.................................................................................... الرابعة المرحلة جزيئي بايلوجي

البروتينات / Protein Extraction استخالص 2م

البروتينات

االمينية االحماض من تتركب عاٍل� جزيئي وزن ذات التركيب معقدة عضوية مركبات

الخلية بناء في األساس الحجر وهي والفايروسات الحية المخلوقات كل تركيب في تتواجد

تشكل , البروتينات من فالعديد الخلية وظائف واسطات كونها الى باإلضافة هيكلها وإدامة

من أالفا الخلية وتضم اإلنزيمات بعض تركيب في بروتينية وحدات تدخل قد أو اإلنزيمات

. الفيزيائية و الكيميائية و الحياتية خواصها في المختلفة البروتينات جزيئات

-: مثل شتى إلغراض كانت ايا مصادرها من البروتينات استخالص يتم

1. كميتها- وتقدير تشخيصها لغرض انفراد على كل وفصلها تنقيتها

عالقة- 2 استنباط لغرض للبروتينات والفيزيائية والكيميائية البايلوجية الخواص دراسة

بالوظيفة التركيب

في -3 مفيدة عالقات استنتاج لغرض مختلفة نماذج من المستخلصة البروتينات مقارنة

. المقارنة الدراسية االغراض

4. والغذائية- الدوائية الصناعات من العديد في تدخل حيث التجارية لإلغراض استخالصها

البروتينات , فهنالك ومتنوعة كثيرة أسس على تعتمد البروتينات استخالص طرق ان

, عائدة بروتينات توجد وكذلك الموقع سايتوبالزمية البروتينات وهناك الموقع غشائية

الى باإلضافة االندوبالزمية والشبكة كولجي وجهاز كالمايتوكوندريا المختلفة الخلية لعضيات

مصدر على التأكيد من فالبد وعليه خلوي غير يكون ان يمكن البروتينات مصدر فان ذلك

ما . عضية الى تنتمي معينة بروتينات باستخالص القيام عند االستخالص

غشاء بروتينات وبالذات الخاليا أغشية من البروتينات استخالص سيتم الحالية التجربة في

: مجموعتين الى البروتينات هذه وتنقسم الحمراء الدم كريات

للمذيب : الاولى االيونية القوة في بتغيير وذلك بسهولة عزلها يمكن التي البروتينات مجموعة

غير الخارجية البروتينات مجموعة هذه وتمثل للمذيب الهيروجيني االس درجة في بتغيير او

الدهن طبقة في Extrinsic or non integral proteinالندمجة

المندمجة: )الثانية البروتينات للغشاء( Integral proteinsمجموعة الدهن طبقتي تجوب التي

إن . كيميائية أواصر طريق عن كالفلزات أخرى بعوامل ترتبط او الدهون مع أواصر وتكون

والفلزات والبروتينات الدهون بين التأصر تخريب طريق عن ياتي المجموعة هذه استخالص

المنظفات , ) تستعمل ما وغالبا معها في Detergent)المتحدة اليفاتية كيميائية مواد وهي

1

.................................................................................... الرابعة المرحلة جزيئي بايلوجي

يؤاصرها عما البروتينات تفصل بذلك وهي للتأصر مفككا عنصرا وتوفر تركيبها معظم

. مكانها في ويثبتها

الدهون وبين البروتين في للماء المحب غير التأصر من التقليل على أيضا المنظفات تعمل

القوي . التأصر هذا دور من االقالٍل على تعمل بذلك وهي

الى : المنظفات تقسم

ايونية أ- ( :Ionic detergentمنظفات سالبة ) او موجبة اما شحنة في تمتلك قوية وهي

امثلتها ) ومن للماء المحبة غير الروابط من كثير كسر وباستطاعتها (SDSتاثيرها

Sodium doedecyle sulfat الخلية وتراكيب لمحتويات الكلي للتحطيم تستعمل وهي

البروتينات لمسخ ا Denaturationوكذلك فصلها الكهربائي ثالجل الترحيل Gelناء

electrophoresis.

الالايونية ب- الكيميائي :Non ionic detergentالمنظفات تركيبها في شحنة التمتلك

امثلتها ومن للماء المحب غير التاصر كسر في ايضا مفيدة تستعمل Triton-X-100وهي

الفعالة البروتينات وتسمى أغشيةمن إحيائيالعزٍل الماسخة أيضاالخاليا غير بالمنظفات

Non-denaturing detergent

المواد

) ( , , سالين فسلجي محلوٍل عادية انابيب للتخثر مانعة مادة على حاوية ويمكنانابيب

باذابة من 0.85تحضيره , 100في NaClغم مقطر ماء , مل ماء مركزي طرد جهاز

على حاوي من 0.1مقطر موالري (.7.5له =PHو EDTAملي للخاليا ) المحلل المحلوٍل

العمل طريقة

بقوة 2يؤخذ- 1 بالنبذ الدم كريات عن البالزما وتفصل النبذ انابيب في ويوضع الدم من مل

لمدة / 4000 دقيقة .10دورة قائق

في- 2 الخاليا وتعلق البالزما من التخلص غسل 10يتم ويتم الفسلجي الملح محلوٍل من مل

مرة . كل في الكريات وتجمع النبذ باستعماٍل مرات ثالث الخاليا

على- 3 الحاوي المقطر الماء بواسطة بتعليقها الدم كريات تحليل عملية ملي 0.1تتم

EDTAموالري

بقوة بالنبذ المنحلة الحمراء الدم كريات اغشية على الحصوٍل دقيقة /10000يتم دورة

ساعة نصف لمدة

السابقة- 4 الخطوة وتكرر السابق المحلوٍل بنفس بتعليقها االغشية غسل يتم

2

.................................................................................... الرابعة المرحلة جزيئي بايلوجي

من- 5 معين حجم في المعلقة االغشية ترج السطحية االغشية بروتينات على للحصوٍل

) المحلوٍل) ويترك باالنفصاٍل الغشائية للبروتينات الفرصة التاحة k قويا رجا الخاليا محلل

ويحفظ لفترة المحلوٍل ترك بعد ماصة باستعماٍل الرائق ويجمع االغشية تترسب كي لفترة

بدرجة - بدرجة- 4الرائق يجمد او .20م الصفر تحت م

المندمجة :- الحمراء الدم كرية بروتينات الستخالص

السابقة -1 المواد نفس تستعمل

استخال -2 محلوٍل على صيضاف Triton-X-100( 0.1 )حاوي لكل من 10مل مل

ويستعمل . المحلل المحلوٍل

بنفس -3 ويحفظ والمندمجة السطحية البروتينات على المحتوي الرائق جمع يتم

الطريقة.

البروتينات / ترسيب 3م

كما البروتينية غير المواد مختلف من لتخليصها استخالصها بعد البروتينات ترسب

البروتينات فصل الى باإلضافة البروتينات محاليل لتركيز الترسيب طريقة تستعمل

.) تنقيتها ) بعضها عن المختلفة

- - ) وتستعمل ) ذائبة غير تصبح منها المذيب الماء بازالة محاليلها عن البروتينات تترسب

ترسيب ويمكن االمونيوم كبريتات منها الترسيب عملية في االمالح من مختلفة انواع

كمادة للماء الساحبة المواد باضافة ايضا وفي poly ethylene glycol( PEG )البروتينات

لالمالح بالنسبة مشبعة بتراكيز الماء في البروتين مرسبات محاليل تحضر االحواٍل كل

( لمادة بالنسبة معينة الرائق( PEGاوتراكيز الى المرسب يضاف الترسيب عملية وفي

. معين تركيز على للحصوٍل البروتيني

المواد:-

االشباع* * درجة الى الملح باذابة ويحضر االمونيوم كبريتات من مشبع محلوٍل انابيب

) باذابة) االشباع درجة على نحصل ما وغالبا المقطر الماء في العالمية الجداوٍل 90حسب

الى ملح ويعدٍل 100غم الغرفة بحرارة المحلوٍل ويحفظ مقطر ماء عند7الى PHمل

- - مصل .* او الغشائية للبروتينات كمصدر السابقة التجربة رائق بروتيني مصدر االستعماٍل

. المناعية للبروتينات كمصدر الدم

3

.................................................................................... الرابعة المرحلة جزيئي بايلوجي

الطريقة:-المشبع- 1 االمونيوم كبريتات محلوٍل اليه ويضاف االستخالص رائق من معين حجم يؤخذ

. المغناطيسي المازج باستخدام ويفضل المستمر الرج مع تدريجيا

المضافة- 2 الملح كمية وتحسب المرسب للبروتين عكرة ظهور عند الترسيب عملية تبدا

) التعكر) ظهور بدأ الملح من كمية أي في أي

النبذ- )3 بوساطة البروتين ( 5000يعزٍل لمدة / دقيقة اما 5دورة الراسب ويحفظ دقائق

. االمالح بزيادة اضافية بروتينات ترسيب فيمكن الرائق

. المعرفة:- غير البروتينات وتركيز وتجزئة لترسيب وسيلة الطريقة هذه مالحظة

4

.................................................................................... الرابعة المرحلة جزيئي بايلوجي

الكميات: , لترسيب االسيتون او االيثانوٍل استخدام ويمكن اخرى ترسيب طرق توجد مالحظة

. الحجم الصغيرة البروتينية المستخلصات في المتواجدة القليلة

/ Dialysis الديلزة 4م

إلزالة الديلزة تستعمل ما وغالبا محاليلها عن عموما األمالح ازالة تتضمن عملية الديلزة

األمالح بهذه الترسيب عملية بعد البروتينات عن خاص حيث األمالح أنابيب لهذا ةتستعمل

لتحتوي (tubes Dialysisتسمى )الغرض مصممة السلفين أوراق تشبه رقيقة انابيب وهي

باالنكسترومات تقاس أقطارها ثقوب . على

البروتينات حجز في لتستعمل يؤهلها وهذا الديلزة انابيب في الثقوب أقطار تختلف

) ( من االمالح جزيئات بمرور االكياس تلك تسمح كما اقطارها الجزيئية أوزانها على اعتمادا

- - ) - باستمرار ) منظم او مقطر ماء المحلوٍل وباستبداٍل الخارج إلى الملح البروتين محلوٍل

البروتين من نهائيا االمالح جزيئات إزالة يتم

المواد

5

.................................................................................... الرابعة المرحلة جزيئي بايلوجي

, , , كلوريد باالمالح المرسب البروتين محلوٍل مقطرمعقم ماء معقمة ديلزة انابيب

الباريوم

الطريقة

1- . لالنبوبة السفلى إلنهاية تغلق

2- ) ( - الديلزة انبوب في المقطر الماء من بقليل إذابته بعد البروتين الملح محلوٍل يسكب

. العليا النهاية وتغلق

كليا .-3 لغمرها الديلزة سائل في الديلزة انبوبة تعلق

عملية -4 في لالسراع مغناطيسي محرك باستعماٍل الخارجي الديلزة سائل تدوير يمكن

. االيونات تنافذ

5- - كل وآخر حين بين الديلزة محلوٍل .24يبدٍل - مرات لعدة ساعة

كلوريد -6 من قطرات عدة بإضافة الديلزة محلوٍل في األمالح وجود انتهاء من التاكد يمكن

. االمونيوم كبريتات وجود على داللة راسب تكون حيث الديلزة محلوٍل الى الباريوم

بدرجة -7 ويحفظ األمالح من الخالي البروتين محلوٍل .20يفصل م

البروتينات / Protein estimation تقدير 5م

من وتجزئتها باستخالصها المتعلقة الخطوات من كثير بعد البروتينات كميات تقدر

: مثل. البروتينات لكمية التقديرية الطرق من الكثير هنالك مصادرها

الطيفية (1 (Spectrophotometerالطريقة المباشرة )

6

.................................................................................... الرابعة المرحلة جزيئي بايلوجي

هذان ويتصف والتربتوفان التايروسين االمينين الحمضين على البروتينات اغلب تحتوي

قدره موجي بطوٍل امتصاصهما في , 280و 275الحمضان ان وبما التوالي على نانومتر

الكثافة ) االمتصاص كمية فان البروتينات من كثير في ثابتا يكون الحامضين هذين مستوى

يتم( خاصة معادلة استخدام خالٍل ومن الحامضين هذين كمية مع طرديا تتناسب الضوئية

تركي على منقى زالتعرف بروتين كمية لتقدير الطريقة هذه تستخدم وغالبا البروتين

النوع . معروف

اللونية (2 الطرق

بايوريت أ- Biuert method طريقة

على التفاعل هذا أساس ويعتمد بايرويت تركيبة استعماٍل خالٍل من الطريقة هذه تتم

ذرة بين معقد تكوين بسبب البروتينات على الحاوي المحلوٍل في ارجواني لون تكوين

لتقدير الطريقة هذه وتستخدم الببتيدية السالسل في النايتروجين مع البايوريت في النحاس

من اعلى تركيزها يكون التي االبروتينات / 1كميات تتحسس وال المحلوٍل في سم ملغم

. االقل للتراكيز

برادفورد ب- Bradford method طريقة

بلو بريلينت الكوماسي صبغة أن حقيقة على الطريقة هذه Coomassie Brilliantتعتمد

Blue 250 األزرق اللون إلى تتحوٍل البروتين بجزيء ارتباطها عند ولكن أحمر بلون توجد

. البروتين من المنخفضة للتراكيز بحساسيتها الطريقة هذه وتمتاز

. ) المباشرة// ) الطريقة عن محورة المحلوٍل في عامة بصورة البروتين تركيز حساب تجربة

السابقة , ,المواد: التجارب في المرسب البروتين محلوٍل المطياف Phosphateجهاز

buffer

: العمل طريقة

بوضع( 1 المرسب البروتين محلوٍل حفظ في المستخدم البفر بواسطة الجهاز يصفر

في 1 لوحده البفر من .cuvetteمل

وتوضع( 2 المقطر بالماء الكيوفيت قياسه 1تغسل المراد البروتين محلوٍل من مل

على االمتصاصية على 280وتقاس تقاس .235ثم

المعادلة( :3 تطبق المحلوٍل في البروتين تركيز لمعرفة

النووية األحماض /حسابات 6م:

7

r

)زتركي mg/ml : 235O.D – 280 O. D)البروتين

2.51

.................................................................................... الرابعة المرحلة جزيئي بايلوجي

نوع ) المزدوج الحلزون هيئة :-B )تتصف األتي النحو على ثابتة بمقاييس

1). خالله من عمودي محور بمرور ويمتاز الدوران يميني انه

الواحدة (2 الدورة في النيوكليوتيدات Pitch = 10عدد

الواحدة = (3 اللفة في تليها التي والقاعدة قاعدة بين فان A° 3.4 المسافة وعليه

: يكون الواحدة اللفة A°34 طوٍل

الـ (4 قطر DNA = A° 20يبلغ

على (5 االسطواني الـتركيب شكل :DNAينطبق يكون حجمه فان وعليه

Volume of DNA= Cycle surface area × height

r2 × hπ

الـ عينات مع التعامل معادلتين DNAقبل إلى اإلشارة من البد المهمة التجارب في

مهمتين

Determination of DNA concentration by Spectrophotometer: ألولى ا

Estimation التركيز بحساب وهي : DNA( )concentration ofتتعلق

Unknown( g/ml) = O.D 260 x dilution factor x 50 g/ml

للبفر( 1 الموجي الطوٍل قياس خالٍل من الجهاز تصفير المستخدم) لوحده يتم

الـ وتخفيف )DNA)لحفظ كوارتز زجاجية أنبوبة تمال بجهاز( Cuvetteحيث خاصة

( مطياف االمتصاصية ( U.Vقياس عينة على تحوي ال انها وبما بالبفر DNAالضوئي

. تصفيره يتم صفر تقرا لم لو وحتى صفر القراءة فتعتبر

الـ( 2 عينة عند DNAتوضع الموجي الطوٍل ويثبت الكيوفيت وتتم 260داخل نانوميتر

االمتصاصية ) وتسجل الجهاز قراءة ويستخرج( O.Dمالحظة المعادلة وتستعمل

التركيز.

الـ( 3 عينة انه بـ DNAبما تقدر كبيرة للقياس اعادتها 2-1المستخدمة واليمكن مل

. كمية اخذ يفضل لذلك والكيوفيت القياس ظروف تعقيم لعدم االساسي للمحلوٍل

معامل خالٍل من المعادلة في ذلك وحساب وتخفيفها بالمايكرولتر تقدر صغيرة

التخفيف.

اٍل تركيز تقدير يمكن )DNA كما االثيديوم بروميد صبغة شدة خالٍل Ethediumمن

bromide ) اٍل قواعد بين تندغم االشعة DNAالتي مرور عند برتقاليا ضوءا وتعكس

8

34 A°

.................................................................................... الرابعة المرحلة جزيئي بايلوجي

( البنفسجية يمكن, UV )فوق القياسية العينة مع ومعايرتها العينة وميض وبقياس

. ضئيلة كانت لو حتى الموجودة الدنا كمية اكتشاف

الـ تركيز لقياس السابقة المعادلة نفس حيث RNAوتستعمل الثابت يختلف ولكن

40يكون

Unknown( g/ml) = O.D 260 x dilution factor x 40 g/ml

الـ : الثانية نقاوة DNA تقدير O.D 260

Purity of DNA = ≥ 1.8 O.D 280

الـ أي عينة امتصاصية الموجي DNAتحسب الطوٍل تحسب 260عند ثم نانوميتر

الموجي الطوٍل عند نفسها للعينة االمتصاصية 280االمتصاصية قسمة وبعد نانوميتر

يساوي او من اكبر الناتج يكون ان يجب الثانية على كان 1.8االولى فهذا اقل واذا

. استخالص اعادة او تنقية وتحتاج نقية غير العينة ان يعني

الـ نقاوة لتقدير نفسها المعادلة او RNAوتستخدم اكبر الناتج يكون ان يجب ولكن

:2يساوي وكاالتي

O.D 260

Purity of RNA = 2 O.D 280

9

.................................................................................... الرابعة المرحلة جزيئي بايلوجي

الـ / DNA استخالص 7م

في واستخدامه عليه للحصوٍل الضروروية العمليات من الدنا استخالص عملية تعد

, خاليا ) بكتريا االستخالص مصدر كان k وأيا الجنائية والتحليالت الجزيئية االختبارات

) الشوائب, إزالة أيضا توفر االستخالص عملية فان النواة حقيقية خاليا نباتية

. الكيميائية الشوائب من وغيرها والدهون كالبروتينات

الـ استخالص خطوات تلخيص :DNAيمكن اآلتية بالنقاط عامة بصورة

1-( الخاليا جدار ( Cell lysesتحليل على محتوية الخاليا كانت وإذا محتوياتها وإخراج

الفائق بالتبريد ذلك يتم وعادة k اوال الخلوي الجدار تحطيم فيجب النباتية كالخاليا

من) تقترب حرارة درجة يوفر حيث السائل النايتروجين (.°م 190 -بوساطة

األنوية )-2 .Nuclei lyses)تحليل النواة حقيقة للخاليا

محلل -3 الرايبوزي( ( RNA aseإضافة الحامض بتحليل يقوم والذي )RNAالذي

) من التخلص يتم و البروتينات هو اآلخر والملوث الدنا ملوثات احد يعتبر

عضوية مذيبات استخدام يتم الخطوة هذه وفي الترسيب بواسطة البروتينات

باألمالح( .buffersوبفرات) التركيز عالية

الـ -4 الخطوة- DNAتنقية محاليل ) 3من المبرد- االيثانوٍل يستخدم الكحوٍل بوساطة

الـ مع السكريات بترسيبه يمتاز االخير لكن المبرد االيزوبروبانوٍل فيDNA او

.) الواطئة الحرارة درجات

الـ -5 درجة DNAوضع في ويوضع عليه للحفاظ مالئم بفر .°م 20 -في

DNA الـ استخالصالمواد: Psudomonas. ssp اوE.coli *بكتريا Luria broth البكتريا انماء *وسط

10

.................................................................................... الرابعة المرحلة جزيئي بايلوجي

الزجاجية( باالنابيب الدنا التصاق بروبيلين)لتجنب بولي *انابيب وملي7.8 هيدروجيني اسTris-HCl موالري ملي10 :يحويTris-EDTA *بفر

بنسبة االيسواميلي كحوٍل – .*الكلورفورم8 هيدروجيني بأس EDTA موالري1:24

يلي: كما .يحضرTris-EDTA ببفر مشبع *فينوٍل المضادة كوينولين -هيدروكسي8 مادة وتضاف م68 بدرجة الفينوٍل يذابأ-

للدنا المحللة لالنزيمات تثبيطيا دورا المادة هذه % وتؤدي0.1 بتركيز للتاكسدTris-EDTA منظم مع مرات عدة المحضر الفينوٍل يستخلصب-

الساخن بالماء اليد غسل يتم المالمسة حاٍل في وفي حارق فهو الفينوٍل جـ-احذرطويلة. لفترة

العمل: طريقة 30لمدة بالنبذ وتجمع م25ب ساعة18 لمدة سائل وسط في البكتريا -تنمى1

دورة/دقيقة5000 بقوة دقيقةالزرع. وسط من العالقة البروتينات إلزالة مرات خمس المقطر بالماء - تغسل2البكتريا: تحليل– 3

المذاب %سكروز25 محلوٍل من مل1.5 في ةالمغسول البكتريا مرسب أ- يعلق..PH:8 ذو Trisمنظم موالري0.05 في

االنزيم و ملغم/مل10تركيز الاليسوزايم محلوٍل)إنزيم من مل0.5 ب- يضافدقائق.5 لمدة يحضن (.ثمTris-EDTAبفر في ملغم/مل5 تركيز للرنا الهاضم

لمدة يحضنPH:8) ذو موالريEDTA ) 0.5 محلوٍل من مل0.5 جـ- يضافدقائق.5

من مل0.1 باذابة )المحضرTriton-X-100 المنظف من مل2.5 د- يضاف) موالريEDTA ,0.05 موالري0.06 محلوٍل من100 في المركز المنظف

Trisبهدوء. .يمزج الرائق ويعزٍل م4 بدرجة دقيقة30 لمدة دورة/دقيقة10.000 بقوة هـ- النبذالدنا. على الحاوي

بروبيلينية, بولي انبوبة في الفينوٍل من متساوي حجم مع الدنا محلوٍل يمزج-4بسداد. األنبوبة فوهة تغطى

المزيج. تكون لحين جيدا يمزج-5 عن الفينوٍل طبقة لفصل دورة/دقيقة2000 بقوة االنبوبة محتويات تنبذ-6

المائية. الطبقة )طبقة والسفلى الوسطى الطبقة وتهمل بهدوء العلوية المائية الطبقة تنقل-7

. باستور ماصة باستعماٍل ( وذلك البروتينات ومعه الفينوٍل وجمع ثانية مرة الوسطى والطبقة الفينوٍل طبقة استخالص إعادة يمكن-8

اعاله.7 في صالمستخل المسخ مع المستخلص– كلوروفوم المذيب من أعاله7 في المائية للطبقة مساوي حجم يضاف-9

االيسوميلي. كحوٍل

11

.................................................................................... الرابعة المرحلة جزيئي بايلوجي

الحمض )مصدر المائية الطبقة وتفصل أعاله والنبذ االستخالص عملية تعاد-10.RNA Free الرنا من النووي(الخالي

الـ بطريقة والتحليل البكتريا باغالء التحليل مثل أخرى تحليل طرق :هناك مالحظةSDS

العدة باستعمال DNA extraction from blood الدم من DNA الـ استخالص محقنه بواسطة الدم من مقدار يسحب :- Promega شركة من المجهزة

وفي. لتخثر مانعة مادة على حاوية أنبوبة في ويوضع طبية التجربة هذه الدم: كاألتي و Promega شركة دليل حسب DNAالـ استخالص طريقة اتبعت

الخاليا محلل محلوٍل من مايكروليتر900 إلى الدم من مايكروليتر300. أضيف1(Cell lyses solutionفي ) المحتويات مزجت و معقمة مل1.5 سعة اختبار أنبوبة

بلطف. الطرد بجهاز نبذت ثم دقائق10 لمدة الغرفة حرارة بدرجة األنبوبة تركت. 2

دقائق.3 لمدة / دقيقة دورة14000 بسرعة المركزي-50 من إبقاء مع البيضاء الخاليا طبقة إتالف دون الراشح من مقدار أهمل. 3

15-10 من بالمازج المحتويات ،مزجت األنبوبة في الراشح من مايكروليتر100. الخاليا لتعليق ثانية

(Nucleic Lyses Solution)االنوية محلل محلوٍل من مايكروليتر100 أضيف. 4المستمر. التحريك مع ساعة نصف لمدة م37 بدرجة وحضنت األنبوبة إلى

ربع لمدة وحضنت األنبوبة إلىRNase محلوٍل من مايكروليتر1.5أضيف. 5. الغرفة حرارة بدرجة لتبرد تركت ثم م37 بدرجة ساعة

Protein Precipitationالبروتين) مرسب محلوٍل من مايكروليتر300 أضيف. 6Solutionثانية20 لمدة بالمازج األنبوبة محتويات ( ومزجت .

. دقائق3 لمدة / دقيقة دورة14000 بسرعة األنبوبة نبذت. 7 مزج ، اآليزوبروبانوٍل من مايكروليتر300 على حاوية أنبوبة إلى الراشح نقل. 8

.DNA الـ خيوط ظهور حتى بلطف الخليط. واحدة دقيقة لمدة / دقيقة دورة14000 بسرعة مركزيا األنبوبة نبذت. 9

الـ % إلى70 ايثانوٍل من مايكروليتر300 وأضيف اآليزوبروبانوٍل أهمل. 10DNAالـ لغسل رج�ت ثم األنبوبة جدران على المتركز DNA. واحدة. دقيقة لمدة / دقيقة دورة14000 بسرعة األنبوبة نبذت.11 وتركت نظيفة ترشيح ورقة على األنبوبة قلبت ثم بلطف االيثانوٍل أهمل. 12

. دقيقة15 -10 من لتجف DNA Rehydration) الهدرجة إعادة محلوٍل من مايكروليتر100 .أضيف13

Solutionالـ ( إلىDNAالـ حفظ ، ساعة لمدة م65 بدرجة مائي حمام في ووضعDNA م8-2 درجة عند الثالجة في .

12

.................................................................................... الرابعة المرحلة جزيئي بايلوجي

االكاروز هالم في الكهربائي : Agarose Gel electrophoresis الترحيل8م/

تقنية الكهربائي تأثير تستخدمالترحيل تحت حركتها معدٍل حسب المواد لعزٍل

كهربائيالمجاٍل ال

من الجل ال يستعمل اال مكون بحرية -كاروزمادة نباتات من مأخوذة مادة يتم -,وهي حيث

اال شريحة اذابة وز اركعمل طريق يصبح العن حتى وتسخينه منظم محلوٍل في مادة

تماما صافيا المحلوٍل

اال صب ثم يتم إناءفي كاروزومن مرنة جيالتينية مادة عنه ينتج مما يبرد حتى خاص

استخدامها

الفصل عملية يحوي وإثناء ,في وعاء داخل الجيالتينية الشريحة توضع الفصل عملية

منظم محلوٍل

قطبان وموجب )وفيه (.سالب

ثم ومن الجل في خاصة فتحات في وضعه طريق عن النووي الحمض تحليل يتم

بوساطة لالمام دفعه

القطب الى باالنتقاٍل النووي الحمض فيبدأ كهربائي جهد القطب الموجبفرق من

السالب

-: منها عوامل عدة تحت يكون .وهذا

الجه -1 فرق د.قوة

االكاروز -2 .تركيز

فك - 3 النووي الحمض قطعة اسرع لحجم كانت اصغر كانت .ما

, و االكاروز لهالم االفقية الترحيل وحدة تستخدم غير عادة� ذاته النووي الحمضال في ترتبط هالممرئي بمادة صبغه يتم و بهلهذا الجل ضقبل في العينات ومنع

مادة برومايد امثلتها .االثيديوم البنفسجية فوق لألشعة تعرضها عند تتألق التي

, المواد: بفرالترحيل , TBE اكاروز التحميل, بفر مقطر Loading buffer ماء , ,) الـ) + عينات االثيديم بروميد سكروز بلو المستخلصة DNAبروموفينوٍل

العمل وبعدTBE الـ بفر من مل100 في االكاروز من غم0.7 يذاب: طريقة 5 إليه يضاف ثم تقريبا م50 درجة إلى ويبرد° م100 درجة إلى التسخين

5 ( )بتركيزEthidium Bromide) االثيديوم بروميد صبغة محلوٍل من مايكروليتر/ مل( . ملغم

13

.................................................................................... الرابعة المرحلة جزيئي بايلوجي

مشط غمس بعد الهالم ويصب ( الزجاجيةTray) االكاروز إسناد صفيحة تحضر (1 أفقي بوضع ليتصلب االكاروز ويترك الصفيحة نهايتي إحدى ( قربCombالحفــر)

k دقيقة30 لمدة اقل. او تقريبا وحدة في مساندها على الصفيحة ثبتت ثم المتصلب الهالم من المشط يرفع (2

.TBE الـ بمحلوٍل المتصلب االكاروز ويغطى األفقية الترحيلk يكروليتر ما7 : مزج كاآلتي المتكونة الحفر داخلDNA تحميل يتم(3 الـ من تقريبا

DNAدارئ)بفر( التحميل محلوٍل مـن يكروليتر مـا3 مع (Loading bufferوتمزج ) كهربائي بجهد العينات ،ترحل المخصصة الحفر في تملىء ثم جيد بشكل المحتويات

. الهالم نهاية قرب الدالة الصبغة بلوغ حتى ساعة2-1 ولمدة / سم فولت7 يقارب البنفسجية فوق األشعة إلى الهالم تعريض بعدDNA الـ عن التقصي يتم (4

.UV transilluminator جهاز بوساطة

● A

piece of E.coli DNA has 60pithes :

a(how long is the DNA molecule?

b(what its volume ?

If The percent of cytosine in a double-stranded DNA is 21%. What is the percent of

thymine in that DNA?

C=G , A=T in DNA Double strand

C=21 G=21

C+G=21+21

=42%

A+T=100-) C+G(

A+T=100-42%

=58% A=T=58/2

=29%

14

.................................................................................... الرابعة المرحلة جزيئي بايلوجي

●What is the base sequence of the DNA strand that would be complementary to the

following single-stranded DNA molecule? How many amino acid can be formed from

it?

5' GGATCTGATCCAGTCAAT 3'

10 م/

االكرلمايد متعدد هالم في الكهربائي Polyacrylamide gel الترحيل

electrophoresis )PAGE(

( االكرلمايد ) ( مادة بلمرة بتشبيك االكرلمايد مكررات اخرى ( acrylamideتنتج بمادة

المشبك عمل )Crosslinkerتعمل بـ ذا ( bisacrylamideتسمى هالميا وسطا ينتج مما

االكرلمايد تركيز باختالف تختلف المشبك (T)فتحات اليتصلب (C )وتركيز الهالم وهذا

مصلبة مادة تضاف لذا الغرفة حرارة بـ بدرجة وتمتازمادة Ammonium per sulfate تعرف

- وارتداء - معها التعامل عند الحذر يجب لذلك عصبيا سامة بكونها بلمرتها قبل االكريلمايد

استنشاقها . وعدم الكفوف

مع خاصة انابيب في او زجاجيتين صفيحتين بين الجل ويصب عمودية تكون الترحيل وحدة

) متعدد ) هالم ويستعمل المنظم المحلوٍل البفر فيهما يوضع وسفلي علوي خزانين

من ) اقل الواطىء الجزيئي الوزن ذات الدنا قطع تعريف او لتحضير 1االكرلمايد

التقنيات( , كفاءة لمعرفة المختلفة البروتينات فصل في يستخدم كما طوال كيلوقاعدة

التعادٍل نقطة لتعيين او الجزيئي الوزن اولتحديد والتنقية االستخالص في المستخدمة

صبغة بواسطة الترحيل اكتماٍل بعد البروتينات تصبيغ ويتم لها Coomassieالكهربائي

Brilliant Blue 250 الى البروتينات ترحيل ينقسم و k ازرقا k لونا البروتينية الحزم تعطي والتي

المستخدمة : البفرات نوع على اعتمادا نوعين

. أ- متشابهين وسفلي علوي بمنظم الترحيل

.ب- مختلفين وسفلي علوي بمنظم الترحيل

الـ/ من عينات ترحيل االكريلمايد DNAتجربة متعدد هالم في

المواد:

الـ ,Polyacrylamid , d H2O, Ammonium per sulfate, TEBهالم Temed مادة

العمل طريقة

)Polyacrylamid مادة من( w/v%)40 بإذابة حضر Polyacrylamid هالم-1 بنسبة

1:99( )acrylamide: bisacrylamide)، التحضير هذا من اخذ (ml15) ، له واضيف (ml15

TEB (5X) محلوٍل من ، ml20 من d H2O ، μl 800 10) من( )%w/v )مادة من

15

.................................................................................... الرابعة المرحلة جزيئي بايلوجي

Ammonium per sulfate μl 80 مادة من Temed ) دارئ محلوٍل واستعمل (X 1.5)

.الكهربائي الترحيل عملية اثناء في TBEمن

أمايد 6اخذ -2 األكريل متعدد خزين من ) مل مع%( 40بتركيز من 6ومزج مل

ammonium per من μl160 معه وخلط dH2O من مل 4 واضيف، )TBE )X5دارئ

sulfate اضافة يتم نفسه بالوقت%( 10) بتركيز μl 16 مادة من TEMED.

لوحي -3 بين الفراغ وملئ جاهزة طبية محقنه بواسطة بسرعة المزيج سحب

المشط . لوضع مكان ترك مع العموديتين الزجاجيتين الترحيل

مدة -4 ليتصلب الدارئ 20ترك محلوٍل من القليل اضيف ، ).TBE)X51دقيقة

المشط ) رفع الترحيل( combقبل حوض داخل القالب ضع ثم الفقاعات لتكون منعا

دارئ على المحتوى ).TBE )X51الكهربائي

بوضع -5 وذلك الهالم حفر في الدنا عينات تحميل عملية بالحفرة .μl20 أجريت

كهربائي -6 بجهد العينات لمدة 20و فولت 100رحلت .3 امبير ساعة

16

.................................................................................... الرابعة المرحلة جزيئي بايلوجي

القياسي Standard curve المنحنى

البياني ) الرسم من نوع كتقنية( Graphهو يستخدم

هذه وتشمل المجهولة البايلوجية النماذج تراكيز لتقدير

القياسية ) العينات من مجموعة استعماٍل التقنية

Standards )والمتدرجة المعلومة والتراكيز الصفات ذات

ويتكون ) البياني الرسم على وتحدد بالجهاز تقاس حيث

Stander curve ) النقاط على مستقيم خط رسم خالٍل من

المجهوٍل ) النموذج كميات بتحديد يسمح الرسم هذا فان وبالتالي (Unknownالمتكونة

. خاصة معادلة استخدام خالٍل من او االحداثيات على التسقيط خالٍل من

والـ البروتينات لتقدير االستخدام شائعة تقنية القياسية سبيل DNAالمنحنيات وعلى

الحليب ) مصل بروتين يستخدم قياسية( Milk serum Albuminالمثاٍل معلومة كعينة

يمكن . التي الصفات اما قياسي منحنى خاللها من يرسم و تراكيز مجموعة منها تحضر

او الضوئية الكثافة او االمتصاصية تكون قد الطريقة هذه في المنحنى ورسم قياسها

. المنبعث االشعاع كمية او التألق

17