中山大学中山医学院 朱振宇 教授、博士生导师 020-87330640 ( o )
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中山大学中山医学院 朱振宇 教授、博士生导师 020-87330640 ( O ). 临床聚合酶链反应( PCR )试剂盒的选用和质检. PCR 技术最早由美国 Cetus 公司人类遗传研究室 Kary Mullis 及同事于 1985 年发现并研制成功 Kary Mullis 因发明了 “ 聚合酶链式反应 ” 而获得 1993 年度诺贝尔化学奖。. Kary Mullis. PCR 是在模板 DNA 、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下, DNA 聚合酶依赖的酶促合成反应,整个扩增过程分变性、退火、延伸三步。经过若干 循环后使目的 DNA 得以迅速扩增。. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Kary Mullis
PCR 技术最早由美国 Cetus 公司人类遗传研究室Kary Mullis 及同事于 1985 年发现并研制成功
Kary Mullis 因发明了“聚合酶链式反应”而获得 1993 年度诺贝尔化学奖。
● PCR 试剂盒的质量对测定结果的影响是直接而 且是至关重要的
● 试剂盒的质量不但受到生产过程中质量控制 诸要素的影响,原材料的质量、方法学设计、包 装、运输和贮存等一系列的环节,都对试剂盒的 质量有决定性的影响
核酸提取方法 ●经典方法:酚-氯仿抽提法,提取效率高、纯度好,但过程繁琐,易增加标本间相互污染的机会 ●简便方法:煮沸裂解法、玻璃粉或硅吸附法等 核酸提取除了要求操作简便外,更重要的是提取的效率及纯度,因此煮沸裂解法已被核酸纯化方法替代。
扩增缓冲液和 dNTP
●缓冲液包括: Tris-HCL(pH8.3~8.8) , KCl 或 NaCl ,酶保护剂如小牛血清蛋白、明胶、 Tween20或 DTT ● Mg2+ ,过高或过低镁离子浓度均不利于扩增 ●四种 dNTP 的终浓度应相等
目前国内用于定性测定的 PCR 试剂盒的测定模式主要有 PCR - ELISA 和 PCR -膜上杂交(杂交流)和分子信标荧光检测等;用于定量测定的试剂盒的测定模式则主要有 TaqMan和 Amplisensor荧光定量以及 PCR - Elisa 定量等
临床 PCR 试剂盒的质检 ●内外包装的检查(厂家名称、检测目的、批准文号、批号和有效期等 ),内包装的检查主要是看试剂瓶是否漏液、真空包装是否破损、试剂是否齐全以及是否有使用说明书等 ●试剂盒测定性能的检验(采用“血清盘”进行 )
●血清盘是由一定数量的原血清阴阳性样本、以及 3-5份系列稀释阳性样本所组成 ●原血清样本可用于判断 PCR 试剂盒对特定病原体核酸检出的特异性、灵敏度和符合率;系列稀释阳性样本用于判断试剂的测定下限
表中 a为真阳性, b为假阳性,各项指标的计算公式如下: 特异性( %) =d/b+d×100% 灵敏度( %) =a/a+c×100 % 符合率( %) =a+d/a+b+c+d×100 % 理想情况下,试剂盒的特异性、灵敏度及符合率应为 100%。
对不同试剂生产厂家或同一厂家不同批号试剂盒采用同一弱阳性定值质控物检测,可比较出不同厂家或不同批号试剂盒的测定下限的差异。在每次临床检测中,同时带上弱阳性质控物与临床标本一起检测,对判断试剂盒的质量及其稳定性具有重要的参考价值。