第 11 章 吸光光度法11.1 吸光光度法基本原理11.2 吸光光度法的仪器11.3 显色反应及影响因素11.4 吸光度的测量及误差控制11.5 吸光光度分析方法11.6 吸光光度法的应用

11.1 吸光光度法基本原理1 单色光和复合光

光 : 一种电磁波 , 波粒二象性；

普朗克方程： E=h=hc/

单色光 : 具有相同波长的光；

复合光 : 由不同波长的单色光组成的光；

光谱名称 波长范围X 射线 0.1~10nm

远紫外光 10~200nm

近紫外光 200~400nm

可见光 400~750nm

近红外光 0.75~2.5um

中红外光 2.5~5.0um

远红外光 5.0~1000um

微波 0.1~100cm

无线电波 1 ～ 1000m

物质的颜色吸收光

颜色 波长范围 ( ,nm)

绿黄橙红紫蓝

青蓝青

紫蓝

青蓝青绿黄橙红

400-450450-480480-490490-500500-580580-600 600-650650-750

2 互补色

3 物质对光的选择性吸收

当光子的能量与分子的 E匹配时，就会吸收光子。

吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小； A ～ 关系

最大吸收波长 max ：吸光度最大值处对应的波长。

吸收曲线的形状和 max 的位置取决于物质的分子结构。据此可进行定性分析。

4 朗伯 - 比尔定律

I0

Ir

It

Ia

I0 = Ir + It + Ia

I0 = It + Ia

T = It / I0 , T: 透射比或透光度A=lg (I0 / It ) ＝ lg(1/T), A: 吸光度朗伯定律（ 1760 年）：光吸收与溶液层厚度成正比；比尔定律（ 1852 年）：光吸收与溶液浓度成正比；

当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度）成正比关系－－－朗伯比尔定律

－－－光吸收定律

数学表达： A ＝ lg(1/T)=Kbc

其中， A: 吸光度， T: 透射比， K: 比例常数， b: 溶液厚度， c: 溶液浓度

注意： 平行单色光 均相介质 无反射、散射或光化学反应

A = bc

c: mol/LA = bc 摩尔吸光系数 ε

c: g/LA = abc a: 吸光系数

表示物质的浓度为 1mol/L, 液层厚度为 1cm 时，吸光物质对某波长光的吸光度。单位 (L•mol-1 •cm-1)

灵敏度表示方法：摩尔吸光系数

桑德尔 (Sandell) 灵敏度： S

当仪器检测吸光度为 0.001 时，单位截面积光程内所能检测到的吸光物质的最低含量。

单位： g/cm2

S=M/

50ml 容量瓶中有 Nb30μg ，用 2cm 比色池，在 650nm 测定光吸收， A ＝ 0.43, 求 S. (Nb 原子量 92.91) 。

＝ 3.3×104 L·mol-1·cm-1

5 、吸光度的加和性

A1 = 1bc1

A2 = 2bc2

A = 1bc1+ 2bc2

根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定。

在某一波长，溶液中含有对该波长的光产生吸收的多种物质，那么溶液的总吸光度等于溶液中各个吸光物质的吸光度之和。

1 分光光度计的组成

光源 单色器 样品池 检测器读出系统

11.2 吸光光度法的仪器

常用光源

光源 波长范围 (nm) 适用于氢灯 185~375 紫外氘灯 185~400 紫外钨灯 320~2500 可见，近红外

卤钨灯 250~2000 紫外，可见，近红外氙灯 180~1000 紫外、可见（荧光）

能斯特灯 1000~3500 红外空心阴极灯 特有 原子光谱

激光光源 特有 各种谱学手段

单色器 作用 : 产生单色光 常用的单色器：棱镜和光栅

样品池（比色皿）

厚度 ( 光程 ): 0.5, 1, 2, 3, 5…cm

材质：玻璃比色皿－－可见光区 石英比色皿－－可见、紫外光区

检测器

作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号。

常用检测器： 光电管 光电倍增管 光二极管阵列

光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧化铯为红敏，适用 625－ 1000nm波长；阴极表面涂锑和铯为紫敏，适用 200－ 625nm波长。

目视比色法—比色管

光电比色法—光电比色计 光源、滤光片、比色池、硒光电池、检流计

分光光度法与分光光度计 722型分光光度计光学系统图

1. 光源； 2.滤光片； 3,8聚光镜 4,7.狭缝； 5.准直镜； 6.光栅9. 比色池； 10. 光电管

分光光度计的类型：

根据波长范围：可见分光光度计、紫外 - 可见分光光度计和红外分光光度计；

根据仪器的结构与功能：单光束、双光束和双波长三种基本类型；

11.3 显色反应及影响因素

要求：a. 选择性好b. 灵敏度高 (ε>104)c. 产物的化学组成稳定d. 化学性质稳定e. 反应物和产物有明显的颜色差别 (>60nm)

没有颜色的或颜色较浅的化合物，需要通过适当的反应定量生成有色化合物再测定－－ 显色反应；

1 显色反应

对比度 (Δλ): 络合物最大吸收波长 (λ MRmax) 与试剂最大吸收波 (λ Rmax) 之差。

络合反应

氧化还原反应

2 显色反应类型

N N

Fe2+3

3 显色剂

无机显色剂 : 过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾

N N N N

SO3HHO3S

OH OHAsO H3 2 H O As32

有机显色剂：

偶氮类：偶氮胂 III

生色团 : 含有 π→π*跃迁的不饱和基团

助色团 : 含非键电子的杂原子基团 ,如 -NH2, -OH, -CH3…

三苯甲烷类 三苯甲烷酸性染料 铬天菁S

O

CH3

COOH

HO

C

ClCl

SO3H

CH3

COOH

三苯甲烷碱性染料 结晶紫

C

N(CH3)2(H3C)2N

N(CH3)2

4 影响因素a 溶液酸度（ pH 值及缓冲溶液）

影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变Δ

影响待测离子的存在状态，防止沉淀；

影响络合物组成

形式 pH λmax(nm) 形式 pH λmax(nm)

H4L+ 1.2 462-465 Sn4+ 1.0 530

H3L 4.8-5.2 462,490 Ga3+ 5.0 550

H2L- 8.4-9.0 512

HL2- 11.4-12.0 532-538

pH 对苯芴酮及其络合物的颜色影响

b 显色剂的用量

c 显色反应时间

针对不同显色反应确定显示时间 显色反应快且稳定；显色反应快但不稳定； 显色反应慢，稳定需时间；显色反应慢但不稳定

d 显色反应温度加热可加快反应速度，导致显色剂或产物分解

e 溶剂

f 干扰离子

有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率

消除办法： 控制酸度，加入掩蔽剂，改变价态 选择合适参比 褪色空白 (铬天菁 S 测 Al ，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰 ) 选择适当波长

1 ） 测定波长选择选择原则：“吸收最大，干扰最小”

灵敏度 选择性

11.4 吸光度的测量及误差控制

2 ） 测定浓度控制控制浓度 吸光度 A ： 0.2 ～ 0.8

减少测量误差

1 、吸光度的测量条件的选择

3） 参比溶液选择

仪器调零消除吸收池壁和溶液对入射光的反射 扣除干扰

蒸馏水空白试剂空白

4 ） 标准曲线制作

0 1 2 3 4 5 6 7 80.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

A

concentration

理论基础：朗伯 - 比尔定律

相同条件下测定不同浓度标准溶液的吸光度 A

A ～ c 作图

光度分析法设计的步骤：

1. 选择显色反应2. 选择显色剂3. 优化显色反应条件4. 选择检测波长5. 选择合适的浓度6. 选择参比溶液7. 建立标准曲线

测量条件选择

2 、 吸光光度法的误差

非单色光引起的偏移物理化学因素：非均匀介质及化学反应吸光度测量的误差

对朗伯 - 比尔定律的偏移：

1 ）非单色光引起的偏移复合光由 1 和 2 组成，对于浓度不同的溶液 a

和 b,引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。

非均匀介质 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测

吸光度增加，导致线性关系上弯

2 ） 物理化学因素

离解、缔合、异构等如： Cr2O7

2-+H2O=2HCrO4-=2H++2CrO4

2-

PAR 的偶氮－醌腙式

化学反应

3 ） 浓度过高

1.经典光度分析法11.5 吸光光度分析方法

一、校准曲线法

在确定的最佳显色反应条件和最佳测量条件下，分别测定一系列的不同浓度的标准溶液的吸光度，绘制 A-C曲线。

0 1 2 3 4 5 6 7 80.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

A

concentration

二、示差吸光光度法

分类：高吸光度示差法、低吸光度示差法、 精密示差吸光度法

特点： 以标准溶液作空白原理： A 相对 = A = bcx- bc0= b c

准确度：读数标尺扩展 , 相对误差减少 , c0愈接近 cx, 准确度提高愈显著。

目的：提高光度分析的准确度和精密度；解决高( 低 ) 浓度组分 (i.e. A 在 0.2~0.8 以外 )问题

三、解联立方程法目的：对多组分的吸光物质的含量进行同时测定；

Aλ1= Ax, λ1 + A y, λ1 = x, λ1 bcx + y, λ1 bcy

Aλ2= Ax, λ2 + A y, λ2 = x, λ2 bcx + y, λ2 bcy

原理：吸光度的加和性

目的：解决浑浊样品光度分析 消除背景吸收的干扰 多组分同时检测

2. 双波长吸光光度法

原理： A = Aλ1 -A λ 2 = （ λ 1 - λ 2 ） b c

波长对的选择：等吸光度点法

选 1 为参比波长 , 2 为测量波长

得 A1= x1bcx + y1bcy

A2= x2bcx+ y2bcy

ΔA=A2-A1= ( xλ2bcx+ y2bcy)-( x1bcx+ y1bcy)

在等吸光度的位置 (G, F), y2 ＝ y1 ，则上式为

ΔA=( x2- x1 ） bcx

ΔA 与 cx 成正比 , 可用于测定

例 ,苯酚与 2,4,6-三氯苯酚 (y)混合物中苯酚 (x) 的双波长分光光度法测定。

11.6 吸光光度法的应用1 测定弱酸和弱碱的离解常数

AHB 和 AB- 分别为有机弱酸 HB 在强酸和强碱性时的吸光度，它们此时分别全部以 [HB] 或 [B-] 形式存在。

HB ＝ H+ + B- [H+][B-]Ka

=

[HB]

pKa=pH+ lg [HB][B-]

pKa=pH+ lg AB- - AA- AHB

lg AB- - AA- AHB

对 pH 作图即可求得 pKa

2 络合物组成确定 饱和法（摩尔比法）

制备一系列含钌 3.0×10-5 mol/L (固定不变 ) 和不同浓度（小于 12.0×10-5 mol/L ）的 PDT 溶液，按实验条件， 485nm 测定吸光度 , 作图。

PDT:Ru=2:1

等摩尔连续变化法

固定 [M]+[L],改变 [M],获得一系列吸光度值，吸光度最大的值所对应的 [M] 与 [L] 的比值，即获得M:L 比值。

Co(III) 与 3 ， 5 －二氯－ PADAT 的比值为 1:2

平衡移动法

固定 [M], 不断改变 [L] ，以 lg[MLn]/[M] 为纵坐标，lg[L] 为横坐标，作图，斜率 n即是络合物中 L:M的比值；纵轴上的截距 lgK是络合物的稳定常数。

lgK+nlg[L]=lg([MLn]/[M])

[MLn] K =

[M][L]n

lgK+nlg[L]=lgA/(Amax-A)