xvi curso de microbiología clínica sochinf evolución de ... · nucleicos en microbiología...

71
XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC

Upload: others

Post on 31-Oct-2019

24 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

XVI Curso de Microbiología Clínica – SOCHINF

Evolución de las técnicas de amplificación de ácidos

nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak

Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC

Page 2: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Temas a tratar

• La muestra y la extracción de ácidos nucleicos

• Búsqueda e identificación de microorganismos. Tecnología, formatos y plataformas. – PCR convencional y PCR en tiempo real – Paneles moleculares por PCR en tiempo real – Identificación por secuenciación (Sanger) – Secuenciación de próxima generación

– Secuenciación de 2ª generación Pirosecuenciación – Secuenciación de 3ª generación (Illumina) – Secuenciación de 4ª generación (Ion Torrent)

• Estandarización de tests moleculares

Page 3: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Extracción de ácidos nucleicos ¿Qué muestra es adecuada ?

Sangre Hisopado

Nasofaríngeo Exudado

endocervical

Ej: Tripanosoma cruzi, Toxoplasma gondii

Ej: Bordetella pertussis, Mycoplasma pneumoniae

Ej: Clamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae

Elegir la muestra adecuada de acuerdo a la localización del agente etiológico

Page 4: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

• Virus

• Hongos

• Bacterias

• Parásitos

La composición de los distintos microorganismosla es diferente

¿Qué método de extracción utilizar?

Page 5: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Liquid sample Solid sample Lysis buffer

Silica column

Sistema de extracción manual Columnas con filtro de silica

Page 6: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Magna Pure Compact (Roche)

Se basan en la separación de NA

utilizando partículas

magnéticas

NucliSENS® easyMAG® (biomerieux)

Equipos para extracción automatizada

Page 7: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

La extracción se realiza de acuerdo al tipo de microorganismo Extracción de virus y Micoplasmas • Lisis suave • No hay centrifugación

Extracción de bacterias • Hay 2 pasos de lisis y centrifugación Extracción de hongos • Además de los 2 pasos de lisis hay lisis enzimática e incubación

adicional Extracción de virus ARN • Los virus RNA deben ser estabilizados (ej buffer AVL)

Page 8: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

La extracción se realiza de acuerdo al tipo de muestra Extracción de Salmonella o Yersinia de deposición • La deposición contiene muchos inhibidores de la PCR (sales biliares) • Se incuba la muestra con un buffer que inactiva inhibidores Extracción de Tripanosoma cruzi de sangre • La sangre contiene hemoglobina (Fe) que inhibe la PCR • Se lisan los glóbulos rojos con buffer de lisis • Se centrifugan y se descarta el sobrenadante • Hay 3 pasos de centrifugación en donde se eliminan los inhibidores

Page 9: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Comparación de métodos de extracción de DNA

Page 10: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

HSV(skin swab)

BP(naso-

pharyngealswab)

HCV(plasma)

PJ(respiratoryspecimens)

C

T R

NA

se P

(Q

- M

P)

Lahiri MP MP + Q0

10

20

30***

NS

CT

RN

Ase P

Extracción de DNA de muestras de sangre

La extracción por Magna Pure es mas eficiente que la tradicional en hisopado de piel, hisopado nasofaríngeo, plasma y muestras respiratorias, pero no en sangre.

Q: Qiagen (filtro de silica, manual) MP: Magna Pure (partículas magnéticas, automatizado) CT: Cycle Treshold (ciclo umbral) RNAsaP: gen humano que se utiliza como control interno de calidad de la muestra

Comparación de la extracción de DNA con método manual vs método automatizado

Wozniak et al, 2016. Diagn Microbiol Infect Dis

Salting-out

Page 11: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Temas a tratar

• La muestra y la extracción de ácidos nucleicos

• Búsqueda e Identificación de microorganismos. Tecnología, formatos y plataformas. – PCR convencional y PCR en tiempo real – Paneles moleculares por PCR en tiempo real – Identificación por secuenciación (Sanger) – Secuenciación de próxima generación

– Secuenciación de 2ª generación Pirosecuenciación – Secuenciación de 3ª generación (Illumina) – Secuenciación de 4ª generación (Ion Torrent)

• Estandarización de tests moleculares

Page 12: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

¿Qué gen buscar para poder identificar?

Especie Gen blanco

Bordetella pertussis Secuencia de inserción IS481

Tripanosoma cruzi Secuencia nuclear repetida 120.000 veces

Treponema pallidum tpN47 (Antígeno de T. pallidum)

Chlamydia trachomatis Secuencia de plasmidio críptico

Mycobacterium tuberculosis rpoB

Pneumocystis jirovecii Gen de la proteína MSG (Major surface Glycoprotein)

Toxoplasma gondii rep529 (secuencia repetida de 529 pb)

E. coli O157:H7 Verotoxinas 1 y 2

Neisseria gonorrhoeae Región de repetición DR-9

Virus herpex simplex 1 y 2 Gen de la DNA polimerasa

Porphyromonas gingivalis Gen RNA 16S

Actinobacillus actinomycetemcomitans Gen RNA 16S

Page 13: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Detección: Electroforesis en geles de agarosa

PCR : Reacción en cadena de la Polimerasa PCR Convencional

Templado

partidor partidor

Paci

ente

Co

ntr

ol p

osi

tivo

Co

ntr

ol n

ega

tivo

Paci

ente

Co

ntr

ol p

osi

tivo

Co

ntr

ol n

ega

tivo

P. gingivalis A. actinomycetemcomitans

262 pb 197 pb En 32 ciclos se pueden generar 1 x

109 de copias del ADN blanco.

Page 14: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

PCR touch down Comienza con una temperatura de hibridación por encima de la Tm de los partidores, que disminuye gradualmente, 1 a 2 ºC por ciclo, hasta llegar a la temperatura óptima. Es para aumentar la especificidad de la PCR

PCR nested PCR de dos vueltas Aumentar sensibilidad Manipulación del producto Sensibilidad vs contaminación

Detección del producto de PCR por ELISA Hito: Sonda (oligonucleótido complementario)

Especificidad, Sensibilidad, amplificación de la Señal

Page 15: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

PCR en tiempo real

Ventajas: - amplificación y detección simultáneas -rapidez (termocicladores tecnología avanzada) - formato cerrado (menor riesgo de contaminación) - Mayor sensibilidad -permite realizar cuantificación

Punto final (PCR convencional, electroforesis)

Tiempo real (seguimiento de la

reacción por fluorescencia en equipo de PCR tiempo real: termociclador + fluorímetro

Templado

partidor sonda partidor *

Page 16: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

relativa absoluta

Controles

Genes de

referencia

Controles

Estándares de

calibración

Cuantificación por PCR en tiempo real

Cp crossing point, elevación de la FLUORESCENCIA sobre la línea de base

Page 17: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Detección con SYBR Green:

es inespecífica; requiere mucha estandarización

Detección del producto por fluorescencia

Page 18: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Detección específica con sondas

Sonda: 5´FAM-CACACACTGGACACCAA-MGB-3´

Sonda FRET: Fluoroscence Resonance Energy Transfer 1 fluoróforo donador 1 fluoróforo aceptor

Sonda Taqman

Page 20: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Equipos de PCR en tiempo real

StepOne

Applied Biosystems

MX300P Stratagene

CFX96

BioRad

Page 21: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

A- Pruebas de PCR de 1ª generación •Master-mix; riesgo de contaminación cruzada •Requiere personal con experiencia en técnicas moleculares •Reactivos se almacenan a 4° o -20°C •Equipos con gran versatilidad de aplicaciones (abiertos) B- Pruebas de PCR de 2ª generación •No hay Master-mix; reducción de riesgo de contaminación •1 cartucho por muestra •No requiere personal con experiencia en técnicas moleculares •Reactivos se almacenan a temperatura ambiente •Equipos no tienen versatilidad (cerrados)

Clasificación de las pruebas de PCR

Page 22: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Conceptos importantes sobre técnicas de diagnóstico IVD: “In vitro Diagnostic” Cumple con la normas 98/79/EC del parlamento Europeo y del Concejo del 27 de Octubre de 1998. RUO: “Research Use Only” “In house”: Técnica desarrollada en el laboratorio Cuando una técnica es IVD, se requiere solamente verificación: •Se debe probar que los controles positivo y negativo se lean correctamente •Se puede probar también muestras positivas y negativas (pero no es necesario) Cuando una técnica es RUO o “in house” se requiere validación: •Determinación de sensibilidad y especificidad analítica •Determinación de sensibilidad y especificidad clínica

Page 23: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Ejemplo PCR de 1ª generación: Detección de Herpes simplex tipos 1 y 2 por PCR en tiempo real

• En pacientes graves que necesitan certeza del 100%. • Se realiza en muestras de piel o LCR • Se usa equipo Light cycler de 3 canales • Partidores que amplifican gen de la DNA polimerasa viral • Sonda FRET que hibrida región interna específica de HSV

Page 24: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Tm : temperatura 50% DNA disociado.

Depende de composición de las bases, longitud del fragmento,

presencia de mismatches

Aumento gradual de la temperatura

Identificación de HSV 1 y 2

Curva de fusión o disociación (melting)

No complementaridad en una base o más disminuye la Tm

HSV1 HSV2

Page 25: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

CFX96: Equipo de 5 canales

Page 26: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Ejemplo PCR de 2ª generación: Detección de Mycobacterium tuberculosis y

resistencia a rifampicina por GeneXpert Automatización :

Extracción + Amplificación + Detección

No requiere extracción de DNA El análisis demora alrededor de 3 horas (vs cultivo aprox. 10 días) Elevada sensibilidad (alrededor de 95%) No hay que interpretar curvas ni CTs No requiere equipamiento No requiere personal con conocimiento de técnicas moleculares

Page 27: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Result: MTB positive; Rif negative

Output del análisis:

Result: MTB positive; Rif positive

Page 28: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Temas a tratar

• La muestra y la extracción de ácidos nucleicos

• Búsqueda e Identificación de microorganismos. Tecnología, formatos y plataformas. Aplicaciones y ejemplos. – PCR convencional y PCR en tiempo real – Paneles moleculares por PCR en tiempo real – Identificación por secuenciación (Sanger) – Secuenciación de próxima generación

– Secuenciación de 2ª generación Pirosecuenciación – Secuenciación de 3ª generación (Illumina) – Secuenciación de 4ª generación (Ion Torrent)

• Estandarización de tests moleculares

Page 29: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Las enfermedades gastrointestinales son comunmente de origen infeccioso

Muchas limitaciones en su diagnóstico (pocos tests disponibles, de baja sensbilidad y especificidad, muchos patógenos diferentes, tecnicamente muy complejo)

El diagnostico equivocado lleva a empeoramiento de la enfermedad, secuelas, efectos secundarios innecesarios, resistencia a antibióticos

Los tests disponibles son caros y lentos

Diagnóstico de enfermedad gastrointestinal

Page 30: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Detección simultánea de 22 patógenos gastrointestinales que incluyen virus, bacterias y parásitos

Muestras de deposición en tórula Cary-Blair

Se demora 1 hora!

Menos de 2 min de manipulación!

No se requiere extracción de DNA de deposición

Filmarray-Panel gastrointestinal

Page 31: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas
Page 32: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Filmarray GI

El filmarray es un PCR nested: • en el 1er PCR se amplifican muchos

fragmentos en un multiplex PCR • En el 2do PCR se amplifican cada uno

individualmente

Los productos de PCR se marcan con LC Green y fluorescen Se hace una curva de melting para cada producto de PCR (aumento de la temperatura hasta 94ºC) y se determina la temperatura de melting de cada producto El QC del panel solo considera positivo cuando hay al menos 2/3 señales positivas

Page 33: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Filmarray Torch

Permite procesar hasta 264 muestras por día!

Page 34: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

FILMARRAY PARA IDENTIFICACIÓN DE PATOGENOS EN HEMOCULTIVO+

Page 35: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas
Page 36: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas
Page 37: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Treponema pallidum Trichomonas vaginalis Mycoplasma genitalium Ureaplasma urealyticum Haemophilus ducreyi Herpes simplex virus 1 and 2

Filmarray para infecciones de transmisión sexual (STIs)

Es RUO aun….

Bacillus anthracis Brucella melitensis Burkholderia Clostridium botulinum Coxiella burnetii Ebola virus (Zaire) EEE virus F. tularensis Marburg virus Ricinus communis Rickettsia prowazekii Variola virus VEE virus WEE virus Yersinia pestis Orthopox virus

Filmarray Biothreat (Bioterrorismo)

No es para diagnóstico Es para muestras ambientales

Page 38: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Ventajas: • Rapidez (1h!) • Detección múltiple de microorganismos • Elevada sensibilidad y especificidad (alrededor 97%) • Reducción de costos del manejo del paciente • Reducción de tiempo de terapia subóptima • reducción de estancia hospitalaria (ej MRSA, VRE)

Page 39: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Desventajas: • Microorganismos no presentes en el panel??? • 1 muestra a la vez • Interpretación de infecciones polimicrobianas • Genotipo ≠ Fenotipo (necesidad de antibiograma) • Costo muy elevado • DNAemia = Becteremia/Fungemia

Page 40: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

PCR de última generación: PLEX-ID (ABBOTT)

•Es una técnica de PCR-ESI/MS •Realiza la extracción de ácidos nucleicos y amplificación con partidores panbacterianos y panvirales •El producto de PCR es inyectado en una aguja para electrospray •Detecta la masa de los distintos amplicones (MS) •Aplicable a muestras ambientales •Detecta resistencia y toxinas de bacterias virulentas •Puede diferenciar clones •Puede identificar cultivos mixtos

PERO CUESTA ~ 1 MILLÓN DE DÓLARES!!!!

Page 41: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Temas a tratar

• La muestra y la extracción de ácidos nucleicos

• Búsqueda e Identificación de microorganismos. Tecnología, formatos y plataformas. Aplicaciones y ejemplos. – PCR convencional y PCR en tiempo real – Paneles molecular por PCR en tiempo real – Identificación por secuenciación (Sanger) – Secuenciación de próxima generación

– Secuenciación de 2ª generación Pirosecuenciación – Secuenciación de 3ª generación (Illumina) – Secuenciación de 4ª generación (Ion Torrent)

• Estandarización de tests moleculares

Page 42: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Concepto - PCR universal: El RNA 16S está presente en todas las bacterias y tiene regiones

conservadas, variables y altamente variables

Templado

16S rRNA Partidor Partidor sentido anti-sentido

sec. altamente secuencia variable sec. altamente conservada conservada

Identificación de especie bacteriana o de hongos por secuenciación del RNA 16S o de ITS

respectivamente

Secuenciación del producto de PCR

amplificación

Identificación de especie

Page 43: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

•macromolécula universal (requerida para la traducción) presente en todas las bacterias

• antigua y de función constante en el tiempo

•amplias bases de datos

•Contiene regiones conservadas, variables y altamente variables

•Gen multicopia: aumenta la sensibilidad

Estructura secundaria del

ARNr 16S

Rojo – regiones de máxima variabilidad Azul: regiones de maxima conservación (basado en alineamiento de 500 rDNA)

¿Por qué utilizar este gen para identificar?

Page 44: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Proceso de secuenciación

Extracción de DNA en sitio estéril

Amplificación del rDNA 16S con partidores

universales

Visualización en gel Purificación del producto

de PCR

PCR de secuencia con un partidor interno y con didesoxinucleótidos

marcados con fluoróforos

Purificación del producto de PCR

Electroforesis capilar del producto purificado

Page 45: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Fred Sanger: Ganó el premio Nobel en 1980 por el método de secuenciación

Page 46: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Plataforma de secuenciación

“El secuenciador”

Separa los fragmentos de

DNA por electroforesis

capilar

Page 47: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas
Page 48: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Temas a tratar

• La muestra y la extracción de ácidos nucleicos

• Búsqueda e Identificación de microorganismos. Tecnología, formatos y plataformas. Aplicaciones y ejemplos. – PCR convencional y PCR en tiempo real – Paneles molecular por PCR en tiempo real – Identificación por secuenciación (Sanger) – Secuenciación de próxima generación

– Secuenciación de 2ª generación Pirosecuenciación – Secuenciación de 3ª generación (Illumina) – Secuenciación de 4ª generación (Ion Torrent)

– Control de calidad

Page 49: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Evolución de las técnicas de secuenciación

Page 50: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

El costo de secuenciar 1 megabase cayó 10.000 veces su costo desde 2001 a 2011!

Page 51: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas
Page 52: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Secuenciación de próxima generación

Secuenciación de primera generación

Page 53: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Secuenciación de 2ª generación • Muchas muestras son secuenciadas simultáneamente en el mismo equipo

• Miniaturización y alto poder computacional

• Disminución notoria del tiempo y del costo de secuenciación

• Secuenciación de moléculas individuales de DNA

• Se logra con nanocontenedores (20 nm de diámetro donde cada molécula queda

aislada de las demás)

• Las marcas fluorescentes están unidas al grupo pirofosfato que es descartado, es la pirosecuenciación

Page 54: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

PIROSECUENCIACIÓN

Page 55: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

PCR de 3ª generación MiSeq (Illumina)

• Los distintos nucleótidos están marcados con distintos colores • La fluorescencia es eliminada • Lectura óptica de los colores

Page 56: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas
Page 57: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas
Page 58: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas
Page 59: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Secuenciación de 4ª generación Post-light sequencing: ya no se usa la detección óptica Ejemplo: Ion Torrent sequencing method Detecta la liberación de protones cada vez que se inserta un desoxirribonucleótido por medio de un chip de silicona Oxford Nanopore Technologies: el ssDNA pasa por un nanoporo formado por una proteína que registra los cambios de corriente eléctrica generados por la adición de los nucleótidos

Page 60: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Utilidad del estudio del Microbioma en el diagnóstico de enfermedades

La NGS ha permitido el desarrollo de la Metagenómica: conocer el rol del microbioma en condiciones normales y en enfermedades como obesidad, colon irritable, diabetes, etc. Secuenciación Metagenómica ha permitido identificar patógenos que no habían podido ser identificados con métodos tradicionales. Ej: encefalitis causada por: • Leptospira (antes se probaron 38 tests tradicionales sin resultados!) • Astrovirus • Bornavirus Estudio de brotes: • SHU en Alemania causado por E. coli inusual • Epidemia de Vibrio cholerae en Haiti • Brotes de K. Pneumoniae productora de KPC NGS es la mejor aproximación analítica para estudiar microbiomas, pero…… La aplicación de NGS al diagnóstico clínico, laboratorio de microbiología clínica, epidemiología y patofisiología debe ser cuidadosamente evaluada en términos económicos.

Page 61: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Algunos puntos a tener en cuenta sobre NGS en diagnóstico clínico: • Es muy costosa y falta financiamiento para hacer validaciones apropiadas

• Incapacidad de distinguir colonización de infección

• Interpretación de multiinfecciones

• No permite conocer viabilidad

• No es apropiado para determinar susceptibilidad a antibióticos: la confirmación fenotípica

seguirá siendo necesaria

• El único test basado en NGS aprobado por la FDA es la determinación del gen de fibrosis quiística utilizando MiSeq Dx system

Page 62: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

La composición del microbioma del TGI está relacionada con obesidad en modelos murinos y en humanos: el aumento de bacterias del grupo Firmicutes está asociado a obesidad. Esto se debe a que estas bacterias producen mayor cantidad de ácidos grasos de cadena corta a partir de la fibra dietaria.

Page 63: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

La disbiosis altera la permeabilidad al LPS El LPS estimula producción de citoquinas que alteran la fisiología del cerebro y modula la síntesis de neuropéptidos

Page 64: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas
Page 65: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Temas a tratar

• La muestra y la extracción de ácidos nucleicos

• Búsqueda e Identificación de microorganismos. Tecnología, formatos y plataformas. Aplicaciones y ejemplos. – PCR convencional y PCR en tiempo real – Paneles moleculares por PCR en tiempo real – Identificación por secuenciación (Sanger) – Secuenciación de próxima generación

– Secuenciación de 2ª generación Pirosecuenciación – Secuenciación de 3ª generación (Illumina) – Secuenciación de 4ª generación (Ion Torrent)

• Estandarización de tests moeculares

Page 66: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Guías CLSI – Microbiología Molecular (Clinical and Laboratory Standards Institute)

Estándares para las buenas prácticas de laboratorio

Incluye: Conceptos generales, definiciones, bases de las metodologías,

aplicaciones, informe de resultados

Para: validación de métodos, evaluación de desempeño de los métodos,

interpretación de resultados

MM3-A2. NCCLS. Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved

Guideline - Second edition.MM3

MM18-A. CLSI — Interpretive Criteria for Identification of Bacteria and Fungi by DNA

Target Sequencing; Approved Guideline. CLSI document. MM18

Control de Calidad Interno

Page 67: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Control de Calidad Externo

CAP: College of American Pathologists

Es una validación inter-laboratorios Ej: Chlamydia trachomatis

Page 68: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

• Los NAATs están poco a poco reemplazando los tests microbiológicos convencionales

• Los NAATs utilizan tecnologías, calibradores y reactivos químicos diferentes • Las determinaciones de química clínica glucosa en sangre, electrolitos, creatinina,

etc., cuentan con materiales de referencia trazables al International System of Units (SI) tal como se describe en la norma ISO 17511.

• ….Pero para los NAATs de agentes infecciosos no hay materiales de referencia trazables al SI ni procedimientos de referencia como en ISO 17511.

• Esto conduce a una alta variabilidad de los resultados cuantitativos y cualitativos

• Los materiales de referencia de “alto orden” con valores trazables al SI son claves para mejorar la comparabilidad a traves del tiempo, de las distancias y de los diferentes métodos utilizados.

ESTANDARIZACIÓN DE LOS TESTS DE DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Page 69: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

• El PCR digital (dPCR) es una técnica basada en la amplificación de una sola molécula.

• Es un potencial método de alto orden para determinación de agentes infecciosos porque su medición no está basada en un calibrador que fue a su vez cuantificado.

• BioMark arrays (Fluidigm), QX100 y QX200 (Bio-Rad).

• Se ha usado para certificar estándares para evaluación de GMOs con alta precisión

• Desventajas: requiere poco volumen de muestra; es mas adecuado para altas concentraciones de DNA

PCR digital

Page 70: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Iniciativas mundiales para estandarizar los procedimientos y los materiales de referencia:

• Standardization of Genomic Amplification Techniques (SoGAT) Working Group

• Quality Control for Molecular Diagnostics (QCMD), (desarrollo de materiales de referencia)

• El proyecto INFECT-MET, “Metrology for Monitoring Infectious Diseases, Antimicrobial Resistance, and Harmful Micro-Organisms”, en el marco del “European Metrology Research Programme” (EMRP), será el apoyo metrológico dedicado a generar un estandar cuantificado trazable al IS (por PCR digital?). Patricipan 9 instituciones de 5 países de la UE.

• En un futuro no muy lejano se podrían adquirir estándares internacionales para las pruebas de biología molecular

Page 71: XVI Curso de Microbiología Clínica SOCHINF Evolución de ... · nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC . Temas

Preguntas?....