생체적합성 고분자의...

생체재료의 생체적합성 평가방법

박 종 철

연세대학교 의과대학 의학공학교실

2007 2007 예과 의학공학예과 의학공학

www.cellbiocontrol.or.kr

Contents

조직배양 기술

생체 재료로서 필요한 조건

조직, 세포와 생체재료의 친화성

생물학적 안전성

멸균방법의 적용가능성

www.cellbiocontrol.or.kr2 / 84

조직배양 기술

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조직배양

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정의 생체의 일부를 떼어내어, 적절한 배지를 포함한 배양기 안에서

생육시키는 기술

조직배양 기관배양 (Organ culture)

■ 세포배양 (Cell culture)

● 세포배양 ■ Monolayer culture : 부착 단층 배양•

■ Suspension : 혈액계 세포


세포 및 조직배양에 필요한 기기

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무균실 • Clean bench

멸균기 (Autoclave)

배양기 (CO2 incubator)

증류수 제조장치 (DW DI)•원심분리기 (세포분리 : 500 ~ 3,000 rpm)

현미경 (도립현미경)

Glass ware : Pipettee (Mass, Pasteur), Flask, Bottle,

Centrifuge tube …

Plastic ware : Petri dish, Well plate …


멸균법

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종별 방법 내용

가열법

가스법

조사법

약액법

여과법

고압증기법

건열법

방사선법

자외선법고주파법

115°C (30분)121 °C (20분)126°C (10분)135 ~ 145°C (3 ~ 5시간)160 ~ 170°C (2 ~ 4시간)180 ~ 200°C (0.5 ~ 1시간)

Ethylene Oxide

60Cr 또는 137Cs의 γ-ray전자선파장 254nm주파수 915 or 2450kHz

Ethanol (70%), Phenol

Pore size 0.2 or 0.45um


세포 및 조직배양용 배지 (I)

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배양세포 : 종속영양체 (Heterotroph)

배지의 조건 물리적 환경 조성 (pH, 삼투압 등)

■ 세포증식에 필요한 영양분, 미량성분 (일반적으로 혈청

과 같은 천연물 첨가)

배지 제조용 증류수 : DI & DW

배지의 종류 천연배지 (Natural media)혈장 (plasma)혈청 (serum) : Lot No.에 따라 차이 큼Yeast extractBacto-pepton, skim milk부착인자 (fibronectin, collagen)


세포 및 조직배양용 배지 (II)

배지의 종류 (계속)

합성배지 (Synthetic media)

MEM, RPMI 1640, Ham’s F-10, F-12 등

증식배지 (Growth media) 세포의 영양요구성, 실험내용, 가격, 입수 용이성

일반적으로 FBS 또는 CS를 5 ~ 10% 첨가

부착성 세포 : MEM, Ham’s F-12

부유계 세포 : RPMI 1640

유지배지 (Maintenance media) 증식은 안하며, 세포의 대사 유지가 필요한 경우

혈청량을 1/2 ~ 1/10 정도로 낮춤.

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세포 및 조직배양용 시약류

염류용액 (Balanced salt solution, BSS)무기이온 공급이나 삼투압, pH조절, 세포세척

Hanks solution

Earle solution

Phosphate buffered saline (PBS)

pH 지시약 0.2% Phenol red

조직으로부터 세포 분리용 효소Trypsin

Dispase (세균유래 중성 protease)

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혈청 (Serum)

Hormone 또는 성장인자의 공급원

물에 불용성 또는 난용성 물질의 용해성 개선 (지방산)

표면에 대한 접착성 개선FBS (Fetal bovine serum)

■ CS (Calf serum)■ HS (Horse serum)

혈청배양10% 전후의 혈청 첨가

■ 세포의 증식 분화의 완전제어 불가능•■ 세포가 분비하는 미량물질 정제를 방해■ 대량 배양시의 경제성 문제

● 무혈청배양

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세포의 계수

Cell counter

Haematocytometer (혈구계산판)

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배양세포의 보존

계대(transfer)의 반복으로 인한 형질전환, 오염 가능성

동결보존법

완서동결 (-1°C/분)■ 액체질소온도보존 (-196 °C)■ 보호제 : Glycerin, DMSO (15%)

● 해동 : 30 ~ 37℃안에서 해동시킴

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생체재료로서 필요한 조건



생체재료로서 필요한 조건

BiomaterialsBiomaterials(Polymer, Metal, (Polymer, Metal,

Ceramic ets.)Ceramic ets.)

생체적합성생체적합성BiocompatibilityBiocompatibility

생체기능성생체기능성BiofunctionalityBiofunctionality

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생체적합성

• Biocompatibility

생체재료가 생체조직이나 체액 등과 접촉하였을 때 거부반응을 나타내지 않아야 하는 특성

• 세포독성

• 생체조직 자극

• 염증 유발

• 알레르기 유발

• 암 유발

• 혈액성분 파괴 또는 변형

• 혈전형성

즉, 생체조직과의 상호작용으로 정상적인 대사와 생리적인 과정 등에 미치는 영향

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생체기능성

• Biofunctionality

생체재료가 체내에 존재하는 동안 목표한 기능을 완전히 수행할 수 있어야 하는 특성

• 화학적 안정성

• 적당한 기계적 강도

• 적당한 피로 강도

• 적합한 모양으로 설계

• 용이한 가공성

• 멸균 또는 소독 가능성

• 재현성

즉, 심장, 폐, 신장 등과 같은 장기나 상피, 혈액, 근육 등의 본래의 기능을 생체 내에서 실현하는 성질

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조직, 세포와 생체재료의 친화성



세포 생존능 (Cell Viability)

Functional assay

DNA labeling assay

Morphological assay

Reproductive assay

Membrane integrity assay

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End Point Measurements Used in Cell viability

Basis/end pointMethod

FDA & PI double staining Memb. damage & Enz. activity

Neutral red release Cell membrane injury

Total protein General cytotoxicity

Fluorescein leakage Cell membrane injury

Colony forming efficiency Lethal cytotoxicity

MTT dye reduction Mitochondrial damage

Crystal violet staining Lethal cytotoxicity - membrane

Alkaline phosphatase release Membrane injury

Intracellular ATP General metabolic toxicity

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Assessment of Viability by Double-Staining

Viable CellViable Cell

PIPI

Esterase

FDAFDA

FF FFFFFF

FF 515 nm515 nm(Fluorescence)(Fluorescence)

Non-viable Non-viable CellCell

PIPI FDAFDA

620 nm620 nm(Fluorescence)(Fluorescence)

488 nm488 nm(Excitation)(Excitation)

PIPIPIPI PIPI

PI: Propidium IodidePI: Propidium Iodide

FDA: Fluoresein DiacetateFDA: Fluoresein Diacetate

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Flow cytometry (FCM)

Cell Cell SuspensionSuspension

Laser-BeamLaser-Beam

전방산란광[ Scatter ]

형광형광[ Fluorescence ][ Fluorescence ]

[- control][- control]: non-staining: non-staining Living cellsLiving cells Dead cellsDead cells

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Neutral Red: an indicator of lysosome integrity

Viable cellViable cell Dead cellDead cell

Red StainedRed Stained

• Neutral Red is endocytosed by vital cells and Neutral Red is endocytosed by vital cells and internalized inside lysosomeinternalized inside lysosome

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Crystal Violet Assay

Crystal violetCrystal violet

up-taken dye measured colorimetric method after lysis

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Trypan Blue Exclusion Methods

Dead Cell (Blue stained)

Hmocytometer

Live Cell

Dead cell

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MTT assay: Cell viability by mitochondrial dehydrogenase

Mitochondrial Mitochondrial dehydrogenasedehydrogenase

MitochondriaMitochondria

Substrate (MTT)Substrate (MTT)



Insoluble coloredInsoluble coloredformazen (product)formazen (product) • MTT is converted to anMTT is converted to an

insoluble colored formazaninsoluble colored formazan derivative which is thenderivative which is then solubilized in acidicsolubilized in acidic isopropanolisopropanol

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부착 & 증식시험 (Attachment & Proliferation)

Attachment 재료가 목적하는 세포의 초기 부착 정도 및 친화도를 확인 세포가 재료에 부착할 수 있는 최대 시간인 4시간 동안 배양하여 cell

viability 측정 Proliferation

재료가 목적하는 세포의 증식 정도를 확인 재료 위에 직접 세포를 수일 동안 배양하여 cell viability를 확인하는 방법

Measured cell viabilityIncubation

scaffold

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SEM photographs of rat neural cortical cells on the PLGA films coated with mixtures.

A, non-coatedB, PDL10/LN100-coatedC, PDL10/FN100-coatedD,PDL10/CN100-coated (µg/ml)

Biotechnol Lett 2005;27(1):53-8

• Surface-Modified PLGA by ECM

부착 & 증식시험 (Attachment & Proliferation)

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기능변화시험 (Function)

Osteogenic differentition Alkaline phosphatase (ALP) activity assay

혈관의 기능성 확인

Endothelialnitric oxide synthase (eNOS) western blotting

Neurite outgrowth Fluorescent dyes double staining

(Neurofilament-FITC &MAP2-Texas Red)

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Alkaline phosphatase (ALP) activity assay

Osteogenic Differentiation MarkersSubstrate (ρ-Nitrophenyl phosphate)Substrate (ρ-Nitrophenyl phosphate)

ALP (catalyze)

ρ-Nitrophenolρ-Nitrophenol

PhosphatePhosphate

ALP hydrolyzes ρ-nitrophenyl phosphate to ρ-Nitrophenol and inorganic phosphate.

Dark blue stains represent highly induced ALP in osteoblastic cells.

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Endothelial nitric oxide synthase western blotting

Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) is an important enzyme in the cardiovascular system and have been associated with endothelial function measures.

eNOS (145 kDa)

GAPDH (36 kDa)

control(native)

before afterimplantation

Endothelial cells

Homogenize the vessel tissue

Western blotting by immunodetection

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Neurite outgrowth

Neurite outgrowth stimulation of rat neuronal cell (PC12) Fluorescent dyes double staining

Neurofilament-FITC MAP2-Texas RedSEM photography

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생물학적 안전성



ISO/TC 194를 통해 ISO 10993 ‘의료용구의 생물학적 안전성 평가’라는 의료용구의 생물학적 안전성 시험에 관한 규격을 제정하여 생체적합성 시험방법을 규정

ISO 10993 guideline

생물학적 안전성에 대한 규격

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전임상 시험

기존에 개발, 판매되고 있는 약 또는 의료기기와 전혀 다른 재료 또는 효능/효과가 있는 새로 개발된 제품에 대하여 사람에게 임상 시험하기 이전에 제품의 안전성이나 유효성을 시험하는 것

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접촉특성비접촉 의료용구 (non-contact device)표면접촉 의료용구 (surface-contacting device)체내삽입 의료용구 (external communicating device)이식형 의료용구 (implant device)

접촉기간일시 (limited exposure) : <24hrs연장 (prolonged exposure) : >24hrs and <30days영구 (permanent contact) : >30days

전임상시험을 위한 재료의 특성에 따른 분류

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피부 전극, 외부 보철물, 고정테이프, 압박붕대, 여러 가지 감시장치 등

점막콘택트렌즈, 요도 카테터, 질내 삽입기구, 위장용 튜브, S상경장경, 결장내시경, 위내시경, 기관지용 튜브, 기관지경, 치과용 보철물, 치과용 교정기구, 자궁내 피임기구 등

파열 또는 손상된 표면 궤양, 화상 및 육아조직 드레싱 또는 치료기구,

폐색성 패취 등

표면접촉 의료용구(Surface-contacting devices)

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체내삽입 의료용구(External communicating devices)

혈관(간접)

조직/뼈/상아질

순환혈액

혈관의 한 부분에 접촉되어 순환계 진입의 도관 역할을 하는 의료용구: 주입용 기구, 확장세트, 수혈세트 등

조직, 뼈, 혹은 상아질과 접촉하는 의료용구: 복강경, 관절경, 치과용 시멘트, 치과용 충전제, 피부 스태플 등순환하는 혈액과 접촉하는 의료용구: 혈관내 카테터, 심장박동전극, 산소발생기, 체외산소발생기 튜브 및 부속품, 혈액투석기 튜브 및 부속품, 혈액흡착제, 면역흡착제 등


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뼈

조직

혈액

주로 뼈에 접촉하는 의료용구: 고정용 핀, 판, 인공관절, 인조뼈, 시멘트, 골내 삽입물 등

주로 조직과 체액에 접촉하는 의료용구: 심장박동기, 의약품공급장치, 신경근육 센서 및 자극기, 인조건, 유방 삽입물, 인공후두, 골막하 이식물, 결찰클립 등

주로 혈액과 접촉하는 의료용구: 심장박동전극, 인공동정맥관, 심장판막, 인공혈관, 약물주입 카테터 및 심실보조기 등

이식형 의료용구(Implant devices)


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추출용매 Polar solvent

Water or saline solution with/without alcohol

Non-polar solvent

vegetable oil (cotton seed oil, sesame oil)

polyethylene glycol(PEG) solution

culture medium with/without serum 추출온도 및 시간

37 ± 1 for 24h ± 2h℃ ℃

37 ± 1 for 72h ± 2h℃ ℃

50 ± 2 for 72h ± 2h℃ ℃

70 ± 2 for 24h ± 2h℃ ℃

121 ± 2 for 1h ± 0.2h℃ ℃

추출조건의 선택

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Extraction ratio (+ 10%)

Metal; synthetic polymer; ceramic; composite film, sheet and tubing wall

< 0.5 6 cm2/ml

Thickness(mm) Example of materials

Metal; synthetic polymer; ceramic; composite tubing wall; slab; moulded items

> 0.5 3 cm2/ml

Natural elastomer< 1.0 3 cm2/ml

Natural elastomer> 1.0 1.25 cm2/ml

Powder; pelletsIrregular 0.1 to 0.2 g/ml; 6 cm2/ml

추출조건의 선택 및 추출비

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생물학적 안전성 시험방법

생체적합성 평가방법생체적합성 평가방법

초기 시험

추가 시험

세포독성

감작성

자극성

피내 반응

전신독성급성 아급성독성

유전독성

발열성

이식성

만성 독성

발암성 생식발생독성

생분해성

혈액적합성

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생물학적 안전성 초기 시험

세포독성

시험

자극성/

피내반응

시험

감작성

시험

×××

전신(

급성)

독성

시험

아급성독성

시험

유전독성

시험

발열성

시

험이식

시

험

혈액적합성

시험

×××

×××

×××

×××

×××

×××

×××

×××

×××××××××

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×××

신체 접촉 특성

표면접촉의료용구

체내삽입의료용구

이식형의료용구

피부

점막

파열 또는 손상된 표면

간접적인혈액경로

조직/뼈/상아질+

순환혈액

조직/뼈

혈액

접촉기간A-24시간 이내B-24시간~30일C-30일 이상

의료용구 분류

ABCABCABCABCABC

ABC

ABCABC

만성독성

시험

생식(

발생)

독성 시험

발암성

시험

생분해성

시험

··×

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··×

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추가 시험

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세포독성시험

세포배양 기술을 이용하여, 의료용구나 재료 또는 그 용출물에 의한 세포의 용해(괴사) 또는 성장저해 및 기타 세포에 미치는 영향을 평가함으로써 의료기기 또는 의료용구의 생체적합성을 결정하는 중요한 시험

시험의 종류 직접 접촉 시험 (Direct contact test) 간접 접촉 시험 (Indirect contact test)

한천 확산법 (Agar diffusion) 필터 확산법 (Filter diffusion)

추출액 희석 시험 (Dilution extraction test)

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세포독성시험 : 직접 접촉 시험법

Cell monolayer와 재료들을 직접 접촉함으로써 재료들로부터 유리되어 나오는 성분이나 재료의 표면특성이 세포에 미치는 정도를 파악

세포독성이 나타난 면적을 측정하여 zone index에 의해 세포독성 정도를 평가

4X105 cells/well

Incubate2 days

Incubate1 days

Formation of confluent monolayerLoad specimen

Stain with crystal violet (CV)Measure Zone/Lysis/Response Index

1cmX1cmTest culturemid log phase

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시편과 접촉한 세포의 형태 관찰(Crystal violet Staining)

판별기준

(–) control :HDPE

(+) control :PU with 0.1%ZDEC

Zone limited zone around specimen1

Zone extend less than 0,5cm beyond specimen2

Zone extend 0.5-1.0cm beyond specimen3

No detectable zone around or under specimen0

Zone extend greater than 1.0cm beyond specimen but does not involve entire dish4

Zone involves entire dish 5

Zone DescriptionsZone Index

세포독성시험 : 직접 접촉 시험법

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세포독성시험 : 간접 접촉 시험법

한천 확산법 (Agar diffusion test) 세포독성의 정성적 분석이 가능하며, 한천층을 통해 확산

을 일으키지않는 삼출물 또는 한천과 반응을 일으키는 삼출물에 대해서는 적절치 않음

필터 확산법 (Filter diffusion test) 세포독성의 정성적 분석이 가능하며 여과지를 이용하여

세포독성을 판정

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세포독성시험 : 간접 접촉 시험법

Negative Positive

왼 쪽 : Film

오른쪽 : Cell

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세포독성시험 : 추출 희석법 시험법

Measure IC50(%)Colony counting or Measure the absorbance of dye

.....

liquid medium

Extracts stock sol.

Dilute extracts

Rinse with PBSTrypsinize and transfer

IncubateIncubate1 days

0.25X105 cells/well

Cell attachment / Add extracts or diluted extracts

100% 50% 25%1cmX5cm

3 cm2/ml in culture media

재료들로부터 유리되어 나오는 성분이나 추출 성분 등이 세포에 미치는 정도를 파악. 추출액의 희석농도에 대한 각 흡광도로부터 relative cell viability를 구한 후 이로부터 IC50(%)로 표현

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판별기준추출액의 희석농도(%)에 대한 각 흡광도로 relative cell viability(%)를 구한 후 이로부터 IC50 (%)로 표현

The optical densities in the medium containing with diluted extracts

The optical densities in the fresh control medium

X100

Cytotoxicity using indirect method

0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

100.0

120.0

3.125 6.25 12.5 25 50 100

Dose (%)R

elat

ive

perc

enta

ge o

f L

929

viab

ility

to B

lank

Positive (ZDEC)SampleNegative (HDPE)Blank

세포독성시험 : 추출 희석법 시험법

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감작성시험

생체재료의 안전성을 평가하는데 있어서 알레르기성 접촉 피부염 유발의 잠재성을 알아보는 것은 매우 중요

감작성 시험은 아주 미량의 용출물에 노출 또는 접촉 되더라도 알레르기나 감작반응이 일어날 수 있음을 바탕으로 하여, 의료용구나 재료 또는 그 용출물을 적당한 모델에 접촉시켜 잠재적 감작성을 평가하는 시험

Intradermal induction phase

Topical induction phase

Challenge phase Rechallenge phase

Observation phase

7 days

14 days

24, 48, 72 hours

Record of skin appearance

healthy youngadult albinoguinea-pigs(300g-500g)

AA

BB

CC

Intradermalinjection siteA, B, C

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감작성시험

shaving marking injection

피하유도단계 (Intradermal induction phase)

대상 동물의 피하와 표피를 각각 시험 물질에 초기 노출(initial exposure) 시켜 면역 반응 유도 (7일)

국소유도단계 (Topical induction phase)

피내주사부위를 덮을 수 있도록 여과지로 시험재료나 용출물을 국소적용(14일)하고 밀폐성 드레싱으로 보호

48h±2h후에 드레싱과 patch를 제거

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감작성시험

shaving marking

시도 단계 (Challenge phase)

모든 시험 및 대조군에 시험재료나 용출물로 적신 patch를 사용하여 옆구리에 국소적용하고 밀폐성 드레싱으로 적용부위를 보호24h±2h 후에 드레싱과 patch를 제거

시험동물의 관찰

solvent control-treated(saline)

positive control-treated(2,4-dinitrochlorobenzene)

드레싱을 제거하고 24h,48h 및 72h 후에 시험동물과 대조동물의 적용 부위의 상태를 관찰각각의 적용부위에 대하여 표에 나타나 있는 등급체계에 따라 시간대별로 홍반이나 부종 등 피부반응을 기술하고 등급을 정함

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감작성시험 : 결과 판정

반응

홍반과 가피 형성

홍반 없음약간의 홍반경계가 분명한 홍반적당한 홍반심한 홍반, 가피 형성

등급01234

부종 형성부종 없음약간의 부종경계가 분명한 부종적당한 부종

0123

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자극성시험

피부에 접촉하는 물질의 독성을 평가하는데 있어, 피부 자극 정도를 평가하는 것은 유용 적당한 모델의 피부, 눈 또는 점막과 같은 이식조직이나 적절한 부위에 대하여 의료용구나 재료 또는 그 용출물의 잠재적인 자극성을 평가하는 시험자극성 시험의 종류

피부 자극성 시험 (Skin irritation test) 안자극성시험 (Ocular irritation test) 피내반응시험 (Intracutaneous (intradermal) reactivity test)

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자극성시험 : 피부 자극성 시험

B: control intact siteA: test intact site

clipped dorsal region

Sample (0.5g or 0.5ml)

healthy young adultalbino rabbits (>2kg)

Repeated exposure removal after 1hr

record the appearances

last exposure

record the appearances

Single exposure (acute)removal of patches after 1, 24, 48, 72 h

record the appearance

1, 24, 48, 72 h

BB

AA

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자극성시험 : 피내반응 시험

healthy young adult albino rabbits (>2kg, >3마리)Non-polar

solvent 0.2ml

Non-polar solvent

control 0.2ml

Polar solvent 0.2ml

Polar solvent control 0.2ml

Intracutaneous injection

24, 48, 72h

Record the appearances

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자극성시험 : 결과판정

피부 자극성 시험

홍반과 가피 형성

홍반 없음아주 약간의 홍반잘 형성된 홍반중간정도의 홍반심한 홍반 (홍반의 등급을 결정할 수 없을 정도의 가피 형성)

등급01234

부종 형성

부종 없음아주 약간의 부종잘 형성된 부종 (경계가 분명한 부종)중간 정도의 부종 (1mm 솟아오름)심한 부종 (1mm이상 솟아오르고, 노출 부위를 벋어나는 경우)

01234

홍반 없음아주 약간의 홍반 (감별이 어려울 정도)감별이 가능한 홍반상당한 홍반심각한 홍반 (짙은 붉은색 내지는 홍반의 등급을 결정하기 어려운 가피 형성)

부종 없음아주 약간의 부종 (감별이 어려울 정도)감별이 가능한 부종 (주변 경계가 확실)중간 정도의 부종 (1mm 솟아오름)심한 부종 (1mm이상 솟아오르고, 노출 부위를 벋어나는 경우)

피내 반응 시험

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전신독성시험

의료용구의 구성성분의 체내 방출을 알아보는 시험으로써, 의료용구및 그 재료가 구성성분을 체내로 방출하는 경우 전신독성 시험의 잠재적 가능성을 평가

종류 급성 전신독성 시험법 (Acute systemic toxicity) 아급성 전신독성 시험법 (Subacute systemic toxicity) 만성 전신독성 시험법 (Chronic systemic toxicity)

시험방법의 선택 환자와의 접촉방법 및 접촉기간을 고려하여 의료용구에 대한 적

절한 시험의 종류와 방법을 선택

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전신독성시험 : 급성 전신독성 시험법

시험샘플을 1회 이상 적용하였을 때 24시간 이내 나타나는 부작용을 관찰 (행동 및 무게변화)

적용방법 급성경구적용 (Acute oral application) 급성피부적용 (Acute dermal application) 급성흡입적용 (Acute application by inhalation) 급성정맥내적용 (Acute intravenous application) 급성복강내적용 (Acute intraperitoneal application)

Injection 행동, 무게 관찰

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전신독성시험 : 아급성 & 만성 전신독성

아급성 전신독성 (Subacute systemic toxicity) 의료용구 및 의료용 재료 또는 용출액을 24시간 이상 시험동물 수명의 10%이하(쥐의 경우 최고 90일) 이내로 1회 이상 노출시켰을 때 나타나는 영향을 측정

만성독성 시험자료가 있는 의료용 재료에 대해서는 시행하지 않을 수 있고,접촉방법과 시간에 대하여 적절하여야 함

만성 전신독성 (Chronic systemic toxicity) 의료용구 및 의료용 재료 또는 용출액을 시험동물 수명의 10%이

상(쥐의 경우 최저 90일이상) 이내로 1회 이상 노출시켰을 때 나타나는 영향을 측정

치과재료와 같이 구강에 만성적으로 노출되는 특별한 의료용구에 주로 사용되는 시험법

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전신독성시험 : 아급성 & 만성 전신독성

적용방법 경구적용 (Oral application) 피부적용 (Dermal application) 흡입적용 (Application by inhalation) 정맥내적용 (Intravenous application) 복강내적용 (Intraperitoneal application)

아급성, 만성 전신독성의 결과 판명기준 실험기간동안의 체중 변화 실험기간동안의 먹이섭취량의 변화 혈액검사 뇨검사 해부학적 장기 채취 조직학적 검사

Oral Dermal

Intravenous

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아급성 & 만성 전신독성 : 채취장기

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유전독성시험

세포 또는 개체수준에서 돌연변이 (mutation)를 유발하는 성질과 DNA에 상해성을 나타내는 성질(genotoxicity)을 포함하는 광범위한 의미

포유 동물 또는 비포유 동물의 세포배양 기술을 이용하여 의료용구나 재료 또는 그 용출물에 의한 유전자 변이, 염색체의 구조 또는 수의 변화 및 기타 DNA 또는 유전자에 미치는 독성을 평가하는 시험

시험종류 Ames test : Salmonella typhimurium, reverse mutation assay

Sister chromatid exchange (SCE) : In vitro sister chromatid exchange assay in mammalian cells

Chromosomal Aberration : In vitro mammalian cell gene mutation test

Micronucleus assay : Micronucleus test

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유전독성시험 : Ames test

Salmonella typhimurium, reverse mutation assay

특정 아미노산 합성이 저해된 미생물을 이용하여 시험물질에 의해서 아미노산 합성 균주로 전환 되는 지를 확인하는 시험

Ames test의 특징 화학물질의 독성을 결정하기 위한 모든 방법 중 가장 보편적으로 사용 살모네라 균주의 reverse mutation 을 측정 돌연변이가 frameshift 또는 base-pair substitution type으로 됨 시험물질의 성질에 따라서 대사활성화에 의해 유전독성을 나타내는 것이 있으므

로 Rat liver S9 fraction (metabolic activation을 공급)을 가한 계와 가하지 않은 계를 병행하여 시행

mutant bacteria

: His-auxotroph: Trp-auxotroph

wild typeBack mutation

by point mutation( )Salmonella typhimuriumEscherichia coli

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유전독성시험 : Ames test

TA98 , -S9 TA1535, -S9

TA98, +S9 TA1535, +S9

(–) control (+) control (Na azide)

(–) control (+) control (NQNO)

(–) control (+) control (AA)

(–) control (+) control (AA)

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유전독성시험 : SCE

In vitro sister chromatid exchange assay in mammalian cells 사람 및 포유류의 배양세포(일반적으로 Chinese Hamster Lung(CHL)

세포주를 이용)를 이용하여 염색체가 복제될 때, 어떤 물질이 두 자매염색분체간의 DNA사슬 상호교환을 증가시키는 능력이 있는가를 감지하는 방법

시험물질을 투여한후 bromodeoxyridine(BrdU)을 처리하고 세포들이 중기상에 머무르게 하기 위하여 방추체 억제제 (Colchicine 또는 Colcemid )를 처리하고 중기세포의 염색체 표본을 염색하여 SCE를 계수

SCEsample-treated MMS-treatedsolvent-treated

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유전독성시험 : Chromosomal aberration test

사람 및 포유류의 배양세포(일반적으로 Chinese Hamster Lung(CHL) 세포주를 이용)를 이용하여 시험물질의 cytogenetic effect를 확인하기 위해 염색체이상 유발성 유무와 유발정도를 검색하는 시험

염색체이상(chromosome aberration) 수적이상 : 주로 분열장치에 작용하여 생기는 염색체의 불분리 또는 분열정지

에 기인함 이수성 - aneuploid 배수성 - polyploid (핵내배화 endoreduplication도 포함)

구조이상(structural aberration) : DNA 이중쇄 절단(double strnad breaks)에 기인함

Gap (g) : 염색분체형, 염색체형을 포함 염색분체형 절단 : (ctb) 염색분체형 교환 : (cte) 염색체형 절단 : (csb) 염색체형 교환 : (cse) 기타 이상 : (단편화 등)

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유전독성시험 : Micronucleus assay test

설치류 골수중의 유약적혈구에 출현하는 소핵을 지표로 하여 시험물질의 염색체 이상 유발성을 in vivo에서 평가하는 방법

만일 소핵을 가진 적혈구가 증가한다면 시험물질이 염색체를 손상시켰거나 세포분열장치에 이상을 유발한 것으로 평가

골수중의 분열중기상을 해석하는 염색체이상시험과 함께 생체내에서 염색체이상 유발물질을 검출하는 시험

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유전독성시험 : Micronucleus assay test

Jenner 염색법으로 염색된 적혈구

Giemsa 염색법과 acridine orange로 염색한 적혈구

음성대조군 양성대조군

PCENCE

음성대조군 양성대조군

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발열성 시험

발열성은 일반적으로 의료용구가 endotoxin 박테리아에 감염됨으로써 순환혈류세포나 장벽과 만나 체온을 상승시킴으로써 발생

최근에는 일부 재료자체에 발열물질이 내재된 경우도 많으며, 이러한 경우는 동물실험을 통하여야만 확인

제품제작의 마지막 공정 과정에서의 미생물 감염과 연관된 경우가 대부분 의료용구에는 주로 gram-negative가 endotoxin으로 작용하는 경우가 많은데

이는 살균 후에도 남아 있을 수 있음 (박테리아 endotoxin의 허용량은 0.5 EU/ml)

결과판정 : 체온상승이 0.5℃ 이상인 동물이 없으면 발열 음성으로 판정

시료 투여 체온측정 직장온도측정기

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Endotoxin

Gram negative 박테리아의 outer cell wall 물질과 lipids, polysaccharides 등이 섞인 물질로서 host의 innate immune response를 자극하여, 국소 또는 전체적인 염증반응을 일으키며 조직의 손상을 가져옴

미생물이 멸균 되었다 하더라도 LPS와 같은 endotoxin은 제거되지 않고 남아 있어 결국 면역체계의 손상을 초래함

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LAL (Limulus amebocyte lysate) phemus test

Limulus Polyphemus로부터 추출한 효소와 endotoxin을 반응시켜 응고 정도를 알아 봄으로써 endotoxin 감염 정도를 알 수 있음

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이식 시험

의료기기의 사용목적에 따라 완제품이나 그 재료를 외과적으로 이식하거나 이식부위에 삽입함으로써 생체조직에 나타나는 병리학적 영향을 육안 및 현미경으로 관찰

고분자 혹은 엘라스토머(천연/합성고무)의 경우 상대적으로 단기간 동안 피부를 제외한 조직과 직접 접촉할 때의 효과를 평가하고, 세라믹이나 금속의 경우 장기간 이식에 따른 효과를 평가

근육에 대한 이식 시험 과정 뼈에 대한 이식 시험 과정

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시험기간 동안 적절한 간격으로 각 실험동물을 관찰하고, 국소적, 전신, 행동상의 이상 유무를 기록

생물학적 반응의 평가: 시간의 경과에 따른 육안 및 조직병리학적 반응을 기록하고 등급별로 평가

각 이식부위의 동일지점에서 시험군과 대조군을 서로 비교하여 시편의 움직임에 따른 상대적 영향을 최소화

육안 평가: 저배율 확대경을 사용하여 각 이식 부위를 관찰조직학적 평가

이식 시편/조직 경계면에서 정상 조직과 혈관구조의 비영향 부위까지의 거리를 측정하여 반응 정도를 결정 이식 시편의 치수와 방향, 단면수 및 절단 기하학적 형태에 비례한 단면방향을 기록 평가 및 기록해야 할 생물학적 반응 항목

- 섬유화/섬유질 캡슐 및 염증 정도 - 조직 형태학적 변화에 의한 퇴화- 핵 잔해 혹은 모세 혈관 벽 파괴에 따른 괴사 유무 - 시편 잔해, 지방 침윤, 육종과 같은 기타 - 다공성 이식 시편 내부로의 조직 성장의 양과 질 - 다형핵 백혈구, 림프구, 혈장세포, 호산 백혈구, 대식세포 및 다핵세포 등과 같은 염증 세포 종류별로 시

편/조직 경계면으로부터의 거리에 따른 숫자와 분포 뼈이식은 뼈 접촉 부위와 시편 주변 골량, 비석화회 조직의 존재 유무, 뼈흡수 그리고 뼈형성 등을 평가

이식 시험 : 수술 후 평가

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혈액과 접촉하는 의료용구나 재료에 대해 적절한 모델이나 시스템을 사용하여 혈액이나 그 성분에 대한 영향을 평가하는 시험

의료용구와 혈액과의 상호작용 평가방법 : 혈전 (Thrombosis), 혈액응고 (Coagulation), 혈소판 (Platelets), 혈액학 (Hematology) ,면역학 (Immunology)

혈액과 접촉하는 의료용구

혈액적합성

의료용구종류

캐뉼라,확장기 세트,채혈기구, 혈약 저장기구 및 혈액주입용 기구순환혈액과 직접 접촉

체내삽입 의료용구

인공심장판막,인공혈관, 조직혈관 수복재료,의료용 보조순환장치,하대정맥필터,스텐트,동정맥 션트, 혈액모니터, 체내 의약품 전달카테

터, 이식형 심장박동기 전극, 혈관내막형 산소발생기이식형 의료용구

심폐순환용 혈액회로, 심폐용 산화기, 혈액투석장치, 자동혈액성분분리장치, 심장 및 혈관 중재술용 기기, 경피순환 보조 시스템,

인공심장 박동기 전극순환계의 도관역할

체외 진단용 기기비접촉 의료용구

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혈액적합성 시험의 하나로 혈액과 직/간접적으로 접촉하는 의료용구 및 재료의 용혈에 대한 적혈구의 용해와 안전성을 평가하기 위한 in vitro 시험으로서, 적혈구의 용해와 헤모글로빈 노출 정도를 측정하여 평가함

ASTM F756-82 기준에 의거한 용혈성 시험 용혈지수와 등급

혈액적합성 : 용혈성시험

눈에 띄게 있음20 - 40

심한 용혈성적당히 있음약간 있음용혈성 없음용혈등급40 초과10 - 202 - 100 – 2용혈지수

일본 후생성 가이드라인에 의거한 용혈성 시험 공시험액과 양성 대조군의 흡광도를 각각 측정하여 용혈율 산출 판정 기준 : 2회 평균 용혈도가 2% 이하

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생식/ 발생 독성 시험

생체재료 또는 그 재료의 용출물이 생식 기능 전반 뿐만 아니라 다음세대의 분화, 발생, 성장 및 기능 발달 등에 미치는 영향을 관찰

시험 종류 수태능 및 일반 생식 독성시험 최기형성 시험 주산, 수유기 시험

시험적용 자궁 내 삽입기구 또는 생식기나 배/태아에 장기간에 걸쳐 직접적으로 접촉될 가능

성이 있는 경우 에너지 축적형 재료인 경우 재흡수 또는 여과성의 재료인 경우

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발암성 시험

생체 내에서 초기에 일어난 독성 반응의 결과 세포의 변형으로 인해 생체 재료가 장기간에 걸쳐 체내에서 존재할 때, 그 주위에 조직이 악성종양화 될 수 있음.

그 여부를 설치류를 이용하여 판단하는 방법으로 생체재료 또는 그 재료의 용출물을 최대 이식 량을 투여하여 종양 형성의 가능성을 검사 평가.

최소한 한 종류 이상의 설치류에 대하여 일생 동안 생체시험 해야 함 시험 적용

재흡수성의 생체재료가 임상에 관한 충분한 자료가 없을 때 생체재료가 포유동물을 대상으로 한 유전독성 시험에서 양성반응을 나타낸 경우 생체재료가 체내 또는 체공에 지속적으로 또는 총 사용 시간으로 30일 이상 삽입되고

임상에 관한 충분한 자료가 없는 경우 유전독성은 없으나, 발암성 시험이 필요한 경우

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생분해성 시험 (생체안정성/용출물 시험)

의료용구나 재료 또는 그 용출물이 분해 또는 재흡수의 가능성이 존재할 경우 그 분해산물이나 삼출물의 흡수, 분포, 생체내 변환 및 배설 등의 과정을 평가하는 시험

생분해성 시험의 종류 체외 생분해성 시험

accelerated and real time testing exposure to 0.9% isotonic saline or solutions containing enzymes,

phosholipids SEM, TEM, TLC, GLC, GPC, AA, ICP-MS, SIMS, ESCA, NMR, FTIR,

microincineration, Optical microscopy, electron probe microscopy, neutron activation analysis

체내 생분해성 시험 exposure to human body

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멸균 방법의 적용 가능성



무균시험

약품이나 생체재료를 배양하여 증식되는 미생물(세균 도는 진균)의 유무를 시험하는 방법

단순히 미생물의 오염 여부만을 판정 직접법

시험 검체를 직접배지에 넣어 배양하는 방법 미생물발육저지활성시험의 결과 미생물 발육의 저지 활성이 없을 때 시

행하고, 다른 요인에 의한 오염이 없도록 한다.

멤브레인 필터법 시험 검체의 추출물 또는 시험 검체를 담근 용액을 멤브레인 필터를 사

용하여 여과하여 필터는 배양하는 방법 미생물발육저지활성시험의 결과 미생물 발육의 저지 활성이 있을 때 시

행하고, 다른 요인에 의한 오염이 없도록 한다.

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무균시험

액상치오글리콜산배지Ⅰ

호기배양 35℃

액상치오글리콜산배지Ⅱ

혐기배양35℃

대두카제인소화배지

호기배양 25℃

대조군 대조군 대조군실험군 실험군실험군

액상치오글리콜산배지Ⅰ

호기배양 35℃

액상치오글리콜산배지Ⅱ

혐기배양35℃

대두카제인소화배지

호기배양 25℃

대조군 대조군 대조군실험군 실험군실험군

직접법의 의한 결과

멤브레인 필터법에 의한 결과

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여러 가지 멸균 방법

멸균방법 장점 단점 적용 가능성

고압증기 멸균(121 , 15℃ 분)

고온•압축 증기로 시편 멸균,아포 형성 세균 30분 내 사멸

급랭시에 습기 응축외부공기가 안으로 유입 오염 유발 가능성

정형외과 이식편 멸균 시

가스 멸균(EO 가스)

비교적 낮은 온도 (55 )℃ 에서 멸균,세균의 세포벽 침투 세포 증식 억제 및 화학적으로 방해

피부 자극성신체조직에 화상 유발혈액의 용혈현상 유발공기에 충분히 노출

정형외과 이식편 멸균 시

자외선 소독(254 nm)

전자기의 낮은 에너지 형태로 미생물 세포 파괴,표면 미생물 멸균용

불투명한 물질을 침투하지 못하므로 포장된 시편이나 불규칙한 모양의 시편 소독에는 비효과적

소독에 적용 가능하나 효과가 떨어짐

방사선 멸균(g-ray)

사람 피질골 이식편 에서 HIV나 hepatitis C 감염과 관련하여 멸균 효율성 입증

고가의 장비,일반 멸균 방법으로는 부적합

혈관 이식편 등의 연조직에 대한 안전성은 입증된 바 없음

세포독성을 지닌 모든 화합물은 항생제로 분류 가능

화학적멸균 방법

최적 조건 및 넓은 스펙트럼의 항생제 선택이 관건잔류여부

모든 재료에 적용 가능

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생체적합성 생체재료

생체적합성 생체재료

생체안전성생체안전성

생체기능성생체기능성

생체안정성생체안정성

+ 멸균가능멸균가능

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감사합니다 !!

연세대학교 의과대학 의학공학교실 세포제어연구실 (☎ 02-2228-1917)

연세의료기술품질평가센터 (☎ 02-2228-1192)

E.mail : [email protected]

Homepage : www.cellbiocontrol.or.kr

mailto:[email protected]

생체적합성 고분자의...

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