DNA、gene的manipulation，所以造成不確定的安全考量。但是Zhou所用的方式只是以具細胞穿透能力的重組蛋白質來誘使鼠的fibroblast變成piPSC，而且可以長時間自我更新、不管在in vitro或in vivo的環境下pluripotency 都不受影響。至於如何送入，這裡是用poly-arginine protein transduction domain接到之前提過那四個transcription factors的C-terminus，以CPP將其帶入cell。

這篇paper重要一個地方在於作者的觀念是，若要避免不可預期的基因改變，那麼最好的方法不是把gene丟進去讓它transcribe，而是直接放translated好的蛋白質。

幹細胞的研究回顧（附圖上的支線發展）：

右邊，1998年JA Thomson直接從人體取ESC，這樣最直接，但是到最後還是有道德的爭議。

一直延續到2007，Thomson跟Yamanaka一起用人體細胞做ES，但將近十年過去的科技進步，已經不在使用人類胚胎，直接使用成人的體細胞。

左邊方框是一篇Yamanaka在2009年寫的review，針對iPS方式造成teratoma腫瘤的問題作一些討論，但是二月剛發表，短短不到兩個月，五月在Cell Stem Cell上Zhou et al.,發表的piPSC直接送蛋白質的方式顯然解決了許多iPSC的問題。

Retroviral的方式：要把DNA送入eukaryotic cell 之方法

Transfection:1.生化實驗用electroporation2.加calcium phosphate,

DEAE-dextran使cell 吸收DNA

3.Lipofection4.Microinjection(像是

1962JB Gurdon就有用到)

Transduction:用retrovirus攜帶我們要的基因去感染目標，讓他把

那段基因reverse-transcribed到目標DNA上。

Poly-arginine:基本上就是把要送入的蛋

白質接上CPP(cell penetrating peptides)，利用這些多lysine或arginine的帶正電amino acids把想送入的蛋白質送入cell。

台灣動物研究所與李博士之幹細胞演講

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1962

JB Gurdon

!"#$%&'()*+,-.(X.laevis)/0

12345

2003

JB Gurdon et al.

67&89:;<=>$%1?@AXenopus

BCDoct-40E8(FGHIJ$KL

2009

Zhou et al.

*MNO@PQR0ST/UVWXYZ[\

2006

Yamakana et al.

HIA]^123_`a&bcde(fdghijk0lmnop/UqrsYZ[\

2007

Yamakana et al.

t*uvwxy/z{|{}~Yxw��v�{�/Uq�sYZ[\

1998

JA Thomson

MN��e�|vz~x}�z~��[\

���G�a��*�e$%�Yw��}{(�G���

2007

JA Thomson

`YZ[\��(r�67*��/

2007

Yamakana et al.

`YZ[\��(F�)*c�0�Y��x�|vz~��

2009

Yamakana et al.

�{�Y{� ¡¢YZ[0£¤¢¥¦§�r¨©ªaXYZ[\«I¬­

關於iPSC的問題：

在2007年Yamakana 的iPSC出來之後，有一些問題需要解決：

1. low reprogramming efficiency：送入的OSKM factors引誘產生pluripotent cell的效率太差，2006的第一篇paper做出來0.01–0.5%，2007雖然解決一些問題，但損失的是效率，只有2006用Fbx15的1/10，0.001–0.03%。

2. genomic alterations due to viral integration：之前提過，因為這樣做是用病毒感染reverse transcribe一些基因（OSKM）回DNA，對DNA有所改變，所以在臨床應用上會擔心是否會造成不可預期的後果。

3. c-Myc和Klf-4本身是oncogene

另外關於同學結束後問的問題，telomere是否在iPSC/piPSC也是正常的？

正常體細胞內沒有telomerase所以我們的細胞分化一段時間之後(~50 cycles)就會死亡。但是部份腫瘤細胞或ES cell會有telomerase使telomere在新生兒一般最長的狀態，再隨著衰老而減短。

在2007年Yamanaka所作的以Nanog為selection marker那篇論文中有提到他們做出來的iPSC細胞中hTERT(human Telomerase Reverse Transcriptase)的表現和hES(human ES)cell line一致，或高於hES。實際iPSC生長情形如右圖，可以看到60天內細胞都呈指數生長。但圖表沒列出的部份，實際上細胞在四個月內都不斷分裂。根據作者資料這幾個clone的cell doubling time是：

• 46.9 ± 12.4 (201B2)• 47.8 ± 6.6 (201B6)• 43.2 ± 11.5 (201B7)•

與hES的doubling time一樣。圖中三個clones有分顏色但印成黑白會看不到，不過因為三個數值近似所以沒關係。

因此以作者提供這樣的數據來看看來，iPSC所做出來的幹細胞，其telomere是會被從原本體細胞的樣子，修復成為分化的原始狀態的。

心得：

重新跟著研究者的腳步走過一次，對了解整個幹細胞研究的歷史有很大的幫助。聽演講時不知道為什麼講幹細胞又會提到GFP(Green Fluorescent Protein) 和Chimera，在找資料的過程中才了解到GFP可以用來監測基因transfection 是否成功（Yamanaka的第二篇paper就用到GFP，李博士自己做的”由小鼠胚幹細胞株產製表現綠色螢光且具高性腺遺傳能力嵌合小鼠”也是GFP）。才知道Lasker獎是什麼，而這次做報告也是我第一次上Nobel Prize的網站看歷年的得獎者。

OSKM factors:

Yamakana發表的四個factors的縮寫：Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc

台灣動物研究所與李博士之幹細胞演講

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才了解2007年的生醫獎跟stem cell 研究有什麼關係。（gene targeting in mice其實所有研究都用的上，只是幹細胞研究也在其中之一）

不過回到幹細胞，iPSC在piPSC之後是否會變得多餘的問題，目前看到問題比較多是在oncogene那一塊。網路上看得到持反對意見的學者，某教

授寫了一篇很短的letter給PNAS，標題是 ”Distinguishing Cancerous iPSCs from ESCs”，抗議在論文中宣稱iPSC跟ESC沒有分別，卻沒有明白的討論iPSC引發癌症的風險。

幹細胞研究這個領域牽涉到太多慾望，進而金錢、權力。如果牽涉到利益，不知道有多少類似

Cancerous iPSC的衝突和矛盾會產生。這跟現在的食品工業是類似的情況，工業的目的不是餵飽人們，利益才是目的，但限於跟主題無關就不提

了。我在想，這個研究領域底下不知道有多少除了學術研究之外的鬥爭，或許能坐在電腦和課本

前面吸收知識打打報告是很幸福的。

最後一點，看完這些資料之後，我想或許有些人

也會有這個認知，如果我們在大學四年的課本裡日以繼夜（理想情況...）所吸收的知識，大體都還離不開十七世紀到20世紀60~80年代的範疇，那麼我們的資訊、知識究竟已經膨脹到什麼程度，但相對應的人類福祉有多少成長？不提幹細

胞，若醫學發達讓人都不死，又會發生什麼後果？在某一個角度來說，或許科技發展與經濟活

動應該暫時停止讓人類重新思考自己要的是什麼。

如果交通工具的發明能讓人們每天不用走路上學上班，那這些省下來的時間似乎也沒有真的讓大

家一天多出一個兩個小時來睡覺或是玩。四十年前沒有車的台灣人，到現在幾乎人人有車，人是變得更忙碌了呢，還是因為有了車而可以有更多

時間可以體驗生活。

上次回母校找之前的導師，雖然她還是忙的完全沒時間回我的信但碰面時她還是跟以前一樣親切，後來聊了一會兒才知道她是在忙教學評鑑。

為什麼老師（or助教）本來應該快樂的把時間花在教學上，到最後反而是教學評鑑佔掉這麼多時

間？我想這跟前面的問題有很大的關係。

Reference:

Bibliography

1. Campbell NA, Reece JB. BIOLOGY. 6th ed. Benjamin Cummings; 2001.

Literature

1. 盧道權, 幹細胞研究的進展, 生殖醫學新知, (2008) pp 20-26

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3. JB Gurdon, The Developmental Capacity of Nuclei taken from Intestinal Epithelium Cells of Feeding Tadpoles, J. Embryo. exp. Morph., (1962) pp. 622-40

4. JB Gurdon et al., Nuclei of Adult Mammalian Somatic Cells Are Directly Reprogrammed to oct-4 Stem Cell Gene Expression by Amphibian Oocytes, Current Biology (2003) pp. 1206–1213

5. S Yamanaka et al., Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors, Cell, (2006) pp. 663-676

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10. JA Thomson et al., Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells, Science Express, (2007) pp. 1-4

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