ZEISS 510 META

MICROSCÓPIO CONFOCAL

START-UP E SHUT-DOWN

MANUAL

CAPI

(Centro de Aquisição e Processamento de Imagens)

(Greg Kitten - versão 07/07/2008)

2

START-UP E SHUT-DOWN INSTRUCTIONS - ZEISS 510 META MICROSCÓPIO CONFOCAL

1) Ao chegar na sala do microscópio confocal 1.1 – Se o sistema estiver totalmente desligado, passe para o item 2. 1.2 – Se o sistema foi utilizado por outros usuários e já se encontra ligado, passe para o item 3.4.

1.3 Nota importante: Após o termino do uso do sistema, não o desligue imediatamente. PRIMEIRO cheque se algum outro usuário possui reserva. Se positivo, ligue para o usuário para verificar se ele virá utilizar o sistema em breve. - caso ele venha a iniciar seus experimentos nos próximos 60 minutos, deixe o sistema e a lâmpada de UV ligados e o laser em Standby Mode (laser de argônio – 488) e os demais lasers ligados. - caso o próximo usuário não vá iniciar os experimentos nos próximos 60 minutos, desligue a lâmpada de UV e os lasers, mas deixe ligado o computador e o programa Zeiss 510 Meta. - Se ninguém está agendado após você, o sistema deve ser totalmente desligado. Veja item 9.

Perigo! Quando a lâmpada de UV é desligada, esta deverá permanecer desligada por no mínimo 15 minutos antes de ser religada.

2) Ligando o microscópio:

2.1 ligar o disjuntor (C9) do estabilizador na caixa de distribuição de energia (parede) 2.2 ligar a chave “Remote Control” (ao lado do microscópio) 2.3 ligar o computador e monitores – Na caixa de logon do Windows clique em “ENTER”

3) Utilizando o software LSM 510

3.1 Iniciar o programa LSM 510 localizado no desktop

3.2 Em Switchboard

- Com a opcao Scan New Images ativada, clique em seguida em Start Expert Mode - esta opção permite o uso do microscópio e captação de novas imagens – veja figura ao lado

- selecionar Use Existing Images para trabalhar com fotos já adquiridas sem utlilizar o microscópio

O software irá fazer uma varredura do microscópio, checando os lasers, a luz de fluorescência e as objetivas - exemplo ao lado

3.3 – Ligue a Lâmpada de UV – Obs. - somente após o inicio do programa é que a lâmpada de UV ligará - Não se esqueça de anotar o tempo da lâmpada na agenda (= começo de uso)

3.4 Em Expert Mode:

3

- selecionar Acquire

- em Laser: selecionar o laser a ser utilizado

- Laser Argon/2 - flourescência verde (458 etc): clicar em Standby (o laser ira aquecer), somente depois de aquecido clique em ON. Na opção Output (%) coloque em ≤50%

- Laser HeNe1 – flourescência vermelha (543):

clicar em ON

- Laser HeNe2 – flourescência infravermelha (633):

clicar em ON

- em Micro - escolher a objetiva e refletor (filtros)

Objetivas:

1) Plan-Neofluar 2) LD Achroplan

10x 20x

Ph2

3) LD Achroplan 4) Plan-Neofluar

40x 40x

Ph2 Oil DIC

5) C-Apochromat 40x Water 6) Plan-Apochromat 63x Oil DIC

Nota: A objetiva que está sendo utilizada é mostrada na tela do computador e também no painel digital do microscópio.

Refletor - jogo de filtros UV - Axiovert 200 M

DAPI - jogo de filtros 01 excitacao UV H 365

FITC - jogo de filtros 09 excitacao azul 450-490

RODAMINA - jogo de filtros 15 excitacao verde H 546

4

- em Config:

- escolher o laser a ser utilizado –

em Excitation selecione

- 10-30% de potência para o laser de argônio (488)

- 50-70% para os demais (laser HeNe 543 e 633)

- escolher os dicróicos primários e secundários (Mirror, HFT etc) e os filtros (LP etc) de acordo com o comprimento de onda de excitação e emissão.

Selecione o canal (Ch2 etc) a ser utilizado.

4) Seleção e captura de imagens

4.1 Selecionar o modo VIS para visualização da amostra no microscópio de fluorescência e escolher a região desejada, acertar o foco.

4.2 selecionar modo de LSM para captura da imagem pelo confocal

4.3 selecionar modo de Scan para abrir o menu de opções para aquisição da imagem

Em Mode selecionar Fast XY para iniciar os escaneamento da sua amostra.

5

4.4 Selecionar Channels para ajustar: Pinhole, Detector Gain, Amplifier Offset, Amplifier Gain

Obs: Na opção de ajuste do pinhole, não esquecer

de clicar em 1 (seta)

Ex: laser argônio (488) com 20% de exitação:

Observação: você deve utilizar a ferramenta Palette, opção Range Indicator, para ajustar Detector Gain e Amplifier Offset

No Detector Gain, evite deixar áreas muito avermelhadas – marcação saturada

4.5 Após a escolha correta das configurações da imagem, retorne na opção Mode.

Ajustar o parâmetros que afetam a resolução da imagem: - Frame Size - Ex. 512x512, 1024x1024, etc - Scan Speed - velocidade de escaneamento - Data Depth: 8 bit ou 12 bit

(256 e 4096 valores de cinza, respectivamente) - Scan Direction: - Mode Line - Method Mean - Number - média de vezes escaneadas (comece com 4)

Após o ajuste das configurações, clique em Single para a aquisição da imagem.

6

5) Capturando imagens com DAPI

Abaixo segue um modelo de configuração para captura de DAPI.

- em Config:

- escolher os dicróicos primários e secundários (Mirror, HFT etc) e os filtros (LP etc) de acordo com o comprimento de onda de emissão do DAPI (setas).

Em Scan Control ajuste o Pinhole, Detector Gain e Amplifier Offset para a quantidade desejada.

Ainda em Scan Control, na opção Mode, reduza a Scan Speed (velocidade de escaneamento) para obter uma melhor qualidade de imagem.

Obs: como a aquisição de DAPI é feita a partir de fluorescência do microscópio (lampada UV), os detalhes não são tão definidos quanto ao uso de outros marcadores de DNA (por exemplo: Iodeto de propídio e To-Pro-3 etc usados com os lasers).

7

6) Capturando DIC (Differential interference contrast) 6.1 Configurações no microscópio Selecione uma das objetivas para uso do DIC (objetiva 40x óleo ou 63x óleo). Posicione o polarizador (1), o condensador (2) na posição DIC III. Deslize o analisador (3) da posição 1 (figura 3a) para a posição 2 (fig. 3b – observe orientação da seta pontilhada).

1

2

3

1 2

3a 3b

8

Capturando DIC (Differential interference contrast (continuação)

6.2 No software do confocal

Com a opção Config selecionada, ative o ChD (seta).

Mude a cor do canal ChD para cor branca.

Observamos também na figura um exemplo de configuração para aquisição de emissão no comprimento de onda do verde (FITC, por exemplo). Essa configuração não interfere com a aquisição e configuração do DIC.

Na opção Scan:

Mude o Detector Gain e Amplifier Offset para a quantidade desejada. Após selecionar as configurações desejadas, clique em single para a aquisição da imagem (exemplo abaixo).

9

7) Salvando a imagem:

Com sua imagem escaneada, clique em Save. Uma caixa de diálogo aparecerá. Você

devera criar seu banco de dados ou utilizar um banco de dados pré-existente. Para criar um novo banco de dados, clique em New MDB – (veja figura abaixo – seta).

Nomeie o banco de dados e clique em Create. Você retornara a caixa de dialogo anterior e você poderá nomear sua imagem, adicionar descrição e outras observações. Após adicionar todos os dados necessários, clique em OK e sua imagem será salva dentro do banco de dados que você criou. À medida que você salvar as imagens, estas serão adicionadas ao banco de dados.

Obs: O HD do computador foi dividido em C: (instalação do sitema operacional do confocal e programas, menor capacidade de armazenagem) e D: que é utilizado para salvar as imagens (possui maior capacidade de armazenagem). Em hipótese alguma salve suas imagens em C:, pois serão apagadas sem aviso. Em D: crie uma pasta com o nome do chefe do laboratório para o qual você trabalhe, e dentro da pasta dele, crie sua própria pasta. É nessa pasta que você deve criar seu banco de dados onde serão salvas suas imagens, como foi explicado anteriormente. Veja exemplo abaixo:

D:\Prof. Greg\Elisandra\experimento1.mdb (disco local\nome do orientador\nome do aluno\nome do banco de dados do experimento)

Nota: O computador e o monitor estão conectados a um NO-BREAK contendo baterias que permitirão a continuação do seu trabalho por 10-15 minutos em caso de falta elétrica no ICB. Caso isso ocorra, salve seus arquivos e desligue imediatamente todo o sistema (computador e monitor) até que a energia se restabeleça.

10

Banco de dados – Nele você poderá visualizar todas as imagens adquiridas, checar os parâmetros utilizados para a aquisição de cada imagem, apagar, carregar sua imagem, etc....

8) Copiando seus arquivos

Após o termino do experimento, faça o backup das suas imagens gravando um CD ou copiando em um dispositivo de transferência de dados (pendrive). O computador do confocal será utilizado para aquisição e armazenagem temporária de suas imagens de confocal. Depois que você transferir seus dados para um computador de trabalho definitivo (do seu laboratório), volte e apague sua pasta do computador do confocal. You can download the Zeiss LSM Image Browser and other programs to analyze your images

- see below.

9) Desligando o Sistema: PRIMEIRO, see note 1.3 above 9.1 Anotar a hora de uso do sistema de acordo com:

o tempo da lâmpada de UV ou relógio da parede 9.2. Fazer anotações com relação ao microscópio na agenda – espaço de observações – caso seja necessário. 9.3 desligar a luz de UV 9.4 Vá até a opção Laser e os desligue.

Observação importante: o laser de argônio 488 precisa de 3-5 minutos para resfriar. Não desligue o sistema durante esse tempo.

9.5 Sair do programa LSM 510 9.6 Limpar as objetivas com papel apropriado (localizado na mesa ao lado do microscópio) caso tenha utilizado óleo de imersão. 9.7 Desligar a chave Remote Control – SOMENTE APÓS O RESFRIAMENTO DO LASER!! 9.8 Desligar o computado e monitores 9.9 Desligar o disjuntor localizado na caixa de distribuição de energia localizada na parede – chave C9 9.10 Cobrir o microscópio e os módulos do confocal com os plásticos.

11

Nota: O ar-condicionado deverá permanecer ligado todo o tempo e suas configurações não podem ser alteradas (temperatura). Uma vez que o sistema e os lasers são ligados a sala vai aquecendo, além disso todo o sistema funciona melhor em uma sala perfeitamente refrigerada e com baixa umidade.

10) Limpeza e instalação de programas no computador

Periodicamente, as pastas contendo as imagens com os experimentos são apagadas. Um aviso prévio será realizado via notificação impressa colocada na sala do confocal ou via email. Todos os outros tipos de arquivos (ex: ppt, documentos do Word, etc) serão apagados a qualquer momento sem notificação. ABSOLUTAMENTE NENHUM PROGRAMA PODERÁ SER INSTALADO NO COMPUTADOR sem a obtenção prévia de permissão do Prof. Greg. O COMPUTADOR NÃO PODE SER CONECTADO À INTERNET devido a infecções anteriores com vírus, Trojans, etc.

11) Realizando reservas

As reservas do confocal podem ser realizadas pelo site :

http://www.calsnet.net/confocalcemel

ou http://www.icb.ufmg.br/ clique no link : pesquisa e posteriormente em Microscópio Zeiss LSM510 Meta – Marcação de Horários

Abaixo estão listados vários programas de análise de imagens. Nota – Os links para os sites estão incluídos também na página de reserva do confocal.

Zeiss LSM Image Browser http://www.zeiss.com/C12567BE0045ACF1/Contents-Frame/CAA2EF638EC5F0D3C1256ADF0050E2F1

UTHSCSA ImageTool http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html Confocal Assistant http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/software/cas402.htm Image J - NIH Image http://rsbweb.nih.gov/ij/ http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/download.php http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/PDF/ImageJ_Manual.pdf

The information contained in this Startup/Shutdown manual was developed by Prof. Greg Kitten and his students, especially: Lorenza Machado de Souza Carvalhaes D.Ds., M.Sc., PhD. and Laser Antônio Machado Oliveira D.Ds., M.Sc.

Beatrix Fauler and several other users of the Zeiss 510 Meta also made useful comments.

If you have additional comments or suggestions, please send them to kitten@icb.ufmg.br

(Zeiss 510 Meta Startup-Shutdown manual - versao 07-07-2008.doc)