Иванова Анна Пустоварова Мария

Научные руководители:

д.б.н. В.В.Алёшин К.В.Михайлов Москва, 2011

Московская гимназия на Юго-Западе №1543 Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Лаборатория геносистематики

Введение

• На сегодняшний день систематику эукариот нельзя считать сложившейся.

• Наиболее распространена классификация Кавалье-Смита, согласно которой все эукариоты делятся на одножгутиковых и двужгутиковых.

• Изучаемый нами объект принадлежит кладе Heterokonta (разножгутиковые) (рис.1)

Рисунок 1. Филогенетическое положение клады Heterokonta.

Введение

•Объект нашего изучения- представитель ещё не описанного вида.

• Его наиболее близкий родственник- Developayella elegans (см рис.)

• D. elegans- одноклеточный организм, питающийся бактериями и передвигающийся с помощью одного из своих жгутиков. (рис.2)

• Возможно, D. Elegans - близкий родственник оомицетов. Рисунок 2. Developayella elegans

Цель работы

Целью нашей работы было более точное определение филогенетического положения Colp-4a.

Для этого необходимо было определить нуклеотидную последовательность некоторых генов и сравнить их с соответствующими генами других гетероконт.

В нашей работе проанализированы последовательности 18S и 28S рРНК нашего объекта.

Несколько генов берутся для более достоверного определения филогенетического положения.

Материалы и методыДля получения необходимого участка ДНК в ходе нашей

работыбыли использованы следующие методы молекулярной

биологии:

Выделение из организма тотальной ДНК

Амплификация нужного фрагмента методом ПЦР

Электрофорез для выявления результатов ПЦР

Отделение требуемых фрагментов ДНК от побочных продуктов ПЦР

Молекулярное клонирование

Выделение плазмид, содержащих разные типы вставок

Секвенирование

Материалы и методы

Выделение культуры Colp-4aДанная культура была выделена из морского осадка,

привезённого сКрасного моря.

Выделение геномной ДНКДля изучения данного объекта было необходимо выделить его

ДНК.Этапы выделения ДНК:

1. Лизис клеток и денатурация белков2. Удаление мембран и клеточных органелл3. Экстрагирование ДНК из раствора

Материалы и методыПЦР (полимеразная цепная реакция)Данный метод позволяет многократно увеличить число

определённыхфрагментов ДНК в пробе.

Необходимые компоненты реакции:

1. ДНК-матрица2. Прямые и обратные праймеры3. ДНК-полимераза4. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dNTP)5. Буферный раствор

Ход реакции:

1. Денатурация (цепи ДНК расходятся)2. Отжиг (связывание праймеров с одноцепочечной ДНК)3. Элонгация (репликация матричной цепи ДНК-полимеразой)

Материалы и методы

Гель-электрофорез

Данный метод демонстрирует концентрацию молекул ДНК в анализируемом

образце, а также их длины.

Элюция ДНК

Данный метод используется для выделения нужной ДНК из полоски геля.

Ход реакции:1. Растапливание полоски геля и помещение её в пробирку с фильтром2. Осаждение ДНК на фильтре, удаление остальных веществ из раствора3. Отсоединение ДНК от фильтра

Материалы и методы

Молекулярное клонированиеМы использовали данный метод для выявления и разделения

разных типовфрагментов ДНК одинаковой длины, полученных в ходе ПЦР и

последующей элюции.

Ход работы:1.Выделение нужного фрагмента ДНК

2. Встраивание нужного гена в вектор (плазмиду, которая разрезается рестриктазой, а к липким концам присоединяется нужная нам последовательность) (рис.3)

Рисунок 3. Плазмидный вектор

Материалы и методы

Материалы и методы

3. Трансформация (введение плазмидного вектора в бактериальную клетку)

4. Отбор клеток, в которые вошла чужеродная ДНК (не все бактерии трансформируются; не все плазмиды несут вставку). Используются плазмиды, обладающие двумя свойствами:

Устойчивость к ампициллину, который содержится в среде (рис.3)

Вставка инактивирует ген фермента LacZ в плазмиде => колонии не окрашиваются в синий цвет.

5. Анализ колоний (случайный выбор колоний и амплификация их плазмид) (рис.4)

Рисунок 4. Анализ колоний (на рисунке – амплифицированные вставки).

Материалы и методы

6. Рестрикция вставок (различаются ли вставки по нуклеотидной последовательности?)

(рис.5)

Рисунок 5. Пример рестрикции . Стрелочками отмечены разные типы вставок.

Молекулярное клонирование

Материалы и методы Выделение плазмидВыделение плазмид, несущих интересующую нас вставку, и

ихсеквенирование для определения нужной вставки.

Построение филогенетического дерева

Сравнение полученной нами последовательности с ужесеквенированными генами других гетероконт для создания выравнивания. На основе выравниваний генов 18S и 28S

рРНК были построеныфилогенетические деревья.

РезультатыВ ходе работы нами были выделены и секвенированы гены 18S и

28S рРНК

Были составлены три выравнивания (первое содержало лишь 18S рРНК, второе – 28S рРНК, третье - и то, и другое)

На основе каждого из них построены деревья

Подтвердилось, что ближайшим родственником Colp-4a является Developayella elegans.

Филогенетическое дерево 18S рРНК демонстрирует родство D. elegans и оомицетов. Но, судя по дереву, построенному на основе выравнивания 28S рРНК, ни D.elegans, ни Colp-4a не входят в состав Pseudofungi.

(Pseudofungi = оомицеты + близкие к ним виды)

Результаты

ВНЕШНЯЯ ГРУППА

Сolp-4a + D. elegans

ООМИЦЕТЫ

АВТОТРОФНЫЕHETEROKONTA

А) Дерево на основе выравнивания гена 18S рРНК

Результаты

ВНЕШНЯЯ ГРУППА

Сolp-4a + D. elegans

ООМИЦЕТЫ

АВТОТРОФНЫЕHETEROKONTA

Б) Дерево на основе выравнивания гена 28S рРНК

Обсуждение

Подтверждено родство Colp-4a и Developayella elegans. Следовательно, их признаки должны быть схожими.

Однако длина ветвей после их общего узла показывает, что уже должны были появиться различия между этими организмами.

Принадлежность таксона, содержащего D. Elegans, к Pseudofungi требует

дополнительной проверки.

Определение филогении Colp-4a и Developayella elegans позволит уточнить признаки, характерные для группы Pseudofungi.

Выводы За время работы мы освоили многие методы

молекулярной биологии.

Были выделены и секвенированы гены 18S и 28S рРНК простейшего Colp-4a.

Оба филогенетических дерева, построенных на основе полученных последовательностей, показывают, что Colp-4a и Developayella elegans - близкородственные виды.

Филогенетическое дерево по гену 18S рРНК даёт высокую поддержку монофилии группы Pseudofungi, в то время как в дереве по гену 28S рРНК Colp-4a и Developayella elegans не входят в их состав.

Благодарности

Мы благодарим:

Сергея Менделевича Глаголева за организацию практики.

Сотрудников отдела эволюционной биохимии НИИ имени А.Н.Белозерского, которые руководили нашей работой и помогали нам её выполнять.

Вахрушеву Ольгу рецензирование нашей работы.

Спасибо за внимание!

Q5 d6

r71

28d528d1

28r2 28r1228r7Q39 28r3

Карта ДНК в районе 18S и 28S рРНК. Фрагменты слева направо: 18S рРНК, 5S рРНК, 28S рРНК. Стрелочками обозначены различные праймеры к данным генам; сверху прямые, внизу обратные.

d71

18S 28s

Используемые праймерыГен Пра

й-мер

Ориен-тация

Последовательность

Диапазон устойчивости (Тпл)

18s Q51 прямой GTATCTTGTTGATCCTGCCAGTAG

63-64 °C

18s Q39 обратный

GAATGATCCWTCYGCAGGTTCACCTAC

65-68 °C

28s 28s d1

прямой GACCCGCTGAAYTTAAGCATAT 60-63 °C

28s 28s d5

прямой TCCGCTAAGGAGTGTGTAACAAC

63-64 °C

28s 28s r7

обратный

AGCCAATCCTTWTCCCGAAGTTAC

63-65 °C

28s 28s r12

обратный

TTCTGACTTAGAGGCGTTCAG 60-62 °C

28s 28s r13

обратный

MRGGCTKAATCTCARYRGATCG 57-68 °C

Bicosoecida

Labyrinthulida

Pseudofungi

Oomycetes

Bacillariophyta

Dictyochophyceae

Pelagophyceae

Pinguiophyceae

Eustigmatophyceae

Raphidophyceae

Phaeothamniophyceae

Xanthophyceae

Phaeophyceae

Chrysophyceae

Laminaria angustata@AB022818.1 Ectocarpus siliculosus@AY307398.1

Fucus distichus@AB011423.1 Phaeothamnion confervicola@AF044846.1

Tribonema intermixtum@AF083397.1 Chlorellidium tetrabotrys@FJ030892.1

Vacuolaria virescens@U41651.1 Chattonella marina@AB217626.1

Heterosigma akashiwo@DQ191681.1 Nannochloropsis gaditana@AF067957.1 Nannochloropsis salina@AF045048.1 Ochromonas distigma@EF165136.1

Synura sphagnicola@U73221.1 Mallomonas tonsurata@FJ030893.1

Pinguiococcus pyrenoidosus@AF438324.1 Glossomastix chrysoplasta@AF438325.1

Phaeodactylum tricornutum@EF140622.1 Skeletonema pseudocostatum@AJ632209.1

Rhizosolenia setigera@M87329.1 Pseudochattonella farcimen@AM075624.1

Dictyocha speculum@U14385.1 Pseudopedinella elastica@U14387.1

Pelagococcus subviridis@U14386.1 Pelagomonas calceolata@U14389.1

Aureococcus anophagefferens@U40257.1 Hyphochytrium catenoides@AF163294.1

Developayella elegans@U37107.1 Colp-4a

Achlya bisexualis@M32705.1 Phytophthora infestans@AY742761.1

Pythium helicoides@EF418925.1 Japonochytrium sp@AB022104.1

Thraustochytrium aureum@AB022110.1 Blastocystis hominis@AB023499.1

Caecitellus parvulus@AY642126.1 Nerada mexicana@AY520453.1

Pfiesteria piscicida@AF077055.1 Akashiwo sanguinea@AY831412.1

Theileria parva@AF013418.1 Frenkelia microti@AF009244.1

Thaumatomonas seravini@AF411259.1 Chlorarachnion CCMP621@AF054832.1

Guillardia theta@X57162.1 Cryptomonas platyuris@AF508271.1

Pavlova pinguis@AF102373.1 Isochrysis galbana@AJ246266.1 Prymnesium sp@AB183612.1

100

100

100

100

100

100 100

100

83

66

100

100 100

76

86

31 100

96

82 100

54

88

87

100

97 100

42

24

100

88 99

89 100

89 100

36

2

4

73

92

99

72 71

83

0.02

Рисунок 6. Филогенетическое дерево на основе последовательностей 18S рРНК

0.05

Theileria parva@AF013419.1

Isochrysis galbana@contig Prymnesium patelliferum@AF289038.1

Pseudochattonella farcimen@FJ030886.1 Dictyocha speculum@AF289046.1

Apedinella radians@AF289045.1 Aureococcus anophagefferens@AF289042.1

Pelagococcus subviridis@FJ030889.1 Pelagomonas calceolata@AF289047.1

Pinguiococcus pyrenoidosa@AF409130.1 Glossomastix chrysoplastos@AF409128.1

Nannochloropsis salina@Y07975.1 Nannochloropsis gaditana@FJ030880.1

Mallomonas tonsurata@FJ030885.1 Synura sphagnicola@DQ980475.1

Ochromonas danica@Y07977.1 Chlorellidium tetrabotrys@FJ030881.1

Tribonema aequale@Y07979.1 Phaeobotrys solitaria@FJ030890.1

Fucus vesiculosus@AF331151.1 Laminaria digitata@AF331153.1

Streblonema maculans@AF331155.1 Skeletonema pseudocostatum@Y11512.1

Phaeodactylum tricornutum@contig Rhizosolenia setigera@AF289048.1

Vacuolaria virescens@AF409125.1 Heterosigma akashiwo@AF409124.1

Chattonella antiqua@FJ030891.1 Colp-4a

Developayella elegans@FJ030882.1 Hyphochytrium catenoides@X80345.1

Achlya@contig Phytophthora megasperma@X75631.1 Pythium@contig

Japonochytrium sp@FJ030887.1 Thraustochytrium aureum@FJ030888.1

Caecitellus parvulus@FJ030883.1 Nerada mexicana@FJ030884.1

Pfiesteria piscicida@AY112746.1 Akashiwo sanguinea@AY831412.1

Frenkelia microti@AF044252.1 Thaumatomonas sp@DQ980477.1

Chlorarachnion CCMP621@AF289036.1 Guillardia theta@AF289037.1

Cryptomonas paramecium@AY752990.1 Pavlova@contig

98

61 100

78 100

100 100

99

100

100 40

19

45 100

91 100

98

87 100

9

44

70

79 100

96

75

100 100

18 16

74

100

100 100

96

100

100 100

100

67

100

99

28

100

/ / Blastocystis hominis@contig

Phaeothamniophyceae

Xanthophyceae

Eustigmatophyceae

Chrysophyceae

Pinguiophyceae

Dictyochophyceae

Pelagophyceae

Oomycetes

Bicosoecida

Raphidophyceae

Bacillariophyta

Phaeophyceae

Labyrinthulida

Рисунок 7. Филогенетическое дерево на основе последовательностей 28S рРНК

Pseudochattonella farcimen Dictyocha speculum

Pedinellales Aureococcus anophagefferens

Pelagococcus subviridis Pelagomonas calceolata

Pinguiococcus pyrenoidosa Glossomastix chrysoplastos

Nannochloropsis salina Nannochloropsis gaditana

Chattonella Heterosigma akashiwo

Vacuolaria virescens Laminaria

Ectocarpales Fucus

Phaeothamniales Chlorellidium tetrabotrys

Tribonema Ochromonas

Synura sphagnicola Mallomonas tonsurata

Rhizosolenia setigera Phaeodactylum tricornutum

Skeletonema pseudocostatum Developayella elegans

Colp-4a Hyphochytrium catenoides

Achlya Phytophthora Pythium

Blastocystis hominis Caecitellus parvulus

Nerada mexicana Thraustochytrium aureum

Japonochytrium sp Pfiesteria piscicida

Akashiwo sanguinea Theileria parva

Frenkelia microti Thaumatomonas

Chlorarachnion CCMP621 Guillardia theta

Cryptomonas Pavlova

Isochrysis galbana Prymnesium

100

100

100 100

100

100

100

100

100

59

100

100

26

51

100

90 100

98 100

100

100 100

92 100

99

100

47

32

83 100

96 100

94 100

100

85

30

90

98

51

93

87 100

100

0.02

Dictyochophyceae

Pelagophyceae

Pinguiophyceae

Eustigmatophyceae

Raphidophyceae

Phaeophyceae

Phaeothamniophyceae

Xanthophyceae

Chrysophyceae

Bacillariophyta

Oomycetes

Bicosoecida

Labyrinthulida

/ /

Рисунок 8. Филогенетическое дерево на основе выравнивания, содержащего гены 18S и 28S рРНК.

Литература

[1] Ingvild Riisberga, Russell J.S. Orrb, Ragnhild Klugeb, Kamran Shalchian-Tabrizid,Holly A. Bowerse, Vishwanath Patilb, Bente Edvardsena and Kjetill S. Jakobsen. Seven

Gene Phylogeny of Heterokonts. // Protist, Vol.160, 191—204, May 2009.

[2] Mayumi Moriya, Takeshi Nakayama, Isao Inouye. Ultrastructure and 18S rDNA Sequence Analysis of Wobblia lunata gen. et sp. nov., a New Heterotrophic Flagellate (Stramenopiles, Incertae Sedis). // Protist, Vol. 151, 41–55, May 2000.

 [3] Neil A. Campbell, Jane B. Reece. Biology - 8th ed. Pearson Benjamin Cummings, San

Francisco, 2008.  [4] Cavalier-Smith T. Only six kingdoms of life. Proc R Soc Lond B. 2004;271:1251–

1262 [5] Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. Молекулярное клонирование. // Москва,

изд. Мир, 1984. [6] Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и

применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с. [7] Encyclopedia of life. Description of Developayella elegans. Режим доступа:http://www.eol.org/pages/2912228