第 21 章 毛细管电泳和毛细管电色谱 capillary electrophoresis
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第 21 章 毛细管电泳和毛细管电色谱 capillary electrophoresis. 毛细管电泳（ capillary electrophoresis;CE ）是一类以高压直流电场为驱动力，毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的新型液相分离分析技术。. 毛细管电泳是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学从微升水平得以进入 纳升 水平，并使单细胞分析成为可能。 - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
第第 2121 章 毛细管电泳和毛细管电色谱章 毛细管电泳和毛细管电色谱 capillary electrophoresiscapillary electrophoresis
毛细管电泳（ capillary electrophoresis;CE ）是一类以高压直流电场为驱动力，毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的新型液相分离分析技术。 毛细管电泳是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学从微升水平得以进入纳升水平，并使单细胞分析成为可能。
毛细管电色谱（ capillary electrochromatography; CE
C ）是毛细管电泳与液相色谱相结合形成的一种高效、快速微分离分析技术。
21.121.1 ． 毛细管电泳和毛细管电色谱的基本理论． 毛细管电泳和毛细管电色谱的基本理论21.1.1 ． 双电层和 Zeta 电势
21.1.221.1.2 ． 电泳． 电泳 在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同的速度或速率向其所带电荷相反电场方向迁移的现象叫作电泳。阴离子向正极方向迁移，阳离子向负极方向迁移，中性化合物不带电荷，不发生电泳运动。
在充满自由溶液开口管中球形粒子的电泳速率公式为：
电泳淌度（ μep) 定义为单位场强下离子的平均电泳速率，即
Ev eep
6
E
vepep
21.1.321.1.3 ． 电渗流． 电渗流 电渗是毛细管中整体溶剂或介质在轴向直流电场作用下发生的定向迁移或流动。
电渗的产生和双电层有关，当在毛细管两端施加高压电场时，双电层中溶剂化的阳离子向阴极运动，通过碰撞作用带动溶剂分子一起向阴极移动，形成电渗流 (EOF) 。
度量电渗流大小是单位电场下的电渗流速率即电渗淌度 (eo) 或电渗速率 (ueo) ，可用 Smoluchowski 方程表示：
woeo
E
Eu woeoeo
0
deo t
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L
t
L
Et
L
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1
0
21.1.321.1.3 ． 电渗流． 电渗流 以电场力驱动产生的溶液 EOF ，与高效液相色谱中由高压泵产生的液体流型不同：
电渗是 CE 的基本现象之一，它可以控制组分的迁移速率和方向，进而影响 CE 的分离效率和重现性，所以电渗流控制是 CE 中的关键问题或技术之一。
21.1.4. 21.1.4. 电渗流的控制电渗流的控制影响电渗流的因素很多，直接影响因素有：
1. 电场强度
2. 温度
3. pH 值
4. 缓冲液溶剂
5. 离子强度
6. 添加剂
7. 管壁涂层
21.1.5. 21.1.5. 分离原理分离原理 电泳和电渗流并存，在不考虑相互作用的前提下，粒子在毛细管内电介质中的迁移速率是两种速率的矢量和：
令 µapp=µep + µeo ，称之为表观淌度，即从毛细管电泳测量中得到的淌度为粒子自身的电泳淌度和由电渗引起的淌度之和，并有
在典型的毛细管电泳分离中，溶质的分离基于溶质间电泳速率的差异。电渗流的速率绝对值一般大于粒子的电泳速率，并有效地成为毛细管电泳的驱动力。溶质从毛细管的正极端进样，带正电的粒子最先流出，中性粒子次之，带负电的粒子在中性粒子之后流出。溶质依次通过检测器，得到与色谱图极为相似的电泳分离图谱。
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21.1.5. 21.1.5. 分离原理分离原理 毛细管电色谱由于引入了色谱机制，其保留机理包括两个方面 :
其一，如同 HPLC ，基于溶质在固定相和流动间分配过程；
其二，如同 CE ，基于溶质电迁移过程。 CEC 容量因子可用下式表示：
由于 CEC 既能分离电中性溶质，又能分离带电溶质，对复杂的混合样品显示出强大的分离潜力。
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21.1.6. 21.1.6. 柱效和分离度柱效和分离度 与色谱相同， CE 和 CEC 的柱效一般也用塔板数 N 或塔板高度 H 来表示。实际应用中，可根据以下公式计算：
从理论上分析， CE 分离的柱效可表示为
D 为扩散系数，样品相对分子质量越大，扩散系数越小，柱效越高，所以毛细管电泳比色谱更适合于生物大分子分离分析。
2
2/1254.5
t
tN R
21.1.6. 21.1.6. 柱效和分离度柱效和分离度 类似于 HPLC ， CEC 的柱效可用 vanDeemter 方程表征：
作为一种重要的分离分析手段， CE 和 CEC 仍沿用分离度R 作为衡量分离程度的指标，并定义如下：
)(
)(2
12
12
WW
ttR RR
21.2. 21.2. 毛细管电泳和电色谱仪器装置毛细管电泳和电色谱仪器装置 21.2.1. 仪器基本结构
1 高压电源； 2 毛细管； 3 检测器； 4 电极； 5 缓冲液瓶； 6 恒温系统； 7 记录仪
21.2.2. 21.2.2. 进样系统进样系统 毛细管分离通道十分细小，整个柱体积一般只有 4~5μL ，所需的样品区带只有几纳升。
毛细管电泳的进样方式一般是将毛细管的一端从缓冲液移出，放入试样瓶中，使毛细管直接与样品接触，然后由重力、电场力或其他动力来驱动样品流入管中。进样量可以通过控制驱动力的大小或时间长短来控制。 CE 进样技术均适用于CEC 。
目前有三种方法可以让样品直接进入毛细管：
电动法、压力法和浓差扩散法。
21.2.3. 21.2.3. 电源及其回路电源及其回路 电流回路系统包括高压电源、电极、电极槽、导线和电
解质缓冲溶液等。 CE 和 CEC 一般采用 0 ~ ±30 kV连续可调的直流高压电源。理想的电源应具备：
1. 能输出单极直流高压 ( 一端接地 ) ； 2. 电压、电流、功率输出模式任意可选； 3. 能控制电压、电流或电功率的梯度； 4. 电压输出精度应高于 1% 。 CE 的电极通常由直径 0.5~l mm 的铂丝制成。 电极槽，即缓冲液瓶，通常是带螺口的小玻璃瓶或塑料
瓶 (1~5mL 不等 ) ，要便于密封。缓冲液内含电解质，充于电极槽和毛细管中，通过电极、导线与电源连通，一同构成整个电流回路。
21.2.4. 21.2.4. 毛细管及其温度控制毛细管及其温度控制 熔融石英毛细管在 CE 中应用最广泛，熔融石英拉制得
到的毛细管很脆，易折断，一般在外表面涂有聚酰亚胺保护层，使之变得富有弹性，不易折断。
内径越小，表面积 / 体积比越大，散热效果越好。内径小，样品负载小，检测、进样、清洗等操作困难。
一般使用的毛细管柱内径在 25 ~100 μm 之间，目前最常用的是 50μm 和 75μm 两种。
检测窗口部位的外涂层剥离。 焦耳热效应产生径向温度梯度，还会导致分离重现性差。商品仪器大多有温度控制系统，主要采用风冷和液冷两种方式。
一般采用物理吸附或化学键合两种方式形成毛细管内壁涂层，对石英毛细管进行改性或修饰，可有效控制电渗流、抑制吸附进而优化分离。
21.2.5. 21.2.5. 检测系统检测系统
21.2.5. 21.2.5. 检测系统检测系统
21.3. 21.3. 毛细管电泳分离模式及应用毛细管电泳分离模式及应用21.3.1. 毛细管区带电泳（ capillary zone electrophoresis; CZE）
21.3.1.1. 基本操作条件
毛细管区带电泳也称为毛细管自由溶液区带电泳，是毛细管电泳最基本、也是应用最广的一种操作模式。其分离原理是基于样品组分荷质比的差异。
需要控制的操作变量主要是电压、缓冲液浓度、 pH 值和添加剂等。
缓冲液的选择通常须遵循下述要求：
1．在所选择的 pH范围内有合适的缓冲容量。
2．本底检测响应低。
3．自身的淌度低，即离子大而荷电小。
21.3.1. 21.3.1. 毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（ CZECZE ）） 在 CZE 分离中，除了背景电解质外，常常还在缓冲溶液中加入某些添加剂：
1. 中性盐
2. 表面活性剂
3. 手性添加剂
对于许多水难溶的样品，如果在缓冲液中加入少量的有机溶剂，常常能有效改善分离度。在极端情况下，可完全使用有机溶剂，或以有机溶剂为主体，这就是非水毛细管电泳技术。 图 21-6 电渗流反向示意
图
21.3.1. 21.3.1. 毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（ CZECZE ））21.3.1.2. 应用
毛细管区带电泳特别适合分离带电化合物，包括无机阴离子、无机阳离子、有机酸、胺类化合物、氨基酸、蛋白质等，不能分离中性化合物。
毛细管区带电泳 3 分钟内分离 30 种阴离子电泳图
21.3.2. 21.3.2. 胶束电动毛细管色谱（胶束电动毛细管色谱（ MEKCMEKC ）） MEKC 是在电泳缓冲溶液中加入表面活性剂，当溶液中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂分子之间的疏水基团聚集在一起形成胶束，成为分离体系的准固定相，溶质基于在水相和胶束相之间的分配系数不同而得到分离。
21.3.2. 21.3.2. 胶束电动毛细管色谱（胶束电动毛细管色谱（ MEKCMEKC ）） MEKC 是在电泳缓冲溶液中加入表面活性剂，当溶液中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂分子之间的疏水基团聚集在一起形成胶束，成为分离体系的准固定相，溶质基于在水相和胶束相之间的分配系数不同而得到分离。
电泳流和电渗流的方向相反，且 ν 电渗流 > ν 电泳 ，负电胶束以较慢的速度向负极移动；
可用来分离中性物质
色谱与电泳分离模式的结合。
21.3.3. 21.3.3. 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳（（ CGECGE ）） 毛细管凝胶电泳 (capillary gel electrophoresis;CGE)是在毛细管中充填多孔凝胶作为支持介质进行电泳，其分离是基于筛分机理。
CGE常用于蛋白质，寡聚核苷酸、 RNA及 DNA片段的分离和测定。
凝胶是毛细管电泳的理想介质，粘度大，抗对流，能减少溶质的扩散，因此能限制谱带的展宽，所得的峰型尖锐，柱效高，有可能使组分在短柱上实现极好的分离。
常用的凝胶有聚丙烯酰胺和琼脂糖，应用最多的是前者。
21.3.4. 21.3.4. 毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦（（ CIFFCIFF ））
1. 根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；
2. 毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的
脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（ 6 ～ 8V ）
时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的 pH 梯度；
3. 氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液 pH 有关，在
酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中
性，淌度为零；
21.3.4. 21.3.4. 毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦（（ CIFFCIFF ）） 1. 根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；
2. 毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（ 6 ～ 8V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的 pH梯度；
3. 氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液 pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；
4. 聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点 pH 的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离。
21.3.4. 21.3.4. 毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦（（ CIFFCIFF ）） 1. 根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；
2. 毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（ 6 ～ 8V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的 pH梯度；
3. 氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液 pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；
4. 聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点 pH 的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离。
21.3.5. 21.3.5. 毛细管等速电泳毛细管等速电泳（（ CITPCITP ）） 1. 将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子 (充满毛细管 )和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。
2. 负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。
3. 不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同 (ν=μE)，淌度大的离子区带电场强度小；
沿出口到进口，将不同区带依次排序 1、 2、 3、 4 电场强度依次增大。假设“ 2”号中离子扩散到“ 3”号，该区电场强度大，离子被加速，返回到“ 2”区；当“ 2”号中离子跑到“ 1”号区，离子被减速使之归队；
4. 特点：界面明显，富集、浓缩作用；
21.4. 21.4. 毛细管电色谱柱技术毛细管电色谱柱技术
毛细管电色谱（ CEC）是毛细管电泳与高效液相色谱的有机结合，其基本理论、仪器装置与毛细管电泳大致类似。
最大的不同是毛细管柱引入了色谱固定相，使CEC同时具有 CE与 HPLC的分离机理，对中性物质和荷电物质都能达到理想的分离效果。
因此毛细管柱是 CEC的心脏，制柱技术是 CEC的关键。按照固定相不同形式， CEC可分为填充柱、开管柱和整体柱（连续床）。
21.4.1. 21.4.1. 填充柱填充柱
填充柱在 CEC中应用最广泛，其最大优点是可以利用众多的 HPLC固定相，根据化合物与固定相作用不同实现高效分离。
1 入口柱塞 ; 2 填充部分 ; 3 出口柱塞 ; 4 检测窗口 ; 5 开管部分
21.4.1. 21.4.1. 填充柱填充柱
21.4.1.1. 柱塞制作
柱塞的制作对于填充柱非常关键。合格的柱塞必须满足如下要求：
有足够的机械强度 , 能够承受填充时的高压；
化学惰性，耐有机溶剂和宽pH值的缓冲液；
有合适的孔隙率，既不使流动相受阻，又可防止固定相颗粒通过；
死体积小，避免电色谱峰展宽。
柱塞制作方法很多，目前应用较多的有水玻璃烧制法和填料直接烧制法。
21.4.1. 21.4.1. 填充柱填充柱
21.4.1.2. 填充柱制备
高压匀浆填充法 电动填充法
21.4.1. 21.4.1. 填充柱填充柱
21.4.1.3. CEC填充固定相
在成功掌握填充柱制备技术条件下， CEC固定相是影响毛细管填充柱分离选择性、柱效、分离速度的重要因素，也是发展新型 CEC分离模式的基础。
应用于 HPLC的各种固定相已被应用于 CEC的分离分析中，其中以十八烷基键合硅胶固定相 (ODS)研究最多，由于 CEC是以电驱动流动相，不存在柱压降问题，因而可以采用粒径很小的固定相，以提高柱效。
混合官能团固定相是专门针对 CEC研制的新型填料，这一类固定相在硅胶表面同时键合具有反相色谱性能的烷基官能团和具有离子交换性质的磺酸官能团，在很宽的 pH范围内都能保持良好的电渗流。
21.4.1. 21.4.1. 填充柱填充柱
21.4.1.3. CEC填充固定相
21.4.1. 21.4.1. 填充柱填充柱
21.4.1.4. 气泡问题
填充柱 CEC操作中的困难是在分离过程中常常伴有气泡产生。气泡一般产生于柱塞与填料交界处或柱塞与检测窗口交界处。
控制气泡的产生，目前主要采取以下措施：
1. 加压，在两端同时施加低压，可较好解决气泡问题。
2. 制备渗透性好的塞子。
3. 利用阻尼管以消除气泡，在分流阀处接一阻尼管，当电极处有气泡产生时，气泡会经分流阀通过阻尼管排出。
4. 利用超声波使样品和流动相充分脱气。
21.4.2. 21.4.2. 开管柱开管柱
开管柱 CEC是在管壁键合或涂覆固定相，引入色谱分配机理。
优点：
无须烧制柱端塞子，少有气泡产生。
开管柱 CEC无涡流扩散，能获得比填充柱 CEC更高的柱效。
缺点：
开管毛细管电色谱柱相比是填充柱的 1/350 ，柱容量低，对溶质的保留有限。
开管柱制备的关键是增大表面积，以制备相比大、柱容量高的色谱柱。主要制备方法有：涂覆聚合物固定相、化学键合固定相和溶胶 -凝胶技术。
21.4.3. 21.4.3. 整体柱（连续床）整体柱（连续床）
整体柱（又称为连续床）是近年来发展的 CEC制柱新技术，其结构和制备技术与 HPLC整体柱相同，一般采用柱内直接聚合的方法，形成整块多孔的交联聚合物，无须制作柱塞，因而简化了 CEC柱制备过程。
得到的固定相含有通透孔和微孔网络结构，有很好的渗透性，对流动相阻力小，溶质在流动相与固定相间快速分配，实现高速高效分离分析。
按照制柱材料，可分为有机高分子整体柱和硅胶基质整体柱。有机高分子整体柱的制备方法是将功能单体、交联剂和致孔剂混合溶液注入毛细管内，在一定的条件下发生原位自由基聚合反应。
另一种方法是先在毛细管内填充 HPLC固定相，再将反应剂四甲氧基硅烷、致孔剂、缓冲溶液等充分混和后引入毛细管反应，经后续处理形成连续床固定相。
21.4.4. CEC21.4.4. CEC应用应用
反相 CEC分离 14种火药及其降解成分
