合成高分子への質量分析法の応用 1. gpc/maldi msの応用例 2. gpc/ api … · gpc/...
TRANSCRIPT
1
©2007 Nihon Waters K.K.
合成高分子への質量分析法の応用合成高分子への質量分析法の応用
1. GPC/MALDI MS1. GPC/MALDI MSの応用例の応用例2. GPC/ API MS2. GPC/ API MSの応用例の応用例
©2007 Nihon Waters K.K. 2
応用分野:
(i) 平均分子量の測定
(ii)末端官能基や繰返しユニットの測定
(ユニットは重合体の性能の特性に重要)
(iii)生産物の化学構造のキャラクタリゼーションによる重合反
応のモニター
(iv)Polymerisation 重合度 の測定
Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) 質量分析は、複
雑な混合物の大規模分析のための最も強力なツールの1つであり、bulk
polymer の MS分析に有用
GPC/MALDI MSGPC/MALDI MS
2
©2007 Nihon Waters K.K. 3
Matrix Assisted Laser Matrix Assisted Laser DesorptionDesorptionIonization (MALDI)Ionization (MALDI)
サンプル調製
サンプルとケミカルマトリクスの混合 (1,000-1 to 10,000-1)
Major advantage= ease of sample prep !!
質量分析
レーザーによる固相中でのイオン化
ソフトなイオン化
一般に 不揮発性高分子の(準) 分子イオン [M+H]+ が最小のフラグ
メンテーションで生成
o Proteins o Peptideso Oligonucleotideso Polysaccharideso Synthetic polymers
正・負双方のイオン化が可能
©2007 Nihon Waters K.K. 4
Matrix Assisted Laser Matrix Assisted Laser DesorptionDesorptionIonization (MALDI)Ionization (MALDI)
ショートレーザーパルス (10-20 ns) がターゲット
に照射
窒素レーザーが一般的 337 nm
照射サイズ: ~10-100 mm
レーザーエネルギーはマトリクスに吸収され、サンプ
ルに穏やかに移行
ソリッドステート相から気相へ不揮発性サンプルが
直接、蒸発・イオン化
3
©2007 Nihon Waters K.K. 5
ポリマー分析におけるポリマー分析における MALDI MALDI 法の制約法の制約
However,
ダイナミックレンジ、高い多分散度がある重合体の正確な質量分布等、MALDI-TOF MSのテクニックには、制限あり
1.3以上の多分散度のサンプル(ほとんどの商品ポリマー)では、紛らわしい平均分子量データとなる— Detector response vs m/z— 多分散サンプルにおける最適matrix/sample ratio 設定の困難さ
— Multimer形成と多価イオンによるシグナルの損失
単分散のサンプルの分析はこれらの制限を受けない
©2007 Nihon Waters K.K. 6
解決策は単分散フラクションに分画するためにMALDI MSの前でサンプ
ルをGPC (SEC)を使用してクロマト分離する
MALDI MS の為のサンプルのGPC (SEC)分離と溶離液分取/定着システムの開発
アプローチアプローチ
4
©2007 Nihon Waters K.K. 7
一般的手順
— GPC (SEC) による単分散フラクションの分離により、より簡便にMALDI MS分析が可能
— GPC 分離後、フラクションを分取
— サンプルはprecoated MALDI target プレート 又は適当なマトリクス溶液を
伴ったmixed post-columnに連続的に供与される
— レーザーが連続的に供与されるサンプルに照射され, 各部位のマススペクト
ルを取得
— ソフトウェアは、GPC分画後の個々のスペクトルを結合し、分画前の元の多分散
サンプルの分子量分布に補正・換算
©2007 Nihon Waters K.K. 8
Waters GPC/MALDI TYOF MS system Waters GPC/MALDI TYOF MS system for polymer characterisationfor polymer characterisation
Waters Micromass MALDI micro™ high performance MALDI-TOF mass spectrometer
5
©2007 Nihon Waters K.K. 9
分析例 (Polylactide glycolide)
GPC/MALDI MSGPC/MALDI MS
©2007 Nihon Waters K.K. 10
イントロダクションイントロダクション
Poly-(DL-Lactide-co-glycolide) (PLG)はドラッグ・デリバリーに使用され
る生物学的適合性と生物分解性ポリエステル
分子量データは性能の特性に関連するため重要
PLG polymers 通常は highly polydisperse (Pd>1.5)
分散型 PLG. へのGPC 分画/ MALDI-MS の応用
6
©2007 Nihon Waters K.K. 11
イントロダクションイントロダクション
PLG is a copolymer of lactide and glycolide.
オリゴマーも分子量の複雑な混合物として存在
O O[–O–CH–C–]m– [–O–CH2–C–]n
CH3Figure. Poly-(DL-Lactide-co-glycolide) (PLG)
©2007 Nihon Waters K.K. 12
MALDI (No GPC)MALDI (No GPC)
スペクトルが共重合体の組成情報を提供している間、正確な分子量分布が
得られない
8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 2 0 0 1 3 0 0 1 4 0 0 1 5 0 0 1 6 0 0 1 7 0 0 1 8 0 0 1 9 0 0 2 0 0 0 2 1 0 0 2 2 0 0 2 3 0 0 2 4 0 0 2 5 0 0 2 6 0 0 2 7 0 0m / z0
1 0 0
%
7 7 2 . 6 4 6 4
8 3 0 . 5 6 5 9
8 4 4 . 5 1 7 3
8 8 8 . 4 0 0 3
9 0 2 . 3 6 2 5
9 2 0 .3 1 3 8
9 6 0 . 2 3 2 1
9 7 6 . 1 4 1 4
1 0 6 2 . 0 4 0 31 1 3 5 . 7 8 1 3
1 1 9 3 . 6 6 8 51 4 8 0 . 9 7 8 8 1 7 2 7 . 4 3 6 3
PLG GPC 分画前のPLG のMALDI MS スペクトル
Lactide Glycolide Copolymer MW: acid MW: mer
Lactic acid: C3O3H6 90 72
Glycolic acid: C2O3H4 76 58
7
©2007 Nihon Waters K.K. 13
プロトコールプロトコール
Gel Permeation Chromatography (GPC)Column: Waters Styragel® HR2 4.6 x 300 mm at 25 °CHPLC Pump: Waters 616 pump with 600S controllerDetector: Waters 410 Refractive index detector
and 996 Photodiode array detector (PDA)Flow rate: Isocratic gradient of tetrahydrofuran (THF) at
0.3 mL/min for 60 min Injection volume: 20 mL
LC-MALDIprep Sample Collection ConditionsSample concentration: 10 mg/mLSheath gas temperature: 125 °CNebulizer gas flow: 25Foil: Dithranol 1 Time®/with sodium saltStage speed: 5 mm/min
©2007 Nihon Waters K.K. 14
.005
.01
.015
10 20 30 40 50 60
Arbitrary Y / Arbitrary X Overlay Y-Zoom CURSORFile # 1 : BASELINE Res=None
GPC - UV Chromatogram of PLG (Lactel)absorbance at 254 nm
GPC PDA chromatogram of the selected PLG co-polymer at UV wavelength of 254 nm
PDAPDA
8
©2007 Nihon Waters K.K. 15
1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000m/z0
100
%
0
100
%
0
100
%
0
100
%
0
100
%
2010.21264584.06354238.5762
4093.07593805.06303777.09252466.8064
4785.46295607.9390
5795.4712
1349.4900
3834.21883271.67241364.04993241.77031571.7360
2766.4451
4325.4932
4482.85064801.1978
921.7535
929.77831130.4019
1146.4146
1355.93543241.77951579.7407 3618.0776
929.9463
2228.8044930.95462070.5942
1170.7274
2447.03642750.3337
3142.6060
1854.31261519.81802056.62622186.8171
2316.96702461.1458
PLG co-polymers GPC フラクションの溶出時間に伴う MS スペクトル
各フラクションの分子量を結合することによって、未分画サンプル(オリジナル)の分子量分布を換算
GPC分離による多分散(分子量分布)の軽減GPC分離による多分散(分子量分布)の軽減
©2007 Nihon Waters K.K. 16
MALDI target plate にスポットされたあるGPCフラクションのMS スペクトルの1例
MALDIMALDI--MS dataMS data
800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800 4000 4200 4400 4600 4800m /z0
100
%
1854.31261519.8180
907.9029
1461.6892
1419.5587
1375.4899
1317.3483
1289.2689
1245.15301231.1182
944.1331
2028.5533
2114.6843
2172.7500
2186.8171
2230.8557
2258.9187
2272.9343
2316.96702346.9697
2405.0195
2461.1458
2463.0964
2491.1392
The polymer distribution is centered at about m/z=2,000 (MP)
9
©2007 Nihon Waters K.K. 17
先のスペクトルの拡大. アイソトピック・クラスター間の 14Daの差異はLactide [OCH(CH3)C(O)] と Glycolide [OCH2C(O)]モノマーに起因
1850 1855 1860 1865 1870 1875 1880 1885 1890 1895 1900 1905 1910 1915 1920 1925 1930 1935 1940 1945 1950m /z0
100
%
1854.3126
1852.3837
1940.48211868.3789
1855.2921
1856.2722
1866.4426
1857.2819
1858.2625
1865.5198
1859.2728
1912.40491882.4089
1869.3622
1870.3160
1880.4655
1871.2700
1872.3138
1873.2983
1898.38321884.3533
1896.4314
1885.3110
1894.5406
1886.2987
1887.3168
1888.3351
1910.4761
1899.3444
1900.3357
1908.5182
1901.2976
1902.2894
1926.4480
1913.3997
1914.3647
1924.5424
1915.3604
1916.3257
1922.5773
1928.4153
1938.5695
1929.3842
1930.3834
1931.3527
1942.4260
1943.3986
1944.4015
1945.4047
1946.3776
14 14
Isotopic clustersIsotopic clusters
©2007 Nihon Waters K.K. 18
MALDI technologyMALDI technologyの利便性の利便性
MALDI 分析による the Poly-(DL-lactide-co-glycolide) (PLG) polymer のGPC分離の確認
GPC 分画を行う事で MALDI-MS の弱点である多分散度のサンプルの問
題を克服
10
©2007 Nihon Waters K.K. 19
応用分野:
(i) ポリマー添加剤の分子量測定
(ii)末端官能基や繰返しユニットの測定 (ユニットは重合体の性能の特性に重要)
(iii)生産物の化学構造のキャラクタリゼーションによる重合反応のモニター
(iv)極性ポリマーや低分子領域の重合度の測定
API 大気圧イオン化法 (ESI, APCI) は、最も一般的なLC/MSイオン化
法であり、比較的極性を有する低分子領域化合物のMS分析に非常に適
しています。
GPC/ API MSGPC/ API MS
©2007 Nihon Waters K.K. 20
LC(RP)/UV & LC(RP)/UV & APcIAPcI chromatograms chromatograms of of polymer additivespolymer additives
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00Time0
100
%
-0
100
%
std_1 3: Diode Array 273
9.40e52.73
8.33
7.56
4.99
2.93
5.79
9.5413.09
std_1 1: Scan AP- BPI
1.13e89.538.325.34
2.92
2.70
4.98
5.79
7.55 13.06
1. Tinuvin P2. Irganox 2453. Tinuvin 3264. Tinuvin 2345. Tinuvin 3276. Irganox 10107. Irganox 13308.Irganox 10769. Irgafos 168
23 4 5
6
7
89
1
11
©2007 Nihon Waters K.K. 21
GPC/ API MSGPC/ API MS
CH2
*
CH3
COOCH3
* n
分析例 ( Poly methyl methacrylate, PMMA )
©2007 Nihon Waters K.K. 22
Time2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00
%
77
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00
AU
0.0
2.0e-2
4.0e-2
6.0e-2
8.0e-2
1.0e-1
SEC_PMMA1uv 3: Diode Array Range: 2.5888.62
210
6.47215
6.95215
7.17214
SEC_PMMA1uv 1: Scan ES+ TIC
1.02e612.167895.87
10400.80739 5.05
12461.81260 4.25
10172.2112783.40
1140
8.4712536.40
12278.40981
9.521355
10.01593
10.871179
14.9340512.29
73014.981247
NNormal GPC (THF)ormal GPC (THF)
12
©2007 Nihon Waters K.K. 23
Scheme of MakeScheme of Make--Up solvent Flow for Up solvent Flow for API API
HPLC (GFC)
Mobile phase: for SECe.g.,THF, CHCl3
0.3-1.0 mL /min.
MS(Q-p single-MS,
ESI/APcI)
HPLC UV/PDASEC Column(s)
T jointMake up pump(bilt in syringe pump etc.)
Make up sol.:for poler solutione.g., CH3CN, MeOH
0.3mL/min.
©2007 Nihon Waters K.K. 24
Mn776
Time2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00
%
1
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00
AU
0.0
2.0e-2
4.0e-2
6.0e-2
8.0e-2
SEC_PMMA1_MS 3: Diode Array Range: 2.5788.64
6.49
6.97
7.19
7.45
10.40
SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ BPI
1.03e88.237.557.23
6.986.83
6.70
6.61
6.50
6.163.701.26
8.46
GPC/ API MSGPC/ API MS
13
©2007 Nihon Waters K.K. 25
Mn776
Time5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00
%
1
5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00
AU
0.0
2.0e-2
4.0e-2
6.0e-2
SEC_PMMA1_MS 3: Diode Array Range: 6.814e-26.49
6.97
7.19
7.457.79
SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ BPI
9.85e78.257.237.02
6.93
6.72
6.59
7.46
Mn776
m/z400 600 800 1000 1200 1400
%
0
100
%
0
100%
0
100
%
0
100
%
0
100
%
0
100
%
0
100SEC_PMMA1_MS 386 (7.795) 1: Scan ES+
5.94e7425.9 525.0625.1825.3
SEC_PMMA1_MS 366 (7.418) 1: Scan ES+ 9.52e7526.0425.9
625.1 725.2
SEC_PMMA1_MS 355 (7.210) 1: Scan ES+ 1.01e8625.1526.0
725.2
SEC_PMMA1_MS 342 (6.966) 1: Scan ES+ 7.32e7725.2625.1
825.3
SEC_PMMA1_MS 332 (6.778) 1: Scan ES+ 4.97e7825.3725.2
925.4
SEC_PMMA1_MS 324 (6.628) 1: Scan ES+ 1.85e7925.4825.3 1025.5
SEC_PMMA1_MS 317 (6.496) 1: Scan ES+ 2.18e71025.5925.4
1125.5
ESI at Low MW rangeESI at Low MW range
©2007 Nihon Waters K.K. 26
Mn776
Time6.00 7.00 8.00
%
0
6.00 7.00 8.00
%
0
6.00 7.00 8.00
%
0
100
6.00 7.00 8.00
%
0
100
6.00 7.00 8.00
%
0
100
6.00 7.00 8.00
AU
0.0
5.0e-2
SEC_PMMA1_MS 3: Diode Array Range: 6.814e-26.49 6.97
7.19 7.79
SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ 1425.654
7.34e66.10
6.05
SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ 1325.575
1.01e76.16
6.27
SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ 1225.583
9.50e66.256.20 6.31
6.42
SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ 1125.522
1.49e76.37
5.74
SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ 1025.454
1.74e76.48
5.84
Mn776
Time6.00 7.00 8.00
%
0
100
6.00 7.00 8.00
%
0
6.00 7.00 8.00
%
0
6.00 7.00 8.00
%
0
6.00 7.00 8.00
%
0
100
6.00 7.00 8.00
AU
0.0
1.0
SEC_PMMA1_MS 3: Diode Array Range: 1.4696.49 6.97
7.457.79
SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ 925.3793.20e7
6.59
5.86
SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ 825.2975.40e7
6.72
SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ 725.2088.52e7
6.936.857.32
SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ 626.0828.27e7
7.157.087.34
SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ 525.9799.76e7
7.42
ESI mass chromatogramsESI mass chromatograms
14
©2007 Nihon Waters K.K. 27
Time3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
AU
0.0
2.5e-2
5.0e-2
3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
AU
0.0
5.0e-2
3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
AU
5.0e-2
1.0e-1
3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
AU
5.0e-2
1.0e-1
1.5e-1
SEC_PMMA4_MS 3: Diode Array Range: 1.857e-15.46
216
SEC_PMMA3_MS 3: Diode Array Range: 1.469e-15.67
215
SEC_PMMA2_MS 3: Diode Array Range: 9.755e-25.96
215
SEC_PMMA1_MS 3: Diode Array Range: 6.814e-26.49;215
6.97214 7.79
210
m/z500 1000 1500 2000
%
0
100
%0
100
%
0
100
%
0
100SEC_PMMA4_MS 244 (5.120) 1: Scan ES+
1.30e518251725
132510751024
484 807751
14251926
19271928
1983
SEC_PMMA3_MS 309 (6.347) 1: Scan ES+ 1.32e61225
1125
1025724674
1325
13261426
1626 17271926
SEC_PMMA2_MS 327 (6.687) 1: Scan ES+ 5.18e6925
825
484 654
1025
11251126
13251525 1727 1926
SEC_PMMA1_MS 346 (7.041) 1: Scan ES+ 2.10e7725
625 825
925 10251226 1426
ESI mass spectraESI mass spectra分子量分布分子量分布
©2007 Nihon Waters K.K. 28
GPC elution (PDA/ESI, Map)GPC elution (PDA/ESI, Map)
15
©2007 Nihon Waters K.K. 29
GPC elution (ESI, Map)GPC elution (ESI, Map)
©2007 Nihon Waters K.K. 30
質量分析計質量分析計イオン化(イオン化(ESIESI&&APCIAPCI)) の原理の原理
M:サンプル分子X:H2OやNH3などの溶媒分子
キャピラリ 4 kVイオン蒸発
-
-+
+
+
-
+
+ +++-
帯電液滴の生成
-
- +
+ +
+
--
--
- +
++ -
- +
+ +
+
--
--
- +
++ -
脱溶媒が進むにしたがってイオン濃度が上昇
++-+
-+++-
++-+
-+++-
キャピラリ 4 kVイオン蒸発
-
-+
+
+
-
+
+ +++-
-
-+
+
+
-
+
+ +++-
帯電液滴の生成
-
- +
+ +
+
--
--
- +
++ -
- +
+ +
+
--
--
- +
++ -
-
- +
+ +
+
--
--
- +
++
- +
+ +
+
--
--
- +
++ -
- +
+ +
+
--
--
- +
++ -
- +
+ +
+
--
--
- +
++ -
脱溶媒が進むにしたがってイオン濃度が上昇
++-+
-+++-
++-+
-+++-
++-+
-+++-
++-+
-+++-
++-+
-+++-
++-+
-+++-
ESI
xxxx
xxHH++ MM
コロナ放電により
試薬イオンが生成
xxxx
xxHH++
MM
試薬イオンとサンプル分子が反応してサンプルイオンが生成(プロトン転移またはチャージ転移)
コロナニードル
xx
xxMM
キャピラリ
加熱
xxxx
xxHH++ MM
xxxx
xxHH++ MM
コロナ放電により
試薬イオンが生成
xxxx
xxHH++
MM
xxxx
xxHH++
MM
試薬イオンとサンプル分子が反応してサンプルイオンが生成(プロトン転移またはチャージ転移)
コロナニードル
xx
xxMM
xx
xxMM
キャピラリ
加熱APCI
Waters ESCi
ESI/APCIの同時取込
16
©2007 Nihon Waters K.K. 31
Time4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
%
0
4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
%
9
4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
AU
2.0e-2
4.0e-2
6.0e-2
8.0e-2
SEC_PMMA1_ESCi 4: Diode Array Range: 3.304e-16.50
215 6.98216
7.46217
SEC_PMMA1_ESCi 1: Scan ES+ TIC
7.49e87.48426
4.27365
7.75;426
SEC_PMMA1_ESCi 2: Scan AP+ BPI
8.95e77.69425
7.12625
7.92325
m/z400 600 800 1000 1200 1400
%
0
100
%
0
100SEC_PMMA1_ESCi 190 (7.481) 1: Scan ES+
2.91e7425
325
327
525
426
441
442
625526
541
542
725
641726 825
741 925 1025 11261226 1426
SEC_PMMA1_ESCi 191 (7.538) 2: Scan AP+ 1.87e7425
325
379
525
426625
526
542725
641 825 925 1025 11261226 1346
GPC with GPC with ESCiESCi ((ESI+APcIESI+APcI))
©2007 Nihon Waters K.K. 32
GPC/MS を用いる事で、従来の溶出時間情報(クロマトグラム)に加え、
1.マススペクトルからの質量情報やフラグメント情報2.低分子領域における高感度化3.共重合体 (co-polymer)におけるより正確な解析
等が可能となった。
まとめ