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XVI Curso de Microbiología Clínica – SOCHINF
Evolución de las técnicas de amplificación de ácidos
nucleicos en Microbiología Aniela Wozniak
Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina - UC
Temas a tratar
• La muestra y la extracción de ácidos nucleicos
• Búsqueda e identificación de microorganismos. Tecnología, formatos y plataformas. – PCR convencional y PCR en tiempo real – Paneles moleculares por PCR en tiempo real – Identificación por secuenciación (Sanger) – Secuenciación de próxima generación
– Secuenciación de 2ª generación Pirosecuenciación – Secuenciación de 3ª generación (Illumina) – Secuenciación de 4ª generación (Ion Torrent)
• Estandarización de tests moleculares
Extracción de ácidos nucleicos ¿Qué muestra es adecuada ?
Sangre Hisopado
Nasofaríngeo Exudado
endocervical
Ej: Tripanosoma cruzi, Toxoplasma gondii
Ej: Bordetella pertussis, Mycoplasma pneumoniae
Ej: Clamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae
Elegir la muestra adecuada de acuerdo a la localización del agente etiológico
• Virus
• Hongos
• Bacterias
• Parásitos
La composición de los distintos microorganismosla es diferente
¿Qué método de extracción utilizar?
Liquid sample Solid sample Lysis buffer
Silica column
Sistema de extracción manual Columnas con filtro de silica
Magna Pure Compact (Roche)
Se basan en la separación de NA
utilizando partículas
magnéticas
NucliSENS® easyMAG® (biomerieux)
Equipos para extracción automatizada
La extracción se realiza de acuerdo al tipo de microorganismo Extracción de virus y Micoplasmas • Lisis suave • No hay centrifugación
Extracción de bacterias • Hay 2 pasos de lisis y centrifugación Extracción de hongos • Además de los 2 pasos de lisis hay lisis enzimática e incubación
adicional Extracción de virus ARN • Los virus RNA deben ser estabilizados (ej buffer AVL)
La extracción se realiza de acuerdo al tipo de muestra Extracción de Salmonella o Yersinia de deposición • La deposición contiene muchos inhibidores de la PCR (sales biliares) • Se incuba la muestra con un buffer que inactiva inhibidores Extracción de Tripanosoma cruzi de sangre • La sangre contiene hemoglobina (Fe) que inhibe la PCR • Se lisan los glóbulos rojos con buffer de lisis • Se centrifugan y se descarta el sobrenadante • Hay 3 pasos de centrifugación en donde se eliminan los inhibidores
Comparación de métodos de extracción de DNA
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
HSV(skin swab)
BP(naso-
pharyngealswab)
HCV(plasma)
PJ(respiratoryspecimens)
C
T R
NA
se P
(Q
- M
P)
Lahiri MP MP + Q0
10
20
30***
NS
CT
RN
Ase P
Extracción de DNA de muestras de sangre
La extracción por Magna Pure es mas eficiente que la tradicional en hisopado de piel, hisopado nasofaríngeo, plasma y muestras respiratorias, pero no en sangre.
Q: Qiagen (filtro de silica, manual) MP: Magna Pure (partículas magnéticas, automatizado) CT: Cycle Treshold (ciclo umbral) RNAsaP: gen humano que se utiliza como control interno de calidad de la muestra
Comparación de la extracción de DNA con método manual vs método automatizado
Wozniak et al, 2016. Diagn Microbiol Infect Dis
Salting-out
Temas a tratar
• La muestra y la extracción de ácidos nucleicos
• Búsqueda e Identificación de microorganismos. Tecnología, formatos y plataformas. – PCR convencional y PCR en tiempo real – Paneles moleculares por PCR en tiempo real – Identificación por secuenciación (Sanger) – Secuenciación de próxima generación
– Secuenciación de 2ª generación Pirosecuenciación – Secuenciación de 3ª generación (Illumina) – Secuenciación de 4ª generación (Ion Torrent)
• Estandarización de tests moleculares
¿Qué gen buscar para poder identificar?
Especie Gen blanco
Bordetella pertussis Secuencia de inserción IS481
Tripanosoma cruzi Secuencia nuclear repetida 120.000 veces
Treponema pallidum tpN47 (Antígeno de T. pallidum)
Chlamydia trachomatis Secuencia de plasmidio críptico
Mycobacterium tuberculosis rpoB
Pneumocystis jirovecii Gen de la proteína MSG (Major surface Glycoprotein)
Toxoplasma gondii rep529 (secuencia repetida de 529 pb)
E. coli O157:H7 Verotoxinas 1 y 2
Neisseria gonorrhoeae Región de repetición DR-9
Virus herpex simplex 1 y 2 Gen de la DNA polimerasa
Porphyromonas gingivalis Gen RNA 16S
Actinobacillus actinomycetemcomitans Gen RNA 16S
Detección: Electroforesis en geles de agarosa
PCR : Reacción en cadena de la Polimerasa PCR Convencional
Templado
partidor partidor
Paci
ente
Co
ntr
ol p
osi
tivo
Co
ntr
ol n
ega
tivo
Paci
ente
Co
ntr
ol p
osi
tivo
Co
ntr
ol n
ega
tivo
P. gingivalis A. actinomycetemcomitans
262 pb 197 pb En 32 ciclos se pueden generar 1 x
109 de copias del ADN blanco.
PCR touch down Comienza con una temperatura de hibridación por encima de la Tm de los partidores, que disminuye gradualmente, 1 a 2 ºC por ciclo, hasta llegar a la temperatura óptima. Es para aumentar la especificidad de la PCR
PCR nested PCR de dos vueltas Aumentar sensibilidad Manipulación del producto Sensibilidad vs contaminación
Detección del producto de PCR por ELISA Hito: Sonda (oligonucleótido complementario)
Especificidad, Sensibilidad, amplificación de la Señal
PCR en tiempo real
Ventajas: - amplificación y detección simultáneas -rapidez (termocicladores tecnología avanzada) - formato cerrado (menor riesgo de contaminación) - Mayor sensibilidad -permite realizar cuantificación
Punto final (PCR convencional, electroforesis)
Tiempo real (seguimiento de la
reacción por fluorescencia en equipo de PCR tiempo real: termociclador + fluorímetro
Templado
partidor sonda partidor *
relativa absoluta
Controles
Genes de
referencia
Controles
Estándares de
calibración
Cuantificación por PCR en tiempo real
Cp crossing point, elevación de la FLUORESCENCIA sobre la línea de base
Detección con SYBR Green:
es inespecífica; requiere mucha estandarización
Detección del producto por fluorescencia
Detección específica con sondas
Sonda: 5´FAM-CACACACTGGACACCAA-MGB-3´
Sonda FRET: Fluoroscence Resonance Energy Transfer 1 fluoróforo donador 1 fluoróforo aceptor
Sonda Taqman
Fluoróforos y atenuadores
Equipos de PCR en tiempo real
StepOne
Applied Biosystems
MX300P Stratagene
CFX96
BioRad
A- Pruebas de PCR de 1ª generación •Master-mix; riesgo de contaminación cruzada •Requiere personal con experiencia en técnicas moleculares •Reactivos se almacenan a 4° o -20°C •Equipos con gran versatilidad de aplicaciones (abiertos) B- Pruebas de PCR de 2ª generación •No hay Master-mix; reducción de riesgo de contaminación •1 cartucho por muestra •No requiere personal con experiencia en técnicas moleculares •Reactivos se almacenan a temperatura ambiente •Equipos no tienen versatilidad (cerrados)
Clasificación de las pruebas de PCR
Conceptos importantes sobre técnicas de diagnóstico IVD: “In vitro Diagnostic” Cumple con la normas 98/79/EC del parlamento Europeo y del Concejo del 27 de Octubre de 1998. RUO: “Research Use Only” “In house”: Técnica desarrollada en el laboratorio Cuando una técnica es IVD, se requiere solamente verificación: •Se debe probar que los controles positivo y negativo se lean correctamente •Se puede probar también muestras positivas y negativas (pero no es necesario) Cuando una técnica es RUO o “in house” se requiere validación: •Determinación de sensibilidad y especificidad analítica •Determinación de sensibilidad y especificidad clínica
Ejemplo PCR de 1ª generación: Detección de Herpes simplex tipos 1 y 2 por PCR en tiempo real
• En pacientes graves que necesitan certeza del 100%. • Se realiza en muestras de piel o LCR • Se usa equipo Light cycler de 3 canales • Partidores que amplifican gen de la DNA polimerasa viral • Sonda FRET que hibrida región interna específica de HSV
Tm : temperatura 50% DNA disociado.
Depende de composición de las bases, longitud del fragmento,
presencia de mismatches
Aumento gradual de la temperatura
Identificación de HSV 1 y 2
Curva de fusión o disociación (melting)
No complementaridad en una base o más disminuye la Tm
HSV1 HSV2
CFX96: Equipo de 5 canales
Ejemplo PCR de 2ª generación: Detección de Mycobacterium tuberculosis y
resistencia a rifampicina por GeneXpert Automatización :
Extracción + Amplificación + Detección
No requiere extracción de DNA El análisis demora alrededor de 3 horas (vs cultivo aprox. 10 días) Elevada sensibilidad (alrededor de 95%) No hay que interpretar curvas ni CTs No requiere equipamiento No requiere personal con conocimiento de técnicas moleculares
Result: MTB positive; Rif negative
Output del análisis:
Result: MTB positive; Rif positive
Temas a tratar
• La muestra y la extracción de ácidos nucleicos
• Búsqueda e Identificación de microorganismos. Tecnología, formatos y plataformas. Aplicaciones y ejemplos. – PCR convencional y PCR en tiempo real – Paneles moleculares por PCR en tiempo real – Identificación por secuenciación (Sanger) – Secuenciación de próxima generación
– Secuenciación de 2ª generación Pirosecuenciación – Secuenciación de 3ª generación (Illumina) – Secuenciación de 4ª generación (Ion Torrent)
• Estandarización de tests moleculares
Las enfermedades gastrointestinales son comunmente de origen infeccioso
Muchas limitaciones en su diagnóstico (pocos tests disponibles, de baja sensbilidad y especificidad, muchos patógenos diferentes, tecnicamente muy complejo)
El diagnostico equivocado lleva a empeoramiento de la enfermedad, secuelas, efectos secundarios innecesarios, resistencia a antibióticos
Los tests disponibles son caros y lentos
Diagnóstico de enfermedad gastrointestinal
Detección simultánea de 22 patógenos gastrointestinales que incluyen virus, bacterias y parásitos
Muestras de deposición en tórula Cary-Blair
Se demora 1 hora!
Menos de 2 min de manipulación!
No se requiere extracción de DNA de deposición
Filmarray-Panel gastrointestinal
Filmarray GI
El filmarray es un PCR nested: • en el 1er PCR se amplifican muchos
fragmentos en un multiplex PCR • En el 2do PCR se amplifican cada uno
individualmente
Los productos de PCR se marcan con LC Green y fluorescen Se hace una curva de melting para cada producto de PCR (aumento de la temperatura hasta 94ºC) y se determina la temperatura de melting de cada producto El QC del panel solo considera positivo cuando hay al menos 2/3 señales positivas
Filmarray Torch
Permite procesar hasta 264 muestras por día!
FILMARRAY PARA IDENTIFICACIÓN DE PATOGENOS EN HEMOCULTIVO+
Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae Treponema pallidum Trichomonas vaginalis Mycoplasma genitalium Ureaplasma urealyticum Haemophilus ducreyi Herpes simplex virus 1 and 2
Filmarray para infecciones de transmisión sexual (STIs)
Es RUO aun….
Bacillus anthracis Brucella melitensis Burkholderia Clostridium botulinum Coxiella burnetii Ebola virus (Zaire) EEE virus F. tularensis Marburg virus Ricinus communis Rickettsia prowazekii Variola virus VEE virus WEE virus Yersinia pestis Orthopox virus
Filmarray Biothreat (Bioterrorismo)
No es para diagnóstico Es para muestras ambientales
Ventajas: • Rapidez (1h!) • Detección múltiple de microorganismos • Elevada sensibilidad y especificidad (alrededor 97%) • Reducción de costos del manejo del paciente • Reducción de tiempo de terapia subóptima • reducción de estancia hospitalaria (ej MRSA, VRE)
Desventajas: • Microorganismos no presentes en el panel??? • 1 muestra a la vez • Interpretación de infecciones polimicrobianas • Genotipo ≠ Fenotipo (necesidad de antibiograma) • Costo muy elevado • DNAemia = Becteremia/Fungemia
PCR de última generación: PLEX-ID (ABBOTT)
•Es una técnica de PCR-ESI/MS •Realiza la extracción de ácidos nucleicos y amplificación con partidores panbacterianos y panvirales •El producto de PCR es inyectado en una aguja para electrospray •Detecta la masa de los distintos amplicones (MS) •Aplicable a muestras ambientales •Detecta resistencia y toxinas de bacterias virulentas •Puede diferenciar clones •Puede identificar cultivos mixtos
PERO CUESTA ~ 1 MILLÓN DE DÓLARES!!!!
Temas a tratar
• La muestra y la extracción de ácidos nucleicos
• Búsqueda e Identificación de microorganismos. Tecnología, formatos y plataformas. Aplicaciones y ejemplos. – PCR convencional y PCR en tiempo real – Paneles molecular por PCR en tiempo real – Identificación por secuenciación (Sanger) – Secuenciación de próxima generación
– Secuenciación de 2ª generación Pirosecuenciación – Secuenciación de 3ª generación (Illumina) – Secuenciación de 4ª generación (Ion Torrent)
• Estandarización de tests moleculares
Concepto - PCR universal: El RNA 16S está presente en todas las bacterias y tiene regiones
conservadas, variables y altamente variables
Templado
16S rRNA Partidor Partidor sentido anti-sentido
sec. altamente secuencia variable sec. altamente conservada conservada
Identificación de especie bacteriana o de hongos por secuenciación del RNA 16S o de ITS
respectivamente
Secuenciación del producto de PCR
amplificación
Identificación de especie
•macromolécula universal (requerida para la traducción) presente en todas las bacterias
• antigua y de función constante en el tiempo
•amplias bases de datos
•Contiene regiones conservadas, variables y altamente variables
•Gen multicopia: aumenta la sensibilidad
Estructura secundaria del
ARNr 16S
Rojo – regiones de máxima variabilidad Azul: regiones de maxima conservación (basado en alineamiento de 500 rDNA)
¿Por qué utilizar este gen para identificar?
Proceso de secuenciación
Extracción de DNA en sitio estéril
Amplificación del rDNA 16S con partidores
universales
Visualización en gel Purificación del producto
de PCR
PCR de secuencia con un partidor interno y con didesoxinucleótidos
marcados con fluoróforos
Purificación del producto de PCR
Electroforesis capilar del producto purificado
Fred Sanger: Ganó el premio Nobel en 1980 por el método de secuenciación
Plataforma de secuenciación
“El secuenciador”
Separa los fragmentos de
DNA por electroforesis
capilar
Temas a tratar
• La muestra y la extracción de ácidos nucleicos
• Búsqueda e Identificación de microorganismos. Tecnología, formatos y plataformas. Aplicaciones y ejemplos. – PCR convencional y PCR en tiempo real – Paneles molecular por PCR en tiempo real – Identificación por secuenciación (Sanger) – Secuenciación de próxima generación
– Secuenciación de 2ª generación Pirosecuenciación – Secuenciación de 3ª generación (Illumina) – Secuenciación de 4ª generación (Ion Torrent)
– Control de calidad
Evolución de las técnicas de secuenciación
El costo de secuenciar 1 megabase cayó 10.000 veces su costo desde 2001 a 2011!
Secuenciación de próxima generación
Secuenciación de primera generación
Secuenciación de 2ª generación • Muchas muestras son secuenciadas simultáneamente en el mismo equipo
• Miniaturización y alto poder computacional
• Disminución notoria del tiempo y del costo de secuenciación
• Secuenciación de moléculas individuales de DNA
• Se logra con nanocontenedores (20 nm de diámetro donde cada molécula queda
aislada de las demás)
• Las marcas fluorescentes están unidas al grupo pirofosfato que es descartado, es la pirosecuenciación
PIROSECUENCIACIÓN
PCR de 3ª generación MiSeq (Illumina)
• Los distintos nucleótidos están marcados con distintos colores • La fluorescencia es eliminada • Lectura óptica de los colores
Secuenciación de 4ª generación Post-light sequencing: ya no se usa la detección óptica Ejemplo: Ion Torrent sequencing method Detecta la liberación de protones cada vez que se inserta un desoxirribonucleótido por medio de un chip de silicona Oxford Nanopore Technologies: el ssDNA pasa por un nanoporo formado por una proteína que registra los cambios de corriente eléctrica generados por la adición de los nucleótidos
Utilidad del estudio del Microbioma en el diagnóstico de enfermedades
La NGS ha permitido el desarrollo de la Metagenómica: conocer el rol del microbioma en condiciones normales y en enfermedades como obesidad, colon irritable, diabetes, etc. Secuenciación Metagenómica ha permitido identificar patógenos que no habían podido ser identificados con métodos tradicionales. Ej: encefalitis causada por: • Leptospira (antes se probaron 38 tests tradicionales sin resultados!) • Astrovirus • Bornavirus Estudio de brotes: • SHU en Alemania causado por E. coli inusual • Epidemia de Vibrio cholerae en Haiti • Brotes de K. Pneumoniae productora de KPC NGS es la mejor aproximación analítica para estudiar microbiomas, pero…… La aplicación de NGS al diagnóstico clínico, laboratorio de microbiología clínica, epidemiología y patofisiología debe ser cuidadosamente evaluada en términos económicos.
Algunos puntos a tener en cuenta sobre NGS en diagnóstico clínico: • Es muy costosa y falta financiamiento para hacer validaciones apropiadas
• Incapacidad de distinguir colonización de infección
• Interpretación de multiinfecciones
• No permite conocer viabilidad
• No es apropiado para determinar susceptibilidad a antibióticos: la confirmación fenotípica
seguirá siendo necesaria
• El único test basado en NGS aprobado por la FDA es la determinación del gen de fibrosis quiística utilizando MiSeq Dx system
La composición del microbioma del TGI está relacionada con obesidad en modelos murinos y en humanos: el aumento de bacterias del grupo Firmicutes está asociado a obesidad. Esto se debe a que estas bacterias producen mayor cantidad de ácidos grasos de cadena corta a partir de la fibra dietaria.
La disbiosis altera la permeabilidad al LPS El LPS estimula producción de citoquinas que alteran la fisiología del cerebro y modula la síntesis de neuropéptidos
Temas a tratar
• La muestra y la extracción de ácidos nucleicos
• Búsqueda e Identificación de microorganismos. Tecnología, formatos y plataformas. Aplicaciones y ejemplos. – PCR convencional y PCR en tiempo real – Paneles moleculares por PCR en tiempo real – Identificación por secuenciación (Sanger) – Secuenciación de próxima generación
– Secuenciación de 2ª generación Pirosecuenciación – Secuenciación de 3ª generación (Illumina) – Secuenciación de 4ª generación (Ion Torrent)
• Estandarización de tests moeculares
Guías CLSI – Microbiología Molecular (Clinical and Laboratory Standards Institute)
Estándares para las buenas prácticas de laboratorio
Incluye: Conceptos generales, definiciones, bases de las metodologías,
aplicaciones, informe de resultados
Para: validación de métodos, evaluación de desempeño de los métodos,
interpretación de resultados
MM3-A2. NCCLS. Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved
Guideline - Second edition.MM3
MM18-A. CLSI — Interpretive Criteria for Identification of Bacteria and Fungi by DNA
Target Sequencing; Approved Guideline. CLSI document. MM18
Control de Calidad Interno
Control de Calidad Externo
CAP: College of American Pathologists
Es una validación inter-laboratorios Ej: Chlamydia trachomatis
• Los NAATs están poco a poco reemplazando los tests microbiológicos convencionales
• Los NAATs utilizan tecnologías, calibradores y reactivos químicos diferentes • Las determinaciones de química clínica glucosa en sangre, electrolitos, creatinina,
etc., cuentan con materiales de referencia trazables al International System of Units (SI) tal como se describe en la norma ISO 17511.
• ….Pero para los NAATs de agentes infecciosos no hay materiales de referencia trazables al SI ni procedimientos de referencia como en ISO 17511.
• Esto conduce a una alta variabilidad de los resultados cuantitativos y cualitativos
• Los materiales de referencia de “alto orden” con valores trazables al SI son claves para mejorar la comparabilidad a traves del tiempo, de las distancias y de los diferentes métodos utilizados.
ESTANDARIZACIÓN DE LOS TESTS DE DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
• El PCR digital (dPCR) es una técnica basada en la amplificación de una sola molécula.
• Es un potencial método de alto orden para determinación de agentes infecciosos porque su medición no está basada en un calibrador que fue a su vez cuantificado.
• BioMark arrays (Fluidigm), QX100 y QX200 (Bio-Rad).
• Se ha usado para certificar estándares para evaluación de GMOs con alta precisión
• Desventajas: requiere poco volumen de muestra; es mas adecuado para altas concentraciones de DNA
PCR digital
Iniciativas mundiales para estandarizar los procedimientos y los materiales de referencia:
• Standardization of Genomic Amplification Techniques (SoGAT) Working Group
• Quality Control for Molecular Diagnostics (QCMD), (desarrollo de materiales de referencia)
• El proyecto INFECT-MET, “Metrology for Monitoring Infectious Diseases, Antimicrobial Resistance, and Harmful Micro-Organisms”, en el marco del “European Metrology Research Programme” (EMRP), será el apoyo metrológico dedicado a generar un estandar cuantificado trazable al IS (por PCR digital?). Patricipan 9 instituciones de 5 países de la UE.
• En un futuro no muy lejano se podrían adquirir estándares internacionales para las pruebas de biología molecular
Preguntas?....