รายงานผลการวจย

เร�อง

การพฒนาดาวเรองสายพนธเพศผเปนหมนโดยการเพาะเล�ยงโอวล

Improvement of Male Sterile Line (A-line) Marigold via Ovule Culture

โดย

เฉลมศร นนทสวสด�ศร

มหาวทยาลยแมโจ

2556

รหสโครงการวจย มจ. 1-55-018

รายงานผลการวจย

เร�อง การพฒนาดาวเรองสายพนธเพศผเปนหมนโดยการเพาะเล�ยงโอวล

Improvement of Male Sterile Line (A-line) Marigold via Ovule Culture

ไดรบการจดสรรงบประมาณวจย ประจาป 2555

จานวน 350,000.00 บาท

หวหนาโครงการ นางสาวเฉลมศร นนทสวสด�ศร

งานเสรจส�นสมบรณ

11 มนาคม 2556

สารบญ

หนา

สารบญตาราง ข

สารบญภาพ ค

บทคดยอ 1

Abstract 2

คานา 3

วตถประสงคของการวจย 3

ประโยชนท�คาดวาจะไดรบ 4

การตรวจเอกสาร 4

อปกรณและวธการ 5

ผลการวจย 11

วจารณผลการวจย 23

สรปผลการวจย 24

เอกสารอางอง 25

ข

สารบญตาราง

หนา

ตารางท� 1 คาเฉล�ยเปอรเซนตการเกดแคลลสของช�นของกลบดอกจากการ 12

เพาะเล�ยงโอวล ของดาวเรอง

ตารางท� 2 คาเฉล�ยเปอรเซนตการเกดแคลลสของดาวเรองสายพนธตางๆ 13

จาการเพาะเล�ยงโอวล

ตารางท� 3 คาเฉล�ยเปอรเซนตการเกดแคลลสจาการเพาะเล�ยงโอวล สายพนธ และ 15

ช�นกลบดอกตางๆ บนอาหารสตร MS+1 mg/l TDZ +0.1 mg/l NAA

และ B5+1 mg/l BA +0.1 mg/l NAA

ค

สารบญภาพ

หนา

ภาพท� 1 ลกษณะของดอกดาวเรอง ท�สมบรณเตมท�พรอมท�จะบานในวนถดไป 9

ภาพท� 2 ลกษณะของดอกยอยของดาวเรองท�อยในดอกแบบฐานรวม (head) 9

ภาพท� 3 ลกษณะขนาดของโอวล (ovule)ในแตละวงของกลบดอก 10

ภาพท� 4 แผนภมแสดงคาเฉล�ยเปอรเซนตการเกดแคลลสของช�นกลบดอก (%) 12

ภาพท� 5 แผนภมแสดงคาเฉล�ยเปอรเซนตการเกดแคลลสของสายพนธ 13

MAR 1, MAR 2, MAR 3, MAR 4, MAR 5และ MAR 6

ภาพท� 6 แสดงลกษณะการเกดแคลลสในการเพาะเล�ยงโอวล (ovule) ดาวเรอง 17

ภาพท� 7 แผนภมแสดงเปอรเซนตความสามารถในการเกดยอดของแคลลสท�ไดจาก 19

การเพาะเล�ยงโอวล (ovule)

ภาพท� 8 แสดงลกษณะการเกดยอดของแคลลสท�ไดจากการเพาะเล�ยงโอวล 20

ภาพท� 9 ลกษณะของตน ดอก และจานวนโครโมโซมของดาวเรองท�เปนดพลอยด 22

และแฮพลอยด

ภาพท� 10 ลกษณะของดอกดาวเรองสายพนธแทท�มเกสรเพศผเปนหมนไดจากการ 24

เพาะเล�ยงโอวลและทาการเพ�มโครโมโซมดวยสารโคลชซน

กตตกรรมประกาศ

ผวจยขอขอบคณสานกวจยและสงเสรมวชาการการเกษตร มหาวทยาลยแมโจ ท�สนบสนนทน

ในการทาการวจยน� และ คณะผลตกรรมการเกษตร ท�อานวยความสะดวกในการใชเคร�องมอและ

สถานท�ในการทาการวจยในคร� งน�

ผวจย

การพฒนาดาวเรองสายพนธเพศผเปนหมนโดยการเพาะเล�ยงโอวล

Improvement of Male Sterile Line (A-line) Marigold via Ovule Culture

เฉลมศร นนทสวสด�ศร1

Chalermsri Nontaswatsri1

1 สาขาพชสวนประดบ คณะผลตกรรมการเกษตร มหาวทยาลยแมโจ สนทรายเชยงใหม 50290

-----------------------------------------------

บทคดยอ

จากการศกษาการเพาะเล�ยงโอวลของดาวเรอง เพ�อสรางสายพนธแท โดยวางแผนทดลอง

แบบ Factorial in CRD ประกอบดวย 3 ปจจยคอ ปจจยท� 1 อาหารท�ใชเพาะเล�ยง ม 2 ระดบ คอ MS

+ 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA + น� าตาล 30 g/l และ B5 + 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA + น� าตาล

30 g/l ปจจยท� 2 ระยะการบานของช�นกลบดอก ม 4 ระดบ คอ วงท� 1 (นบจากวงนอกสดเปนวงท� 1)

วงท� 2 วงท� 3 และวงท� 4 และ ปจจยท� 3 สายพนธดาวเรอง ม 6 ระดบ คอ สายพนธ MAR 1, MAR 2,

MAR 3, MAR 4, MAR 5 และMAR 6 พบวา อาหาร B5 จะมแคลลสเกดข�นดและเม�อยายแคลลล

ไปยงอาหารท�ปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต พบวา แคลลสไมสามารถพฒนาเปนยอดได

สวนท�โอวลท�เพาะเล�ยงบนอาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/ l NAA สามารถ

ชกนาใหเกดยอดและยอดมการพฒนาเปนตนมากท�สดถง 20 เปอรเซนตของแคลลสท�ยายลงอาหาร

ท�ปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต และเม�อนาตนดาวเรองดงกลาวมาตรวจสอบจานวน

โครโมโซมพบวาตนท�ไดมโครโมโซมลดลงคร� งหน�ง หรอตนท�เปนแฮพลอยด ไดสงสดเทากบ

72.72 เปอรเซนต และเม�อทาการเพ�มจานวนโครโมโซมโดยสารโคลชซนพบวาสามารถพบตน

ดาวเรองเพศผเปนหมนเกดข�น

คาสาคญ : ดาวเรอง การเพาะเล�ยงโอวล สายพนธแท และ เกสรเพศผเปนหมน

2

Abstract

A study on ovule culture of marigold for pure line production by Factorial in CRD with 3

factors. Factor 1 culture medium include two kind of medium MS medium with 1 mg/l TDZ +

0.1 mg/l NAA and 30 g/l sugar and B5 medium with 1 mg/l BA+ 0.1 mg/l NAA and 30 g/l

sugar. Factors 2 the layer of petal are first to fourth cycle of petals. Factor 3 varieties of marigold

are Mar 1, Mar 2 Mar3, Mar4, Mar5 and Mar6. The result showed that ovule cultured on B5

medium produced higher calli than cultured on MS medium but the calli not regenerated to plant,

only calli from ovule culture on MS medium regenerated to shoot. After sub-culturing onto MS

free medium the highest shoots regenerate form calli were 20 percent and 72.72 percent of them

were haploid. After double chromosome by colchicine some plants were male sterility.

Keywords : Marigold, ovule culture, pure-line and male sterile

3

คานา

ดาวเรองเปนไมดอกท�ไดรบความนยมและมความสาคญทางเศรษฐกจเปนอยางมาก ในป

หน�งๆเกษตรกรใชเมลดลกผสมช�ว1 จานวนมากในแตละป ซ�งในการผลตเมลดพนธลกผสมช�วท�

หน�งน�นส�งท�สาคญคอการสรางสายพนธพอแม ซ�งโดยปกตการสรางสายพนธพอแมซ�งเปนสายพนธ

แทน�นทาไดยากอยแลว สาหรบดาวเรองซ�งมชอดอกเปนแบบ Head ซ�งมดอกจานวนมากตอหน�ง

ชอดอกและดอกมขนาดเลกยากตอการตอนดอก การใชระบบเกสรเพศผเปนหมนมาชวยทาใหสาย

พนธแมท�ใชสรางลกผสมช�วท�1 น�นมลกษณะเพศผเปนหมนจะชวยทาใหการผสมเกสรเพ�อสรางสาย

พนธลกผสมช�วท�หน�งงายและสะดวกมาก ซ�งจะเปนประโยชนอยางย�งในการผลตเมลดพนธเพ�อ

การคา

วตถประสงคของการวจย

1. เพ�อพฒนาสายพนธเกสรเพศผเปนหมนในดาวเรอง

2. เพ�อศกษาการเพาะเล�ยงโอวลของดาวเรอง

4

ประโยชนท�คาดวาจะไดรบ

สามารถทราบวธสกดสายพนธแทและสรางสายพนธแทท�เพศผเปนหมนเพ�อประโยชนใน

การปรบปรงพนธและการผลตเมลดพนธลกผสมช�วท�1

การตรวจเอกสาร

ในการสรางสายพนธลกผสมช�วท�1น�นส�งสาคญคอการสรางสายพนธแทท�เปนสายพนธพอ

แมซ�งการสรางสายพนธแทจะใชการผสมตวเองหลายๆช�วซ�งตองใชเวลาและคาใชจายมาก

นอกจากน�ดาวเรองเปนไมดอกท�มชอดอกแบบ Head ประกอบดวยดอก 2 ประเภทคอ Ray floret

และ Disc floret ใน1 ชอดอกน�นจะประกอบดวยดอกยอยจานวน 200-500 ดอกซ�งดอกยอยจะม

ขนาดเลกทาใหการผสมเกสรทาไดยาก จงไดมการพฒนาสายพนธแมท�เกสรเพศผเปนหมนซ�งชวย

ใหงายในการผสมแตจะยากในการพฒนาสายพนธแมท�เกสรเพศผเปนหมน ระบบเกสรเพศผเปน

หมนม3 แบบคอ ระบบเกสรเพศผเปนหมนท�เกดจากยนในนวเคลยส ระบบเกสรเพศผเปนหมนท�

เกดจากยนในไซโตพลาสซม และ ระบบเกสรเพศผเปนหมนท�เกดจากยนในนวเคลยสรวมกบยนใน

ไซโตพลาสซม โดยระบบเกสรเพศผเปนหมนแบบเกสรเพศผเปนหมนท�เกดจากยนในนวเคลยส

รวมกบยนในไซโตพลาสซม จะนยมใชมากท�สดเพราะสะดวกในการใชผลตสายพนธลกผสม

ในการสรางสายพนธแทปจจบนจะนยมใช วธการเพาะเล�ยงอบละอองเกสรแตในการพฒนา

สายพนธแมท�มเกสรเพศผเปนหมนไมสามารถพฒนาโดยการเพาะเล�ยงอบละอองเกสรไดการใชการ

เพาะเล�ยงโอวลจะสามารถแกปญหาน� ได แมวาการเพาะเล�ยงโอวลยงไมนยมแพรหลายเทาการ

เพาะเล�ยงอบละอองเกสรเน�องจากการเพาะเล�ยงโอวลจะยงยากและไดผลนอยกวาการเพาะเล�ยงอบ

ละอองเกสรแตนกวจยจานวนมากกประสพความสาเรจในการเพาะเล�ยงโอวล เชน Tosca และคณะ

(1999) ไดรายงานถงความแตกตางของเยอรบรา 4สายพนธใ นการชกนาใหเกดแคลลสและ

ความสามารถในการชกนาใหเกดยอดจากการเพาะเล�ยงโอวล (ovule) ในทานตะวน Jonard และ

Mazzarobba (1990) ไดรายงานถงความสามรถในการชกนาใหเกดแคลลสและสามารถชกนาใหเกด

ยอดในทานตะวนสายพนธปาแตไมสามารถชกนาใหเกดยอดไดในสายพนธปลก สาหรบการ

เพาะเล�ยงovuleน�นมกทาการเพาะเล�ยงovuleท�โตเตมท�แตไมไดรบการผสม ในเยอรบราToscaและ

5

คณะ (1999) และ Miyoshiและ Asakura, (1996) สามารถชกนาการเกดแคลลสและยอดในการเล�ยง

ovule โตเตมท�แตไมไดรบการผสม Musial และคณะ(2001) รายงานความสาเรจในการเพาะเล�ยง

ovuleของหอมในระยะท�ดอกเจรญมากท�สดแตยงไมบานและสามารถผลตตนหอมท�มโครโมโซม

ลดลงคร� งหน�งได สภาพทางสรรวทยาของพชท�นาเซลหรออวยวะมาทาการเพาะเล�ยง Afele และ

คณะ 1992 กลาววาการขาดธาตอาหารในขณะท�พชไดรบอณหภมท�ต �ากวาอณหภมท�เหมาะสมใน

การเจรญเตบโตจะชวยชกนาใหเกดยอดในการเพาะเล�ยงเซลสบพนธ Puddephat และคณะ (1999)

ประสพความสาเรจในการชกนาใหเกดตนในการเพาะเล�ยงโอวลของหอมโดยนาตนแมไปปลกท�

อณหภม 10-15 ˚C อาหารท�ทาการเพาะเล�ยงองคประกอบของธาตอาหารและฮอรโมนท�ใชในการ

เพาะเล�ยงเซลและอวยวะสบพนธของพชน�นเปนปจจยมผลตอความสาเรจในการชกนาใหเกดยอดใน

การเพาะเล�ยงเซลและเน�อเย�อเหลาน� เปนอยางมาก Muren 1989 สามารถชกนาพชท�มโครโมโซม

ลดลงคร� งหน�งจากการเล�ยงโอวลของหอมบนอาหาร B5 เปนตน

อปกรณและวธการ

อปกรณ

- ดอกดาวเรอง (Marigold) ท�ใชในการทดลอง จานวน 6 ประชากร ไดแก MAR 1,

MAR 2, MAR 3, MAR 4, MAR 5 และ MAR 6

- อปกรณสาหรบปฏบตงานเพาะเล�ยงเน�อเย�อ

- อาหารสาหรบเพาะเล�ยงเน�อเย�อ2 สตรคอ

1. อาหารสตร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA+น� าตาล 30 gl-1

2. อาหารสตร MSท�ประกอบดวย 1 mg/lTDZ+0.1 mg/l NAA+น� าตาล 30 gl-1

- อปกรณท�ใชในศกษาจานวนโครโมโซมของตนดาวเรองไดแก ปลายรากของตน

ดาวเรองท�ตองการนบจานวนโครโมโซม ขวดแกวขนาดเลก สาหรบเกบปลายราก

สไลด(slide) แผนปดสไลด (cover slip) ใบมดผาตดและใบมดโกน จานแกว (petri-

dish) และกลองจลทรรศนชนด compound microscope สารเคม ไดแก 8-Hydroxy-

chinolin (ความเขมเขมขน 0.02 M) กรดอะซตกเขมขน และเอธลแอลกอฮอร 95

6

เปอรเซนต 3:1 กรดไฮโดรคลอรก เขมขน 1 โมล สยอมโครโมโซม ไดแก Aceto-

orcein

วธการดาเนนงาน

ทาการวางแผนทดลองแบบ Factorial in CRD ม 3ปจจย คอ

ปจจยท� 1 สตรอาหารท�ใช ม 2 ระดบ คอ

-MS + 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA + น� าตาล 30 g-1 l

- B5 + 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA + น� าตาล 30 g-1 l

ปจจยท� 2 ระยะการบานของช�นกลบดอก ม 4 ระดบ คอ

- วงท� 1 (นบจากวงนอกสดเปนวงท� 1)

- วงท� 2

- วงท� 3

- วงท� 4

ปจจยท� 3 สายพนธดาวเรอง ม 6 ระดบ คอ

- สายพนธ MAR 1

- สายพนธ MAR 2

- สายพนธ MAR 3

- สายพนธ MAR 4

- สายพนธ MAR 5

- สายพนธ MAR 6

กาหนดการทดลองใหม 48 วธการ (2 x 4 x 6) ในแตละวธการจะมโอวล (ovule) 5 อน ทา

การทดลองท�งหมดจานวน 6 ซ�า

การทดลองท� 1 การชกนาการเกดแคลลสจากโอวล (ovule)

ดอกดาวเรองท�มลกษณะสมบรณเตมท�พรอมท�จะบานในวนถดไปทาความสะอาดช�นสวน

พ�นผวดวยใชน� ายาลาจานนาน 2-3 นาท หนงจากน�นทาการฆาเช�อพ�นผวดวยเอธลแอลกอฮอร 70

เปอรเซน นาน 30 วนาทนาช�นสวนพชแชในโซเดยมไฮโปคลอไรท ท�มความเขมขนของคลอรน 1

เปอรเซนต และใส Tween 20 2-3 หยด นาน10 นาท และทาการลางช�นสวนพชดวยน� ากล�นท�น� งฆา

7

เช�อ 3 คร� ง ๆ ละ 10 นาท ใชมดผาตดผารงไข และนาโอวลออกจากรงไขภายใตกลองจลทรรศน

ชนดสเตอรโอ (stereo microscope) นาโอวลมาเล�ยงบนอาหารโดย วางโอวลใหสมผสกบผวอาหาร

ในหน�งจานแกวจะมโอวล (ovule) 20 อน และนาไปไวท�มด

การบนทกขอมล

1. เปอรเซนตเกดแคลลส

โดยคานวณจาก จานวนช�นสวนท�เกดแคลลส x 100

จานวนช�นสวนท�งหมด

การวเคราะหผลการทดลอง

การวเคราะหขอมลโดยใชโปรแกรมสาเรจรป SAS (Statistical Analysis System) โดยใช

Model Factorial in CRD และแสดงผลในรปของตาราง ANOVA โดยเปรยบเทยบคาเฉล�ยของแตละ

คาสงเกตโดยวธ Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) ท�ระดบความเช�อม�น 95 เปอรเซนต

การทดลองท� 2 ความสามารถในการเกดยอดหลงจากการยายอาหาร

ยายแคลลสจากอาหารแตละสตรลงบนอาหารท�ปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต เม�อ

ทาการยายแคลลสแลวนาไปเพาะเล�ยงในหองเพาะเล�ยง เปนเวลาประมาณ 1 เดอน เพ�อดการเจรญ

และพฒนาของแคลลส

การบนทกขอมล

1.เปอรเซนตเกดยอด ภายหลงจากการยายแคลลสท�ไดจากเพาะเล�ยงโอวลไปยง

อาหารท�ปราศจาสารควบคมการเจรญเตบโต

โดยคานวณจาก จานวนแคลลสท�เกดเปนตน x 100

จานวนช�นสวนแคลลลท�งหมด

8

การทดลองท� 3 ศกษาจานวนโครโมโซมของตนดาวเรอง

ข�นตอนการศกษาจานวนโครโมโซมของตนดาวเรอง โดยการเตรยมปลายราก ตดเฉพาะ

สวนทกาลงเจรญเตบโต โดยสงเกตจากรากท�มสขาวและปลายรากมสขาวขนเลกนอยทาการหยด

การเจรญของเสนใยสปนเดล โดยการแชรากในสารละลาย 8-Hydroxy-chinolin เปนเวลา 1 ช�วโมง

แลวลางปลายรากดวยน� ากล�นเพ�อนาไปหยดการทางานของเซล และรกษาสภาพเซลดวย กรดอะ

ซตกเขมขน และเอธลแอลกอฮอร 95 เปอรเซนต 3:1 แยกเซลโดยการแชปลายรากลงในกรดไฮโดร

คลอรก(HCI) เขมขน 1 N เปนเวลา 10 นาท ท�อณหภม 60 องศาเซยส แลวลางออกดวยน� ากล�นยอมส

เน�อเย�อปลายรากดวยสยอม Aceto-orcein โดยแชนาน 10 นาทปดดวยแผนแกวปดสไลด ใชกระดาษ

ซบบรเวณแผนแกวปดสไลด กดน�วหวแมมอลงไปเพ�อใหเซลกระจาย และเปนการซบสท�มาก

เกนไปออกนาแผนสไลดไปศกษาดภายใตกลองจลทรรศน เลอกเซลท�มการแบงนวเคลยสในระยะเม

ตาเฟส โดยเลอกเซลท�ไมกระจายทบกน นบจานวนโครโมโซมแลว บนทกภาพ

การบนทกขอมล

1.เปอรเซนตการเกดแฮพลอยด

โดยคานวณจาก จานวนท�เปนเกดแฮพลอยด x 100

จานวนตนท�งหมด

9

ภาพท� 1 ลกษณะของดอกดาวเรอง ท�สมบรณเตมท�พรอมท�จะบานในวนถดไป

ภาพท� 2 ลกษณะของดอกยอยของดาวเรองท�อยในดอกแบบฐานรวม (head)

ระยะการบานของดอกยอย (วงท� 1) ระยะการบานของดอกยอย (วงท� 1)

10

ภาพท� 3 ลกษณะขนาดของโอวล (ovule)ในแตละวงของกลบดอก

หมายเหต 1 คอ โอวลจากกลบดอกวงท� 1 (นบจากกลบดอกวงนอกสด)

2 คอ โอวลจากกลบดอกวงท� 2

3 คอ โอวลจากกลบดอกวงท� 3

4 คอ โอวลจากกลบดอกวงท� 4

1 2 3 4

11

ผลการวจย

จากการศกษาการเพาะเล� ยงโอวล (ovule) ของดาวเรอง จานวน 6 สายพนธ บนอาหาร

สงเคราะห 2 สตร คอ อาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ และ0.1 mg/lNAA และอาหาร

สตร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA และ0.1 mg/lNAA โดยนาโอวล (ovule)ของดาวเรองในแตละ

การบานของช�นกลบดอก นามาชกนาใหเกดแคลลสไดผลการทดลองดงน�

การเกดแคลลส

จากการเพาะเล� ยงโอวล (ovule) ของดาวเรองเพ�อทาการศกษาการเกดแคลลส พบวา

กรรมวธการตาง ๆ (Treatment) ตางๆ มความแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต โดยสตรอาหาร

(Medium )มผลตอการทาใหเกดแคลลสมความแตกตางกนอยางมนยสาคญย�งทางสถต สวนช�นของ

กลบดอก(Layer) พบวา วงท� 1 และ2 สามารถชกนาใหกดแคลลสสงสด และสายพนธ (Cultivar)

MAR 1ชกนาใหเกดแคลลสสงสด และพบปฏกรยารวมระหวางสตรอาหารกบสายพนธ (M*C) แต

ไมพบปฏกรยารวมระหวางสตรอาหารกบช�นของกลบดอก (M*L), ช�นของกลบดอกกบสายพนธ

และสตรอาหารกบช�นของกลบดอกกบสายพนธ (M*L*C) (ตารางภาคผนวกท� 1) (ตารางท� 5)

อทธพลของช�นของกลบดอกในการชกนาใหเกดแคลลสจาการเพาะเล�ยงโอวล (ovule) ของ

ดาวเรองพบวา มความแตกตางทางสถตอยางมนยสาคญทางสถต โดย ช�นของกลบดอก วงท� 1 และ

วงท� 2 มเปอรเซนตการเกดแคลลสมากท�สด คอ26.20 และ 26.16 เปอรเซนต รองลงมาคอ วงท� 3 ม

เปอรเซนตการเกดแคลลส คอ 24.86 เปอรเซนต และวงท� 4 มเปอรเซนตการเกดแคลลสต�าท�สดคอ

23.94 เปอรเซนต (ตารางท� 3) (ภาพท� 4)

อทธพลของสายพนธในการชกนาใหเกดแคลลสจาการเพาะเล� ยงโอวล (ovule) ของ

ดาวเรองพบวา มความแตกตางทางสถตอยางมนยสาคญทางสถต โดย สายพนธ MAR 1 ม

เปอรเซนตการเกดแคลลสมากท�สด คอ 28.39 เปอรเซนต รองลงมาคอ สายพนธ MAR 6 ม

เปอรเซนตการเกดแคลลส คอ 26.67 เปอรเซนต และ สายพนธ MAR 4, MAR 5, MAR 3 และ MAR

2 มเปอรเซนตการเกดแคลลสท�ต �า คอ25.09, 24.02, 23.97 และ23.62 ตามลาดบ (ตารางท� 4) (ภาพท�

5)

12

ตารางท� 1 คาเฉล�ยเปอรเซนตการเกดแคลลสของช�นของกลบดอกจาการเพาะเล�ยงโอวล

(ovule)ของดาวเรอง(%)

ช�นของกลบดอก(Layer) การเกดแคลลสของช�นของกลบดอก(%)

วงท� 1 26.20a

วงท� 2 26.16a

วงท� 3 24.86ab

วงท� 4 23.94b

Sig. *

C.V. (%) 7.57

หมายเหต *มความแตกตางทางสถตอยางมนยสาคญท�ระดบความเช�อม�น 95%

คาเฉล�ยท�ใชตวอกษรเหมอนกน ไมมความแตกตางกนทางสถตท�ระดบความ

เช�อม�น 95 % ตามการเปรยบเทยบแบบ Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)

ภาพท� 4 แผนภมแสดงคาเฉล�ยเปอรเซนตการเกดแคลลสของช�นกลบดอก (%)

26.20 26.16

24.86

23.94

22.00

23.00

24.00

25.00

26.00

27.00

วงท� 1 วงท� 2 วงท� 3 วงท� 4

การเกดแคลลสของช�นของกลบดอก(%)

13

ตารางท� 2 คาเฉล�ยเปอรเซนตการเกดแคลลสของดาวเรองสายพนธตางๆ จาการเพาะเล�ยงโอวล

สายพนธ(Cultivar) การเกดแคลลสของสายพนธ (%)

MAR 1 28.39a

MAR 2 23.62b

MAR 3 23.97b

MAR 4 25.09b

MAR 5 24.02b

MAR 6 26.67ab

Sig. *

C.V. (%) 3.02

หมายเหต *มความแตกตางทางสถตอยางมนยสาคญท�ระดบความเช�อม�น 95%

คาเฉล�ยท�ใชตวอกษรเหมอนกน ไมมความแตกตางกนทางสถตท�ระดบความ

เช�อม�น 95 % ตามการเปรยบเทยบแบบ Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)

ภาพท� 5 แผนภมแสดงคาเฉล�ยเปอรเซนตการเกดแคลลสของสายพนธMAR 1, MAR 2,

MAR 3, MAR 4, MAR 5และ MAR 6

MAR1 MAR2 MAR3 MAR4 MAR 5 MAR 6

14

อทธพลของอาหารในการชกนาใหเกดแคลลสเม�อเพาะเล�ยงโอวล (ovule) บนสตรอาหาร

B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA สามารถชกนาใหเกดแคลลสไดสงกวาอาหารสตร

MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA โดยมเปอรเซนตคาเฉล�ยคอ 16.11 และ 11.25

เปอรเซนต ตามลาดบ และในการเพาะเล� ยงโอวล (ovule) ช�นของกลบดอกวงท� 3 ของ สายพนธ

MAR 1 บนอาหารสตร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA พบวาสามารถชกนาใหเกด

แคลลสไดสงท�สด คอ 43.33 เปอรเซนต รองลงมาคอ ช�นของกลบดอกวงท� 2 ในสายพนธMAR 1

บนอาหารสตร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA คอ 36.67 เปอรเซนต สวนช�นของ

กลบดอกวงท� 4 ในสายพนธMAR 3 บนอาหารสตร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA,

ช�นของกลบดอกวงท� 3 ในสายพนธMAR 1 และ ช�นของกลบดอกวงท� 4 ในสายพนธMAR 2 บน

อาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA ไมสามารถชกนาใหเกดแคลลสได

(ตารางท� 5)

15

ตารางท� 3 คาเฉล�ยเปอรเซนตการเกดแคลลสจาการเพาะเล�ยงโอวล สายพนธ และช�นกลบดอกตางๆ

บนอาหารสตร MS+1 mg/l TDZ +0.1 mg/l NAA และ B5+1 mg/l BA +0.1 mg/l NAA

สตรอาหาร

(Medium)

สายพนธ

(Cultivar)

ช�นของกลบดอก (Layer) Mean

-C วงท� 1 วงท� 2 วงท� 3 วงท� 4

MS+1 mg/l TDZ

+0.1 mg/l NAA

MAR 1 20.00bcdef 13.33cdefg 0.00g 6.67efg 10.00

MAR 2 13.33cdefg 16.67bcdefg 6.67efg 0.00g 9.17

MAR 3 13.33cdefg 13.33cdefg 13.33cdefg 6.67efg 11.67

MAR 4 13.33cdefg 10.00defg 16.67bcdefg 20.00bcdefg 15.00

MAR 5 13.33cdefg 6.67efg 3.33fg 10.00defg 8.33

MAR 6 20.00bcdef 13.33cdefg 13.33cdefg 6.67efg 13.33

Mean-L 11.25

B5+1 mg/l BA

+0.1 mg/l NAA

MAR 1 33.33abc 36.67ab 43.33a 30.00abcde 35.83

MAR 2 6.67efg 10.00defg 13.33cdefg 3.33fg 8.33

MAR 3 16.67bcdefg 10.00defg 3.33fg 0.00g 7.50

MAR 4 10.00defg 13.33cdefg 6.67efg 13.33cdefg 10.83

MAR 5 10.00defg 16.67bcdefg 20.00bcdefg 3.33fg 12.50

MAR 6 16.67cdefg 30.00abcd 13.33cdefg 26.67abcde 21.67

Mean-L 16.11

หมายเหต คาเฉล�ยท�ใชตวอกษรเหมอนกน ไมมความแตกตางกนทางสถตท�ระดบความ

เช�อม�น 95 % ตามการเปรยบเทยบแบบ Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)

16

จากตารางท� 5 การเพาะเล�ยงโอวล (ovule) ของดาวเรอง บนสตรอาหาร B5 ท�ประกอบดวย

1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA สามารถชกนาใหเกดแคลลสไดดกวา อาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1

mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAAและในสายพนธ MAR 1 ช�นของกลบดอกวงท� 1, 2, 3 และ4 พบวา

ความสามารถชกนาใหเกดแคลลส บนสตรอาหาร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA

สามารถชกนาใหเกดแคลลสไดดกวา อาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA

ในสายพนธ MAR 2 ช�นของกลบดอกวงท� 1 และ2 พบวา อาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l

TDZ + 0.1 mg/l NAA สามารถชกนาใหเกดแคลลสไดดกวา สตรอาหาร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l

BA + 0.1 mg/l NAA และช�นของกลบดอกวงท� 3 และ4 พบวา สตรอาหาร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l

BA + 0.1 mg/l NAA สามารถชกนาใหเกดแคลลสไดดกวา อาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l

TDZ + 0.1 mg/l NAA ในสายพนธ MAR 3 ช�นของกลบดอกวงท� 2, 3 และ4 พบวา อาหารสตร MS

ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA สามารถชกนาใหเกดแคลลสไดดกวา สตรอาหาร B5

ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA และช�นของกลบดอกวงท� 1 พบวา สตรอาหาร B5 ท�

ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA สามารถชกนาใหเกดแคลลสไดดกวา อาหารสตร MS ท�

ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA ในสายพนธ MAR 4 ช�นของกลบดอกวงท� 1,3 และ4

พบวา อาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA สามารถชกนาใหเกดแคลลสได

ดกวา สตรอาหาร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA และช�นของกลบดอกวงท� 2 พบวา

สตรอาหาร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA สามารถชกนาใหเกดแคลลสไดดกวา

อาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA ในสายพนธ MAR 5 ช�นของกลบดอก

วงท� 1 และ4พบวา อาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA สามารถชกนาให

เกดแคลลสไดดกวา สตรอาหาร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA และช�นของกลบ

ดอกวงท� 2 และ3 พบวา สตรอาหาร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA สามารถชกนา

ใหเกดแคลลสไดดกวา อาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA และในสาย

พนธ MAR 6 ช�นของกลบดอกวงท� 1 พบวา อาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l

NAA สามารถชกนาใหเกดแคลลสไดดกวา สตรอาหาร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l

NAA และช�นของกลบดอกวงท� 2 และ3 พบวา สตรอาหาร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l

NAA สามารถชกนาใหเกดแคลลสไดดกวา อาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l

NAA ช�นของกลบดอกวงท� 3สามารถชกนาใหเกดแคลลสไดเทากนในท�งสองสตร

17

ภาพท� 6 แสดงลกษณะการเกดแคลลสในการเพาะเล�ยงโอวล (ovule) ดาวเรอง

(A) ลกษณะการเกดแคลลสในอาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/ l TDZ + 0.1 mg/ l NAA

เม�อเพาะเล�ยงได 3 สปดาห

(B) ลกษณะการเกดแคลลสในอาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/ l TDZ + 0.1 mg/ l NAA

เม�อเพาะเล�ยงได 4 สปดาห

(C, D) ลกษณะของแคลลสเร�มมการเกดยอดในอาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/ l TDZ +

0.1 mg –l NAA

(E, F) ลกษณะการเกดแคลลสในอาหารอาหาร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/ l BA +0.1 mg/ l NAA

เม�อเพาะเล�ยงได 20 วน

A B

C D

E F

18

การเกดยอดจากแคลลสท�ไดจากการเพาะเล�ยงโอวล (ovule)

จากการศกษาการเกดยอดจากแคลลสท�ไดจากการเพาะเล�ยงโอวล (ovule) ของดาวเรองเม�อ

ยายไปเล�ยงบนอาหารท�ปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต พบวา แคลลสท�ไดจากการเพาะเล�ยง

โอวล (ovule)บนอาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA สามารถเกดยอดได

ดกวาแคลลสท�ไดจากการเล�ยงบนอาหารสตร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA โดย

พบวา ช�นของกลบดอก วงท�1, 2 และ 3 มเปอรเซนการเกดยอดต�งแต 20 -100 เปอรเซนตบนอาหาร

สตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA ซ�งมเปอรเซนตท�สงกวา แคลลสท�ไดจากการ

เพาะเล�ยงโอวล (ovule)บนอาหารสตร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA (ภาพท� 7) เม�อ

ทาการยายแคลลสท�ไดจากการเพาะเล� ยงโอวล (ovule) ของดาวเรองบนอาหารสตร MS ท�

ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA ไปเพาะเล�ยงในอาหารท�ปราศจากสารควบคมการ

เจรญเตบโต พบวา แคลลสสามารถพฒนาไปเปนยอดได และหลงจากการเพาะเล�ยงได 4 สปดาห

สามารถพฒนาไดท�งยอดและราก (ภาพท� 8 (B-D)) สวนแคลลสท�ไดจากการเพาะเล�ยงโอวล (ovule)

ของดาวเรองบนอาหารสตร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAAหลงจากการเพาะเล�ยงได

4 สปดาห พบวา แคลลสมการเกดยอดไมด และแคลลสสวนใหญมการพฒนาไปเปนราก(ภาพท� 8

(E, F))

19

ภาพท� 7 แผนภมแสดงเปอรเซนตความสามารถในการเกดยอดของแคลลสท�ไดจากการเพาะเล�ยง

โอวล

100.00 100.00 100.00

50.00 50.00

33.00 20.00 16.67

MAR 1 MAR 2 MAR 3 MAR 4 MAR 5 MAR 6

20

ภาพท� 8 แสดงลกษณะการเกดยอดของแคลลสท�ไดจากการเพาะเล�ยงโอวล

(A) ลกษณะของแคลลสบนอาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l

NAA ท�พรอมทาการยายไปยงอาหารใหมท�ปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต

(B-D) ลกษณะการเกดยอดของแคลลสบนอาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ +

0.1 mg/l NAA gเม�อยายไปยงอาหารใหมท�ปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต

(E, F) ลกษณะการเกดรากของแคลลสบนอาหารสตร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1

mg/l NAA เม�อยายไปยงอาหารใหมท�ปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต

หมายเหต

ลกศรสแดง คอ ลกษณะการเกดยอด

ลกศรสเหลอง คอ ลกษณะการเกดราก

A B

C D

E F

21

การตรวจสอบจานวนโครโมโซม

จากการตรวจสอบจานวนโครโมโซมของตนดาวเรองท�ไดจากการเพาะเล�ยงโอวล (ovule)

พบวา จานวนโครโมโซมของดาวเรองลดลง จากดาวเรองเรองปกต(ดพลอยด) จะมจ านวน

โครโมโซมเทากบ 2n =24 โดยโครโมโซมของดาวเรองท�ไดจากการเพาะเล� ยงโอวล (ovule) ม

โครโมโซมเทากบ 2n =12 ซ�งเปน แฮพลอยด (ภาพท� 9 (E, F))และตนดาวเรองท�ไดจากการ

เพาะเล�ยงโอวล (ovule) มเปอรเซนตความสามรถในการเกดตนแฮพลอดย เทากบ 72.72 เปอรเซนต

และเม�อนาตนดาวเรองท�ไดจากการเพาะเล�ยงโอวล (ovule) ออกปลก พบวา ดาวเรองตนท�มจานวน

โครโมโซมเทากบ 2n =24 (ดพลอยด) สามารถเจรญเตบโตไดปกต สวนดาวเรองตนท�มจานวน

โครโมโซมเทากบ 2n =12 (แฮพลอยด) มการเจรญเตบโตคอนขางชา ตนมลกษณะเต�ย และดอกเลก

เม�อเปรยบเทยบกบดาวเรองตนปกต (ภาพท� 9 (A-D))

22

ภาพท� 9 ลกษณะของตน ดอก และจานวนโครโมโซมของดาวเรองท�เปนดพลอยด และแฮพลอยด

(A) ลกษณะของตนดาวเรอง ท�มจานวนโครโมโซมเทากบ 2n =24

(B) ลกษณะของตนดาวเรอง ท�มจานวนโครโมโซมเทากบ 2n =12

(C) ลกษณะของดอกดาวเรอง ท�มจานวนโครโมโซมเทากบ 2n =24

(D) ลกษณะของดอกดาวเรอง)ท�มจานวนโครโมโซมเทากบ 2n =12

(E) จานวนโครโมโซมดาวเรอง (ดพลอยด) 2n =24

(F) จานวนโครโมโซมดาวเรอง (แฮพลอยด) 2n =12

A B

C D

E F

23

วจารณผลการวจย

อทธพลของสตรอาหารตอการเพาะเล� ยงโอวล (ovule) ดาวเรองจากการเพาะเล�ยงโอวล

(ovule) ของดาวเรองบนอาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA และอาหาร

สตร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA เม�อพจารณาคาเฉล�ยของเปอรเซนตการเกด

แคลลสพบวาอาหารสตร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA และอาหารสตร MS ท�

ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA มเปอรเซนตการเกดแคลลสท�แตกตางกน และเม�อทา

การยายแคลลสไปยงอาหารท�ปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโตพบวา แคลลสท�จากการ

เพาะเล�ยงโอวล (ovule) บนอาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA สามารถ

พฒนาไปเปนตนไดดกวา แคลลสท�จากการเพาะเล� ยงโอวล (ovule) บนอาหารสตร B5 ท�

ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA

อทธพลของช�นของกลบดอกในการชกนาใหเกดแคลลสจาการเพาะเล�ยงโอวล (ovule) ของ

ดาวเรองพบวา ช�นของกลบดอกวงท� 1 และ2 มเปอรเซนตการเกดแคลลสมากกวา ช�นของกลบดอก

วงท� 3และ 4 แสดงวาดอกท�มอายมากกวาจะพฒนาไปเปนไดดกวาเชนเดยวกบ ทดลองของ Bhat

andMurthy (2007) ทาการเพาะเล�ยงโอวลท�ยงไมผานการปฏสนธ ของniger (Guizotia abyssinica

(L. f.) โดยการเกบโอวล (ovule) ท�จะมการบานของดอกต�งแต 0, 1 และ 2 วน มาเพาะเล�ยงบนอาหาร

สงเคราะหพบวา ดอกท�มอาย 0วนคอดอกท�จะบานในวดถดไปมเปอรเซนตเกดแคคลสมากท�สด

อทธพลของสายพนธในการชกนาใหเกดแคลลสจาการเพาะเล� ยงโอวล (ovule) ของ

ดาวเรองพบวา สายพนธ MAR 1 มเปอรเซนตการเกดแคลลสมาก รองลงมาคอ สายพนธ MAR 6 ม

และ สายพนธ MAR 4, MAR 5, MAR 3 และ MAR 2 มเปอรเซนตการเกดแคลลสท�ต �า

การตรวจสอบจานวนโครโมโซม จากการตรวจสอบจานวนโครโมโซมของตนดาวเรองท�

ไดจากการเพาะเล�ยงโอวล (ovule) พบวา จานวนโครโมโซมของดาวเรองลดลง จากดาวเรองเรอง

ปกต (ดพลอยด)จะมจานวนโครโมโซมเทากบ 2n =24 โดยโครโมโซมของดาวเรองท�ไดจากการ

เพาะเล�ยงโอวล (ovule) มโครโมโซมเทากบ 2n =12 ซ� ง Bhat andMurthy (2007) กลาววาการ

เพาะเล�ยงโอวลท�ยงไมผานการปฏสนธ ของniger (Guizotia abyssinica (L. f.) สามารถสรางพช

แฮพลอยดไดโดยมจานวนโครโมโซมลดลงคร� งหน�ง

ซ�งในการศกษาคร� งน� พบวาต�นท�ไดจากการเพาะเล�ยง โอวลสามารถสรางตนดาวเรองแฮ

พลอยดไดและเม�อนาตนดาวเรองดงกลาวมาเพ�มจานวนโครโมโซมโดยการใหสารโคลชซนพบวา

สามารถสรางตนสายพนธแทของดาวเรองและบางตนแสดงลกษณะเพศผเปนหมนได

24

ภาพท� 10 ลกษณะของดอกดาวเรองสายพนธแทท�มเกสรเพศผเปนหมนไดจากการเพาะเล�ยงโอวล

และทาการเพ�มโครโมโซมดวยสารโคลชซน

สรปผลการวจย

การเพาะเล�ยงโอวล (ovule) ดาวเรอง ของดาวเรองบนอาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1

mg/l TDZ + 0.1 mg/lNAA และอาหารสตร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA พบวา

อาหารสตร B5 ท�ประกอบดวย 1 mg/l BA + 0.1 mg/l NAA สามารถชกนาใหเกดแคลลสไดดกวา

อาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA แตไมสามารถพฒนาเปนยอดได สวน

แคลลสท�ไดจากการเพาะเล�ยงโอวลดาวเรองบนอาหารสตร MS ท�ประกอบดวย 1 mg/l TDZ + 0.1

mg/lNAA สามารถพฒนาเปนตนไดหลงจากยายลงสอาหารท�ปราศจากสารควบคมการเจรญเตบโต

เม�อนาตนท�ไดจากการเพาะเล�ยงโอวลมาทาการนบจานวนโครโมโซมพบวา ตนท�ไดมโครโมโซม

เปนแฮพลอยดถง 72.72 เปอรเซนต

25

เอกสารอางองของโครงการวจย

Afele J.C., L.W. Kannenberg, R. Keats, S. Sohota, and E. B. Swanson, 1992. Increased

induction of microspore embryos following manipulation of donor plant environment

and culture temperature in corn (Zea mays L.). Plant Cell Tissue and Organ Culture.

28: 87-90.

Bhat, J.G. and H.N. Murthy. 2007. Haploid Plant Regeneration from Unpollinated Ovule

Cultures of Niger (Guizotia abyssinica (L.f.) Cass.). Plant Physiology. 55: 241-245

Jonard R. and A. Mazzarobba, 1990. In Bajaj Y.P.S. Biotechnology in Agriculture and

Forestry 10, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, pp. 485-501.

Miyoshi K. and N. Asakura, 1996. Callus induction, regenration of haploid plants and

chromosome doubling in ovule cultures of pot gerbera (Gerbera jamesonii), Plant Cell

Report 16: 1-5.

Muren R.C. 1989. Haploid plant induction from unpollinated ovaries in onion. Hortscience:

24(5) 833-834.

Musial K., B. Bohanec and L. Prywara, 2001. Embryological study on gynogenesis in onion

(Allium cepa L.) Sex Plant Reproduction 13:335-341.

Puddephat I.J., H.T. Robinson, B.M. Smith and J. Lynm, 1999. Influence of stock plant

pretreatment on gynogenic embryo induction from flower buds of onion. Plant Cell,

Tissue and Organ Culture 57: 145-148.

Tosca A. L. Arcara and P. Frangi, 1999. Effect of genotype and season on gynogenesis

efficiency in Gerbera. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 59:77-80.