ФОСФАЗИД

МЕДПРАКТИКА-ММосква, 2017

А.В. Кравченко, Г.А. Галегов, В.Г. Канестри

3

УДК 615.31+616.981.21 ББК Р514.87-5 Ф 812

А.В. Кравченко, Г.А. Галегов, В.Г. Канестри ФОСФАЗИД.– М.: ИД «МЕДПРАКТИКА-М», 2017, 208 с.

© А.В. Кравченко, Г.А. Галегов, В.Г. Канестри, 2017© Оформление: ИД «МЕДПРАКТИКА-М», 2017

ISBN978-5-98803-371-4

Монография «Фосфазид» – это результат обобщения многолетнего опыта кли-нического использования отечественного антиретровирусного препарата. В книге освещены различные аспекты создания и успешного применения фос-фазида. Протоколами диспансерного наблюдения и лечения ВИЧ-инфекции он рекомендован для терапии больных ВИЧ-инфекцией в составе предпочти-тельных и альтернативных схем АРВТ первого ряда. Отдельно обсуждаются во-просы разработки комбинированной лекарственной формы Фосфаладин®, со-держащей фиксированные дозы фосфазида и ламивудина.

Рецензенты:Максимов Семен Леонидович – доктор медицинских наук, профессор ка-

федры инфекционных болезней и эпидемиологии ФГБОУ ВО «Мо-сковский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Минздрава России.

Воробьёва Майя Сергеевна – доктор медицинских наук, профессор, главный эксперт Управления противовирусных МИБП ФГБУ «На-учный центр экспертизы средств медицинского применения» Минз-драва России.

АВТОРЫ

Кравченко Алексей Викторович – доктор медицинских наук, про-фессор, ведущий научный сотрудник специализированного научно-исследовательского отдела по профилактике и борьбе со СПИДом ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспо-требнадзора.

Галегов Георгий Артемьевич – доктор биологических наук, про-фессор, заведующий лабораторией химиотерапии вирусных инфекций Института вирусологии им. Д.И. Ивановского, ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

Канестри Вероника Геннадиевна – доктор медицинских наук, старший научный сотрудник специализированного научно-исследовательского отдела по профилактике и борьбе со СПИДом ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора.

4 ФОСФАЗИД 5

СОДЕРЖАНИЕ

Условные обозначения .......................................................................................6Предисловие .......................................................................................................8введение ...........................................................................................................10

Глава 1. ТеореТические основы создания фосфазида – анТиреТровирУсноГо ПреПараТа ПролонГированноГо дейсТвия ................................ 14Глава 2. физико-химические и фармацевТические свойсТва фосфази-да, лекарсТвенные ПреПараТы на еГо основе .................................................31

Физико-химические свойства фосфазида .............................................................32Биофармацевтическая растворимость фосфазида ................................................34Фармацевтические свойства фосфазида................................................................34Лекарственные препараты фосфазида ...................................................................36

Глава 3. доклиническое изУчение фосфазида ...............................................373.1. Доклинические исследования эффективности и безопасности препа-

рата фосфазид ...................................................................................................373.2. Доклиническое исследование эффективности и безопасности комби-

нации фосфазида с ламивудином ...................................................................... 52

Глава 4. клиническое изУчение фосфазида ...................................................814.1. Данные по эффективности и безопасности, полученные в результате

клинического исследования фосфазида .........................................................814.2. Опыт пострегистрационного/постмаркетингового применения

препарата ...........................................................................................................86

Глава 5. Применение фосфазида У больных особых каТеГорий .................1175.1. Фосфазид в схемах АРВТ у больных ВИЧ-инфекцией и ХГС, полу-

чавших лечение ХГС .....................................................................................1175.2. Применение Фосфазида у больных острым гепатитом В .........................1355.3. Фосфазид в схемах АРВТ у больных ВИЧ-инфекцией туберкулезом .....1385.4. Фосфазид в схемах перинатальной химиопрофилактики передачи ВИЧ ......1415.5. Фосфазид в схемах АРВТ у ВИЧ-инфицированных больных с тяже-

лым иммунодефицитом, в том числе в стадии СПИДа .............................1685.6. Применение Фосфазида в комплексе первичных профилактических

мероприятий по предотвращению заражения ВИЧ-инфекцией ...............175

Глава 6. обсУждение данных и ПерсПекТивы дальнейшеГо Применения фосфазида .......................................................................................................185заключение .....................................................................................................194Приложения ...................................................................................................201

Светлой памяти академика РАН Александра Антоновича Краевского

посвящается

Краевский Александр Антонович (1932–1999), специалист в обла-сти молекулярной биологии и химии биологически активных соеди-нений, академик РАН (1994) по Отделению биохимии, биофизики и химии физиологически активных соединений (физико-химическая биология), заместитель директора института молекулярной биоло-гии им. В.А. Энгельгардта РАН по научной работе.

В 1987 году в лаборатории химического и биологического анализа биополимеров и клеток Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН под руководством академика Александра Антоновича Краевского ученые синтезировали новое вещество, блокирующее размножение вируса иммунодефицита человека – фосфазид.

В 1995–1999 гг. в России были проведены клинические ис-пытания первого оригинального отечественного антиретровирус-ного препарата фосфазид, вдохновителем которых был Президент РАМН, академик Валентин Иванович Покровский.

6 ФОСФАЗИД 7

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

АЗТ (АZТ) – азидотимидин АлАТ – аланинаминотрансфераза АРВТ – антиретровирусная терапияАРВП – антиретровирусные препараты АсАТ – аспартатаминотрансфераза АЧН – абсолютное число нейтрофилов БВО – быстрый вирусологический ответ ВГВ – вирус гепатита В ВГС – вирус гепатита СВИЧ – вирус иммунодефицита человека ГГТ – гаммаглутамилтранспептидаза ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИФА – иммуноферментный анализ ИИ – ингибиторы интегразы ВИЧИП – ингибиторы протеазы ВИЧ КУБ – кислотоустойчивые бактерии КФК – креатининфосфокиназа ЛДГ – лактакдегидрогеназаЛПВП – липопротеиды высокой плотности ЛПНП – липопротеиды низкой плотности НВО – непосредственный вирусологический ответНИОТ – нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы

ВИЧННИОТ – ненуклеозидные ингибиторы обратной транскрипта-

зы ВИЧНЯ – нежелательные явления ОГВ – острый гепатит ВПегИФН – пегилированный интерферон ПТП – противотуберкулезная терапия ПЦР – полимеразная цепная реакция РБВ – рибавиринРВО – ранний вирусологический ответРНК – рибонуклеиновая кислота

СНЯ – серьёзное нежелательное последствиеСПИД – синдром приобретенного иммунодефицита УВО – устойчивый вирусологический ответ ТТГ – тиреотропный гормон Ф-АЗТ – фосфазидХГВ – хронический гепатит ВХГС – хронический гепатит СХП – химиопрофилактика ЦНС – центральная нервная система ЩФ – щелочная фосфатаза ЭКГ – электрокардиограммаABC – абакавирATV – атазанавирd4T – ставудин ddC – зальцитабин ddI – диданозин DLV – делавердин DRV – дарунавир DTG – долютегравир EFV – эфавиренз ENF – энфувиртид ETR – этравирин EVG – элвитегравир FPV – фосампренавир FTC – эмтрицтабин IDV – индинавир MVC – маравирок NFV – нелфинавир NVP – невирапин RAL – ралтегравир RPV – рилпивирин RTV – ритонавир SQV – саквинавирTAF – тенофовира алафенамидTDF – тенофовира дизопроксил фумарат TPV – типранавирZDV – зидовудин 3TC – ламивудин

8 ФОСФАЗИД 9

ПРЕДИСЛОВИЕ

Широкое внедрение в клиническую практику антиретровирусной терапии позволило существенно продлить и улучшить качество жиз-ни больных ВИЧ-инфекцией. Настоящая монография посвящена оригинальному отечественному антиретровирусному препарату монофосфонату азидотимидина – Фосфазиду (коммерческое на-звание Никавир®). За разработку и внедрение препарата фосфазид в клиническую практику группа российских ученых была удостоена государственной премии Российской Федерации в области науки и техники за 2000-й год.

Препарат Никавир® рекомендован Российским национальным научным обществом инфекционистов в качестве одного из клю-чевых препаратов из группы нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ в схемах первой линии терапии больных ВИЧ-инфекцией.

В монографии представлены результаты доклинических и клинических исследований, обобщен опыт применения препарата в составе схем АРТ, том числе и у особых категорий больных ВИЧ-инфекцией (беременные, больные вирусными гепатитами, туберкулезом). В клинической апробации фосфазида принимали участие сотрудники Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИДом, Республиканской клинической инфекционной больницы (пос. Усть-Ижора, г. Санкт-Петербург), Санкт-Петербургского, Московского областного, Нижегородского, Пермского, Красноярского, Тверского, Тюменского, Волгоградско-го, Краснодарского и Ставропольского центров СПИД.

Особый интерес для практикующих врачей представляет раздел, посвященный перспективам применения фосфазида в сочетании с ламивудином в виде комбинированной формы. Также в моногра-фии представлены результаты доклинических и клинических ис-следований I фазы нового перспективного лекарственного сред-ства 6НР – препарата пролонгированного действия с однократ-ным приемом в сутки.

Монография А.В. Кравченко, Г.А. Галегова, В.Г. Канестри «Фосфазид» представляет несомненный интерес для врачей-инфекционистов и других специалистов, оказывающих медицин-скую помощь больным ВИЧ-инфекцией.

Действительный член РАН,доктор медицинских наук,

профессор Вадим Валентинович Покровский

10 ФОСФАЗИД Введение 11

ВВЕДЕНИЕ

Более 25 лет в Российской Федерации для лечения больных ВИЧ-инфекцией применяют антиретровирусные препараты. Эра антиретровирусной терапии (АРВТ) в России началась в 1987 г., когда был зарегистрирован первый антиретровирусный препарат – Зидовудин (Азидотимидин, Ретровир, Тимазид).

К настоящему времени (февраль 2017 г.) на территории Россий-ской Федерации зарегистрировано 24 антиретровирусных препарата 6 лекарственных групп: нуклеозидные (НИОТ) и ненуклеозидные (ННИОТ) ингибиторы фермента «обратная транскриптаза ВИЧ»; ингибиторы фермента «протеаза ВИЧ» (ИП); ингибиторы процесса присоединения ВИЧ к клеткам (фузии); ингибиторы рецепторов CCR5 и ингибиторы фермента «интеграза ВИЧ» (ИИ).

Согласно данным Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИДом ФБУН Центрального НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора и статистической учетной фор-мы №61 на 31 декабря 2016 г. общее число ВИЧ-инфицированных граждан Российской Федерации превысило 1 070 000 человек. Толь-ко в течение 2015 г. диагноз ВИЧ-инфекции был установлен 100 220 жителям Российской Федерации. Согласно кумулятивным данным формы мониторинга приоритетного национального проекта «Здо-ровье» по состоянию на 31 декабря 2016 г. в России умерло более 240 000 инфицированных ВИЧ, в т.ч. за 2015 г. – 27 654.

Среди впервые взятых под наблюдение в 2015 г. стадию вторичных проявлений имели 32,7% (в 2011 г. – 24,4%) больных ВИЧ-инфекцией россиян, а значит, они уже нуждались в назначении АРВТ. В конце 2016 г. около 250 000 (в конце 2015 г. – около 217 000) больных ВИЧ-инфекцией получали АРВТ. Вместе с тем, согласно существующим рекомендациям, назначение АРВТ показано 600–700 тыс. пациентам.

Несмотря на то, что современная АРВТ широко применяется уже более 18 лет, определенные трудности при выборе схемы лечения вызывают особые группы больных ВИЧ-инфекцией, к которым относят больных хроническими вирусными гепатитами, туберку-

лезом. Лечение больных сочетанной патологией (ВИЧ-инфекция и хронический вирусный гепатит, ВИЧ-инфекция и туберкулез) довольно сложно, поскольку пациенту необходимо принимать большое количество лекарственных препаратов, между которыми существуют лекарственные взаимодействия.

Кроме того, пациент, помимо ВИЧ-инфекции, хронических вирусных гепатитов и туберкулеза, может страдать другими вто-ричными и сопутствующими заболеваниями (церебральным ток-соплазмозом, цитомегаловирусной инфекцией, пневмоцистной пневмонией и др.), лечение которых может создавать дополнитель-ные сложности. Существенная доля российских пациентов являет-ся внутривенными потребителями психоактивных веществ (более 55%, по данным Федерального НМЦ ПБ СПИД), злоупотребляет алкоголем, что приводит к нарушениям режима лечения, привер-женности терапии и в значительной степени снижает вероятность успешного исхода лечения.

Применяемые в настоящее время схемы АРВТ обладают высокой эффективностью, поэтому среди современных антиретровирусных препаратов преимущество имеют лекарственные средства, облада-ющие хорошей переносимостью и минимальными лекарственны-ми взаимодействиями. К таким препаратам можно отнести отече-ственный препарат из группы нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ – фосфазид (Н-фосфонат азидотимидина, Ни-кавир®, Ф-АЗТ), который в 1999 г. был утвержден к применению на территории России, а коллектив авторов под руководством ака-демика РАН Краевского А.А., за разработку стратегии получения ингибиторов вируса иммунодефицита человека и создания фосфа-зида – нового лекарственного препарата для лечения людей, был удостоен государственный премии Российской Федерации в обла-сти науки и техники за 2000-й год (Приложение).

В соответствии с Клиническими рекомендациями «ВИЧ-инфекция и СПИД» М, ГЕОТАР-Медиа, 2016 – 111 с., препарат фосфазид ре-комендован для терапии больных ВИЧ-инфекцией в составе предпо-чтительных и альтернативных схем АРВТ первого ряда, в том числе и для лечения беременных женщин, больных хроническими вирус-ными гепатитами, туберкулезом и другими заболеваниями.

По своей структуре фосфазид является фосфонатным произ-водным зидовудина. После перорального приема фосфазид мета-

12 ФОСФАЗИД Введение 13

болизируется двумя путями одновременно: 1) одна его часть мед-ленно гидролизуется в русле крови человека и в лейкоцитах непо-средственно в АЗТ, который далее подвергается действию клеточ-ных тимидинкиназы, тимидилаткиназы и неспецифической кина-зы, последовательно метаболизируясь в дальнейшем путем фос-фолирирования с образованием моно-, ди- и трифосфатных со-единений, конкурирующих, в свою очередь, с природным суб-стратом тимидин-трифосфатом за встраивание в цепи вирусной РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы), из-бирательно подавляя тем самым дальнейшую репликацию и рост вирусной ДНК; 2) другая часть фосфазида при попадании в клетку окисляется в азидотимидин-5’-фосфат, минуя таким образом пер-вую стадию внутриклеточного фосфорилирования свободного АЗТ. Важным свойством фосфазида в первом варианте метаболическо-го пути является его способность медленно дефосфорилироваться до АЗТ, при этом существенно улучшается фармакокинетический профиль азидотимидина по сравнению с пероральным приемом по-следнего, а значительное снижение Сmax не приводит к уменьше-нию противовирусной активности но, напротив, уменьшает ток-сичность терапии. Указанные особенности фармакокинетики пре-парата позволяют пролонгировать интервалы между приемами ле-карства, что наряду с созданием пролекарства тенофовира – пре-парата Виреад® – является ярким примером успеха и целесообраз-ности направления создания депоформ известных антиретрови-русных препаратов. В случае реализации второго альтернативного пути метаболизма фосфазида удается существенным образом уве-личить скорость замены природных нуклеозид-5’-трифосфосфатов на модифицированные нуклеозид-5’-трифосфаты, за счет чего ле-карственный препарат становится более эффективным и позволя-ет добиваться хорошего клинического результата без увеличения доз, избегая, таким образом, возникновения побочных эффектов на фоне терапии. Поэтому применение фосфазида наиболее це-лесообразно в тех случаях, когда необходимо снизить токсическое действие антиретровирусной терапии.

Таким образом, фосфазид является эффективным антиретрови-русным препаратом пролонгированного действия. Азидотимидина трифосфат – конечный продукт метаболизма фосфазида, образую-щийся при всех вариантах метаболических путей, действует одно-

временно и как конкурентный ингибитор, и как субстрат для дей-ствия обратной транскриптазы вируса. Способность фосфазида ин-гибировать обратную транскриптазу ВИЧ в 100 раз выше, чем спо-собность подавлять ДНК-полимеразу человека. Отмеченное позво-ляет избежать целого ряда побочных эффектов, связанных, прежде всего, с митохондриальной токсичностью антиретровирусных пре-паратов, влиянием на цикл Кребса и β-окисление жирных кислот, а также снижением эффективности карнитинацилтрансферазного транспорта жирных кислот через мембрану митохондрий. Поэтому 3'-азидо-3'-дезокситимидин-5'-фосфонат натрия (Фосфазид/Ника-вир®), одобренный в России для терапии больных ВИЧ-инфекцией, существенно менее токсичен, чем АЗТ.

Многолетний опыт широкого клинического применения фосфазида является отличным практическим подтверждением этих слов. Авторы монографии выражают благодарность всем спе-циалистам центров СПИД Российской Федерации в разные годы, принимавшим участие в клинических исследованиях препарата Фосфазид: О.Г. Юрину, Н.В. Козыриной, У.А. Куимовой, Д.С. Кон-нову (Федеральный НМЦ ПБ СПИД, г. Москва), Е.Е. Воронину, Ю.А. Фомину, Л.Ю. Афониной (Республиканская клиническая инфекционная больница, пос. Усть-Ижора, Ленинградская обл.), Е.Н. Виноградовой, Н.А. Белякову, Н.В. Сизовой, А.М. Пантелееву, Д.Б. Купцову (г. Санкт-Петербург), Г.Ф. Мошковичу, С.В. Мина-евой (г. Нижний Новгород), Э.С. Ивановой, Н.Н. Воробьевой) (г. Пермь), Н.Ю. Ганкиной (г. Красноярск) и другим коллегам. Осо-бую благодарность авторы монографии выражают академику РАН В.В. Покровскому за многолетнюю поддержку исследований оте-чественных инновационных препаратов и внедрения их в клини-ческую практику.

Авторы выражают признательность А.В. Кононову и А.Ф. Хохло-ву за представленные материалы и активное участие в подготовке настоящего издания.

Авторы с благодарностью воспримут критические замечания и предложения читателей, направленные на улучшение содержания книги.

14 ФОСФАЗИД Глава 1. Теоретические основы создания фосфазида 15

Глава1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СОЗДАНИЯ ФОСФАЗИДА –

АНТИРЕТРОВИРУСНОГО ПРЕПАРАТА ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ

Антиретровирусные препараты (АРП) нацелены на уязвимые этапы жизненного цикла ВИЧ. Основной их недостаток заключа-ется в том, что они подавляют репродукцию вируса лишь частично и на относительно небольшое время, тогда как вирусная нагрузка и скорость размножения вируса высоки. В жизненном цикле ВИЧ имеется несколько ключевых звеньев, воздействие на которые по-зволяет прервать размножение вируса:

• присоединениевируснойчастицыклимфоцитучеловекапо-средством соединения гликопротеидов 41 и 120 вируса к кле-точному рецептору CD4 и хемокиновым ко-рецепторам (CCR5 и СХСR4);

• синтезвируснойДНКнаматрицеРНКврезультатедействияфермента ВИЧ – обратной транскриптазы;

• встраивание провирусной ДНК в ДНК человека с помощьюфермента ВИЧ – интегразы;

• формированиебелковвирусаподдействиемпротеазыВИЧ.В настоящее время разработаны и внедрены в лечебную практи-

ку лекарственные препараты, способные воздействовать на все эти звенья репликации ВИЧ, в том числе путем блокады ферментов ВИЧ – обратной транскриптазы, интегразы и протеазы [1].

Первую (в том числе и по времени внедрения в клиническую практику) группу составляют нуклеозидные ингибиторы процес-са обратной транскрипции, называемые также нуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы (НИОТ) ВИЧ и нукле-отидные ингибиторы этого фермента (монофосфонаты нуклео-зидов). Являясь дефектным аналогом того или иного нуклеози-да, эти препараты встраиваются в строящуюся цепочку вирусной ДНК, при этом обратная транскриптаза ВИЧ не может присое-

динить к ним следующий нуклеозид, и дальнейшее построение цепочки нарушается.

В зависимости от того, аналогом какого нуклеозида является препарат, лекарственные средства этой группы можно объединить в следующие подгруппы:

А. Аналоги тимидина – нуклеозидные аналоги: зидовудин (ZDV), ставудин (d4T), нуклеотидный аналог – фосфазид (Ф-АЗТ).

Б. Аналоги цитидина – нуклеозидные аналоги: ламивудин (3TC), эмтрицитабин (FTC).

В. Аналоги аденина – нуклеозидные аналоги: диданозин (ddI), ну-клеотидный аналог – тенофовира дизопроксил фумарат (TDF) и тенофовира алафенамид – пролекарство тенофовира (TAF).

Г. Аналоги гуанина – нуклеозидные аналоги: абакавир (ABC).Д. Комбинированные препараты – зидовудин/ламивудин

(ZDV/3TC), абакавир/зидовудин/ламивудин (ABC/ZDV/3TC), абакавир/ламивудин (АВС/3ТС), тенофовир/эмтрицитабин (TDF/FTC), тенофовира алафенамид/ эмтрицитабин (TAF/FTC). В группу НИОТ входил и вышедший ныне из употребления препарат зальцитабин (ddC).

Вторую группу составляют ненуклеозидные ингибиторы фермен-та обратной транскриптазы (ННИОТ) ВИЧ. Эти препараты встра-иваются в активный центр фермента вируса и таким образом бло-кируют дальнейшее построение РНК ВИЧ. В арсенале врачей име-ется 5 препаратов этой группы:

Делавердин (DLV), который в России никогда не был зареги-стрирован, а за рубежом практически вышел из употребления; Не-вирапин (NVP); Рилпивирин (RPV); Этравирин (ETR); Эфавиренз (EFV). В настоящее время завершены клинические исследования и поданы документы на регистрацию в России нового отечественно-го препарата из группы ННИОТ Элсульфавирина (EPV).

Третью группу составляют ингибиторы протеазы (ИП) ВИЧ. Протеаза ВИЧ-1 расщепляет полипротеин Gag-Pol на отдельные структурные белки и ферменты. При этом образуются зрелые ви-русные частицы. ИП связываются с активным центром протеазы ВИЧ и препятствуют продукции вирусных белков. После действия ИП вирусные частицы получаются нежизнеспособными, поэтому они не поражают другие клетки. В настоящее время применяют следующие ИП: Атазанавир (ATV); Дарунавир (DRV); Индинавир

16 ФОСФАЗИД Глава 1. Теоретические основы создания фосфазида 17

(IDV); Нелфинавир (NFV); Ритонавир (RTV); Саквинавир (SQV); Типранавир (TPV); Фосампренавир (FРV); Лопинавир/ритонавир (LPV/r) – единственный, зарегистрированный в России, комбини-рованный препарат из этой группы.

К четвертой группе относят ингибитор фузии (процесс подтяги-вания вирусной частицы к лимфоциту) Энфувиртид (Т-20, ENF), который препятствует проникновению вируса в клетку, ингибируя слияние, связанное с вирусным белком gp41, и ингибитор хемоки-нового рецептора CCR5 Маравирок (MVC).

Пятая группа представлена ингибиторами фермента интегразы (ИИ) Ралтегравиром (RAL), Элвитегравиром (EVG) и Долютегра-виром (DТG).

Препараты блокируют ковалентное прикрепление (или интегра-цию) линейной ДНК ВИЧ-1 в геном клетки-хозяина, предотвра-щая образование провируса ВИЧ-1, таким образом, блокируя раз-множение вируса.

В начале 80-х годов ХХ века, когда в зарубежной научной литературе были опубликованы описания первых случаев ВИЧ-инфекции, одним из наиболее перспективных направлений хи-миотерапии представлялось подавление ранних стадий реплика-ции ВИЧ, в результате чего нарушался синтез провирусной ДНК и включение ее в геном клетки. Препараты из группы нуклео-зидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ до настояще-го времени являются основой схем антиретровирусной терапии (АРВТ) и будут являться таковыми в обозримом будущем. Они применяются в сочетании с ненуклеозидными ингибиторами об-ратной транскриптазы ВИЧ или ингибиторами протеазы ВИЧ или ингибиторами интегразы ВИЧ, а также ингибиторами хемокино-вых рецепторов (CCR5).

В соответствии с современными представлениями молекулярный механизм действия модифицированных нуклеозидов включает не-сколько стадий. После пассивной диффузии или активного транс-порта в клетки для подавления репликации ВИЧ нуклеозид дол-жен пройти каскад трех реакций фосфорилирования, после чего эффективно и селективно подавить биосинтез провирусной ДНК, включаясь в 3`-конец новосинтезируемой цепи ДНК, и из-за от-сутствия гидроксила в 3’-положении модифицированного нуклео-тидного остатка, уже в цепи ДНК терминировать синтез. Схема ак-

тивации на примере AZT представлена на рис. 1.1, а последующей терминации элонгации провирусной ДНК – на рис. 1.2.

Первая стадия фосфорилирования, превращающая AZT в AZT-монофосфат (AZTMP), катализируется клеточной тимидинкиназой; далее AZTMP при катализе тимидилаткиназой фосфорилируется в соответствующий дифосфат (AZTDP) и, наконец, при участии тре-тьего фермента; (по-видимому, нуклеозиддифосфаткиназой) – в трифосфат – AZTTP. В свою очередь, AZTTP селективно ингиби-рует синтез ДНК, катализируемый обратной транскриптазой ВИЧ. В активации d4T участвуют те же ферменты, для ddC и 3TC катализ осуществляется, главным образом, дезоксицитидин-специфичными ферментами, а для ddI – дезоксиаденозин-специфичными фермен-тами. Однако, активность почти всех этих ферментов в клетках до-статочно высока только в период фазы репликации ДНК, что дости-гается при иммуностимуляции лимфоцитов. В свою очередь, имму-ностимуляция активирует репликацию ВИЧ, в результате чего вре-мя накопления в клетках активных форм ингибиторов соизмеримо со временем одного полного раунда репликации вируса.

N3

OOH

Thy

N3

OO

ThyP

O

OH

OH

P

O

OH

OH

N3

OO

ThyP

O

O

OH

P

O

OH

OH

P

O

O

OH

N3

OO

ThyP

O

O

OH

AZT AZTMP AZTDP AZTTP

Рис.1.1.СхемавнутриклеточнойактивацииAZT.

AZTMP – монофосфат AZT; AZTDP – дифосфат AZT; AZTTP – трифосфат AZT

Рис.1.2.СхемаселективнойтерминациибиосинтезапровируснойДНК

18 ФОСФАЗИД Глава 1. Теоретические основы создания фосфазида 19

Среди наиболее существенных недостатков лекарств нуклеозид-ной природы следует назвать следующие: 1) достаточно высокую токсичность, так как они участвуют во многих метаболитических ре-акциях, которым подвержены природные нуклеозиды; 2) замедлен-ное ингибирующее действие на репликацию ВИЧ (необходимость трех этапов фосфорилирования); 3) быстрое выведение препарата из крови человека; 4) образование резистентности как к ВИЧ, так и лейкоцитов к этим препаратам, хотя и относительно медленное по сравнению с препаратами из группы ННИОТ.

Приведенные выше причины определили необходимость поиска новых лекарственных препаратов ингибирующих репликацию ВИЧ. Особый интерес как 25 лет назад, так и в настоящее время пред-ставляют фосфорилированные формы модифицированных нукле-озидов зависимые либо от меньшего количества фосфорилирую-щих ферментов, либо в идеальном случае вообще не зависимые от этих ферментов. Однако на пути создания таких ингибиторов сто-ял ряд значительных трудностей:

Такие соединения должны были:1. Сохранить активность и селективность при подавлении ре-

пликации ВИЧ в клетках. Однако принципы конструирова-ния молекул с такими свойствами до настоящего времени не разработаны.

2. Быть достаточно устойчивы в крови человека и клеточной ци-топлазме, содержащих большое разнообразие и высокую ак-тивность дефосфорилирующих ферментов.

3. Достаточно хорошо диффундировать в инфицированные клет-ки, а также иметь другие приемлемые фармакологические по-казатели, в том числе низкую токсичность.

4. Обеспечивать более медленное образование вирусной и кле-точной резистентности.

В 1983–1985 годах сначала в СССР, а с 1991 г. – в Российской Федерации было начато создание теоретической основы поиска ле-карств этой группы, которая включала несколько этапов, опреде-ляемых логикой поставленной задачи:

1. Разработка теоретических основ создания эффективных и се-лективных нуклеозидных ингибиторов репликации ВИЧ. В ка-честве вирусной мишени для ингибирования была избрана об-ратная транскриптаза ВИЧ – вирусный фермент, первым на-

чинающий многостадийный цикл репликации вируса. Этот подход предусматривает также создание рациональных мето-дов синтеза многих групп модифицированных нуклеозидов, нуклеотидов и нуклеозид-трифосфатов.

2. Введение в практику вирусологической работы инфицирован-ных ВИЧ клеточных культур и применение их для исследова-ния активности ингибиторов.

3. Изучение метаболизма отобранных для углубленного исследо-вания ингибиторов в крови человека.

4. Токсикологическое и фармакологическое исследование луч-ших ингибиторов на экспериментальных животных.

Начиная с 1980 г. в лаборатории химического и биологического анализа биополимеров и клеток Института молекулярной биологии

R

OO

ВP3O9H4

I

OO

ВP3O9H4

II

OO

ВP3O9H4

X

III IV

OO

ВP3O9H4

X

V VI VII

VIII

X XI XII

IX

OВ

P3O9H4 O

В

P3O9H4

P2O6H3 OCH2P

O

OH

O В P2O6H3 OCH2P

O

OH

O ВP2O6H3 OCH2P

O

OH

OO

В

P2O6H3 OCH2P

O

OH

OY

В

P2O6H3 OCH2P

O

OH

OY

В

P2O6H3 OCH2P

O

OH

O В

B = Ade, Thy, Gua, Cyt; R = N3, NH2, NHMe, NMe2, F, H, Cl, NO2 и др.; X = O, S

B = Ade, Thy, Gua, Cyt

B = Ade, Thy, Gua, Cyt; Y = O, CH2

B = Ade, Thy, Gua, Cyt

Рис.1.3.Модифицированныенуклеозиды

20 ФОСФАЗИД Глава 1. Теоретические основы создания фосфазида 21

им. В.А. Энгельгардта РАН под руководством академика А.А. Краев-ского была начата разработка способов синтеза модифицированных 2’,3’-дидезоксинуклеозидов (dN) и их 5’-трифосфатов (dNTP) [2–7].

Были развиты как методы модификации природных рибонуклео-зидов 2’-дезоксинуклеозидов, так и синтезы, исходящие из доступ-ных сахаров (глюкозы, рибозы, ксилозы, 2’-дезоксирибозы), что позволило создать набор десятков нуклеозидов, а позднее выбрать оптимальные способы препаративного получения наиболее интерес-ных соединений, базирующиеся на отечественном сырье. Был раз-работан оригинальный метод синтеза 3’-азидо-3’-дезокситимидина (АZT), который лег в 1992 г. в основу производства препарата «Ти-мазид» – первого отечественного аналога препарата фармацевтиче-ской компании Wellcome (в настоящее время ViiV Healthcare) – ре-тровира (зидовудина, ZDV).

Для понимания влияния различных модификаций на электрон-ные и конформационные свойства, которые формируют активность и селективность модифицированных нуклеозидов, впервые в мире выполнен рентгеноструктурный анализ АZT и ряда других высоко-активных НИОТ [8–11].

Параллельно в лаборатории проводили разработку методов фос-форилирования модифицированных нуклеозидов в 5’-моно-, ди- и трифосфаты. Был получен большой набор соединений, наиболее перспективные из которых показаны на рис. 1.3.

На следующем этапе было проведено сравнительное изучение подавления биосинтеза ДНК, катализируемого обратной транс-криптазой ВИЧ и ДНК-полимеразами человека. Были иссле-дованы эффективность, специфичность и молекулярный меха-низм действия нескольких десятков модифицированных dNTP. Для этого осуществлены выделение и очистка всех основных ДНК-полимераз человека – альфа, бета, эпсилон, гамма и дель-та (двух последних совместно с сотрудниками Йельского Уни-верситета, Нью-Хейвен, США и Университета штата Нью-Йорк, Стони-Брук). Также были выделены ДНК-полимеразы вируса про-стого герпеса, цитомегаловируса и аденовируса (совместно с со-трудниками фирмы American Cyanamid, создавшими суперпроду-центы этих ферментов) [12–18].

Было разработано несколько методов исследования молекуляр-ных механизмов и субстратных свойств (включая эффективность

и селективность по отношению к различным ДНК-полимеразам) в бесклеточных системах. Их особенностью является возможность количественного определения названных параметров на природ-ных РНК- и ДНК-матрицах. Необходимо отметить, что в восьми-десятых годах ХХ столетия такого разнообразия ДНК-полимераз, их ингибиторов и методов их исследования не было ни в одной ла-боратории других стран. Были определены структурные особенно-сти селективного действия модифицированных dNTP на обратную транскриптазу ВИЧ.

Проведенные исследования позволили впервые выявить ряд фун-даментальных закономерностей:

1. Субстратная специфичность обратных транскриптаз ретрови-русов (в том числе и ВИЧ) оказалась наименьшей среди ис-следованных ДНК полимераз. Этот вывод нашел теоретиче-ское обоснование в том, что только этот тип ДНК-полимераз использует в качестве матрицы как вирусную РНК при синте-зе (–)-цепи провирусной ДНК при обратной транскрипции, так и этой (–)-цепи ДНК при синтезе дуплексной провирус-ной ДНК. Это определяет высокую конформационную под-вижность обратных транскриптаз, способных катализировать как синтез гибридов ДНК-РНК (существующие в А-форме), так и дуплексных ДНК (В-форма). В свою очередь, высокая конформационная подвижность обратных транскриптаз свя-зана с уменьшением точности синтеза, включая и понижен-ную субстратную специфичность по отношению к субстратам.

2. Репликативные ДНК-полимеразы человека альфа, эпсилон, дельта наиболее специфичны; остальные изучавшиеся фер-менты располагаются по специфичности между двумя назван-ными группами. Это позволило провести поиск селективных ингибиторов обратных транскриптаз.

3. Модифицированные dNTP c объемными группами в 3´-поло-жении (I, R=N3, NO2, NHMe, NMe2, Cl, SH), а также с упло-щенной структурой гликона за счет введения 2´-3´-двойной связи или дополнительного оксиранового или тиуранового ци-клов с рибо- или ликсоположением (II-VII, XI, рис. 1.3), пока-зали высокую активность и селективность в подавлении толь-ко обратных транскриптаз ретровирусов. Молекулярный ме-ханизм подавления репликации ВИЧ азидотимидином прохо-

22 ФОСФАЗИД Глава 1. Теоретические основы создания фосфазида 23

дит именно по механизму селективной терминации биосин-теза провирусной ДНК.

4. Модификация трифосфатного остатка также понижает ак-тивность, но за счет этого повышается специфичность dNTP по отношению к обратной транскриптазе ВИЧ (V-VII, XI на рис. 1.3).

5. Определены принципы отбора разными ДНК-полимеразами изомерных, аномерных и энантиомерных форм dNTP (D-α-dNTP, L-β-dNTP, L-α-dNTP, VII-IX на рис. 1.3). Показа-но, что отбор ДНК-полимеразами, в том числе и обратными транскриптазами L-β-dNTP, эффективно запрещается лишь при наличии в 3´-положении этих субстратов гидроксила, тог-да как при его отсутствии модифицированные L-β-dNTP мо-гут служить селективными терминаторными субстратами об-ратных транскриптаз. L-β-dNTP и L-α-dNTP, а также моди-фицированные dNTP с транс-расположением нуклеинового основания и фосфатов (XII на рис. 1.3) не являются субстрата-ми ДНК-полимераз. В результате были сформулированы сте-реохимические основы биосинтеза ДНК и предложены моде-ли строения активного центра обратных транскриптаз и дру-гих ДНК-полимераз [19–36].

Основываясь на приведенных выше закономерностях, была син-тезирована новая группа фосфатов нуклеозидов с модификацией од-новременно по нуклеозидной компоненте и по фосфату. Использо-вание немодифицированных фосфатов в нуклеотидах исключается из-за их быстрого дефосфорилирования в крови и клетках. Созда-ние модифицированных фосфорилированных форм нуклеозидов преследовало цель исключения первой стадии внутриклеточного фосфорилирования нуклеозидов. Вследствие относительно высо-кой специфичности соответствующих нуклеозидкиназ на стадии первого фосфорилирования, как правило, происходит выбраковка лейкоцитами большого количества модифицированных нуклеози-дов, которые могли бы обладать высоким противовирусным потен-циалом. Поэтому одной из задач применения модифицированных нуклеозид-фосфатов является придание им относительно высокой стабильности в крови и цитоплазме клеток человека.

Замещение фосфатного остатка на разные фосфонаты в нуклео-тидах определялось рядом причин. Известно несколько разных хи-

мических групп фосфонатов, что дает возможность выбрать струк-туры этих молекул, наиболее соответствующие заданной биологи-ческой задаче. Далее, по химической структуре фосфонаты доста-точно близки к фосфатам – это замещения пятивалентного фосфо-ра, несущие отрицательные заряды. Они, как правило, более гидро-фобны и являются слабыми кислотами, что улучшает их свойства диффундировать через клеточные мембраны. В то же время фос-фонаты нуклеозидов несколько отличаются от фосфатов длинами связей и валентными углами заместителей вокруг атома фосфора, что теоретически должно уменьшить их сродство к ферментам де-фосфорилирования. В процессе исследования зависимости струк-тура – активность было синтезировано и изучено в инфицирован-ных ВИЧ клеточных культурах более 150 соединений нескольких типов (рис. 1.4).

В изучении антивирусных свойств этих соединений на разных этапах работы, помимо российских вирусологов, участвовали про-фессор Э. Де Клерк (Католический Университет г. Лейвена, Бель-гия), а также профессор К. Ватанабе и профессор Б. Польски (Ме-мориальный онкологический центр Нью-Йорка, США). Был про-веден системный анализ зависимости активности от модификации каждого из компонентов молекул нуклеотидов по отдельности и в различных сочетаниях. В результате было найдено несколько со-единений с высокой анти-ВИЧ активностью и низкой токсично-стью, из которых, по совокупности свойств, выбран для углубленно-го, в том числе, клинического изучения АZT 5´-Н-фосфонат (XIII, R=N3, R´=H на рис. 1.4 и 1.5), названный фосфазидом.

Следует отметить, что практически все фосфонаты модифици-рованных нуклеозидов имеют значительно более низкую токсич-

R

OO

ВP

O

OH

R'O

OВ

P

O

OH

R'

P

O

OH

OH

CH2 OO

В P

O

OH

OH

CH2 O В

XIII XIV XV XVI

B=Thy,Ade,Cyt,Gua;R=N3,F;H;NH2;SH,=CHидругие;R´=H,COOEt,COOMe,CONH2,CH3,CH2F,CHF2;CF3,F,COCH3,CN,CH2N3идругие.

Рис.1.4.Фосфонатынуклеозидов

24 ФОСФАЗИД Глава 1. Теоретические основы создания фосфазида 25

ность по сравнению с родительскими нуклеозидами. Это показы-вает, что фосфорилированные формы нуклеозидов метаболитиче-ски менее активны, что открывает перспективу создания малоток-сичных лекарств пролонгированного действия [37–61].

В дальнейшем было проведено изучение в крови человека ме-таболизма нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ, отобранных для углубленного исследования. Исследова-ние преследовало цель выбрать такие фосфорилированные фор-мы модифицированных нуклеозидов, которые, обладая анти-ВИЧ эффектом в клеточных культурах, были бы также достаточно ста-бильны в крови и диффундировали в лейкоциты. Поэтому пер-вой задачей было исследование наиболее перспективных соеди-нений в плазме крови.

Было показано, что замещение фосфата в АZT и некоторых дру-гих модифицированных нуклеозидах на фосфит в 100–1000 раз уменьшает скорость их дефосфорилирования по сравнению с ана-логичными фосфатами (табл. 1.1). Как видно из данных этой табли-цы, уменьшение скорости примерно на 90% определяется структу-рой замещенного фосфата, но модификация нуклеозида также вно-сит свой вклад на 5–15%. Имеются и исключения: для фосфонатов модифицированного аденозина вклады нуклеозидной и фосфонат-ной компонент примерно одинаковы. Эти данные показали, что сродство фосфорилированных нуклеозидов к ферментам дефосфо-рилирования крови (фосфатазам, фосфоэстеразам, нуклеотидазам) определяется природой фосфатного остатка в значительно большей степени, чем природой нуклеозида.

N3

OO

ThyP

O

O

H

Na

Рис.1.5.Фосфазид

Таблица 1.1Скорости дефосфорилирования нуклеотидов

в сыворотке крови человекаСоединение Время дефосфорилирования 50% вещества

5´-фосфат-тимидина 20 мин.5´-фосфат AZT 35 мин.5´-фосфат 3´-фтортимидина 40 мин.5´-фторфоcфат 3’-азидотимидина 70 мин.5´-фторфосфат 3`-фтортимидина 70 мин.фосфазид 33 ч5´-Н-фосфонат 3´-фтортимидина 60 ч

5´-Н-фосфонат 2´,3´-дидезоксиаденозина был устойчив на 100% в плазме крови человека, тогда как 5´-фосфат 2´,3´-дидезоксиаде-нозина в тех же условиях за 4 часа полностью дефосфорилировал-ся, дезаминировался до 2´,3´-дидезоксиинозина и частично апури-низировался до гипоксантина.

Еще один цикл исследований был выполнен по катализу дефос-форилирования нуклеотидов очищенными фосфатазами из пла-центы человека, кишечника теленка, E.coli, а также 5´-нуклеоти-дазы яда кобры (табл. 1.2).

Таблица 1.2Действие фосфатаз и 5´-нуклеотидазы на фосфатные и фосфонатные производные тимидина или его аналогов

Вещество Фосфатаза E.coli

Фосфатаза плаценты человека

Фосфатаза кишечника

теленка

5´-нуклео-тидаза яда

кобры5´-фосфат тимидина + + + +5´-фосфат AZT + + + +5´-Н-фосфонат тимидина – – – +фосфазид – – – +5´-α-глицерофосфат AZT – – – ±5´-β-глицерофосфат AZT – – – ±5´-карбоксифосфонат AZT – – – +5´-карбоксифосфонат тимидина – – – +5´-метилфосфонат AZT – – – –5´-фосфат 5´-фтортимидина + + + ±5´-фосфат 5´-хлортимидина + + + +

Как видно из таблиц 1.1 и 1.2, фосфазид является одним из наи-более стабильных соединений в реакции дефосфорилирования как

26 ФОСФАЗИД Глава 1. Теоретические основы создания фосфазида 27

некоторыми индивидуальными ферментами, так и сывороткой кро-ви людей, наиболее близко моделирующей условия применения на человеке [62–65].

Показано, что гидрофобность Н-фосфонатов нуклеозидов очень близка к таковой для нуклеозидов, что значительно отличает их от гидрофильных фосфатов нуклеозидов. Это наблюдение хорошо объ-яснило выявленную диффузию фосфитов модифицированных ну-клеозидов в клетки в клеточных культурах [66, 67].

Полученные данные были подтверждены в лаборатории профес-сора В. Игана в Институте FDA (Бетесда, США) [68]. В той же ра-боте было косвенно продемонстрировано окисление Н-фосфоната АZT в фосфат АZT, минуя стадии гидролиза – фосфорилирования.

Таким образом, проведенные исследования показали, что соеди-нение АZT 5´-Н-фосфонат (фосфазид) обладает высокой анти-ВИЧ активностью, низкой токсичностью и является одним из наиболее стабильных соединений в реакции дефосфорилирования сыворот-кой крови людей, что позволило выбрать фосфазид для дальней-шего изучения на клеточных культурах и биологических объектах.

Список литературы1. ErikDeClercq,HighlihtsintheDiscoveryofAntiviralDrugs:APersonalRetrospective;

JournalofMedicinalChemistryPerspective,2010,53,1438-1450.2. OzolsA.M.,AzhayevA.V.,DyatkinaN.B.,KrayevskyA.A.,Aminonucleosidesandtheir

derivatives;VI.Anewsynthesisof1,2,5-tri-O-acyl-3-azido-3-deoxy-β-D-ribofuranose,Synthesis,1980,N7,557-559.

3. OzolsA.M.,AzhayevA.V., KrayevskyA.A.,UshakovA.S.,GnuchevN.V.,GottikhB.P.,Aminonucleosides and their derivatives;VII. Synthesis of 3’,5’-dideoxy-3’,5’-diaminonucleosides,Synthesis,1980,N7,559-562.

4. KrayevskyA.A.,AzhayevA.V.,KukhanovaM.K.,ScapcovaN.V.,ZaycevaV.E.,Syn-thesisofoligonucleotideswith5’-3’phosphoamidoesterbond,Nucl.AcidsRes.,Symp.Ser.1981,N9,203-205.

5. KrayevskyA.,KukhanovaM.,AtrazhevA.,AzhayevA.,ChidgeavadzeZ.,BeabealashvilliR.,2’,3’-Dideoxy-3’-aminonucleoside5’-triphosphatesaretheterminatorsofDNAsynthesiscatalyzedbyDNApolymerases,Nucl.AcidsRes.,Symp.Series,1984,N14,283-284.

6. ЗайцеваВ.Е.,СкапцоваН.В.,АжаевА.В.,КраевскийА.А.,Аминонуклеозидыиихпроизводные.Х.2’-Дезоксидинуклеозидфосфатыи2’-дезоксидинуклеотидысфосфамиднымисвязями,Биоорг.Химия,1984,10,401-407.

7. DyatkinaN.B.,KrayevskyA.A.,AzhayevA.V.,JartsevaI.V.,Aminonucleotidesandtheirderivatives;XIII.Synthesisofbenzimidazoleazidonucleosides,Synthesis,1985,N4,410-411.

8. ГурскаяГ.В.,ЦапкинаЕ.Н.,СкапцоваН.В.,КраевскийА.А.,ЛиндеманС.Б.,Струч-ковЮ.Т.,Рентгеноструктурноеисследованиеспецифическогоингибитораобрат-нойтранскриптазы–3’-азидо-2’,3’-дидезокситимидина,Докл.АНСССР,1986,291,854-859.

9. ГурскаяГ.В.,ЦапкинаЕ.Н.,ЛиндеманС.Б.,СтручковЮ.Т.,КраевскийА.А.,Рент-геноструктурноеисследование3’-амино-2’,3’-дидезокситими-динахлоргидрата–терминаторногосубстратаДНК-полимераз,Докл.АНСССР,1988,303,1378-1382.

10. GurskayaG.V.,BochkarevA.V.,ZdanovA.S.,PapchikhinA.V.,PuryginP.P.,KrayevskyA.A.,X-Rayanalysisof2’,3’-lyxoanhydrothymidine,conformationallyrestrictedinhibitorofretroviralreversetranscriptases,FEBSLett.,1990,265,63-66.

11. GurskayaG.V., BochkarevA.V., ZdanovA.S., PapchikhinA.V., KrayevskyA.A.,Structural studies of 2’,3’-riboanhydroadenosine, a conformationally restrictedterminationsubstrateofDNApolymerases,Nucleosides&Nucleotides,1992,11,1-9.

12. АтражевА.М., КухановаM.K.,ДНК-полимеразаβиз печени крыс.Выделение,свойства,ингибиторныйанализгомогенногопрепарата,Биоорг.химия,1985,11,1627-1635.

13. МозжеринД.Ю.,АтражевA.M.,КухановаM.K.,ДНК-полимеразы��изплацен-A.M.,КухановаM.K.,ДНК-полимеразы��изплацен-.M.,КухановаM.K.,ДНК-полимеразы��изплацен-M.,КухановаM.K.,ДНК-полимеразы��изплацен-.,КухановаM.K.,ДНК-полимеразы��изплацен-M.K.,ДНК-полимеразы��изплацен-.K.,ДНК-полимеразы��изплацен-K.,ДНК-полимеразы��изплацен-.,ДНК-полимеразы��изплацен-��изплацен-�изплацен-�изплацен-изплацен-тычеловека;очистка, свойстваиингибиторныйанализ,Moл.Биол., 1992,26,999-1010.

14. РозовскаяT.A.,БелогуровA.A.,ЛукинM.A.,�ерновД.Н.,КухановаM.K.,Биби-T.A.,БелогуровA.A.,ЛукинM.A.,�ерновД.Н.,КухановаM.K.,Биби-.A.,БелогуровA.A.,ЛукинM.A.,�ерновД.Н.,КухановаM.K.,Биби-A.,БелогуровA.A.,ЛукинM.A.,�ерновД.Н.,КухановаM.K.,Биби-.,БелогуровA.A.,ЛукинM.A.,�ерновД.Н.,КухановаM.K.,Биби-A.A.,ЛукинM.A.,�ерновД.Н.,КухановаM.K.,Биби-.A.,ЛукинM.A.,�ерновД.Н.,КухановаM.K.,Биби-A.,ЛукинM.A.,�ерновД.Н.,КухановаM.K.,Биби-.,ЛукинM.A.,�ерновД.Н.,КухановаM.K.,Биби-M.A.,�ерновД.Н.,КухановаM.K.,Биби-.A.,�ерновД.Н.,КухановаM.K.,Биби-A.,�ерновД.Н.,КухановаM.K.,Биби-.,�ерновД.Н.,КухановаM.K.,Биби-M.K.,Биби-.K.,Биби-K.,Биби-.,Биби-лашвилиР.Ш.Выделениеинекоторыесвойстварекомбинантнойобратнойтранс-криптазыВИ�,Moл.Биол.,1993,27,618-630.

15. KukhanovaM.,LiuS.-H.,MozzherinD.,LinT.-S.,ChuC.K.,ChengY.-C.L-andD-enantiomersof2’,3’-dideoxycytidine5’-triphosphateanalogsassubstratesforhumanDNApolymerases.Implicationsforthemechanismoftoxicity,J.Biol.Chem.,1995,270,23055-23059.

16. MozzherinD.Ju.,McConnellM., JaskoM.V.,KrayevskyA.A.,TanC.-K.,DowneyK.M.,FisherP.A.,Proliferating cellmisincorporation catalyzedby calf thymusDNApolymeraseδ,J.Biol.Chem.1996,271,N49,31711-31717.

17. КухановаМ.К.,КузнецоваЕ.В.,ЯськоМ.В.,МоринДж.,БеккерДж.,О’ХараБ.,ГлузманЯ.,ВыделениерекомбинантныхДНК-полимеразвирусагерпесапросто-го,цитомегаловирусаиаденовируса,Мол.Биол.,1994,28,339-351.

18. КухановаМ.К., КузнецоваЕ.В., КраевскийА.А.,О’ХараБ.,БеккерДж.,МоринДж.,ГлузманЯ.ИнгибиторныйанализДНК-полимеразвирусовчеловекаспо-мощьюмодифицированныхсубстратов,Мол.Биол.1994,28,530-541.

19. BeabealashvilliR.Sh.,ScamrovA.V.,KutateladzeT.V.,MazoA.M.,KrayevskyA.A.,KukhanovaM.K.,Nucleoside5’-triphosphatesmodifiedatsugarresiduesassubstratesforcalfthymusterminaldeoxynucleotidyltransferaseandforAMVreversetranscrip-tase,Biochim.Biophys.Acta,1986,868,136-144.

20. ChidgeavadzeZ.G.,BeabealashvilliR.Sh.,KrayevskyA.A.,KukhanovaM.K.,Nucleo-side5’-triphosphateswithmodifiedsugarsassubstratesforDNApolymerases,Bio-chim.Biophys.Acta,1986,868,145-152.

21. DyatkinaN.,KukhanovaM.,KrayevskyA.,vonJanta-LipinskiM.,ChidgeavadzeZ.,BeabealashvilliR.,Propertiesof2’,3’-dideoxy-2’,3’-didehydrothymidine5’-triphosphateinterminatingDNAsynthesiscatalyzedbyseveraldifferentDNApolymerases,FEBSLett.,1987,219,151-155.

22. KrayevskyA.A., KukhanovaM.K.,AtrazhevA.M.,DyatkinaN.B., BeabealashvilliR.Sh.,SelectiveinhibitionofDNAchainelongationcatalyzedbyDNApolymerases,Nucleosides&Nucleotides,1988,7,613-617.

23. KrayevskyA.A.,KukhanovaM.K.,Physicochemical aspects of functioning ofDNApolymerases,Sov.Sci.Rev.D.Physicochem.Biol.,1990,9,179-242.

24. SemizarovD.G.,VictorovaL.S.,KrayevskyA.A.,KukhanovaM.K.,Modifiednucleoside5’-triphosphates containing2’,3’-fused threemembered ringsas substrates ofDNApolymerases,FEBSLett.,1993,327,45-48.

28 ФОСФАЗИД Глава 1. Теоретические основы создания фосфазида 29

25. KrayevskyA.A., Victorova L.S., Mozzherin D.Ju., Kukhanova M.K.,Acyclic2’,3’-dideoxy-2’,3’-didehydronucleoside5’-triphosphatesasterminationsubstratesofbroadsetofDNApolymerases,Nucleosides&Nucleotides,1993,12,83-93.

26. KrayevskyA.A.,WatanabeK.A.,Possibilityforexistanceofageneralconformationalmotifinactivecentersofwidegroupofenzymeswhichareinvolvedinnucleicacidsmetabolism,Nucleosides&Nucleotides,1993,12,649-670.

27. SemizarovD.G.,VictorovaL.S.,DyatkinaN.B.,vonJantaLipinskiM.,KrayevskyA.A.SelectivityofDNApolymerasestowardandnucleotidesubstratesofDandLseries,FEBSLett.1994,354,187-190.

28. ShirokovaE.A.,TarussovaN.B., ShipitsinA.V., SemizarovD.G., KrayevskyA.A.,Novel acyclic nucleoside 5’-triphosphate analogs imitating 2’,3’-dideoxy-2’,3’-didehydronucleotides: synthesis andbiological properties, J.Med.Chem. 1994, 37,3139-3148.

29. DyatkinaN.B.,ArzumanovA.A.,VictorovaL.S.,KukhanovaM.K.,KrayevskyA.A.,SynthesisandsubstratepropertiesofTTPanalogswithlargehydrophobicsubstituentgroupsatatoms,Nucleosides&Nucleotides,1995,14,91-103.

30. DyatkinaN.,SemizarovD.,VictorovaL.,KrayevskyA.,TheilF., vonJanta-LipinskiM.,Synthesisoffourstereoisomersofcarbocyclic5’-norD4Aandevaluationoftheirtriphosphatesassubstrates forDNApolymerases,NucleosidesNucleotides,1995,14,723-726.

31. ArzumanovA.A.,SemizarovD.G.,Victorova L.S.,DyatkinaN.B.,KrayevskyA.A.,Phosphate-substituted 2’-deoxynucleoside 5’-triphosphates as substrates forDNApolymerases,J.Biol.Chem.1996,271,24389-24394.

32. SemizarovD.G.,ArzumanovA.A.,DyatkinaN.B.,MeyerA.,Vichier-GuerreS.,Gos-selinG.,RaynerB.,ImbachJ.-L.,KrayevskyA.A.,Stereoisomersofdeoxynucleoside5’-triphosphatesassubstratesfor template-dependentand-independentDNApoly-merases,J.Biol.Chem.,1997,272,9556-9560.

33. MartynovB.I.,ShirokovaE.A.,JaskoM.V.,VictorovaL.S.,KrayevskyA.A.,Triphos-phatemodificationin2’-deoxynucleoside5’-triphosphatesontheirspecificitytowardsvariousDNApolymerases,FEBSLett.,1997,410,423-427.

34. SosunovV.V.,SantamariaF.,VictorovaL.S.,GosselinG.,RaynerB.,KrayevskyA.A.,StereochemicalcontrolofDNAbiosynthesis,NucleicAcidsResearch,2000,Vol.28,No.5,1170-5.

35. KrayevskyA.A.,DyatkinaN.B.,KukhanovaM.K.,DoesinteracttionofdNTPglyconewithanactivecenterof reverse transcriptases takesplace?Amodel forabindingsite,Nucleosides&Nucleotides,1995,14,735-738.

36. KrayevskyA.A.,WatanabeK.A.,SubstratesofDNApolymeraseswithplanarconfigu-rationofsugar:modelofsubstratetransitionstate?Nucleosies&Nucleotides,1998,17,1153-1162.

37. ХорлинA.A., ТарусоваН.Б.,ДяткинаН.Б., КраевскийА.А.,БибилашвилиР.Ш.,ГалеговГ.А.,ЖдановВ.М.,КорнееваМ.Н.,НосикД.Н.,МайороваС.Н.,ШобуховВ.М.,5’-Фосфонаты2’,3’-дидезоксинуклеозидов,ПатентРФ1548182,16.02.1992,USPatent 5,043,437, 27.8.1991,EuropeanPatent 0-354-246, 16.03.1994, JapanPatentN0-354-246B1,08.25.1995,КoreanPatent106,957,12.01.96.

38. ТарусоваН.Б.,ХорлинА.А.,КраевскийА.А.,КорнееваМ.Н.,НосикД.Н.,КругловИ.В.,ГалеговГ.А.,БибилашвилиР.Ш.,Ингибированиевирусаиммунодефицитачеловекавкультуреклеток5’-фосфонатами3’-азидо-2’,3’-дидезоксинуклеозидов,Мол.Биол.,1989,23,1716-1724.

39. TarussovaN.B., KukhanovaM.K.,KrayevskyA.A., KaramovE.V., LukashovV.V.,KornilayevaG.V.,RodinaM.A.,GalegovG.A.,Inhibitionofhumanimmunodeficiency

virus(HIV)productionby5’-hydrogenphosphonatesof3’-azido-2’,3’-deoxynucleosides,Nucleosides&Nucleotides,1991,10,351-354.

40. КарамовЭ.В.,ЛукашовВ.В.,ТарусоваН.Б.,КорнилаеваГ.В.,РодоваМ.А.,Ку-хановаМ.К.,КраевскийА.А.,Подавлениевирусаиммунодефицитачеловекавкультуре клеток 5’-фосфитами3’-азидо-2’,3’-дидезоксинуклеозидов,Мол.Биол.1990,24,1695-1701.

41. КарамовЭ.А.,ЛукашевВ.В., ГорбачеваА.П.,МакароваТ.В., КорнилаеваГ.В.,ТарусоваН.Б.,КраевскийА.А.,Ингибированиерепродукциивирусаиммуноде-фицитачеловекавклеточныхкультурах5’-фосфитами2’,3’-дидезоксинуклеози-дов,Мол.Биол.,1992,26,201-207.

42. AtrazhevaE.D.,LukinM.A.,JaskoM.V.,ShushkovaT.V.,TarussovaN.B.,KrayevskyA.A.,BalzariniJ.,DeClercqE.,2’,3’-O-Cyclicderivativesofribonucleosidesandtheir5’-phosphonates:synthesisandanti-HIVactivity,Med.Chem.Res.,1991,1,155-165.

43. KrayevskyA.A.,TarussovaN.B.,KukhanovaM.K.,BalzariniJ.,DeClercqE.,KaramovE.V.,LukashovV.V,InvestigationofDNAbiosynthesiscatalyzedbyDNApolymerases:approachof synthesis of compoundswith anti-HIVactivity,Nucl.AcidsRes., 1991,N24,13-16.

44. KrayevskyA.A.,TarussovaN.B., ZhuQ.-Y.,VidalP.,ChouT.-C.,BaronP.,PolskyB.,JiangX.-Y.,Matulic-AdamicJ.,RosenbergI.,WatanabeK.A.,5’-Hydrogenphos-phonatesand5’-methylphosphonatesof sugarmodifiedpyrimidinenucleosidesaspotentialanti-HIVagents.Nucleosides&Nucleotides,1992,11,177-196.

45. Matulic-Adamic J., Rosenberg I.,ArzumanovA.A., Dyatkina N.B., ShirokovaE.A., Krayevsky A.A., Watanabe K.A., A simple multigram synthesis of5’-hydrogenphosphonatesand5’-phosphorofluoridatesofsugarmodifiednucleosides,Nucleosides&Nucleotides,1993,12,1085-1092.

46. Jasko M., ShipitsinA., Shirokova E., KrayevskyA., Polsky B., Baron P.,MacLowC.,OstranderM.,O’Hara B., 5’-Phosphonates of ribonucleosides and2’-deoxyribonucleosides:synthesisandantiviralactivity,Nucleosides&Nucleotides,1993,12,879-892.

47. АрзумановА.А.,ДяткинаН.Б., КухановаМ.К., КраевскийА.А.,СемченкоФ.М.,ЕреминО.Г.,МартыновБ.И.,3’-Фтор-3’-дезокситимидин-5’-фторфосфаткакэф-фективныйингибитор продукцииВИ�в клеточных культурах,Биоорг.Химия,1993,19,978-980.

48. DyatkinaN.,ArzumanovA.,KrayevskyA.,O’HaraB.,GluzmanJa.,BaronP.,MacLowC.,PolskyB.Synthesisandantiviralactivityofsomefluorinatednucleotidederivatives,Nucleosides&Nucleotides,1994,13,325-337.

49. KrayevskyA.A.,GalegovG.A.,Nucleotide-typeinhibitorsofreversetranscriptaseandchemotherapyofHIVinfections,Sov.Med.Rev.SectionE,VirologyReviews,1994,5,55-82.

50. КраевскийА.А.,КухановаМ.К.,РепликацияДНКуэукариот,Итогинаукиитех-ники,Мол.Биол.,22,3-164,Изд.ВИНИТИ,1986.

51. KrayevskyA.A.,KukhanovaM.K.,BeabeaashvilliR.Sh.,ChidgeavadzeR.S