Wykład specjalizacyjny

BADANIE MECHANIZMÓW REAKCJI

Prof. dr hab. Marianna Kańska

IZOTOPOWE METODY BADANIA MECHANIZMÓW

REAKCJI

Ustalenie mechanizmów reakcji jest jednym z bardzo ważnych zadań

fizykochemii organicznej, która ułatwia zrozumienie i sterowanie złożonymi

syntezami związków biologicznie czynnych. Znajomość mechanizmów reakcji

ułatwia odtworzenie in vitro przebiegu syntez, zachodzących in vivo w

organizmach żywych, oraz opracowanie nowych dróg syntezy bardzo

skomplikowanych związków organicznych. W badaniach mechanizmów reakcji

stosuje się różne metody eksperymentalne, a wśród nich również metody

izotopowe.

W chemii organicznej można wyróżnić trzy metody, gdzie stosuje się

znakowanie izotopami zarówno promieniotwórczymi, jak i stabilnymi.

1. Metoda wskaźników izotopowych, która umożliwia w warunkach laboratoryjnych

lub in vivo prześledzenie drogi interesującego nas atomu, lub stabilnych grup

atomów, w cząsteczce biorącej udział w reakcji organicznej lub bioorganicznej.

2. Metoda specyficznej wymiany izotopowej, która jest stosowana w radiochemii i

znajduje szerokie zastosowanie w syntezie znakowych związków organicznych

oraz w badaniu trwałości wiązań. Dzięki tej metodzie ustalono, które atomy

wodoru w cząsteczce organicznej są labilne i wymieniają się miejscami z

wodorami labilnymi cząsteczek rozpuszczalnika zawierającymi wodory np. w

grupach aminowych, hydroksylowych, czy merkaptanowych. Takie

radiochemiczne wstępne informacje są często wykorzystywane w syntezach

związków organicznych znakowanych metodą wymiany izotopowej. Istnieje

bogata literatura na temat wymian izotopowych, a mimo to metoda ta w dalszym

ciągu jest wykorzystywana do ustalania struktury skomplikowanych związków

organicznych

3. Metoda kinetycznego efektu izotopowego, KEI- (Kinetic Isotope Effect, KIE), która

polega na wyznaczeniu stałych szybkości przebiegających reakcji z użyciem cięższego i

lżejszego izotopu. Najczęściej wyznaczane są KEI deuteru, trytu i węgla. Cząsteczka

chemiczna, wykorzystywana w tych badaniach, jest znakowana izotopem w ściśle

określonym miejscu. Korelacja między doświadczalnie zmierzonym, a teoretycznie

wyliczonym KEI jest jedną z najlepszych metod do wyjaśnienia struktury i detali

kompleksu aktywnego, a także zmian, jakie zachodzą w wiązaniu w trakcie

przechodzenia od substratu do produktu. Metoda KEI jest szczególnie użyteczna, kiedy

do badania mechanizmu danej reakcji używa się kolejno substratów znakowanych w

różnych pozycjach, przy których mogą występować zmiany w wiązaniach chemicznych.

Dodatkowych cennych szczegółów może dostarczyć użycie substratu z różnymi

podstawnikami, indukującymi zmiany w otoczeniu wiązań ulegających przekształceniu

w trakcie badanego procesu.

Mechanizm reakcji

Mechanizm opisuje przebieg reakcji chemicznej. Mówi on o tym:

a) które wiązania ulegają pęknięciu,

b) jakie wiązania się się tworzą, c) jaka jest kolejność tych zjawisk,d) z ilu etapów składa się rozpatrywany proces,e) jakie są względne szybkości poszczególnych etapów

Poznanie odpowiedzi na te pytania jest często bardzo trudnym zadaniem.Szczególnie może to być skomplikowane w przypadku reakcji enzymaty-cznych, ze względu na złożoną strukturę enzymu i zachodzące procesy katalityczne.

Metody wyznaczania mechanizmów reakcji

1. Badanie produktów produktów reakcji:• identyfikacja,• dowody stereochemiczne.

2. Badanie produktów pośrednich:

• izolacja produktów pośrednich,• wykrywanie produktów pośrednich (metody spektroskopowe i rezonansowe),• wychwycenie produktów pośrednich (przy założeniu, że produkt pośredni będzie reagować

z danym reagentem dając ściśle określony produkt),• dodatek oczekiwanego produku pośredniego.

3. Badania kinetyczne:• równanie kinetyczne (mechanizm musi objaśniać obserwowane równanie i rząd reakcji),• badania katalizy (również inhibicji),• efekty izotopowe.

4. Stosowanie cząsteczek znakowanych izotopowo (analiza produktów takimi

technikami, jak MS, NMR itp.).

Kinetyczny efekt izotopowy k1

A + 1B ------------ A1B

k2

A + 2B ------------ A2B

k1 -stała szybkości reakcji z udziałem izotopu lżejszego (1B)

k2 -stała szybkości reakcji z udziałem izotopu lżejszego (2B)

KIE odwrotny 1

KIE jest 1

KIE ma nie 1

2

1

2

1

2

1

k

k

k

k

k

k

Kinetyczny efekt izotopowy

Jednym z najpotężniejszych narzędzi w badaniu mechanizmów reakcji jest metoda

kinetycznego efektu izotopowego. Jest ona bardzo często stosowana do badania

mechanizmów reakcji enzymatycznych.

Teoretyczne wyjaśnienie kinetycznych efektów izotopowych jest złożonym i

trudnym zadaniem. Z praktycznego punktu widzenia istotne jest jedynie uzmysłowienie

sensu fizycznego tego zjawiska. Zastąpienie atomu pierwiastka, w cząsteczce związku

biorącym udział w reakcji, na jego cięższy izotop często powoduje zmianę szybkości

reakcji. Różna szybkość tych dwóch reakcji jest nazywana kinetycznym efektem izotopowym i określa się ją jako stosunek stałych szybkości:

kiz. lżejszego / kiz. cięższego

Różnica ta wynika z tego, że energia oscylacyjna wiązania chemicznego na najniższym

możliwym poziomie (zero-point energy) nie jest zerowa (wynosi: E = hυ) i zależy od

masy zredukowanej:

= 21

21

mmmm

zgodnie z prawem Hook’a:

k

21

υ

(k- stała siłowa niezależna od masy).

Z tego wynika że wiązanie z cięższym izotopem będzie miało niższą energię oscylacji i rozerwanie wiązania będzie wymagało większej energii.

Obrazowo przedstawiono to na poniższym schemacie:

Energia dysocjacji wiązań C-H i C-D

Ta właśnie różnica w energiach dysocjacji jest powodem różnych szybkości

procesów z udziałem izotopów. Efekt izotopowy obserwujemy jedynie wówczas,

gdy rozpatrywany etap jest wystarczająco wolny, aby mieć decydujący wpływ na

szybkość całego procesu.

Kinetyczne efekty izotopowe. Najważniejsze kryteria podziału.

1. Podział KEI ze względu na wielkość stosunku

heavier.is

lighter.is

k

k

• efekty normalne, występują wówczas gdy szybkość reakcji dla związku z izotopem

lżejszym jest większa niż dla związku z izotopem cięższym

heavieris

lighteris

k

k

.

.> 1

• brak efektu izotopowego

heavieris

lighteris

k

k

.

. = 1

• efekty odwrotne (obserwowane rzadko) gdy:

heavieris

lighteris

k

k

.

.< 1

Metody wyznaczania mechanizmów reakcji

1. Badanie produktów produktów reakcji:• identyfikacja,• dowody stereochemiczne.

2. Badanie produktów pośrednich:

• izolacja produktów pośrednich,• wykrywanie produktów pośrednich (metody spektroskopowe i rezonansowe),• wychwycenie produktów pośrednich (przy założeniu, że produkt pośredni będzie reagować

z danym reagentem dając ściśle określony produkt),• dodatek oczekiwanego produku pośredniego.

3. Badania kinetyczne:• równanie kinetyczne (mechanizm musi objaśniać obserwowane równanie i rząd reakcji),• badania katalizy (również inhibicji),• efekty izotopowe.

4. Stosowanie cząsteczek znakowanych izotopowo (analiza produktów takimi

technikami, jak MS, NMR itp.).

3. Podział KEI ze względu na położenie znacznika izotopowego w stosunku do miejsca w cząsteczce, gdzie zachodzi etap determinujący szybkość reakcji:

a) pierwszorzędowe,b) drugorzędowec)drugorzędowe

Na przykładzie mechanizmu E1 można wyjaśnić te efekty.Według tego mechanizmu, najwolniejszym etapem jest rozerwanie wiązania pomiędzy atomem węgla a grupą X (odchodzącą), co prowadzi do utworzenia karbokationu. Ten etap będzie decydował o szybkości całego procesu. W związku z tym podstawienie atomu 12C1 izotopem 14C spowolni reakcję. Taki efekt izotopowy jest nazywany efektem pierwszo-rzędowym. Analogicznie dla wodoru H2 wystąpi efekt drugorzędowy, a dla wodoru H3 wystąpi efekt drugorzędowy.

C C 1

H3

H X

H2

HH

C C+1

H3

H

H2

H H

C C+1

H3

H

H H

H2

C C 1

H3 H

2

HH

wolno

szybko

Mechanizm E1

4. Podział na efekty substratowe i rozpuszczalnikowe

• substratowe – występują wówczas gdy zmiana składu izotopowego substratu powoduje zmianę szybkości reakcji,

• rozpuszczalnikowe – występuje wówczas gdy zmiana rozpuszczalnika np. • z H2O na D2O powoduje zmianę szybkości reakcji.

5. Podział efektów izotopowych znajdujących odbicie w zmianie kinetycznych parametrów reakcji enzymatycznych:

kinetyczne efekty izotopowe na Vmax

kinetyczne efekty izotopowe na Vmax /Km

4. Podział na efekty substratowe i rozpuszczalnikowe

• substratowe – występują wówczas gdy zmiana składu izotopowego substratu powoduje zmianę szybkości reakcji,

• rozpuszczalnikowe – występuje wówczas gdy zmiana rozpuszczalnika np. • z H2O na D2O powoduje zmianę szybkości reakcji.

5. Podział efektów izotopowych znajdujących odbicie w zmianie kinetycznych parametrów reakcji enzymatycznych:

kinetyczne efekty izotopowe na Vmax

kinetyczne efekty izotopowe na Vmax /Km

METODY WYZNACZANIA KINETYCZNYCH EFEKTÓW IZOTOPOWYCH

1. Bezpośrednie wyznaczanie kinetycznych efektów

izotopowych.

2. Metoda zaburzeń równowagi.

3. Metody z użyciem spektrometrii mas.

Wyznaczanie KIE wg równań Bigeleisena i Wolsgerga

)1ln(

)1ln(

])1(

)1(1ln[

)1

11ln( 0

0

0

0

f

R

Rf

RR

RfR

R

Rf

p

p

p

p

)1ln(

)1(ln

)1(

)1()1(ln

1

)1()1(ln 0

0

0

0

f

R

Rf

RR

RfRR

Rf

s

s

s

s

])1(

)(

1

1ln[

])1(

)(

1

1ln[

])1()1(

)(

1

1ln[

])1()1(

)(

1

1ln[

ps

sp

p

sp

ps

sp

p

sp

RRf

RRf

f

Rf

RRf

f

RRf

RRf

f

Rf

RRf

f

0

0

0

)(

)(ln

ln

RRR

RRR

RR

RR

sp

sp

sp

p

- R0 - aktywność molową lub stosunek zawartości izotopu lżejszego do izotopu cięższego w substracie przed rozpoczęciem reakcji, - Rp - aktywność molową lub stosunek   zawartości   izotopu    lżejszego  do   izotopu   cięższego w produkcie w chwili, gdy stopień przereagowania wynosi f,- Rs - aktywność molową lub stosunek zawartości   izotopu    lżejszego   do  izotopu  cięższego w substracie, gdy stopień przereagowania wynosi f,- f - stopień przereagowania.- α - kinetyczny efekt izotopowy,

B a d a n i e m e c h a n i z m u e l e k t r o f i l o w e j s u b s t y t u c j i w p i e r ś c i e n i u

a r o m a t y c z n y m

M e c h a n i z m e l e k t r o f i l o w e j s u b s t y t u c j i w p i e r ś c i e n i u a r o m a t y c z n y m

( 1 ) A r H + Y

( 2 ) A r

A r

H

Y

Y

H

+ Z A r Y + H : Z

Powoli; etap określajacyszybkość reakcji

Szybko

( 1 a ) A r H + Y A r

H

Y

A r Y + H

B a d a n i e m e c h a n i z m u e l e k t r o f i l o w e j s u b s t y t u c j i w p i e r ś c i e n i u a r o m a t y c z n y m

Z n a j o m o ś ć e f e k t u i z o t o p o w e g o o r a z o g ó l n a z n a j o m o ś ć p r z y c z y n j e g o w y s t ę p o w a n i a ,

s t w a r z a m o ż l i w o ś ć w y j a ś n i e n i a , d l a c z e g o t e n e f e k t i n t e r e s u j e c h e m i k a o r g a n i k a .

Z d o t y c h c z a s o w y c h u s t a l e ń e k s p e r y m e n t a l n y c h , d o t y c z ą c y c h r e a k c j i e l e k t r o f i l o w e j

s u b s t y t u c j i w z w i ą z k a c h a r o m a t y c z n y c h , w y n i k a , ż e z a c h o d z ą o n e w e d ł u g j e d n e g o

m e c h a n i z m u , n i e z a l e ż n i e o d r o d z a j u r e a g e n t a b i o r ą c e g o w n i e j u d z i a ł . D l a r e a g e n t a Y Z

o g ó l n y m e c h a n i z m t e j r e a k c j i m o ż n a z a p i s a ć n a s t ę p u j ą c o :

M e c h a n i z m e l e k t r o f i l o w e j s u b s t y t u c j i w p i e r ś c i e n i u a r o m a t y c z n y m

M e c h a n i z m o b e j m u j e d w a z a s a d n i c z e e t a p y : E t a p ( 1 ) – a t a k r e a g e n t a e l e k t r o f i l o w e g o n a

p i e r ś c i e ń z u t w o r z e n i e m k a r b o k a t i o n u o r a z e t a p ( 2 ) – o d e r w a n i e p r o t o n u o d k a r b o k a t i o n u

p r z e z d o w o l n ą z a s a d ę .

( 1 ) A r H + Y

( 2 ) A r

A r

H

Y

Y

H

+ Z A r Y + H : Z

Powoli; etap określa jacyszybkość reakcji

Szybko

M e c h a n i z m o b e j m u j e d w a z a s a d n i c z e e t a p y : E t a p ( 1 ) – a t a k r e a g e n t a e l e k t r o f i l o w e g o n a p i e r ś c i e ń z

u t w o r z e n i e m k a r b o k a t i o n u o r a z e t a p ( 2 ) – o d e r w a n i e p r o t o n u o d k a r b o k a t i o n u p r z e z d o w o l n ą z a s a d ę .

P y t a n i e s k ą d w i a d o m o , ż e e l e k t r o f i l o w a s u b s t y t u c j a w p i e r ś c i e n i u a r o m a t y c z n y m o b e j m u j e d w a e t a p y ,

a n i e t y l k o j e d e n .

O r a z s k ą d w i a d o m o , ż e p i e r w s z y z d w ó c h e t a p ó w [ e t a p ( 1 ) ] p r z e b i e g a z n a c z n i e w o l n i e j n i ż [ e t a p ( 2 ) ] ?

O d p o w i e d ź u z y s k a n o w w y n i k u s e r i i b a d a ń r o z p o c z ę t y c h p r z e z M e l a n d e r a ( z I n s t y t u t u C h e m i i i m .

N o b l a w S z t o k h o l m i e ) i p r o w a d z o n y c h t a k ż e p r z e z w i e l u i n n y c h b a d a c z y . R ó ż n o r o d n e z w i ą z k i

a r o m a t y c z n e z n a k o w a n e a t o m a m i d e u t e r u i t r y t u w p i e r ś c i e n i u a r o m a t y c z n y m p o d d a n o n i t r o w a n i u ,

b r o m o w a n i u i a l k i l o w a n i u m e t o d ą F r i e d l a - C r a f t s a .

S t w i e r d z o n o , ż e w r e a k c j a c h t y c h n a s t ę p u j e w y m i a n a a t o m ó w d e u t e r u l u b t r y t u z t a k ą s a m ą

s z y b k o ś c i ą j a k a t o m ó w z w y k ł e g o w o d o r u ( p r o t u ) . R ó w n i e ż n i e z a o b s e r w o w a n o w y r a ź n e g o e f e k t u

i z o t o p o w e g o . W i a d o m o , ż e w i ą z a n i e w ę g i e l - d e u t e r u l e g a r o z e r w a n i u w o l n i e j n i ż w i ą z a n i e w ę g i e l - p r o t , a

w i ą z a n i e w ę g i e l - t r y t j e s z c z e w o l n i e j .

J a k w i ę c m o ż e m y i n t e r p r e t o w a ć f a k t , ż e n i e s t w i e r d z a s i ę w t y m p r z y p a d k u e f e k t u i z o t o p o w e g o ?

( 1 a ) A r H + Y A r

H

Y

A r Y + H

Jeżeli szybkości substytucji różnych izotopów wodoru są taki same, może to tylko

oznaczać, że w reakcjach, których szybkość porównujemy, nie następuje rozerwanie

wiązania węgiel-wodór.

Interpretacja ta jest zgodna z przyjętym mechanizmem. Powolne przyłączenie

reagenta elektrofilowego określa szybkość całego procesu substytucji. Powstający

karbokation szybko traci jon wodorowy i przekształca się w cząsteczkę produktu.

Etap (1) jest etapem określającym szybkość reakcji. W etapie tym nie następuje

rozerwanie wiązania węgiel-wodór, dlatego szybkość tego etapu, a więc szybkość

całej reakcji, nie zależy od rodzaju izotopu wodoru, który znajduje się w pierścieniu.

Gdyby reakcja substytucji obejmowała etap (1a), to musiał by on być etapem

określającym szybkość reakcji, a ponieważ następowałoby w nim rozerwanie

wiązania węgiel-wodór, powinniśmy zaobserwować kinetyczny efekt izotopowy.

Gdyby natomiast etap (2) w sekwencji dwuetapowej przebiegał dostatecznie wolno

w porównaniu z etapem (1), wówczas musiałby on wpływać na całkowitą szybkość

reakcji i ponownie należałoby się spodziewać wystąpienia KEI.

Badanie mechanizmu kondensacji Dieckmana

Reakcja kondensacji Dieckmana polega na katalizowanej przez zasadę cyklizacji wewnętrznej

estru dikarboksylowego do β- ketoestru

CH2COOR

CH2COOR

CHCOOR

CH2 C O

OR

O

O OR

OR

OOR

O

B -

(1)

(2)

(3)

Każdy z trzech etapów może określać kinetykę procesu. Problem który z etapów jest kinetycznie

istotnym, rozwiązano znakując kolejno ester węglem 14C, raz w grupie metylenowej, drugi raz w

grupie karbonylowej.

Mechanizm kondensacji Dieckmana

1. Jeżeli etap (1) jest istotny kinetycznie, wtedy powinniśmy obserwować KEI 14C w grupie

metylenowej oraz brak KEI 14C w grupie karbonylowej.

2. Jeżeli etap drugi jest istotny kinetycznie, wtedy powinniśmy obserwować KEI zarówno

dla węgla w grupie metylenowej jak i w grupie karbonylowej, gdyż w stanie

przejściowym tego etapu ulegają zmianie wiązania chemiczne przy obu tych węglach.

3. Jeżeli etap trzeci jest istotny kinetycznie, wtedy w stanie przejściowym reakcji wiązania

chemiczne przy węglu grupy metylenowej nie ulegają zmianie. W tym przypadku KEI 14C

grupy karbonylowej powinien być obserwowany.

Pomiary doświadczalne wykazały istnienie kinetycznego efektu izotopowego zarówno dla

węgla metylenowego i dla węgla z grupy karbonylowej;

Grupa metylenowa; k12/k14 = 1,089

Grupa karbonylowa; k12/k14 = 1,084

Oznacza to, że etap drugi tj. tworzenie nowego wiązania węgiel – węgiel decyduje o

kinetyce reakcji.

Z

S

R Ar

R

Z

Z

ArS

R

Z

S

R Ar

X

R

Z

XArS

X X

ArSX

2 3 4

11

Mechanizm reakcji addycji elektrofilowej chlorku 2,4-dinitrobenzenosulfenowego

Badanie mechanizmu reakcji addycji elektrofilowej chlorku 2,4 dinitrobenzenosulfenowego do styrenu i jego para pochodnych w środowisku

kwasu octowego

Jeżeli reakcje addycji chlorku 2,4-dinitrobenzenosulfenylowego do styrenu i jego para pochodnych prowadzi się w kwasie octowym, to wiadomo, że reakcja przebiega zgodnie z regułą Markownikowa i dodatnia część cząsteczki chlorku 2,4-dinitrobenzenosulfenowego przyłącza się do βC natomiast ujemny chlor przyłącza się do αC i powstają odpowiednie siarczki chloro fenyloetylowo-2,4-dinitrofenylowe.

Powstaje pytanie, jaką strukturę posiada kompleks aktywny powstający w etapie określającym szybkość reakcji w reakcji elektrofilowej? Prezentowany schemat zawiera trzy różne struktury stanów przejściowych dające ten sam produkt końcowy.

Na temat reakcji elektrofilowej addycji do nienasyconych węglowodorów ukazało się wiele prac, ale nie było jednomyślności jaką strukturę ma kompleks aktywny. Problem ten mógł być rozwiązany przez wyznaczenie KEI 14C w pozycji α- i β-styrenów zawierających elektronodonorowe i elektronoakceptorowe podstaw\niki.

Przewidziano, że jeżeli kompleks aktywny posiada strukturę (2) to powinniśmy obserwować kinetyczny efekt izotopowy dla βC, ponieważ tworzy się wiązanie z siarką tylko przy tym węglu. Natomiast jeżeli kompleks aktywny posiada strukturę (3) bądź (4) wówczas powinniśmy obserwować KEI dla αC i dla βC.

Badania doprowadziły do wyznaczenia KEI dla αC i βC następujących dla kolejno podstawionych styrenów:

αC p-CH3; p-H; p-Cl; k/kα = 1,004; 1,022; 1,027βC p-CH3; p-H: p-Cl; k/kβ = 1,037; 1,032; 1,035

Oznaczenia wartości k/kα i k/kβ wykazały, że kinetyczny efekt izotopowy dla węgla 14C jest zależny od miejsca podstawienia izotopowego oraz od charakteru podstawników w pierścieniu aromatycznym. Wyznaczona wartość k/kβ dla βC jest dość duża i nie zależny od charakteru podstawników w pozycji para pierścienia. Natomiast k/kα jest zależny od charakteru podstawnika. Wyraźnie mały kinetyczny efekt izotopowy węgla 14C w reakcji addycji ArSCl do styrenu, posiadający elektronodonorowy podstawnik w pozycji para pierścienia aromatycznego, sugeruje, że struktura stanu przejściowego jest zbliżona do struktury otwartej karbokationu (2), w której dodatni ładunek jest zlokalizowany przy węglu α. Wiązanie βC-S tworzy się niezależnie od mechanizmu i dlatego jest jasne, że KEI występuje i jego wartość nie zmienia się, niezależnie od tego jaki podstawnik jest w pierścieniu aromatycznym.

Jeśli aktywny kompleks miałby strukturę (3) lub (4) to utworzone wiązanie pomiędzy αC i siarką powinno być taki samo lub podobne i wówczas KEI dla αC powinien być podobny. Im silniejsze jest wiązanie αC-S tym większy powinien być KEI. Jeżeli ładunek dodatni na αC jest bardziej zdelokalizowany w pierścieniu wówczas wiązanie αC-S jest bardzo słabe lub go nie ma i wtedy jest brak kinetycznego efektu izotopowego. Jeżeli podstawnik jest elektronodonorowy (-CH3), to wolna para elektronowa jest do pewnego stopnia zdelokalizowana, co powoduje zwiększenie chmury elektronowej pierścienia, a następnie osłabienie ładunku dodatniego przy αC. Wiązanie αC-S jest wtedy bardzo słabe i w konsekwencji tego KEI jest bardzo mały. Obecność chloru w pozycji para pierścienia powoduje, że gęstość elektronowa w pierścieniu jest mniejsza niż w cząsteczce styrenu i dlatego też wiązanie αC-S jest silniejsze i KEI jest większy. A więc jeżeli podstawnik jest elektronodonorowy, to aktywny kompleks ma strukturę (2).

Jeżeli podstawnik jest elektronoakceptorowy, to aktywny kompleks ma strukturę (3) lub (4).

Reasumując, struktura kompleksu aktywnego powstającego w etapie określającym szybkość reakcji zależy od budowy podstawnika znajdującego się przy podwójnym wiązaniu.

Badania mechanizmu reakcji eliminacji bromu z kwasów dibromocynamonowych do odpowiednich kwasów cynamonowych

I e t a p :

I I e t a p :

K J + I B r › K B r + I 2

I 2 + K I › K I 3 ( K I , J 2 )

R

C O O H

R

C O O H

B r

B r

+ K I + K B r + I B r

COOH

BrBr

CH3

COOH

Br

CH3

COOH

CH3

wolno szybko

Mechanizm eliminacji kwasu

para metylo[(2R),(3S)]-dibromocynamonowego

Mechanizm eliminacji kwasu para metylo[(2R),(3S)]-dibromocynamonowego

Br

- Br- , - Br+

- Br+

COOH

R

COOH

R

- Br-

COOH

BrBr

R

E 1 (jednocząsteczkowy)?

E 2 (zsynchronizowany)?

Badania wykazały, że kinetyczny efekt izotopowy 14C występuje w pozycjach α, β, oraz jest zależny od miejsca podstawienia izotopowego i od charakteru podstawnika w pierścieniu aromatycznym. Gdy:

R = H, p-CH3, oraz p-NO2

wtedy (k12\k14) w pozycji wynoszą odpowiednio: 1,05226; 1,0094; 1,0233.

Natomiast (k12\k14) w pozycji dla podstawników R = p-CH3 i H wynoszą odpowiednio:1,072; 1,0483

Wnioski dotyczące mechanizmu reakcji eliminacji bromu z kwasu

[(2R),(3S)]-dibromocynamonowego

KEIZakładanymechanizm

k / k k /

k k / *k

E 1(jedno-

cząsteczkowy)nie tak nie

E 2(zsynchronizowany) tak tak nie

Badanie mechanizmu eliminacji amin z soli p-nitrofenylo-2-etylo-N,N,N-trimetyloamoniowej i n-propylo-N,N,N-trimetyloamoniowej

Reakcje eliminacji, badane metodą KEI z zastosowaniem ciężkich atomów zachodziły głownie według mechanizmu E1 i E2. W związku z tym prowadzone badania były głównie ukierunkowane w stronę wyznaczenia trwałości wiązań przy βC-H i αC-X. Skomplikowana natura takiej reakcji została wyjaśniona na przykładzie wyznaczenia KEI dla kolejno znakowanych związków w trakcie rozkładu soli n-propylo-N,N,N-trimetyloamoniowej oraz p-nitrofenylo-2-etylo-N,N,N-trimetylo-amoniowej

R CH CH2

TB

B -

CH2R CHR CH CH2 NMe3

T

NMe3

+ NMe3 + BT

Mechanizm eliminacji soli amoniowych do styrenu

Badano kinetyczny efekt izotopowy dla węgla 14C, wodoru i azotu. W literaturze występują znaczne różnice w wyznaczonych efektach izotopowych przez dwie oddzielne grupy badawcze. Pierwsza grupa dla podstawnika R = CH3 otrzymała:

k/kβ = 1,036 dla 14C w pozycji β,k/kα = 1,069 dla 14C w pozycji α,

oraz kH/kT = 2 dla trytu w pozycji β.

Reakcja ta była prowadzona w temperaturze 50 oC. Ponadto wyznaczono KEI dla reakcji w tych samych warunkach z podstawnikiem R = p-NO2C6H4 dla 14C w pozycji α, gdzie otrzymano: k/kα = 1,026. Z tego widać, że występujące znaczne efekty izotopowe przy αC, βC i βH wpływają na etapy determinujące szybkość reakcji.

Druga grupa badawcza dla podstawnika R = p-NO2C6H4 wyznaczyła kinetyczny efekt izotopowy:

k/kα = 1,078 dla14C w pozycji 2, k14/k15 = 1,024 dla azotu,

i kH/kT = 2,12 dla trytu w pozycji β.

Reakcję prowadzono w temperaturze 100 oC.

Przyczyna tych rozbieżności nie jest znana, ale autorzy wyciągają podobne wnioski, że zmiany wiązań przy N, αC,βC i βH decydują o szybkości reakcji.

Badanie mechanizmu reakcji dehydrohalogenacjii

BrC CCl3

R

R

R CH2 CH2 NMe3

R CH2 CH2Cl

para podstawiony2,2-difenylo-1,1,1-trichloroetan

para podstawiony1-chloro-2-fenyloetan

para podstawiony1-chloro-1-fenyloetan

R CH

Cl

CH3

bromek para podstawiony2-fenyloetylo-N,N,N-trimetyloamoniowy

Badanie mechanizmu reakcji dehydrohalogenacjii

Zaproponowany mechanizm reakcji dehydrohalogenacji przedstawia poniższy schemat

C

R

R

H

CCl2

Cl

CH3O -

C

R

R

CCl2

Cl

C

R

R

E1cb ?

CCl2wolno

szybko

- Cl -

zsynchronizowany E2

- CH3OH, - Cl-

- CH3OH

Przed dokładnym przebadaniem reakcji dehydrohalogenacji sądzono, że przebiega ona w środowisku zasadowym według mechanizmu E1cB, ale nie wykluczono również mechanizmu podobnego do E2. W związku z czym przebadano proces eliminacji z użyciem czterech uprzednio podanych układów.

Zakładany mechanizm eliminacji amoniaku i odtworzenie miejsca aktywnego

NNR

O

NH3

+

NNR

O

NH2

+

NNR

O

NNR

O

NH2

Enzym

+CO2

-

Enzym

Enzym

CO2-

Enzym

CO2-

+ NH3

a) b)

c)

a) Addycja Michaelab) eliminacjac) odtworzenie dehydroalaniny przez -eliminację

+

Mechanizm reakcji eliminacji z udziałem PAL zaproponowany przez Havir’a i Hanson’a

BH

NH

O

NH

H

HNH2

HPh

B

BH

HNH2

+H

Ph

NH

OH

NH

H H

B

B

HNH2

+

Ph

NH

OH

NH

H H

H

HB B

Ph

HB

NH2NH

OH

NH

H H

+

COO-

Re

Si

:-

COO-

Re

Si

:-

COO-

Re-

:

:

COO-

:

Mechanizm reakcji eliminacji z udziałem PAL zaproponowany

przez Schuster’a i Retey’a

NH

NH

OH+

COO

H H

NH3

+H

NH

NH

OH

COO

H H

NH3

+H

B

NH

NH

OH

COO

NH3

+H

HBNH

NH

OH+

COO

HB

-Re Si -

Re Si

+

:

-

+

-

NH3

+

Kinetyczny efekt izotopowy H/T w pozycji 3-pro-S L-tyrozyny

Liaza fenyloalaninowa katalizuje również eliminację amoniaku z L-tyrozyny,

co pozwala na zbadanie wpływu grupy elektrodonorowej na wielkość kinetycznego

efektu izotopowego w tej reakcji. Nie można jednocześnie wykluczyć, że reakcja

eliminacji z udziałem L-tyrozyny przebiega według innego mechanizmu.

Potwierdzeniem takiej tezy byłby wynik znacząco różny od otrzymanego dla L-Phe,

czyli na przykład brak efektu lub duży efekt.

C14

NH2

T

OH

OOH C14

OH

OOHPALpH = 8,7, 30 oC + NH2T

Kinetyczny efekt izotopowy H/T w pozycji orto pierścienia aromatycznego L-fenyloalaniny

C14

OH

O

NH2

T

T

C14

OH

O

T

T

NH3

PAL

pH = 8,7 +

Wyniki badań kinetycznego efektu izotopowego H/T w pozycji 2 i 6 pierścienia aromatycznego L-fenyloalaniny.

Nr eksperymentu –

nr frakcji

Stopień

przereagowania [%] KEI

1-1 5,89 0,8595

1-2 9,32 0,9664

1-3 12,09 1,0254

1-4 13,86 1,0870

1-5 16,22 1,0991

2-1 9,95 1,0143

2-2 12,34 1,0354

2-3 19,70 1,1559

2-4 21,82 1,1591

2-5 24,12 1,1598

Kinetyczny efekt izotopowy 12C/14C w pozycji 2 L-Phe

CH

OH

O

CH

OH

O

NH2

*PALpH = 8,7

*

Kinetyczny efekt izotopowy 12C/14C w pozycji 2 L-fenyloalaniny

Nr eksp.* R0, Rp, f R0, Rr, f Rp, Rr, f R0, Rr, Rp Średnia

1 0.9957 1.0262 1.0003 0.9981 1.0051

2 0.9955 0.9918 0.9955 0.9955 0.9946

3 1.0095 0.9696 1.0020 1.0050 0.9965

4 1.0085 1.0044 1.0075 1.0078 1.0070

średnia 1.0023 0.9980 1.0013 1.0016 1.0008±0.0062±0.0019

Procedura wyznaczenie KEI H/T w pozycji 3-pro-R

Procedura postępowania dla każdej frakcji

C14

O

O

NH3

+

T

Mieszanina reakcyjna pH=8,7

C14

O

OT

H+

C14

OH

O

NH3

+

T

C14

OH

OT

Reakcja enzymatyczna zatrzymana pH=0-1

Ekstrakcja (Et2O)

Warstwa eterowa

C14

OH

O

NH3

+

TWarstwa wodna

C14

OH

OT

Pomiar aktywnosci 14C (Ai)oraz stosunku aktywności 3H/14C Rp

Po wydzieleniu L-Phe zastosowana do następnego eksperymentu

Pobieram V1 mieszaniny reakcyjnej

Mierzę aktywność (A0) 14 C oraz

stosunek aktywności 3H/14C (R0)

Mieszanina reakcyjna:enzym, L-Phe [1-14C, 3R-3H]bufor boranowy 0,2M pH = 8,7

Pobieram 5 frakcji (każda V1) o różnym stopniu przereagowania w zakresie od 10% do 20%

t1 t2 t3 t4t5

Kinetyczny efekt izotopowy H/T w pozycji 3-pro-R L-Phe

Nr Eksp. KEI Odchyleniestand.

1 1,0594 0,0215

21,0535 0,0187

3 1,0566 0,0151

4 1,0480 0,0167

5 1,0585 0,0193

Średnia 1,0552 0,0046

Procedura badania KEI w pozycji 3-pro-S L-Phe

Procedura postępowania dla każdej frakcji

C14

O

O

NH3

+

T

Mieszanina reakcyjna pH=8,7

C14

O

OH+

C14

OH

O

NH3

+

T

C14

OH

O

Reakcja enzymatyczna zatrzymana pH=0-1

Ekstrakcja (Et2O)

Warstwa eterowa

C14

OH

O

NH3

+

TWarstwa wodna

C14

OH

O

Pomiar aktywnosci 14C (Ai)

Pobieram V1 mieszaniny reakcyjnej

Mierzę aktywność (A0) 14 C oraz

stosunek aktywności 3H/14C (R0)

Mieszanina reakcyjna:enzym, L-Phe [1-14C, 3S-3H]bufor boranowy 0,2M pH = 8,7

Pobieram 5 frakcji (każda V1) o różnym stopniu przereagowania w zakresie od 10% do 20%

t1 t2 t3 t4t5

NH2T+

NH3T

+NH3T

Kolumna jonowymienna Amberlit IR 120 (H+)

elucja H2O

H OT

C14

OH

O

NH3

+

T

0,3 M NH3

C14

OH

O

NH3

+

TOdparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem Pomiar stosunku

aktywności 3H/14C (Rri)

Kinetyczny efekt izotopowy D/T w pozycji 3-pro-S L-Phe

Nr Eksp. KEI OdchylenieStand.

1 1,0750 0,0186

21,0953 0,0187

3 1,0899 0,0151

4 1,0734 0,0167

Średnia 1,0834 0,0109(1,01%)

Zależność Swain’a-Schaad’a

α = k

k kH

T D

= kH

1 44,

k

kD

T obl obs

3 26,

= k

k

k

kH

T

H

T

α =

Gdzie: kH/kT - KIE dla 1H/3H.

kH/kD - KIE dla 1H/2H.

kD/kT - KIE dla 2H/3H.

Jeśli efekt 1H/3H, obliczony z efektów 1H/2H lub 2H/3H przy pomocy wspomnianych zależności, jest mniejszy od efektu zaobserwowanego, wtedy prawdopodobnie w reakcji następuje tunelowanie protonu.

Jeśli wartość wyliczonego KIE jest większa od zaobserwowanej, to mamy do czynienia ze złożonością kinetyczną, tzn. nie tylko etap odrywania protonu decyduje o szybkości reakcji.