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指導教授：吳文海 教授研 究 生：黃柏智報告日期：2009/11/25

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大綱 前言

實驗藥品

實驗步驟

結果與討論

結論

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前言 Liposome 是脂質空心微球，懸浮於水相中。 磷脂分子之磷酸端為親水性，脂質端為疏水性，由此所形成

的脂質層雙面為親水，內層為疏水膜。 水溶性物質 ( 藥物 ) 可包在球心之溶液，油溶性物質可夾在

球皮膜層中，由此 Liposome 可當作水性物質及油性物質之載體。

Liposome 立體示意圖

親水區域

疏水區域

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藥物載體的特性

這些特性可由 Liposome 下列組成來達到 :1.HSPC :Liposome 的主要組成成份，其所形成之單層 Liposome 其粒徑約為 123.8nm( 腫瘤血管壁間隙約 500nm) 。2. 膽固醇 : 膽固醇能幫助膜結構的黏合，同時減緩膜滲透的速 率，降低藥物洩漏率。3.DSPE-PEG :PEG 的長鏈可以增加 Liposome 周圍的立體障礙，防 止血液中的抗體辨識 Liposome ，增加Liposome 在體 內的循環時間 。4.RGD :RGD 胜肽對癌症血管內皮細胞上的 αvβ3 細胞受體 有高度專一結合性，增加 Liposome 對癌細胞的選擇性。

做為一個良好之藥物載體必須具備以下特性 :1. 較小之粒徑以通過血管壁間隙進入細胞2. 低藥物洩漏率3. 可長時間在體內循環4. 高度的細胞選擇性 ( 對癌細胞的選擇性 )

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LCL 結合 RGD 胜肽RGD-LCL

RGD-LCL : RGD- 長效性微脂體 (LCL : Long circulating liposomes)

DSPE-PEG-Mal 與 RGD 結合

RGD 上的硫醇基在室溫以及 pH6.5-7.5 下與 Maleimide 結合

膽固醇在脂質層的排列方式

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藥物的作用機制=RGD-LCL

RGD - LCL 通過血管間隙，與腫瘤內皮細胞上的 αvβ3 受體結合，釋放出Combretastatin A4藥物破壞腫瘤血管細胞之吸收，使腫瘤無法得到養分。

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實驗藥品

Hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC)

氫化大豆卵磷脂

1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho- ethanolamine-N-[Polyethylene glycol] (DSPE-PEG)

二硬脂酸磷酸脂乙醇胺氮聚乙二醇

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實驗藥品 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-

ethanolamine-N-[ Maleimide Polyethylene glycol] ( DSPE-PEG-Maleimide)

Cholesterol

膽固醇

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實驗藥品 Combretastatin A4

cyclo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys](RGD 胜肽 )

cholesteryl [4-14C] oleate

油酸膽固醇酯 [ 碳 -14]

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實驗步驟 (LCL)HSPC :325μmolCholesterol :150μmolDSPE-PEG :25 μmolDrug :100μmol

混合溶解於 chloroform : methanol(9:1 vol:vol) 溶液中

旋轉蒸發法去除溶劑形成脂質薄膜

溶於 50mM HEPES +150mM Nacl buffer(pH6.5) 中

與 50mM HEPES +150mM Nacl buffer(pH6.5) 在 62℃進行水合 2 小時

擠壓 Liposome 通過小孔徑PC 膜，使多層 Liposome 破裂重組成單層 Liposome

形成多層 Liposome

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實驗步驟 (RGD-LCL)HSPC :325 μmolCholesterol :150 μmolDSPE-PEG :24.5μmolDSPE-PEG-Mal:0.5 μmolDrug :100 μmol

由上述方法製備出單層 Liposome

加入 0.1ml 之 0.27 mol RGD( 溶於 PH 6.5 之 50mM HEPES buffer)

在室溫靜置 12 小時，反應生成RGD-LCL

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結果與討論RGD

RGD-LCL

過量 RGD+RGD-LCL

游離之 RGD peak 落在 14 min 的位置

只有 Liposome 的 peak 代表RGD 全部與 Liposome 上之 Maleimide 結合

有 Liposome 和 RGD 的peak 代表 RGD 與Maleimide 之鍵結已飽和

RGD-LCL

由此可證實 RGD 與 LCL 結合

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觀測 Liposome 形狀及粒徑

由光學顯微鏡及 TEM 來觀察多層 Liposome 及單層Liposome

粒徑約為3~7μm

粒徑約為123.8nm

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動態光散射法測定粒徑可使用動態光散射法測定 Liposome的平均粒徑及分佈

可由粒徑判斷經過擠壓後之 Liposome 為多層 Liposome 或單層 Liposome ，以及粒徑之分布情形。

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Liposome配方改變的影響

改變 Liposome 成分之比率、濃度以及藥物和脂質的比率，探討Combretastatin A4 的濃度及包覆率。

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Liposome配方改變的影響配方 配方比率 濃度

(mM)藥物 :脂

質包覆藥物濃度(mg/ml)

包覆率

C 65:30:5 100 20:100 1.55 84.26

D 95:0:5 100 20:100 5.68 95.74

E 50:45:5 100 20:100 0.77 68.30

F 62.5:30:7.5 100 20:100 1.81 89.36

配方 配方比率 濃度(mM)

藥物 :脂質

包覆藥物濃度(mg/ml)

包覆率

A 65:30:5 60 20:100 0.78 71.11

C 65:30:5 100 20:100 1.55 84.26

G 65:30:5 200 20:100 2.11 92.85

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Liposome配方改變的影響配方 配方比率 濃度

(mM)藥物 :脂

質包覆藥物濃度(mg/ml)

包覆率

B 65:30:5 100 10:100 1.05 88.02

C 65:30:5 100 20:100 1.55 84.26

G 65:30:5 200 20:100 2.11 92.85

H 65:30:5 200 40:100 2.99 80.95

上述表格顯示最好的配方為Ｄ，其次為Ｇ、Ｆ、Ｃ。

Ｇ的配方由於所需 Liposome 濃度較高 （ 2倍），成本較高 ， 且包覆藥物濃度並未顯著增加 ( 約為 C 的 1.36 倍 ) ，故不予考 慮。

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體外藥物洩漏率測試左圖顯示：在４８小時 後Ｆ以及Ｄ的包覆率低 於８０％ ，同時有下降 的趨勢。而Ｃ之 LCL 及 RGD –LCL 均在 80% 以上 並且下降趨勢不明顯， 符合 Liposome 需在體內 長時間循環之要求。

由上表及左圖的結果判斷 : C 為 Liposome最佳化配方。 (C = HSPC:Chol:DPSE- PEG = 65:30:5 ，濃度 100mM ，藥物 : 脂質之莫 耳比率為 20:100)

藥物包覆率

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Liposome 與細胞結合率

以油酸膽固醇酯 [ 碳 -14] 進行放射標誌放射性越高代表細胞結合之 Liposme越多

IL-1β 為一種信號分子，可促進發炎反應使細胞表現 αvβ3 -integrin receptor( 一種細胞受體(cell adhesion receptor ，對RGD 有高度專一結合性 ) 。

RGD-LCL 結合量約為LCL 的四倍 !

580

800

310

1120

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Liposome V.S. 細胞 : 擴散 or 內吞

3:1

2:1

3:1

1.6:1

擴散

內吞

若 Liposome 黏附於細胞表面，擴散傳播較易發生。若 Liposome連接於細胞受體上，內吞及擴散傳播發生比率接近。

加入 Trypsin 破壞LCL 與細胞之間的結合

LCL+細胞

LCL

細胞

離心

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加入過量 RGD 對細胞結合的影響加入過量 RGD 證實 Liposome 主要是由

RGD 與 αvβ3 受體之作用結合

IL-1β細胞

= αvβ3 細胞受體= RGD - LCL

= RGD

RGD-LCL

IL-1β細胞

RGD-LCL+Free RGD

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結論RGD-LCL 對腫瘤血管細胞之結合，主要是由 RGD 對 αvβ3 細胞受體作用而結合。

RGD-LCL 相對 LCL 來說，對腫瘤血管細胞有高度 選擇性，可以減少對正常細胞的傷害並提高治療 效率。

RGD-LCL 包覆藥物濃度最高可以達到 2.99 mg / ml ，而成本效益比最佳的 RGD-LCL 藥物濃度為 1.55 mg/ml ，可因應不同情況來選擇藥物濃度。

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謝謝各位的聆聽

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旋轉蒸發儀

接真空幫浦

收集溶劑

持續旋轉使脂質形成均勻薄膜

恆溫水槽

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微孔擠壓機

通入氮氣給予壓力

加入 Liposome 懸浮溶液

通過小孔徑的 PC (poly carbonate) 膜過濾膜的孔徑分別為0.8 、 0.4、 0.2、 0.1μm

擠壓後的 Liposome溶液流出

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Liposome 的合成溶於非極性溶劑 溶於含有藥物的極性溶

液並給予能量 (震盪、超音波等等… )

用旋轉蒸發儀將溶劑蒸發，使其在圓底燒瓶上形成均勻的脂質膜。

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Liposome 的藥物傳播

內吞作用(Uptake)

擴散作用(diffusion)

Liposome 的藥物傳播藉內吞作用以及擴散作用來傳送到細胞內部。