第二章 酶反应的基本原理第二章 酶反应的基本原理

提要：提要： 一、酶的组成及其结构特点 二、酶的催化作用机理 三、酶的类型及命名 四、影响酶催化反应的因素

1. 酶的概念 酶： 生活细胞产生的具有特殊空间构像的 , 能进行生物催化作用的生物大分子，包括蛋白质和核酸两类物质，其中以蛋白质为主。

一、酶基本知识一、酶基本知识

（ 1 ）酶与一般催化剂的共性 用量少，催化效率高 不改变反应平衡点 可降低反应活化能 （ 2 ）酶的特性 高效性：以酶的转换数 Kcat表示， mol底物 /mol酶 .min

酶的 Kcat为 103-107 mol底物 /mol酶 .min，比非酶催化效率高 107-1013 倍。

专一性：结构专一性（相对专一性 /绝对专一性）

立体异构专一性 (几何异构 /旋光异构 )

温和性（不稳定性）：酶催化需要的活化能低，生物大分子，结构稳固性差。

可调控性：底物浓度、温度、 pH、抑制剂和激活剂等。

酶促反应活化能的改变

活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。

酶促反应活化能

一般催化剂催化反应活化能

能

量

反 应 过 程

反应总能量改变

非催化反应活化能

底物

产物

活化态

酶的催化机理也是降低反应的活化能、是更大幅度地降低。

酶的催化效率通常比非催化反应高108～1020倍，比一般催化剂高107～1013倍。

酶的催化不需要较高的反应温度。

2 、酶的聚集方式 2 、酶的聚集方式 （ 1）松散排列 酶在细胞中各自以可溶的单体形式存在，彼此没有

结构上的联系。 反应时酶是随机扩散，催化效率不高。（如糖酵解

历程）

酶 1

酶 2酶 3

酶 4酶 5

（ 2）簇式排列 几种酶有机地聚集在一起，镶嵌成一定的结构，形成多酶复合体。催化效率高。

（如丙酮酸脱氢酶复合体、脂肪酸合成酶、纤维素酶复合体）

Cx 酶

C 酶

C1 酶

C 酶

C0 酶

C 酶

（ 3）与生物膜结合 一种结构更高的多酶复合体，酶整齐的排列在生物膜上。催化效率最高。（如呼吸链）

酶 1

酶 2

酶 4

酶 5

酶 3

单成份酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸

酶等。（简单蛋白质）

双成份酶（结合蛋白质）

酶蛋白

辅因子

（ apoenzyme）

（ cofacter)

辅酶（ coenzyme)辅基 (prosthetic group)

酶

3 、酶的组成

　　一级结构　　二级结构 　 三级结构 　 　四级结构

4 、酶的结构层次

维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键 维系蛋白质分子的二级结构：氢键 维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、

盐键 维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键

a 盐键（离子键） b 氢键 c 疏水相互作用力 d 范德华力 e 二硫键 f 酯键

维持蛋白质结构的作用力

氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键 氢键、范德华力虽然键能小，但数量大 疏水相互作用力对维持三级结构特别重要 盐键数量小 二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定

离子键 氢键 范德华力 疏水相互作用力

键作用力性能

5 、酶的活性基团及活性中心5 、酶的活性基团及活性中心

活性中心：结合部位和催化部位多肽链

结合基团

底物分子

催化基团

酶活性中心

活性中心内的必需基团+_

活性中心外的必需基团

酶活性中心示意图

结合部位 : 决定酶的专一性催化部位 : 决定酶所催化反应的性质。

必需基团(essential group)：

结合基团(binding group)：与底物相结合的基团催化基团(catalytic group)：催化底物转变成产物的基团

酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的基团。

酶的活性中心(active center)/活性部位(active site）：必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。

活性中心内的必需基团：

活性中心外的必需基团：位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。

酶活性中心示意图酶活性中心示意图

部分酶活性中心的氨基酸残基部分酶活性中心的氨基酸残基 酶 残基总数 活性中心

残基

牛胰核糖核酸酶 124 His12, His119, Lys41

溶菌酶 129 Asp52, Glu35

牛胰凝乳蛋白酶 245 His57, Asp102,Ser195

牛胰蛋白酶 238 His46, Asp90, Ser183

木瓜蛋白酶 212 Cys25, His159

弹性蛋白酶 240 His45, Asp93, Ser188

枯草杆菌蛋白酶 275 His46, Ser221

碳酸酐酶 258 His93-Zn-His95

His117

二、酶的催化作用机理 二、酶的催化作用机理1 、中间产物学说

E + S ES E +P

中间产物存在的证据：(1) 同位素 32P 标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）；(2) 吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。

S

Ea

ca b cE

S

E-S 复合物

b

2 、诱导契合假说（ induced-fit hypothesis ）

酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。

酶

AB

3 、趋近效应与定向作用（ proximity effect & orientation arrange ）

　底物和酶的活性中心结合在一有限区域内互相接近，趋近效应使底物在活性中心的局部浓度提高数干至数万倍，大大增加底物互相碰撞的机会。

定向即底物和酶的活性中心结合时，可诱导酶蛋白的构象变化，使底物和酶的活性中心更好地互补，并使底物有正确的定向。这样，底物的反应基团更趋近酶的催化基团。这又进一步使反应速度提高几个数量级。

4 、底物分子的形变与扭曲张力学说（ strain ）4 、底物分子的形变与扭曲张力学说（ strain ）

（ 1 ）酶受底物诱导发生构象改变，特别是活性中心的功能基团发生的位移或改向，呈现一种高活性功能状态。（ 2 ）酶活性中心的某些基团或金属离子可改变底物敏感健的电子云分布，产生“电子张力”而易于断裂，也可使底物的构象改变，接近过渡态　　而易于反应，这就是张力（）学说。　　羧肽酶 A 和溶菌酶的 X 线衍射分析证明了张力效应是酶催化的机制之一。

5 、多元催化 (multielement catalysis)5 、多元催化 (multielement catalysis)

多元催化：多个基元催化形式的协同作用。一般包括酸 - 碱催化，共价催化（亲核催化 , 亲电子催化）等。如凝乳蛋白酶： Ser-195亲核催化， His-57碱催化等；

酸 - 碱催化：通过暂时提供（或接受）一个质子以稳定过渡态达到催化反应的目的；

广义酸基团 广义碱基团 pKa （质子供体） （质子受体）

COOH COO

NH3+ NH2

..

NHNH2

NH2

+NH

NH

NH2

..

SH SH

O

-

OH

NH NH+ NH N

3.96(Asp),4.32(Glu)

10.80

12.48

8.33

10.11

6.00

酶活性中心广义酸碱基团

O

O

CH2OH

CH2OH

R2

OHO

R2

R1O

Glu35

(CH2)2

COO

CO2

CH2

Asp52

-

O

O

CH2OH

CH2OH

R2

OHO

R2

R1O

Glu35

(CH2)2

COO

CO2

CH2

Asp52

-

O

O

CH2OH

CH2OH

R2

OHO

R2

R1

Glu35

(CH2)2

COO

CO2

CH2

Asp52

-

-

H

HO

-H

溶菌酶酸、碱催化反应示意图

•共价催化（亲核催化 , 亲电子催化）：通过催化剂与底物的共价键结合，形成过渡态来加速反应。共价催化具有亲核、亲电过程。 亲核催化：分别带有多电子的原子如 O 、 S 和 N ，可以提供电子去攻击底物上相对带正电子的原子（如羰基碳），即所谓的亲核攻击。 亲电催化：是由亲电试剂 ( 具有接受电子对的原子 ) 引起的催化反应 , 是亲核催化的反过程．

酶促反应曲线

产产

物物

0 0 时 间时 间

初速度

酶促反应速度逐渐降低

三、酶促反应动力学

影响酶促反应速度的因素影响酶促反应速度的因素

底物浓度 [S] 酶浓度 [E] 反应温度 pH 值 抑制剂 激活剂

1 、底物浓度对酶促反应速度的影响

v

Vm

0.3

0.2Vm 2

0.1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 [S]

[S]与 v 关系：当 [S]很低时， [S]与 v 成比例 -- 一级反应当 [S]较高时， [S]与 v 不成比例当 [S]很高时， [S]， v 不变 --零级反应

底物浓度对酶促反应速度的影响

（ 1 ）米氏方程（ Michaelis-Menten equation ）（ 1 ）米氏方程（ Michaelis-Menten equation ）

V=Vmax [S]

Km + [S]

米氏方程解释： 当 [S]Km 时， v=(Vmax/Km) [S], 即 v 正比于 [S]

当 [S]Km 时， v Vmax, 即 [S]而 v 不变米氏方程成立条件： 初速度为标准 单底物 稳态（ steady state ）

（ 2 ）米氏方程推导

（ 3 ）米氏常数的意义米氏常数的意义

• 1 、当反应速度等于最大反应速度一半时，即 V=1/2 Vmax, Km=[S],米氏常数的单位为摩尔 /L 。

• 2 、不同的酶具有不同 Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。

• 3、 Km值只是在固定的底物，一定的温度和 pH 条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的 Km值。

• 4、 Km值表示酶与底物之间的亲和程度： Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低 ;Km值小表示亲和程度大 ,酶的催化活性高。

测定 Km和 V 的方法很多，最常用的是 Lineweaver–Burk 的作图法 — 双倒数作图法。

1 Km 1 1

= + V Vmax [S] Vmax

取米氏方程式的倒数形式：取米氏方程式的倒数形式：

-4 -2 0 2 4 6 8 100.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1/[S](1/mmol.L-1)

1/v

1/Vmax

斜率 =Km/Vmax

-1/Km

米氏常数 Km 的测定：

例题例题D- 丝氨酸脱水酶需要磷酸吡哆醛作为辅酶。催化反应：CH2OH · CHNH2 · COOH CH3CO · COOH+NH3

在实验中测定酶的磷酸吡哆醛饱和曲线得到下列数据： [s] v磷酸吡哆醛 10 -5（M ） 20 分钟生成丙酮酸（ M ） 0.20 0.150 0.40 0.200 0.85 0.275 1.25 0.315 1.70 0.340 2.00 0.350 8.00 0.360

用这些数据求丝氨酸脱水酶对磷酸吡哆醛的表观米氏常数。

v

Vm

0.3

0.2

Vm 2

0.1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 10-6 [S]

丙酮酸

M/20m

in

Vm=0.36 1/2Vm=0.18 Km=3.210-6 M

解： 1、 v对 [S] 作图法 :

磷酸吡哆醛 10 - 5（M ） 20 分钟生成丙酮酸（ M ） [S] 1/[S] v 1/v

0.20 5.0 0.150 6.66 0.40 2.5 0.200 5.00 0.85 1.17 0.275 3.64 1.25 0.80 0.315 3.17 1.70 0.58 0.340 2.94 2.00 0.50 0.350 2.86 8.00 0.125 0.360 2.78

解 2、 1/v 对 1/[S] 作图法：

7

6

5

4

3

2

1

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

1/v

1/[S]

-1/Km=-2.8510 5

Km=3.51 10-6

1/Vm=2.55 ; Vm=0.39

2 、酶浓度对反应速度的影响2 、酶浓度对反应速度的影响

反应速度与酶浓度成正比：当 [S][E], 式中 Km 可以忽略不计。

k3[E][S]

Km + [S]

=k3[E]v=

v

[E]o

0 10 20 30 40 50 60 ℃0 10 20 30 40 50 60 ℃

2.02.0

1.51.5

1.01.0

0.50.5

温度对唾液淀粉酶活性的影响温度对唾液淀粉酶活性的影响

产产物物麦麦芽芽糖糖的的毫毫克克数数

3 、温度对酶促反应速度的影响

酶的最适温度酶的最适温度 : : 酶活性最高时的温度酶活性最高时的温度 , , 也即酶的催化效率最也即酶的催化效率最高高 , , 酶促反应速度最大时的温度。酶促反应速度最大时的温度。

酶的最适酶的最适 pH: pH: 酶催化活性最高时的酶催化活性最高时的 pHpH 。。

2 8 10 2 8 10 pHpH

酶酶的的活活性性

pHpH 对某些酶活性的影响对某些酶活性的影响A: A: 胃蛋白酶胃蛋白酶 ; B: ; B: 葡萄糖葡萄糖 -6--6- 磷酸酶磷酸酶

4、 pH 对酶促反应速度的影响

A B

部分酶的最适 部分酶的最适 pH pH 值值

酶 最适 酶 最适 pHpH

胃蛋白酶 胃蛋白酶 1.81.8

过氧化氢酶 过氧化氢酶 7.67.6

胰蛋白酶 胰蛋白酶 7.77.7

延胡索酸酶 延胡索酸酶 7.87.8

核糖核酸酶 核糖核酸酶 7.87.8

精氨酸酶 精氨酸酶 9.9.88

55 、抑制剂对酶促反应速度的影响、抑制剂对酶促反应速度的影响

抑制作用抑制作用 : : 直接或间接地影响酶的活性中心直接或间接地影响酶的活性中心 ,, 使使

酶活性降低或丧失。酶活性降低或丧失。抑制剂：凡能降低酶活性而不引起酶蛋白变性的物抑制剂：凡能降低酶活性而不引起酶蛋白变性的物质。质。

（ 1 ）不可逆抑制（ irreversible inhibition ）

SHSH SSE + HgE + Hg2+2+ E Hg + 2H E Hg + 2H++

SH SH SS

SH SH Cl Cl SSE + As-CH=CHCl E As-CH=CHCl + 2HClE + As-CH=CHCl E As-CH=CHCl + 2HCl SHSH Cl Cl SS

巯基酶 路易士气巯基酶 路易士气

例例 11 ：： 巯基酶的抑制 巯基酶的抑制

抑制剂与酶的必需基团以牢固的共价键结合 , 使酶丧失活性 , 不能用透析超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性 .

SSE Hg +E Hg + SS

COONaCOONa

CHCHSHSH

CHCHSHSH

COONaCOONa

SHSHE + HgE + Hg SHSH

COONaCOONa

CHCHSS

CHCHSS

COONaCOONa

二巯基丁二酸钠二巯基丁二酸钠

SS CH CH22OH OH SHSH CH CH22OHOH

E As-CH=CHCl + CHE As-CH=CHCl + CHSHSH E + CH E + CHS S S S CH CH22SH SH SHSH CH CH22SS

As-CH=CHClAs-CH=CHCl

二巯基丙醇二巯基丙醇

解毒方法：

RO O RO ORO O RO O

RO X RO RO X RO OO——E E P + EP + E——OH OH P + HX P + HX

有机磷化合物 羟基酶 磷酰化酶有机磷化合物 羟基酶 磷酰化酶 (( 失活失活 ))

RO ORO O

RO ORO O——E E P + -CHNP + -CHNOHOH

磷酰化酶磷酰化酶 (( 失活失活 ))

NN++

CHCH33

-CHN-CHNNN++

CHCH33

O ORO OR

OO OR +E OR +E——OHOH PP

例例 22 ：： 羟基酶的抑制 羟基酶的抑制羟基酶羟基酶 : : 有丝氨酸侧链上的羟基为必需基团的酶有丝氨酸侧链上的羟基为必需基团的酶有机磷有机磷 (( 敌百虫、敌敌畏、对硫磷敌百虫、敌敌畏、对硫磷 )) 不可逆抑制羟基酶的活性中心不可逆抑制羟基酶的活性中心

解磷定

（ 2 ）可逆抑制 (reversible inhibition)

抑制剂与酶以非共价键疏松结合引起酶活性的降低活丧失抑制剂与酶以非共价键疏松结合引起酶活性的降低活丧失 , ,

结合是可逆的结合是可逆的 , , 能够通过透析、超滤等物理方法使酶恢复活能够通过透析、超滤等物理方法使酶恢复活性。性。可逆抑制类型：可逆抑制类型： 竞争性抑制 竞争性抑制 (competitive inhibition)(competitive inhibition) 非竞争性抑制（非竞争性抑制（ non-competitive inhibitionnon-competitive inhibition ）） 反竞争性抑制（反竞争性抑制（ uncompetitive inhibitionuncompetitive inhibition ））

（（ 33 ）竞争性抑制）竞争性抑制 ((competitive inhibitioncompetitive inhibition))

• 概念 竞争性抑制剂的结构与底物结构相似，与底物竞概念 竞争性抑制剂的结构与底物结构相似，与底物竞争同一种酶的活性中心争同一种酶的活性中心 ,, 从而影响从而影响 EE 与与 SS 的结合。的结合。

• 竞争性抑制的底物浓度曲线 竞争性抑制的底物浓度曲线 • 竞争性抑制作用过程竞争性抑制作用过程

SS SSEEEE

II

IIEE

EE + P + P

无 无 II 有 有 II

vv

[S]

• 竞争性抑制的动力学方竞争性抑制的动力学方程程 ::

v= Vmax[S]Km(1+[I]/Ki)+[S]

1v =

Km Vmax

(1+ ) +[I]Ki

1 [S]

1 Vmax

• 竞争性抑制的特征曲线：竞争性抑制的特征曲线： [ I ]

正常

1v

1 [S]

1 Vmax

-1

Km(1+ )[I] Ki

-1 Km

竞争性抑制的特点：竞争性抑制的特点：

I与 S 分子结构相似； Vmax 不变，表观 Km增大； 抑制程度取决于 I与 E 的亲和力 ，以及 [I]和

[S] 的相对浓度比例。

COOHCOOH

CHCH22

CHCH22

COOHCOOH

琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶+ FAD + FADH+ FAD + FADH22

COOHCOOH

CHCH

CHCH

COOHCOOH琥珀酸 延胡索酸琥珀酸 延胡索酸

对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸 二氢蝶呤 二氢蝶呤 FHFH22 FH FH44

谷氨酸谷氨酸

二氢叶酸合成酶 二氢叶酸还原酶二氢叶酸合成酶 二氢叶酸还原酶 磺胺药 磺胺药 (-) (-) 氨甲蝶呤氨甲蝶呤 (-)(-)

例：

COOHCOOH

CHCH22

COOHCOOH

丙二酸（ - ）

（（ 44 ））非竞争性抑制 非竞争性抑制 non-competitive inhibitionon-competitive inhibitionn ））

SSSSEEEE

EE

EE + P + P

SSEESS

I

I I

I

概念 抑制剂与酶分子活性中心以外的其它部位结合而抑概念 抑制剂与酶分子活性中心以外的其它部位结合而抑制酶活性，制酶活性， II和和 SS 与酶结合不存在竞争关系。与酶结合不存在竞争关系。 非竞争性抑制作用过程：非竞争性抑制作用过程：

•非竞争性抑制的动力学方程非竞争性抑制的动力学方程 ::

1v =

Km Vmax

(1+ ) +[I]Ki

1 [S]

1 Vmax（ 1+ ）

[I]Ki

•非竞争性抑制的特征曲线：非竞争性抑制的特征曲线：

1v

正常

[I]

1 [S]

-1 Km

1 Vmax (1+

)

[I]Ki

非竞争性抑制的特点：非竞争性抑制的特点：1 、 I与 S 分子结构不同；2 、 Vmax 减小，表观 Km 不变；3 、抑制程度取决于 [I] 大小。

Ag 1+ 、 Cu 2+ 、 Hg 2+ 和 Pb 2+ 对酶的抑制

质子化的叔胺（ R3NH+ ）对乙酰酯酶的抑制

概念 抑制剂仅与酶和底物的中间复合物结合而抑制酶概念 抑制剂仅与酶和底物的中间复合物结合而抑制酶

活性。活性。• 反竞争性抑制作用过程反竞争性抑制作用过程： ：

EEEE EE + P + P

EEI

I

SSSS

SS

（（ 55 ）反竞争性抑制（）反竞争性抑制（ uncompetitive inhibitionuncompetitive inhibition ））

• 反竞争性抑制的动力学方反竞争性抑制的动力学方程程 ::

v= Vmax[S]Km +(1+[I]/Ki) [S]

1v =

Km Vmax

(1+ )[I]Ki

1 [S]

1 Vmax

• 反竞争性抑制的特征曲线：反竞争性抑制的特征曲线： [ I ]

正常

1v

1 [S]

1 Vmax

-1Km

[I] Ki

+

(1+ ) -1 Km

1 Vmax (1+

)

[I] Ki

•反竞争性抑制的特点：

1、 I与 S 分子结构不同 ,I只与 ES 结合2、 Vmax 和表观 Km都减小；3 、抑制程度取决于 [I]和 [ES] 二者的浓度。

氰化物或肼对芳香硫酸酯酶的抑制

可逆性抑制作用的动力学比较

作用特点 无抑制剂 竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制

与 I 结合组分动力学参数表观 Km

表观 Vm

双倒数作图斜率纵轴截距横轴截距

Km

Vm

Km/Vm

1/Vm

-1/Km

E

Km(1+[I]/Ki)

Vm

Km(1+[I]/Ki)/Vm

1/Vm

1/Km(1+[I]/Ki)

E 、 ES

Km

Vm/(1+[I]/Ki)

Km(1+[I]/Ki)/Vm

(1+[I]/Ki)/Vm

-1/Km

ES

Km/(1+[I]/Ki)

Vm/(1+[I]/Ki)

Km/Vm

(1+[I]/Ki)/Vm

-(1+[I]/Ki)/Km

6 、激活剂对酶促反应速度的影响6 、激活剂对酶促反应速度的影响

（（ 11 ）激活剂）激活剂 : : 凡能使酶由无活性变为有活性或使酶活性凡能使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。如：增加的物质。如：

金属离子： 金属离子： Mg Mg 2+ 2+ 、、 KK++ 、 、 MnMn2+2+

阴离子： 阴离子： ClCl--

有机物： 胆汁酸盐有机物： 胆汁酸盐（（ 22 ）分类：）分类： 必需激活剂 必需激活剂 Mg Mg 2+ 2+ 对己糖激酶对己糖激酶 非必需激活剂 非必需激活剂 ClCl-- 对淀粉酶对淀粉酶

四、酶活性测定 四、酶活性测定

11 、酶活性、酶活性 酶的催化能力，以酶促反应速度来衡量。酶的催化能力，以酶促反应速度来衡量。 22 、酶活性单位、酶活性单位 指酶促反应在单位时间（指酶促反应在单位时间（ s,min,hs,min,h ）内生）内生

成一定量（成一定量（ mg, μg, μmolmg, μg, μmol ）的产物或消）的产物或消耗一定量的底物所需的酶量。耗一定量的底物所需的酶量。

一个国际单位（一个国际单位（ IU ,1976IU ,1976年）：在特定条件下年）：在特定条件下 , 1 , 1

minmin内使底物转变 内使底物转变 1μmol1μmol 所需的酶量；所需的酶量； 一个催量（一个催量（ katkat ）：在特定条件下）：在特定条件下 ,1 Sec,1 Sec 内使底物转内使底物转

变 变 1mol1mol 所需的酶量所需的酶量 1I.U.=16.671I.U.=16.6710 10 -9-9 kat=16.67 kat=16.67 10 10 -3-3 KatKat ； ； 1Kat =61Kat =610 10 77 I.U. I.U. 酶比活：每毫克蛋白所含有的每活力单位数。酶比活：每毫克蛋白所含有的每活力单位数。

3 、酶活力测定 包括两个阶段： 反应阶段和测定阶段。

一般采取如下步骤： (1) 根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。 要求底物均匀一致，具有一定的纯度，新鲜配制。 （ 2 ）确定酶促反应的温度， pH 值等条件。 温度可选酶反应最适温度 pH 值应是酶促反应的最适 pH 值反应条件在

反应过程中应尽量保持恒定不变。 (3) 酶液与底物溶液在规定状态下混合开始反应。 (4) 适时测定产物的生成量或底物的减少量。

终止酶反应的方法 ① 加热失活：酶反应时间一到立即取出适量的反应液，置

于沸水浴中； ② 变性失活：酶反应时间一到立即加入适宜的酶变性剂，

如三氯醋酸等； ③ 酸碱失活：酶反应时间一到使反应液的 pH 值迅速远离

酶催化反应的最适 pH ，从而终止反应； ④低温失活：酶反应时间一到将取出的反应液立即置于冰

粒堆中或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低至 10 ℃以下。

固定化酶的活力测定

振荡测定法：称取一定重量的固定化酶，放在一定形状，一定大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在特定的条件下，一边振荡或搅拌，一边进行催化反应经过一定时间，取出一定量的反应液进行测定。

注意点： （ 1）在振荡或搅拌速度速度不高时，反应速度随振荡或搅拌速度的增加而升高，在达到一定水平后不再升高。（ 2）若速度过大，可能引起固定化酶的结构破坏，缩短固定化酶的使用寿命。（ 3）底物浓度， pH 值，温度，反应时间等条件可与游离酶活力测定的条件相同。

例题：例题：

某无细胞的粗提液，每mL含 20 mg 蛋白质。在 0.5mL的标准总反应体积中，含有 10 L 这中提取液。在最适宜条件下，一分钟内生成 30ng 的产物。求：

用下述单位表示反应速度 v : nmol/ml /min,

nmol/L/min, mol/L/min, mol/L/min

若 10 l该提取液，在 1 ml 总反应体积中进行实验，其反应速度是多少？

反应混合液和提取液中酶活性浓度各是多少？ 酶制剂的比活力是多少？

解：解： V=30/0.5=60 nmol/ml/min =60 10 3 nmol/L/min =60 mol/L/min =6 10-5 mol/L/min V=30/1 =30 nmol/ml/min =3 10-5 mol/L/min 反应液酶活性浓度 = 60 nmol/ml/min =0.06mol/ml/min =0.06 单位 /ml 0.5 ml 的反应液内含 0.03 单位酶，即 10 l (0.01 ml)

提取液含 0.03 单位酶，所以： 提取液酶活性浓度 =0.03/0.01=3 单位 /ml 酶比活 =3/20=0.05 单位 /mg 蛋白

五、酶的分类与命名( 一 ) 分类

1961年国际酶学委员会（ Enzyme Committee, EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把蛋白类酶分成6 大类：1. 氧化还原酶类：主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。AH2 + B（ O2）

A + BH2（ H2O2， H2O）

（ 1 ）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应。

AH2 +B A +BH2 （需辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ）

（ 2 ）氧化酶类

① 催化底物脱氢，氧化生成 H2O2：

AH2 + O2 A + H2O2 （需 FAD或FMN）

② 催化底物脱氢，氧化生成 H2O：2AH2 + O2 2A + 2H2O

（ 3 ）过氧化物酶ROO + H2O2 RO + H2O + O2

（ 4 ）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）

O2 +OHOH

C=O

C=O

OH

OH

（顺，顺 - 已二烯二酸）

ROH + H2O + 氧化型辅助因子RH + O2 + 还原型辅助因子（又称羟化酶）

2. 转移酶类：催化化合物中某些基团的转移。

A·X + B A +B·X

根据 X 分成 8 个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。

3. 水解酶类：催化加水分解作用。

AB + H2O AOH + BH

4. 裂解酶类：催化非水解性地除去基团而形成双键的反应或逆反应。

CH3

C=O

COOH

C—C 键CH3

C=O

H

+ CO2

C—O 键 CH2COOH

HO—CH—COOH

HCCOOH

HOOCCH+ H2O

C—N 键 COOH

CH—NH2

CH2

COOH

COOH

CH

HC

COOH

+ NH3

5. 异构酶：催化 各种异构体之间的互变。A B

常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。6. 合成酶类：催化有 ATP 参加的合成反应。

A + B + ATP A·B + ADP +Pi

7. 核酸酶（催化核酸） Ribozyme

（ 1） ribozyme 的发现 80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的 Thomas Cech和

美国耶鲁大学的 Sidnery Altan各自独立地发现 RNA具有生物催化功能 . 从而改变了生物催比剂的传统概念。为此， T.Cech和S.Altman共同获得了 1989年度诺贝尔化学奖。

（ 2） Ribozyme 的种类根据催化底物是否是本身的 RNA分为：分子内酶（ in cis）包括：自我剪切酶、自我剪接酶分子间酶 (in trans）包括： RNA剪切酶、 DNA剪切酶、多糖剪切、

多糖剪接酶、氨基酸酯剪切酶、多功能酶根据结构特点锤头型酶、发夹型酶、 IVS酶；

自我剪接 ribozyme 简介自我剪接 ribozyme 简介

自我剪接 ribozyme 比较复杂，通常包括 200个以上核苷酸，主要催化 mRNA前体的剪接反应。四膜虫核糖体前体 RNA 可以在体外无蛋白质参与下除掉它自身 413nt内含子。具有核酸内切酶和连接酶活性。

自我剪接 ribozyme 可分为两类： Ⅰ型 IVS：均与四膜虫大核 rRNA前体的 IVS结构相似、催化

自我剪接需鸟苷（或 5′鸟苷酸）和 Mg2+参与。

Ⅱ型 IVS ：结构与四膜虫的不同，而与细胞核 mRNA前体中的IVS相似。它催化自我剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参与，但仍需 Mg2+。

自我剪切 ribozyme 的分类

自我剪切 ribozyme ：自我剪切的RNA结构有锤头结构和发夹结构，其中尖头指出自我剪切的部位。

自我剪接 ribozyme ：包含剪切与连接两个步骤。相当于核酸内切酶。

几种能进行自我剪切的 RNA 结构

酶的命名有两种方法：系统名、惯用名。

系统名：包括所有底物的名称和反应类型。乳酸 + NAD+ 丙酮酸 + NADH + H+

乳酸： NAD+ 氧化还原酶

惯用名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。

乳酸： NAD+ 氧化还原酶

乳酸脱氢酶

对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。

( 二 ) 酶的命名

国际系统分类法编号 系统命名法每一种酶都有其一定的系统编号系统编号采用四码编号

方法： 第 1 个号码表示该酶属于 6 大类中的某一类 第 2 个号码表示该酶属于该类中的某一亚类 第 3 个号码表示属于该亚类中的某一小类 第 4 个号码表示这一具体的酶在该小类中的序号。 每个号码之间用圆点 (·) 分开。

乳酸脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27第 1 大类，氧化还原酶第 1 亚类，氧化基团 CHOH

第 1 亚亚类， H 受体为NAD+

该酶在亚亚类中的流水编号

酶的国际分类表——大类及亚类酶的国际分类表——大类及亚类1 、氧化还原酶类1.1 作用在 -CH- 哦上；1.2 作用在 -C=O 上；1.3 作用在 -CH-CH- 上；1.4 作用在 -CH- NH2 上；1.5 作用在 -CH-NH- 上；1.6 作用在 NADH ， NADPH 上。

2 、转移酶类2.1 作用在碳基团上；2.2 作用在醛或酮基上；2.3 作用在酰基上；2.4 作用在糖苷基上；2.5 作用在除甲基外的烃基或酰上；2.6 作用在含氮基上2.7 磷基；2.8 含硫基。

3 、水解酶类亚类表示被水解键的类型

4 、裂解酶类亚类表示裂开键的类型

5 、异构酶类亚类表示异构类型（消旋或顺反）

6 、合成酶类亚类表示形成键的类型

例如： 葡萄糖氧化酶（ EC1.1.3.4)

EC ：国际酶学委员会 ； 第 1 个号码 “ 1” 表示该酶属氧化还原酶类； 第 2 个号码 “ 1” 表示属氧化还原酶类中的第一亚类，该亚类所催化的反应为在供体的 CH — 基团上进行；

第 3 个号码 “ 3” 表示该酶属第一亚类中的第 3 小类，该小类的酶所催化的反应是以氧为氢受体的；

第 4 个号码 "4" 就是该酶在小类中的特定序号。