www.biq.iqm.unicamp.br arquivos teses 000768040

Murilo Santhiago Dissertao de Mestrado

i

Instituto de Qumica Departamento de Qumica Analtica

Laboratrio de Eletroqumica, Eletroanaltica e Desenvolvimento

de Sensores

Instituto Nacional de C&T de Bioanaltica

DISSERTAO DE MESTRADODISSERTAO DE MESTRADODISSERTAO DE MESTRADODISSERTAO DE MESTRADO

CONSTRUO DE PLATAFORMAS NANOCONSTRUO DE PLATAFORMAS NANOCONSTRUO DE PLATAFORMAS NANOCONSTRUO DE PLATAFORMAS NANOESTRUTURADAS ESTRUTURADAS ESTRUTURADAS ESTRUTURADAS

PARA DETECO DE Cys e NADHPARA DETECO DE Cys e NADHPARA DETECO DE Cys e NADHPARA DETECO DE Cys e NADH

Autor: Murilo Santhiago

Orientador: Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota

Campinas

Fevereiro / 2010


ii


v

Dedico esta dissertao minha famlia,

pelo apoio incondicional,

com amor.


vii

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota, por ter me incentivado e orientado de maneira grandiosa desde o incio do mestrado. Ficam aqui os meus sinceros agradecimentos pela ajuda imediata nos momentos crticos e, principalmente, de tornar possvel realizao deste trabalho;

Aos amigos Phabyanno, Wilney e Caio, pela ajuda, incentivo, amizade e principalmente, companheirismo, qualidade difcil de se encontrar em uma rea em que o individualismo predomina. Pessoas batalhadoras que no desanimam ao enfrentar as dificuldades proporcionadas pela vida;

Aos amigos de Blumenau Eduardo, Aldori, Raquel e Juliano pelo companheirismo que j ultrapassa uma dcada;

A todos os funcionrios do Instituto de Qumica que colaboraram para a realizao deste trabalho, especialmente a Izabel Aquino Calasso, Izabel Ribeiro Filippi, Miguel da Silva Morel e Nestor P. Maia pela ateno e ajuda;

Aos colegas do Laboratrio LEEDS;

Ao CNPq pelo apoio financeiro;


ix

CURRICULUM VITAE

Nome: Murilo Santhiago

Naturalidade: Blumenau-SC

Data de nascimento: 26/04/1984

I.0 Formao acadmica

I.1 Qumica Universidade Federal de Santa Catarina UFSC, Florianpolis-SC Incio: 2003 / 2. semestre trmino: 2007 / 2. semestre Ttulo da monografia: Determinao de cido Rosmarnico Utilizando Sensor Biomimtico Contendo Complexo Binuclear de Fe-Zn e Eletroforese Capilar. Orientadora: Profa. Dra. Iolanda da Cruz Vieira

I.2 Mestrado em Qumica Universidade Estadual de Caminas UNICAMP, Campinas-SP Incio: 2008 / 1. semestre trmino: 2010 / 1. semestre Ttulo da dissertao: Construo de Plataformas Nanoestruturadas para Deteco de Cys e NADH. Orientador: Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota

II.0 Produo cientfica

II.1 Artigos publicados

II.1.1 SANTHIAGO, M. ; LIMA, P. R. ; SANTOS, W. J. R. ; OLIVEIRA, A. B. ; Kubota, L. T. In situ activated 3,5-dinitrobenzoic acid covalent attached to nanostructured platform for NADH electrooxidation. Electrochimica Acta 54 (2009) 6609 6616.


x

II.1.2 SANTHIAGO, M. ; PERALTA, R. A. ; NEVES, A. ; MICKE, G. A. ; VIEIRA, I. C. Rosmarinic acid determination using biomimetic sensor based on purple acid phosphatase mimetic. Analytica Chimica Acta 613 (2008)91 97.

II.1.3 CARVALHO, M. L. ; SANTHIAGO, M. ; PERALTA, R. A. ; NEVES, A. ; MICKE, G. A. ; VIEIRA, I. C. Determination of chlorogenic acid in coffee using a biomimetic sensor based on a new tetranuclear copper(II) complex. Talanta 77 (2008) 394 399.

II.1.4 SANTHIAGO, M. ; VIEIRA, I. C. L-cysteine determination in pharmaceutical formulations using a biosensor based on laccase from Aspergillus oryzae.. Sensors and Actuators B 128 (2007) 279 285.

II.1.5 SANTHIAGO, M. ; LIMA, P. R. ; SANTOS, W. J. R. ; KUBOTA, L. T. An amperometric sensor for Lcysteine based on nanostructured platform modified with 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB). Sensors and Actuators B, 2010.

II.3 Trabalhos completos apresentados em eventos cientficos

II.3.1 OLIVEIRA, C. N. ; LIMA, P. R. ; SANTHIAGO, M. ; KUBOTA, L. T. Determinao de parmetros cinticos do sistema 1,2-NQ/MWCNT imobilizada sobre ouro para oxidao eletrocataltica de NADH. In: XVII Simpsio Brasileiro de Eletroqumica e Eletroanaltica, 2009, Fortaleza-CE.

II.3.2 SANTHIAGO, M. ; LIMA, P. R. ; SANTOS, W. J. R. ; KUBOTA, L. T. Desenvolvimento de uma interface nanoestruturada para deteco eletrocataltica de NADH. In: XVII Simpsio Brasileiro de Eletroqumica e Eletroanaltica, 2009, Fortaleza-CE.


xi

RESUMO

Ttulo: Construo de Plataformas Nanoestruturadas para Deteco de Cys e NADH. Autor: Murilo Santhiago Orientador: Lauro Tatsuo Kubota Palavras-chave: Sensor amperomtrico, nanotubos de carbono, cistena e NADH.

Neste trabalho descreve-se o desenvolvimento de dois sensores amperomtricos empregando mediadores redox derivados do grupo nitro imobilizados sobre plataformas nanoestruturadas para a deteco da nicotinamida adenina dinucleotdeo (NADH) e L-cistena. Para a construo da base das plataformas foram empregados nanotubos de carbono funcionalizados com grupos amino. Uma vez funcionalizada, a plataforma possibilitou o ancoramento dos dois mediadores redox. Para a deteco de NADH foi utilizado o cido 3,5-dinitrobenzoico como mediador redox. Este mediador foi imobilizado na superfcie da plataforma utilizando os catalisadores 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodimida (EDC) e N-hidroxi succinimida (NHS). J para o sensor destinado deteco de L-cistena, foi necessrio a adsoro de nanopartculas de ouro para imobilizar o cido 5,5ditiobis2nitrobenzoico (DTNB) como mediador redox. Para os estudos eletroqumicos, as espcies hidroxilamina foram eletrogeradas in situ a partir do grupo nitro presente em ambos os mediadores. As plataformas nanoestruturadas foram caracterizadas atravs de voltametria cclica, cronoamperometria, MEV e eletrodo de disco rotatrio. Os valores das constantes heterognea de transferncia de eltrons (ks) e da velocidade da reao mediador-analito foram ~50 s-1 e 103 - 104 L mol-1s-1, respectivamente. As curvas analticas para ambos os sensores foram obtidas aplicando baixos sobrepotenciais e resultaram em limites de deteco e quantificao na faixa de 1,2 9,1 mol L-1. O sensor para L-cistena foi aplicado em amostras reais e os resultados obtidos foram estatisticamente iguais quando confrontados com um mtodo comparativo.


xiii

ABSTRACT

Title: Construction of nanostructured platforms for Cys and NADH detection. Author: Murilo Santhiago Adviser: Lauro Tatsuo Kubota Keywords: Amperometric sensor, carbon nanotubes, cysteine and NADH.

This work describes the development of two amperometric sensors using redox mediators derived from the nitro group immobilized on nanostructured platforms for the detection of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and L-cysteine. Carbon nanotubes functionalized with amino groups were used for the construction of the platforms. Once functionalized, the platform allowed the anchoring of two redox mediators. 3,5-dinitrobenzoic acid was used as redox mediator for NADH detection. This mediator was immobilized on the surface of the platform using the catalysts 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodimide (EDC) and N-hydroxy-succinimide (NHS). For the construction of the sensor for L-cysteine detection, it was necessary the adsorption of gold nanoparticles to receive 5,5-dithio-2-nitrobenzoic acid as redox mediator. For the electrochemical studies, the hydroxylamine species were electrogenerated in situ from the nitro group present in both mediators. Nanostructured platforms were characterized by cyclic voltammetry, chronoamperometry, SEM and by rotating disk electrode experiments. Rate constant values for the heterogeneous electron transfer (ks) and the kinetic constants for the mediator-analyte reaction were ~50 s-1 e 103 - 104 L mol-1s-1, respectively. The analytical curves for both sensors were obtained applying low overpotentials and resulted in limits of detection and quantification around 1.2 up to 9.1 mol L-1. The sensor for L-cysteine was used in pharmaceutical samples and the results were statistically the same to those obtained with a comparative method.


xv

SUMRIO LISTA DE ABREVIATURAS xix

LISTA DE TABELAS xxiii

LISTA DE FIGURAS xxv

APRESENTAO xxxi

CAP. I INTRODUO E OBJETIVOS 1 I.1 L-cistena (Cys) 3 I.2 NADH 4

I.3 Deteco de Cys e NADH 5

I.4 Mediadores redox 6

I.5 Nanoestruturas 10

I.6 Nanotubos de carbono 11

I.6.1 Carbono 11

I.6.2 Sntese, estrutura e propriedades eletrnicas 12

I.6.3 Propriedades qumicas 14

I.6.4 Propriedades eletroqumicas 16

I.6.5 Funcionalizao dos nanotubos 18

I.6.5.1 Modificao covalente 18

I.6.5.2 Modificao no-covalente 20

I.7 Nanopartculas de ouro 22

I.8 Motivao 24

I.9 Objetivos 24 I.9.1 Geral 24


xvi

I.9.2 Especficos 25

CAP. II PARTE EXPERIMENTAL 27

II.1 Parte experimental 29

II.1.2 Reagentes e solues 29

II.1.3 Equipamentos 29

II.1.4 Limpeza do eletrodo de trabalho 30

II.1.5 Sensor para Cys (Sen-Cys) 31 II.1.5.1 Planejamento fatorial 32 II.1.6 Sensor para NADH (Sen-NADH) 32 II.1.7 Micrografias 33

II.1.8 Preparo das amostras 33

II.1.9 Estudo de repetibilidade, estabilidade e tempo de vida do sensor

34

CAP. III SENSOR PARA CISTENA 35 III.1 Apresentao do captulo 37

III.2 Resultados e discusso 39

III.2.1 Planejamento fatorial 39 III.2.2 Caracterizao da plataforma por MEV 40

III.2.3 Ativao e caracterizao do par redox 41

III.2.4 Atividade eletrocataltica da plataforma nanoestruturada 47

III.2.5 Estudos cronoamperomtricos 49

III.2.6 Caracterizao analtica 54

III.2.7 Estabilidade do sensor 60


xvii

III.2.8 Aplicao do sensor 60

III.2.9 Concluses 61

CAP. IV SENSOR PARA NADH 63

IV.1 Apresentao do captulo 65

IV.2 Resultados e discusso 67

IV.2.1 Caracterizao por MEV e imobilizao do mediador 67

IV.2.2 Ativao e caracterizao do par redox 69

IV.2.3 Atividade eletrocataltica da plataforma nanoestruturada 72

IV.2.4 Efeito da ativao dos grupos nitro do mediador 74

IV.2.5 Estudos cronoamperomtricos 75

IV.2.6 Estudos com eletrodo de disco rotatrio 77

IV.2.7 O grupo R-NO/R-NHOH como mediador redox 85

IV.2.8 Mecanismo da eletrooxidao de NADH na plataforma 86

IV.2.9 Caracterizao analtica 87

IV.2.10 Estabilidade do sensor 95

IV.2.11 Concluses 95

CAP. V CONCLUSES GERAIS 97 V.1 Concluses gerais 99

CAP. VI REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 101 VI.1 Referncias bibliogrficas 103

CAP. VII PERSPECTIVAS 113

VII.1 Perspectivas 115


xix

LISTA DE ABREVIATURAS

3,5-DNB cido 3,5-dinitrobenzoico 3,5-DNBSE (cido 3,5-dinitrobenzoico) succinimidil ster A rea do eletrodo Coeficiente de transferncia de eltrons

Ag/AgCl Eletrodo de referncia de prata/cloreto de prata

C Concentrao de Cys ou NADH (Eq. Cottrell e Eq.III.4) Ch Vetor de empacotamento

CNTs Nanotubos de carbono

Coef. Ang. Coeficiente angular

Cys L-cistena

D Coeficiente de difuso

E Ep - Eo

Ep Separao dos potenciais de pico

I Delta de corrente

ECS Eletrodo de calomelano saturado

ECV Eletrodo de carbono vtreo

EDC 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodimida DMF NN dimetil formamida

D.P.R. Desvio padro relativo

DTNB cido 5,5ditiobis2nitrobenzoico Eapl. Potencial aplicado

EDR Eletrodo de disco rotatrio

Ep Potencial de pico

Eo Potencial formal (Epa + Epc / 2) F Constante de Faraday


xx

FIA Anlise por injeo em fluxo HEPES [N(2hidroxietil)piperazinaN(cido 2etanosulfnico)] HOPG Grafite piroltico altamente ordenado

I Corrente

Icat Corrente cataltica na presena de Cys ou NADH

Id(L) Corrente limitada pelo transporte de massa

Ikin Corrente limitada cineticamente

IL Corrente na ausncia de Cys ou NADH

Ipa Corrente de pico andica

Ipc Corrente de pico catdica

KM Constante de Michaelis-Menten

kobs Constante cintica da reao mediador-analito

kkkks Constante de velocidade heterognea de transferncia de eltrons

MEV Microscpio eletrnico de varredura

Mox Mediador redox no estado oxidado

Mred Mediador redox no estado reduzido

MWCNTs Nanotubos de carbono de paredes mltiplas

n Nmero de eltrons

np Nmero de prtons

NADH -nicotinamida adenina dinucleotdeo NHS N-hidroxi succinimida

NPAus Nanopartculas de ouro

PBS Soluo tampo fosfato

PEG Polietilenoglicol

PEI Polietilenoimina

PIPES [PiperazinaNNbis[(cido 2etanosulfnico)]


xxi

Q Carga

R Constante universal do gases

SAM Monocamada auto-organizada

Sen-Cys Sensor para cistena

Sen-NADH Sensor para NADH

SWCNTs Nanotubos de carbono de paredes simples

Cobertura aparente de superfcie

t tempo

T Temperatura

p ngulo de piramidalizao TRIS [Tris(hidroximetil) amino-metano] TRITON-100 Polietilenoglicol p-(1, 1, 3, 3-tetrametilbutil)-fenil ter VC Voltametria cclica

VPD Voltametria de pulso diferencial

Velocidade de varredura

a Velocidade de varredura do processo andico

c Velocidade de varredura do processo catdico

Velocidade de rotao do eletrodo

Viscosidade cinemtica


xxiii

LISTA DE TABELAS

CAP. III. Sensor para Cys

Tabela III.1 Parmetros eletroqumicos e cinticos de alguns eletrodos modificados com alguns mediadores redox.

45

Tabela III.2 Parmetros e condies experimetais extrados a partir de estudos cronoamperomtricos para a eletrooxidao de Cys.

51

Tabela III.3 Caracterizao analtica do sensor destinado a deteco de Cys.

54

Tabela III.4 Mtodos eletroqumicos, condies experimentais e parmetros analticos para a determinao de Cys.

58

Tabela III.5 Determinao de Cys nas amostras. 61

CAP.IV. Sensor para NADH

Tabela IV.1 Comparao entre a corrente cataltica da NADH em funo do procedimento de ativao do 3,5-DNB ancorado na plataforma.

74

Tabela IV.2 Parmetros eletroqumicos e cinticos de alguns eletrodos modificados para eletrooxidao de NADH.

84

Tabela IV.3 Caracterizao analtica do sensor destinado a deteco de NADH.

88

Tabela IV.4 Mtodos eletroqumicos, condies experimentais e parmetros analticos para a determinao de NADH.

91


xxv

LISTA DE FIGURAS

I. INTRODUO E OBJETIVOS Figura I.1 Estrutura da L-cistena. 3

Figura I.2 Estrutura da NADH e NAD(P)H. 4 Figura I.3 Esquema de comparao entre processos de oxidao

eletroqumicos: (I) direto e (II) indireto ou mediado. Mox e Mred representam um par redox qualquer confinado na superfcie do eletrodo. (A) e (B) representam o analito no seu estado reduzido e oxidado, respectivamente.

7

Figura I.4 Esquema da estratgia eletroqumica utilizada para formao do par redox nitroso/hidroxilamina a partir do grupo nitro.

9

Figura I.5 Nanotubo de carbono de paredes simples (SWCNT) e mltiplas (MWCNT).

12

Figura I.6 (A) Coordenada dos vetores que definem o empacotamento dos nanotubos e (B) tipo de estruturas normalmente encontradas.

13

Figura I.7 Estrutura e hibridizao dos tomos de carbono para (a) diamante, (b) grafite, (c) fulereno e (d) nanotubo de carbono. Esquema mostrando os ngulos entre as ligaes e pi do tomo de carbono de geometria (e) trigonal planar e (f) tetradrica.

15

Figura I.8 Representao esquemtica das folhas do HOPG incluindo as indicaes dos planos basal e edge.

17

Figura I.9 Esquema ilustrando os tipos mais comuns de reaes covalentes nas extremidades/defeitos e nas paredes laterais dos CNTs.

19

Figura I.10 Representao esquemtica das modificaes no-covalentes nos CNTs. (A) Adsoro de polmeros, DNA ou protenas e (B) exemplos de algumas modificaes covalentes aps imobilizao de pirenos contendo grupos funcionais (GF).

21


xxvi

Figura I.11 Desenho esquemtico das rotas mais utilizadas para a imobilizao de NPAus por: (A) atrao eletrosttica, (B) adsoro de tiis e (C) adsoro de polictions.

23

II. PARTE EXPERIMENTAL

Figura II.1 Esquema ilustrando a clula eletroqumica com capacidade para trs eletrodos (ECV = eletrodo de carbono vtreo, ECS = eletrodo de calomelano saturado e Pt = eletrodo auxiliar) e um local para a entrada de N2.

30

III. SENSOR PARA CISTENA Figura III.1 Frmula estrutural do cido 5,5-ditio-2-nitrobenzoico

(DTNB). 37

Figura III.2 Diagrama de Pareto (A) e superfcies de resposta para PEI DTNB (B), MWCNTs PEI (C) e MWCNTs DTNB (D).

39

Figura III.3 Micrografias da superfcie nas etapas de construo do sensor: (A) MWCNTs, (B) +PEI, (C) +NPAu e (D) +DTNB. Grfico inserido: voltamograma cclico em H2SO4 0,5 mol L-1 e = 100 mV s-1.

41

Figura III.4 Processo de ativao do mediador redox obtido em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 e = 100 mV s-1.

42

Figura III.5 Voltamogramas cclicos do eletrodo modificado com o DTNB-ativado em vrias velocidades de varredura (10 600 mV s-1). (A) Grfico de Ip vs. . (B) Grfico de Laviron.

44

Figura III.6 Influncia do pH da soluo no potencial formal (A) e na corrente de pico (B) do mediador redox a partir de voltamogramas cclicos registrados em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 e = 100 mV s-1.

46

Figura III.7 Grfico de Ep versus pH. 47


xxvii

Figura III.8 Voltamogramas cclicos obtidos em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 na presena de Cys 1,010-4 mol L-1 em 2 mV s-1 () para (A) ECV, (B) +MWCNTs, (C) +PEI, (D) +NPAu, (E) +DTNB-ativado e (----) na ausncia de Cys, respectivamente.

48

Figura III.9 Cronoamperogramas obtidos em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0: branco (a), 50,0 (b) 75,0 (c), 100,0 (d) e 125,0 (e) mol L-1 de Cys.

49

Figura III.10 (A) Grfico de Icat / IL vs. t1/2 ; (B) grfico obtido a partir dos coeficientes angulares das retas obtidas em (A) vs. [Cys]1/2.

51

Figura III.11 (A) grfico I vs. t -1/2 e (B) grfico dos coeficientes angulares obtidos em (A) vs. [Cys]. As concentraes de Cys utilizadas so as mesmas dos cronoamperogramas mostrados na Figura III.8.

52

Figura III.12 Proposta para as reaes que ocorrem na superfcie da plataforma nanoestruturada.

53

Figura III.13 Estrutura, composio e ordem de resposta analtica dos tipos de eletrlitos de suporte estudados na caracterizao analtica do sensor.

55

Figura III.14 Resposta cronoamperomtrica observada aps adies sucessivas de uma soluo estoque de Cys em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 para: (A) ECV, (B) +MWCNTs, (C) +PEI, (D) +NPAu e (E) +DTNB-ativado.

56

Figura III.15 Curva analtica. 57

IV. SENSOR PARA NADH

Figura IV.1 Frmula estrutural do cido 3,5-dinitrobenzoico (3,5-DNB). 65 Figura IV.2 Micrografias obtidas da plataforma nanoestruturada

contendo MWCNTs/PEI para as magnificaes: (A) 1,000 e (B) 10,000.

67


xxviii

Figura IV.3 (A) Esquema de formao do intermedirio 3,5-DNBSE a partir de uma soluo contendo 3,5-DNB, EDC e NHS. (B) Mediador redox imobilizado na superfcie da plataforma.

68

Figura IV.4 Formao do par redox R-NO/R-NHOH em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 e = 50 mV s-1.

70

Figura IV.5 Voltamogramas cclicos do par R-NO/R-NHOH em vrias velocidades de varredura (10 800 mV s-1). (A) Grfico de Ip vs. . (B) Grfico de Laviron.

70

Figura IV.6 Voltamogramas cclicos obtidos em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 para o eletrodo modificado com o 3,5-DNB-ativado em diferentes pHs (5,0 8,0) e = 100 mV s-1 Inserido: Grfico de Eo vs pH.

72

Figura IV.7 Voltamogramas cclicos obtidos em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 e = 2 mV s-1 na presena de NADH 2,010-4 mol L-1 (___) para (A) ECV no modificado, (B) ECV modificado com MWCNTs/PEI, (C) ECV modificado com MWCNTs/PEI/3,5-DNB e (---) na ausncia de NADH, respectivamente.

73

Figura IV.8 Cronoamperogramas do eletrodo modificado com a plataforma contendo o 3,5-DNB-ativado em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 para: (a) branco, (b) 50, (c) 100, (d) 150 e (e) 200 mol L-1 de NADH. Grficos inserido: Icat / iL vs. t1/2 para 50 mol L-1 de NADH.

76

Figura IV.9 (A) Grfico de Q vs t1/2 utilizando as mesmas condies experimentais dos cronoamperogramas ilustrados na Figura IV.8 e (B) Grfico de Qt-1/2 versus [NADH].

77

Figura IV.10 Curvas de polarizao obtidas em diferentes velocidades de rotao do eletrodo para a oxidao eletrocataltica de 300 mol L-1 de NADH na superfcie da plataforma contendo o 3,5-DNB-ativado. Velocidades de rotao: (a) 5,20 ; (b) 7,67 ; (c) 10,89 ; (d) 16,40 ; (e) 23,72 ; (f) 34,00 e (g) 45,70 rad s-1. Estudos feitos em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0, = 2

mV s-1 e = 2,3810-10 mol cm2.

78


xxix

Figura IV.11 Grficos de Levich para a resposta eletrocataltica da plataforma nanoestruturada contendo o 3,5-DNB-ativado em diferentes concentraes de NADH. Estudos feitos em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0, = 2 mV s-1 e = 2,3810-10 mol cm2.

79

Figura IV.12 Grfico de Koutecky-Levich obtidos a partir da Figura IV.11. Estudos feitos em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0, = 2 mV s-1 e = 2,3810-10 mol cm2.

81

Figura IV.13 (A) Variao de kobs versus [NADH] para o eletrodo modificado com a plataforma contendo o 3,5-DNB-ativado e (B) variao de kobs-1 versus [NADH]. Estudos feitos em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0, = 2 mV s-1 e = 2,3810-10 mol cm2.

82

Figura IV.14 Proposta para as reaes que ocorrem na superfcie da plataforma na presena de NADH.

87

Figura IV.15 Resposta cronoamperomtrica observada aps adies sucessivas de uma soluo estoque de NADH em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 para: (A) ECV, (B) +MWCNTs/PEI, (C) +3,5-DNB-ativado.

89

Figura IV.16 Curva analtica. 90


xxxi

APRESENTAO Materiais com propriedades exaustivamente estudadas durante anos

podem apresentar ainda alguma melhora no seu desempenho? Esta pergunta s ter uma resposta negativa se no houver mais possibilidades de inovar e/ou estabelecer novas condies de trabalho para esses materiais. Certamente, do modo como a pesquisa cientfica avana no ser invivel agregar novas propriedades para os materiais j bem estabelecidos. Um exemplo claro de tal contribuio poder ser observado neste trabalho onde sero construdas plataformas nanoestruturadas sobre o eletrodo de carbono vtreo visando melhorar as propriedades interfaciais do eletrodo e, fornecer ainda, condies que possibilitem a imobilizao de mediadores redox. Para apresentar essa contribuio o presente trabalho foi dividido em captulos no sentido de abordar detalhadamente cada plataforma construda.

O primeiro captulo abordar uma pequena introduo sobre os analitos selecionados, caractersticas gerais dos nanomateriais utilizados, estratgias adotadas, alguns princpios tericos e por fim, a motivao e os objetivos deste trabalho.

No segundo captulo sero apresentados os reagentes e equipamentos empregados, rotas de preparao das plataformas e condies experimentais adotadas nos experimentos.

No terceiro captulo sero abordados os resultados referentes construo, caracterizao, estudo das propriedades eletrocatalticas e aplicao de uma plataforma nanoestruturada como sensor amperomtrico para a deteco de cistena. Visando construo de um biossensor, no quarto captulo sero apresentados os resultados relacionados com a caracterizao e estudo das propriedades eletrocatalticas de uma plataforma nanoestruturada para a deteco eletrocataltica de NADH.

Os ltimos captulos sero destinados s concluses gerais, referncias bibliogrficas e perspectivas futuras.


1

CAPTULO I

INTRODUO E OBJETIVOS


3

I.1 L-cistena (Cys) A cistena (Cys), Figura I.1, um dos aminocidos mais importantes e

tambm uma molcula bioativa de grande significncia. A sua participao no stio ativo de enzimas e em muitos outros peptdeos e protenas tambm j foi reportada [1]. Alm disso, este aminocido participa em um grande nmero de processos bioqumicos, os quais dependem diretamente da reatividade relacionada com o grupo tiol (R-SH). A cistena tambm largamente empregada na indstria farmacutica e alimentcia como antioxidante [2].

SH

O

OHNH2

Figura I.1. Estrutura da L-cistena.

A sua ao antioxidante est relacionada diretamente com o processo redox do grupo tiol [1]. Este grupo encontrado tambm em outras molculas bioativas de grande importncia como a glutationa, N-acetil-cistena e o cido lipoico. A funo R-SH o grupo mais facilmente oxidvel presente nas molculas citadas e, portanto, o processo redox dessas molculas pode ser descrito de maneira genrica pela Equao I.1 abaixo.

+++ H22eRSSR SHR2 (Eq. I.1)

Alm do processo descrito acima, a cistena pode estar envolvida na modulao da atividade de protenas atravs de eventos envolvendo reaes de complexao do grupo tiol com metais de transio (Zn2+, Mn2+ e Cu2+) [3].


4

I.2 NADH

Os nucleotdeos NADH (nicotinamida adenina dinucleotdeo) e NAD(P)H (grupo fosfato substituindo o grupo hidroxila) ilustrados na Figura I.2 esto onipresentes em quase todos os sistemas vivos e so necessrios para reaes de mais de 400 xido-redutases denominadas desidrogenases (250 dependentes do NADH e por volta de 150 do NAD(P)H). Este nmero representa 17 % de todas as enzimas classificadas e consequentemente, estes nucleotdeos so responsveis por mais reaes enzimticas do que qualquer outro cofator [4].

Figura I.2. Estrutura do NADH e NAD(P)H.

O papel desses cofatores no-proteicos em reaes catalisadas por enzimas servir como aceptor/doador de eltrons e com isso, acabam sendo cruciais no transporte de eltrons em sistemas biolgicos [5]. A reao de oxidao do NADH descrita pela Equao I.2 abaixo:

++++ H2eNADNADH (Eq. I.2)

O processo de oxidao envolve 2 eltrons e 1 prton e ocorre no anel da nicotinamida. Quando uma enzima ou outras molculas esto presentes no meio reacional o processo redox descrito pode ser mais complexo e apresentar uma


5

etapa limitante da velocidade. Sendo assim, visando construo de biossensores amperomtricos, os qumicos empregam tcnicas eletroqumicas para conhecer e/ou elucidar os sistemas dependentes do processo NADH/NAD+ [6].

I.3 Deteco de Cys e NADH

A deteco de cistena e NADH efetuada normalmente atravs de tcnicas espectrofotomtricas [7-9], cromatogrficas [10-12] e eletroqumicas[13-15]. As tcnicas espectrofotomtricas usualmente necessitam de inmeras solues e reagentes para o desempenho do mtodo. Zaia e col. desenvolveram um mtodo espectrofotomtrico para determinao de cistena monitorando o produto da reao da cistena com a p-benzoquinona em 500 nm [7]. Alm de necessitar de uma elevada concentrao de p-benzoquinona, o mtodo precisa de uma etapa de aquecimento/resfriamento para promover a reao de Michael, o qual aumenta muito o tempo de anlise. J a deteco de NADH por mtodos espectrofotomtricos visando trabalhos analticos no muito frequente, no entanto, o monitoramento da absoro do NADH em 340 nm normalmente utilizado para a avaliao da atividade de enzimas que so dependentes desse cofator [9].

Ao contrrio da espectrofotometria, os mtodos cromatogrficos apresentam elevado destaque no que se diz respeito determinao de inmeros componentes em uma amostra. Os mtodos cromatogrficos superam a falta de seletividade dos mtodos espectrofotomtricos, que se deve ao fato de que grande parte dos reagentes utilizados nas anlises reagem com qualquer grupo tiol presente na amostra. Desta forma, alguns trabalhos envolvendo cromatografia lquida de alta eficincia e gasosa j foram propostos para a determinao de cistena e outros antioxidantes [10-11]. Para o caso do NADH, os mtodos cromatogrficos surgiram principalmente para contribuir com o aspecto mecanstico das reaes envolvendo nucleotdeos em sistemas biolgicos. Myiatake e col. desenvolveram um mtodo cromatogrfico que possibilitou a


6

determinao de 7 nucleotdeos derivados da adenina. O principal objetivo do trabalho foi fornecer uma ferramenta poderosa para qumicos e bilogos estudarem os produtos enzimticos gerados por enzimas dependentes do NADH [12]. No entanto, as tcnicas cromatogrficas necessitam para sua operao de solventes ou gases de elevada pureza tornando o custo da anlise mais elevado quando comparado, por exemplo, com as tcnicas eletroqumicas.

Por sua vez, as tcnicas eletroqumicas apresentam limites de deteco mais apreciveis que as tcnicas espectrofotomtricas e um custo operacional menor do que as cromatogrficas. Entretanto, a cistena e o NADH se oxidam em altos sobrepotenciais em eletrodos convencionais como de carbono, platina ou ouro. Em eletrodos de carbono, este elevado sobrepotencial pode ser diminudo por um pr-tratamento, mas, estes eletrodos so rapidamente desativados [13].

Alm do sobrepotencial, outro problema relacionado com a eletrooxidao do NADH que o produto da oxidao (NAD+) pode adsorver na superfcie do eletrodo, dificultando a transferncia de carga e tornando o sensor inativo [14-15]. Recentemente, Damian e Omanovic publicaram um trabalho mostrando que o processo de adsoro do NAD+ sobre eletrodos de ouro altamente espontneo e ocorre tanto para superfcies com cargas positivas quanto negativas [16].

Por outro lado, no h relatos relacionados adsoro do produto de oxidao da Cys na superfcie de eletrodos como o de carbono vtreo ou platina mas, a aplicao de elevados sobrepotenciais compromete a seletividade do mtodo. Alm dos problemas relacionados com a seletividade, a sensibilidade na deteco da Cys e NADH nesses eletrodos muito baixa. Assim, para contornar os problemas frequentemente observados, muitos eletrodos convencionais tm sido modificados com mediadores redox para a deteco de NADH e Cys.

I.4 Mediadores redox

Os mediadores redox podem ser definidos como qualquer tipo de substncia que facilite a transferncia de eltrons entre a espcie de interesse e a superfcie do eletrodo [17]. A Figura I.3 ilustra um esquema da superfcie do


7

eletrodo que compara um processo de oxidao eletroqumico direto e um processo indireto ou mediado.

Figura I.3. Esquema de comparao entre processos de oxidao eletroqumicos: (I) direto e (II) indireto ou mediado. Mox e Mred representam um par redox qualquer confinado na superfcie do eletrodo. (A) e (B) representam o analito no seu estado reduzido e oxidado, respectivamente.

No processo direto, ilustrado na Figura I.3(I), o analito no seu estado reduzido se aproxima da superfcie do eletrodo por difuso e sofre oxidao na interface eletrodo-soluo. Desta forma, se (A) for cistena ou NADH o processo s ir ocorrer em elevados sobrepotenciais. No entanto, quando um mediador redox est presente na superfcie do eletrodo a converso (A) (B) ocorre atravs do mediador e no diretamente na superfcie do eletrodo (Figura I.3(II)) [17]. Neste caso, a forma oxidada do mediador (Mox) atua como um receptor de eltrons e oxida o analito. Essa reao ocorre com uma certa velocidade e pode


8

ser monitorada por cronoamperometria [18] e atravs de experimentos utilizando o eletrodo de disco rotatrio [19]. Aps a reao, o produto oxidado (B) e a forma reduzida do mediador (Mred) so formados. Assim, o sobrepotencial necessrio que deve ser aplicado para que a reao de oxidao de (A) (B) acontea agora modulado pelo potencial formal do par redox do mediador que est confinado na superfcie do eletrodo [20].

Em alguns casos, mesmo na presena de um mediador redox, no ocorre nenhum deslocamento catdico do potencial de oxidao dos analitos, mas a corrente associada ao processo maior e promove, portanto, um ganho de sensibilidade [21].

E qual propriedade do mediador redox deve ser empregada? A qu diminua o potencial de oxidao ou a qu aumente a sensibilidade? A resposta simples. Ambas. As caractersticas desejveis de um mediador redox so: (i) transferncia eletrnica rpida entre mediador-analito e mediador-eletrodo, (ii) potencial formal em baixos sobrepotenciais para evitar a oxidao de possveis espcies interferentes e (iii) estabilidade das formas oxidada e reduzida [22].

As caractersticas mencionadas j foram exploradas empregando vrios tipos de mediadores redox destinados para detectar Cys ou NADH como: quinonas [23-24], complexos de metais de transio [25-26], nanopartculas metlicas [27-28], corantes [29-30] e etc. No entanto, molculas que apresentam o grupo funcional nitro (R-NO2) tm se destacado bastante nos ltimos anos como estratgia para a formao de pares redox que se enquadram nas caractersticas desejveis para um mediador.

O grupo nitro, no seu estado oxidado, no tem atividade eletrocataltica para a oxidao de tiis ou NADH [31]. Por outro lado, quando reduzido eletroquimicamente in situ, o grupo nitro transformado no grupo hidroxilamina. A hidroxilamina formada pode, assim, ser oxidada para nitroso (par R-NO/R-NHOH), atravs de um processo redox envolvendo 2e-/2H+, resultando em um par redox estvel confinado na superfcie do eletrodo, Figura I.4.


9

Figura I.4. Esquema da estratgia eletroqumica utilizada para formao do par redox nitroso/hidroxilamina a partir do grupo nitro.

Uma vez estabelecida a molcula com o seu o par redox, a questo que deve ser respondida : como ser feita a imobilizao do mediador na superfcie do eletrodo? Para efetuar o processo de imobilizao a poro R ilustrada na Figura I.4, que representa o restante da molcula do mediador, normalmente utilizada para tal processo [32]. No entanto, essa poro R precisa ser combinada com eletrodos convencionais (ouro, platina e carbono vtreo), que basicamente so materiais que apresentam poucos grupos funcionais. Enquanto que os eletrodos de ouro podem ser facilmente funcionalizados empregando monocamadas auto-organizadas de tiis, a criao de grupos funcionais nos eletrodos de carbono muito mais difcil e exige condies drsticas para a funcionalizao, incluindo: aquecimento sob atmosfera rica em oxignio [33], aquecimento em meio cido [34] e tratamento eletroqumico em meio cido [35,36] ou alcalino [37]. Estes mtodos proporcionam a formao de cetonas, cidos carboxlicos, quinonas e de grupos hidroxila na superfcie [38-39]. Por outro lado, a


10

quantidade e a natureza desses grupos so muito difceis de serem controlados. Por esta razo, na modificao da superfcie de carbono, tratamentos oxidativos so raramente empregados atualmente [40].

Assim, buscando contornar este tipo de problema, a combinao da poro R do mediador juntamente com materiais nanoestruturados imobilizados sobre eletrodos convencionais uma abordagem relativamente recente e traz propriedades interfaciais interessantes [41-42]. Essas nanoestruturas podem funcionar como uma plataforma para receber os mais variados tipos de mediadores redox e enzimas [43].

I.5 Nanoestruturas

Nanoestruturas se referem a materiais que apresentam escala de tamanho na ordem nanomtrica. Uma maneira de classificar as nanoestruturas baseada nas regies em que os eltrons podem se mover livremente, que dependem basicamente do formato da nanoestrutura (tubos, partculas, cristais e etc) [44]. De fato, o tamanho e a forma dessas nanoestruturas podem agregar novas propriedades e aplicaes que impulsionam o campo da nanocincia e nanotecnologia. Assim, o estudo de materiais nanoestruturados uma rea ativa de pesquisa da qumica, fsica, engenharia de materiais e engenharia biomdica [45].

Nesse sentido, vrias propriedades foram consideradas dependentes do tamanho de partcula [44]. Materiais formados a partir de partculas nanomtricas possuem caractersticas incomuns, levando a novos fenmenos que so realmente surpreendentes. Por exemplo, Gerberich e col. apresentaram em seu trabalho que nanopartculas individuais de silcio (~40 nm), em temperatura ambiente, possuem dureza quatro vezes maior quando comparadas com agregados formados a partir do mesmo elemento [45]. J em relao s propriedades de nanofios de ZnO, Chen e col. [46] observaram que a elasticidade destes nanofios aumenta medida que o dimetro do fio reduzido. Outro enfoque, voltado construo de cermicas mais resistentes, pode ter uma


11

contribuio de forma direta da nanotecnologia. Blocos de cermica construdos a partir de gros nanomtricos podem ser moldados em peas de motor ou de outras formas teis sem quebra durante o processo [44]. Nanofibras formadas a partir de carbono apresentam uma energia resistente quebra de 570 J/g. O valor apresentado por si s no to impactante, mas quando comparado com um material conhecido torna-se notvel. Por exemplo, as nanofibras de carbono so 17 vezes mais duras que as fibras de Kevlar utilizadas em coletes prova de balas [47]. As fibras tm tambm o dobro da rigidez e 20 vezes a dureza do mesmo peso de um fio de ao. Como msculos artificiais, fibras de nanotubos de carbono so cerca de 100 vezes mais fortes do que o msculo natural com o mesmo dimetro [48].

Fica claro, a partir dos exemplos apresentados, que a nanotecnologia participa de forma significativa na descoberta de novas propriedades para os materiais. Dentre os materiais apresentados destacam-se as nanoestruturas de carbono como material base para a construo de plataformas.

I.6 Nanotubos de carbono

I.6.1 Carbono

O carbono tem se revelado um material muito prtico e amplamente utilizado para a confeco de eletrodos devido s suas timas propriedades para aplicaes eletroqumicas. Eletrodos de carbono fornecem, de maneira geral, boa condutividade eltrica, elevada estabilidade trmica e qumica, uma ampla janela de potencial e em muitos casos atividade eletrocataltica. Alm disso, eles so conhecidos como materiais versteis e de fcil manuseio. Assim, o carbono na forma de carbono vtreo, fibra de carbono, grafite em p, grafite piroltico e grafite piroltico altamente ordenado, tem desempenhado por muito tempo um importante papel no desenvolvimento de eletrodos slidos [49-50]. No entanto, a descoberta de um novo altropo do carbono sob formato de nanotubos [51] impulsionou de forma indita aplicaes na eletroqumica e eletroanaltica [52,53].


12

I.6.2 Sntese, estrutura e propriedades eletrnicas

Os nanotubos de carbono so longos cilindros de tomos de carbono ligados covalentemente. Esses nanomateriais so usualmente sintetizados por 3 diferentes mtodos: descarga em arco eltrico, ablao por laser e deposio qumica de vapor [54]. Descarga em arco eltrico e ablao por laser baseiam-se na condensao de tomos de carbono gerados atravs da evaporao de amostras de carbono slido. Esses mtodos possuem a desvantagem de operar em elevadas temperaturas, prximo do ponto de fuso do grafite. No entanto, ambos os mtodos produzem CNTs de alta qualidade e com poucos defeitos. O terceiro mtodo, baseado na deposio qumica de vapor, pode ser operado em temperaturas consideravelmente menores, mas com a desvantagem de formar nanotubos com mais defeitos quando comparado com as metodologias anteriores. Neste caso, a formao dos CNTs ocorre como resultado da decomposio trmica de uma amostra de carbono lquida ou gasosa sobre a superfcie de um catalisador (nanopartculas de Fe, Co ou Ni) [55]. A Figura I.5 ilustra os dois tipos de nanotubos de carbono mais sintetizados: nanotubos de carbono de paredes simples (do ingls SWCNTs) e nanotubos de carbono de paredes mltiplas (do ingls MWCNTs).

Figura I.5. Nanotubos de carbono de paredes simples (SWCNT) e mltiplas (MWCNT).

Nem sempre as extremidades dos tubos esto abertas assim como ilustrado na Figura I.5. De fato, o fechamento das extremidades nos CNTs pode ser facilmente racionalizada considerando a presena de ligaes pendentes com


13

alta energia nos limites dos tubos. A energia total de um certo nmero de tomos de carbono na camada de grafite pode ser reduzida atravs da formao de uma estrutura fechada que elimina ligaes pendentes, mesmo custa do aumento da energia de deformao das ligaes [56].

A maneira com que a folha de grafite embrulhada para formar o tubo pode ser descrita pelo vetor Ch = na1 + ma2 (n , m) que conecta stios cristalograficamente equivalentes de uma folha de grafite bidimensional, onde a1 e a2 so os vetores base da folha de grafite (Figura I.6(A)).

Figura I.6. (A) Coordenada dos vetores que definem o empacotamento dos nanotubos e (B) tipo de estruturas normalmente encontradas.

A Figura I.6(B) mostra os trs diferentes tipos de estruturas dos nanotubos normalmente encontrados segundo as direes definadas pelo vetor de empacotamento Ch, brao de cadeira (n = m), quiral (n , m) e zigue-zague (m = 0). As diferentes estruturas so oriundas de uma mesma folha de grafite, no entanto, podem apresentar propriedades eletrnicas com comportamento metlico ou semicondutor [57]. Alm do tipo de estrutura, o dimetro dos nanotubos tambm afeta as propriedades eletrnicas. O bandgap de nanotubos semicondutores pode ser aproximado pela relao Eg = 0,8 eV / d, onde d o dimetro do tubo [58,59]. Desta forma, quanto maior o dimetro do CNT, maior a tendncia para um comportamento metlico. Alm do mais, os CNTs so capazes de conduzir


14

densidades de corrente muito grandes. Por exemplo, CNTs tm demonstrado suportar densidades de corrente maiores que 109 A / cm2, um valor que 2 - 3 ordens de magnitude maior que alguns metais como Al ou Cu [60].

Assim, as propriedades eletrnicas mencionadas podem ser atribudas principalmente devido ao formato desse material. Apesar dos CNTs estarem muito relacionados com as placas de grafite, a arquitetura do material sob formato de tubo agrega propriedades nicas que fazem com que os CNTs sejam diferentes do grafite. Alm das propriedades eletrnicas, as propriedades qumicas tambm so alteradas devido a forma do material [61].

I.6.3 Propriedades qumicas

Um bom entendimento das propriedades qumicas dos nanotubos de carbono indispensvel para aumentar a eficincia de dispositivos prticos e tambm para compreender processos fundamentais. A Figura I.7(a d) mostra as estruturas e hibridizaes dos tomos de carbono do diamante, grafite, fulereno e dos nanotubos de carbono. Embora esse materiais sejam feitos a partir do mesmo elemento bsico, a reatividade qumica substancialmente diferente entre eles. A reatividade qumica maior para o CNT do que para uma folha de grafite, mas menor quando comparada com o fulereno [61]. Tal comportamento provavelmente est relacionado com a curvatura da superfcie da estrutura de carbono. A reatividade dos fulerenos devido principalmente alta tenso nas ligaes provocada pela geometria esfrica do material. Essa tenso pode ser avaliada atravs da frmula p = pi - 90o onde pi o ngulo compreendido entre um orbital e um orbital pi em um mesmo tomo de carbono e p o ngulo de piramidalizao. Para um tomo de carbono hibridizado sp2 (trigonal planar), a planaridade altamente preferida e isto implica em um ngulo de piramidalizao de p = 0o, ao passo que um tomo de carbono hibridizado sp3 (tetradrico) requer aproximadamente p = 19,5, assim como ilustrado na Figura I.7(e) e (f). J os tomos de carbono no fulereno C60 apresentam p = 11,6. A converso qumica de qualquer tomo trivalente no C60 para um tomo tetravalente alivia a tenso no


15

ponto em que foi efetuada a converso [61]. Assim, reaes que servem para saturar os tomos de carbono so aceleradas devido ao alvio da tenso e, com isso, modificaes no fulereno so altamente favorecidas [62].

Figura I.7. Estrutura e hibridizao dos tomos de carbono para (a) diamante, (b) grafite, (c) fulereno e (d) nanotubo de carbono. Esquema mostrando os ngulos entre as ligaes e pi do tomo de carbono de geometria (e) trigonal planar e (f) tetradrica.

No caso dos CNTs, a curvatura dos tubos muito menor do que para os fulerenos e, desta forma, o alvio da tenso nas paredes laterais no oferece a mesma fora motriz para a reatividade qumica que vivida pelos fulerenos. No caso do SWCNT, o ngulo de piramidalizao de p = 3,01, menor do que o ngulo obtido para o fulereno C60. Consequentemente, a tenso local por tomo


16

de carbono devido curvatura menor para o SWCNT (0,5 kcal / mol) do que para o fulereno (8,1 kcal / mol) [63]. Ao contrrio das paredes laterais, a reatividade no final dos tubos muito maior, principalmente quando essas extremidades estiverem fechadas. Devido presena de anis de 5 ou 7 tomos de carbono [64], as extremidades fechadas apresentam uma reatividade similar ao do fulereno, assim como demonstrado anteriormente. Por exemplo, quando os nanotubos de carbono so submetidos a um tratamento com cidos e oxidantes fortes so gerados principalmente grupos funcionais cidos carboxlicos e cetonas nas extremidades [64]. Uma vez formados, esses grupos podem permitir a imobilizao de biomolculas e tambm influenciar nas propriedades eletroqumicas.

I.6.4 Propriedades eletroqumicas

De maneira geral, a performance eletroqumica de materiais de carbono basicamente determinada pelas propriedades eletrnicas, pela sua estrutura e qumica superficial (grupos funcionais terminais ou processos de adsoro). Tais caractersticas podero afetar a cintica do eletrodo, janela eletroqumica de potencial, corrente capacitiva e a interao com molculas em soluo [56].

Algumas das propriedades eletroqumicas dos nanotubos de carbono tm sido relacionadas com as propriedades do grafite piroltico altamente ordenado (do ingls HOPG). J sabido que a condutividade eletrnica no plano paralelo das camadas de grafite (plano basal) cerca de 4 ordens de magnitude maior do que no plano perpendicular (plano edge) [49]. O plano basal do HOPG, ilustrado na Figura I.8, ordenado e quimicamente mais inerte do que o plano edge. Tal anisotropia tambm influencia o comportamento eletroqumico do material. J foi demonstrado que o plano basal exibe uma cintica de transferncia eletrnica lenta enquanto que os stios localizados no plano edge favorecem o processo redox [65].


17

Figura I.8. Representao esquemtica das folhas do HOPG incluindo as indicaes dos planos basal e edge.

As extremidades abertas dos CNTs tm sido relacionadas com o plano edge do HOPG, ao passo que as paredes do tubo devem apresentar propriedades eletroqumicas similares ao do plano basal do mesmo material [65-67]. Grupos funcionais presentes nas extremidades dos tubos podem desempenhar um papel importante nas propriedades eletrocatalticas, aumentando a cintica de transferncia de eltrons ou contribuindo em processos de adsoro.

A adsoro outro fator relevante que afeta a performance eletroqumica dos CNTs. O processo de adsoro pode aumentar ou diminuir fortemente a cintica de transferncia de eltrons e a atividade eletrocataltica. Um dos aspectos negativos pode ser observado quando a adsoro de espcies (impurezas ou produtos de reaes redox) diminui drasticamente a performance eletroqumica dos eletrodos. J um dos aspectos positivos se refere adsoro de metaloprotenas. Os CNTs facilitam a troca de eltrons entre o centro redox da protena e a superfcie do eletrodo, permitindo assim que a atividade eletrocataltica seja monitorada [50].

Outra propriedade dos CNTs que eles apresentam uma elevada rea superficial que traz benefcios no s para aumentar as correntes eletroqumicas das espcies eletroativas, mas tambm permitir que enzimas, antgenos, anticorpos e mediadores redox sejam imobilizados em sua estrutura. Nesse sentido, inmeras estratgias tm sido adotadas para permitir que tais processos ocorram [68].


18

I.6.5 Funcionalizao dos nanotubos

A modificao dos CNTs surge como motivao de extremo interesse porque abre uma gama de possibilidades para desenvolver novos dispositivos que unem as propriedades dos CNTs juntamente com as versatilidades geradas pelo processo de funcionalizao. Alm disso, a modificao qumica tambm ajuda contornar um dos problemas encontrados na manipulao de CNTs que a dificuldade de dispersar os nanotubos, principalmente em meio aquoso. No sentido de facilitar a disperso em gua e principalmente possibilitar a unio de novas propriedades destacam-se as modificaes covalentes e no-covalentes nos CNTs [68].

I.6.5.1 Modificao covalente

Assim como mencionado no tpico 1.6.3, as extremidades dos CNTs so quimicamente mais reativas do que as paredes laterais. Quando as extremidades dos tubos esto abertas, as ligaes pendentes tornam-se muitos reativas na presena de gua ou oxignio e normalmente esta regio rica em grupos funcionais derivados do tomo de oxignio (quinonas, cetonas e cidos carboxlicos). Adicionalmente, as extremidades fechadas e defeitos na estrutura dos CNTs podem ser funcionalizadas tratando os CNTs com cidos e oxidantes fortes (HNO3, H2SO4 e H2O2) [69]. Aps o tratamento, dentre os grupos funcionais obtidos, um de interesse especial o grupo R-COOH. Os resduos de R-COOH nas extremidades tornam-se stios teis para a intercalao de outras molculas atravs da formao de ligaes amida ou ster [69,70].

O esquema ilustrado na Figura I.9 mostra as reaes de modificao covalente empregadas para modificar as extremidades e as paredes laterais dos nanotubos de carbono. Na Figura I.9(A) podem ser observadas as estratgias frequentemente utilizadas para a modificao das extremidades/defeitos dos CNTs explorando a versatilidade dos grupos R-COOH. A formao de uma ligao amida pode ser conduzida na presena de uma amina aps ativao dos grupos


19

R-COOH com 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodimida (EDC) e N-hidroxi succinimida (NHS) ou com cloreto de tionila (SOCl2). A ativao do grupo R-COOH com SOCl2 permite ainda que molculas contendo o grupo funcional lcool (R-OH) sejam tambm conectadas nos CNTs [68].

Figura I.9. Esquema ilustrando os tipos mais comuns de reaes covalentes nas extremidades/defeitos e nas paredes laterais dos CNTs.

Por outro lado, a reatividade das paredes laterais dos CNTs aumenta com a curvatura do tubo devido principalmente ao aumento do ngulo de piramidalizao [61]. A reatividade da superfcie , portanto, reforada pela exposio acentuada dos orbitais hbridos que ficam na parte externa do tubo, favorecendo a sobreposio de orbitais com reagentes que se aproximam da superfcie [71].

Desta forma, a Figura I.9(B) ilustra alguns exemplos de reaes que podem ser utilizadas empregando as paredes laterais dos nanotubos de carbono. Molculas derivadas do aminobenzeno podem ser convertidas em sais de diaznio e posteriormente ancoradas nos CNTs [72]. J quando aquecidos na


20

presena de F2, so formadas ligaes C F nas paredes laterais dos CNTs. Esse tipo de intermedirio altamente interessante sntese orgnica, possibilitando reaes com reagentes de Grignard e tambm com ons alcxido [73]. A ligao covalente dos CNTs com polmeros ganha destaque, principalmente, por causa da longa cadeia polimrica que ajuda a dispersar os nanotubos em uma gama de solventes orgnicos ou aquosos. Uma das rotas utiliza os monmeros juntamente com os CNTs na sntese, com isso, o polmero conectado covalentemente e polimerizado sobre o nanomaterial. Dessa forma, j foram reportados trabalhos com polivinilpiridina, poliestirenossulfonato (Figura I.9(B)), poli(metilmetacrilato) e polianilina [74].

As modificaes covalentes apresentadas resultam em coneces nanotubo-molcula alvo efetivas e muito estveis. No entanto, alguns pontos negativos aparecem tona nesse tipo de modificao. A grande densidade de stios reativos ou pontos funcionalizados covalentemente podem trazer uma perda da rede de conjugao e uma degradao das propriedades mecnicas e eletrnicas do CNTs [57]. Assim, as modificaes no-covalentes ganham destaque na funcionalizao de CNTs.

I.6.5.2 Modificao no-covalente

A grande rea superficial constituda por um sistema de eltrons deslocalizados e com carter hidrofbico tornam os CNTs superfcies ideais para interaes no-covalentes com molculas via interaes de Van de Waals, pi-pi ou hidrofbicas [74].

Existem muitos exemplos na literatura de modificaes no-covalentes nos CNTs com agentes capazes de promover o desprendimento dos CNTs e faz-los mais solveis e biocompatveis. Exemplos de tais agentes so alguns surfactantes como dodecilsulfato de sdio [75] ou dodecilbenzeno sulfonato de sdio [76]. Outros exemplos esto ilustrados na Figura I.10 e incluem modificaes com protenas (Figura I.10(A)), polmeros (polivinilpirrolidona [77], poliestirenosulfonato de sdio [78], DNA [79], polissacardeos [80] e etc.) e


21

compostos poliaromticos como os pirenos modificados com grupos funcionais (Figura I.10(B)) que envolvem os CNTs servindo como uma espcie de casaco, de forma que as pores hidrofbicas interagem com a parede do tubo enquanto que as pores hidroflicas interagem com o meio aquoso [56].

Figura I.10. Representao esquemtica das modificaes no-covalentes nos CNTs. (A) Adsoro de polmeros, DNA ou protenas e (B) exemplos de algumas modificaes covalentes aps imobilizao de pirenos contendo grupos funcionais (GF).

Em alguns casos, polmeros como o PEG e Triton-100 no so utilizados para criar pontos que possibilitam a imobilizao de molculas, pelo contrrio, so utilizados para evitar ligaes no-especficas de protenas quando se visa o desenvolvimento de biossensores [81].

Em decorrncia do processo de funcionalizao, tanto covalente quanto no-covalente, existe ainda a possibilidade da combinao com outros


22

nanomaterias a fim de tentar trazer novas propriedades e/ou fornecer um ambiente favorvel que possibilite a imobilizao de outros tipos de mediadores redox ou biomolculas.

I.7 Nanopartculas de ouro

Nanopartculas de ouro (NPAus) possuem propriedades pticas e eletrnicas que esto relacionadas com seu tamanho e formato e so, portanto, de grande interesse em muitas aplicaes nanotecnolgicas [82]. Apesar do crescimento recente buscando novas aplicaes das NPAus, esse nanomaterial j se encontra disponvel por mais de 50 anos. A sntese de NPAus estabilizadas por ons citrato foi reportada em 1950 por Turkevich e col. [83] e em 1973 por Frens [84]. Os agentes estabilizantes, alm de permitir o uso das NPAus por semanas [85], servem como ponto de partida quando se deseja imobilizar esse nanomaterial em uma determinada superfcie.

A Figura I.11 mostra um desenho esquemtico dos tipos de rotas mais utilizadas visando ampliar as aplicaes das NPAus. Uma das maneiras mais simples de se modificar uma superfcie utiliza as propriedades eletrostticas como fora motriz para que o processo ocorra. A Figura I.11(A) ilustra um exemplo de uma nanopartcula carregada negativamente atrada para uma superfcie com carga oposta. Este tipo de procedimento permite que inmeros materiais possam ser modificados com as NPAus, no entanto, algumas superfcies precisam de um pr-tratamento. O pr-tretamento pode incluir desde a aplicao de um elevado sobrepotencial positivo quando o material em questo o eletrodo de carbono vtreo [86] ou ainda, em outros casos, utilizar a qumica de superfcie para criar grupos funcionais que possam ser protonados [87].

Uma segunda abordagem, e talvez a mais elegante, utiliza o modelo de Pearson [88] como inspirao para a funcionalizao de nanopartculas de ouro. A tabela construda por Pearson prev que o grupo tiol (R-SH) deve interagir fortemente com ouro metlico e, desta forma, as NPAus podem ser


23

funcionalizadas e estabilizadas com inmeras molculas derivadas do tomo de enxofre.

Figura I.11. Desenho esquemtico das rotas mais utilizadas para a imobilizao de NPAus por: (A) atrao eletrosttica, (B) adsoro de tiis e (C) adsoro de polictions.

A Figura I.11(B) ilustra de forma simplificada a substituio de ons citrato por alcanotiis, exemplo na qual foi desenvolvido primeiramente em 1993 por Giersig e Mulvaney [89]. Atualmente, a formao de monocamadas auto-organizadas (do ingls SAMs) utilizando tiis ou dissulfetos permite a criao dos mais variados tipos de funcionalidades alterando somente o grupo terminal da molcula [90,91].

Assim como na utilizao de tiis, outro exemplo que permite a funcionalizao e estabilizao de nanopartculas de ouro se refere ao emprego de polmeros. Existem basicamente duas maneiras de se obter nanopartculas modificadas com polmeros. A primeira consiste na sntese das NPAus na


24

presena da rede polimrica [92] e a segunda, menos empregada, envolve a polimerizao ao redor das nanopartculas [93].

I.8 Motivao

O presente trabalho teve como principal motivao unir as propriedades de mediadores redox derivados do grupo nitro juntamente com plataformas nanoestruturadas formadas base de nanotubos de carbono. Nesse sentido busca-se o desenvolvimento de sensores amperomtricos com elevada sensibilidade e atividade eletrocataltica, e principalmente, aplicando sobrepotenciais baixos. Para possibilitar a unio de propriedades, molculas foram selecionadas cuidadosamente para apresentar trs caractersticas marcantes: (I) presena de um grupo funcional que possibilite a imobilizao na interface da plataforma; (II) grupo funcional retirador de eltrons ligado diretamente no anel aromtico do mediador; (III) grupo nitro, que serve como precursor para a formao in situ do par nitroso-hidroxilamina.

I.9 Objetivos

I.9.1 Geral

Este trabalho de pesquisa visa o desenvolvimento de sensores amperomtricos empregando mediadores redox derivados do grupo nitro imobilizados sobre plataformas nanoestruturadas.


25

I.9.2 Especficos

* Construir dois sensores amperomtricos, um destinado para a deteco de NADH e outro para a Cys.

* Caracterizar as plataformas utilizando o MEV e ensaios eletroqumicos.

* Obter as constantes cinticas das reaes interfaciais.

* Fazer a caracterizao analtica dos sensores.

* Aplicar os sensores desenvolvidos.


27

CAPTULO II

PARTE EXPERIMENTAL


29

II.1 Parte experimental

II.1.2 Reagentes e solues A L-cistena, NADH, MWCNTs (dimetro interno 2-10 nm e comprimento

0,1 20 m), cido 5,5ditiobis2nitrobenzoico (DTNB), cido ctrico, PIPES [piperazinaNNbis [(cido 2etanosulfnico)], HEPES [N(2hidroxietil)piperazinaN(cido 2etanosulfnico)], TRIS [tris(hidroximetil) amino-metano], nanopartculas de ouro (10 nm, concentrao ~0,05% em citrato como estabilizante), polietilenoimina (PEI), cido 3,5-dinitrobenzoico (3,5-DNB), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodimida (EDC), catecol, dopamina, L-Dopa, epinefrina, cido clorognico, cido cafico, N-hidroxi succinimida (NHS), ferrocianeto e ferricianeto de potssio foram obtidos da Sigma, St. Louis, USA. NN dimetil formamida (DMF), dihidrogenofosfato de sdio (NaH2PO4), hidrogeno fosfato de sdio (Na2HPO4), cloreto de potssio (KCl) e etanol foram obtidos da Synth, So Paulo, Brasil.

As solues foram preparadas usando gua purificada em um sistema Milli-Q Millipore e os valores de pH das solues tampo foram ajustados com um pHmetro Corning, modelo 350.

II.1.3 Equipamentos

A deteco voltamtrica e cronoamperomtrica foi obtida empregando um potenciostato modelo PGSTAT-30 da Autolab Eco Chemie (Utrecht, Holanda) conectado um computador utilizando um programa computacional GPES 4.9. Uma clula eletroqumica com capacidade para trs eletrodos foi utilizada com um eletrodo de calomelano saturado como referncia, um fio de platina como eletrodo auxiliar e o eletrodo de trabalho de carbono vtreo (Figura II.1). Para homogeneizar a soluo do eletrlito de suporte aps a adio do analitos (Cys ou NADH) foi utilizado um agitador magntico da marca Corning com 6 modos de velocidades. A clula eletroqumica possui tambm um local para entrada de N2, que serve para


30

remover o oxignio dissolvido. Os experimentos utilizando o eletrodo de disco rotatrio foram conduzidos

por um equipamento de controle de rotao da Autolab com amperagem mxima de 500 mA acoplado ao ECV.

Para o preparo das disperses e limpeza do ECV foi utilizado um banho de ultra-som da marca UNIQUE modelo USC-1400.

Uma balana analtica Sartorius BP 211D, de 5 casas decimais, foi utilizada para pesar os reagentes.

Figura II.1. Esquema ilustrando a clula eletroqumica com capacidade para trs eletrodos (ECV = eletrodo de carbono vtreo (forma de disco), ECS = eletrodo de calomelano saturado e Pt = eletrodo auxiliar) e um local para a entrada de N2.

II.1.4 Limpeza do eletrodo de trabalho

O procedimento geral do pr-tratamento do eletrodo de carbono vtreo (ECV) descrito a seguir. Antes das modificaes, o eletrodo de trabalho foi polido com uma pasta de alumina de 1,0, 0,5 e 0,3 m para obter uma superfcie


31

espelhada e ento o eletrodo foi lavado com gua destilada. O ECV foi levado ao ultra-som em uma soluo 1:1 (v/v) etanol/gua por 5 minutos para remover possveis partculas de alumina adsorvidas na superfcie do eletrodo.

II.1.5 Sensor para Cys (Sen-Cys) Inicialmente, 1,0 mg de MWCNTs foram dispersos em 5 mL de DMF

utilizando um banho de ultra-som. As solues de PEI (0,1 4%) foram preparadas dissolvendo o polmero em gua deionizada. A soluo contendo as nanopartculas de ouro foram utilizadas assim como foram recebidas, sem nenhuma diluio.

No ECV limpo de 0,2 cm2 foram adicionadas alquotas da disperso dos MWCNTs (5 30 L) e em seguida a superfcie foi seca sob atmosfera de nitrognio. Aps uma lavagem com gua, o eletrodo foi imerso em uma soluo de PEI (0,1 4%) por 1 h e ento lavado com gua novamente. Ento, o eletrodo foi imerso na soluo de nanopartculas de ouro por mais 1 h a 4oC e em seguida a superfcie foi lavada novamente com gua. Finalmente, a plataforma nanoestruturada foi imersa em uma soluo etanlica (5 50 mmol L-1) do cido 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB) por 15 h e aps este perodo a superfcie foi lavada com etanol e depois gua.

As espcies hidroxilamina foram eletrogeradas in situ a partir do DTNB aps ciclar o potencial entre 0,1 e -0,7 V versus ECS. Dois ciclos em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 com velocidade de varredura de 0,1 V s-1 foram suficientes para gerar o grupo hidroxilamina.

A rea eletroativa do eletrodo modificado foi obtida utilizando 1 mmol L-1 Fe[(CN)6]3/4 em 0,1 mol L-1 KCl empregando a equao de Randles Sevcik [19]. Assim, a rea eletroativa foi de aproximadamente 0,640 cm2.


32

II.1.5.1 Planejamento fatorial Para otimizar a composio da interface do Sen-CyS um planejamento

fatorial completo em duplicata e a matriz de Doehlert foram utilizados. A influncia da quantidade dos MWCNTs (5 30 L), PEI (0,1 4,0 %) e DTNB (5 50 mmol L-1) foram examinadas utilizando um planejamento 23 completo. A matriz de Doehlert foi empregada para otimizar os efeitos mais importantes. Os experimentos foram feitos em duplicata, com exceo para o ponto central onde foram realizadas 3 replicatas. A partir destes resultados foi obtida a superfcie de resposta gerada pelo programa computacional STATISTICA. Todos os experimentos foram realizados em ordem aleatria monitorando a corrente de pico andica dos voltamogramas cclicos em tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 e = 100 mV s-1.

II.1.6 Sensor para NADH (Sen-NADH) A disperso dos MWCNTs com o PEI foi obtida da seguinte forma: 1,0 mg

de MWCNT foi misturado com 1,0 mL de uma soluo de PEI 1,0 mg mL-1 e em seguida a mistura foi colocada no ultra-som por 15 min assim como reportado por Rubanes e Rivas [94].

No ECV limpo com rea geomtrica de 0,07 cm2 foi adicionado 5 L da disperso MWCNT/PEI e ento a superfcie foi seca sob atmosfera de nitrognio. Aps a montagem da plataforma, o eletrodo foi imerso em 5 mL de etanol contendo 4,6 mg de NHS, 4,8 mg de EDC e 10,0 mg do mediador redox (cido 3,5-DNB) por 1,5 h. O tempo reacional de imobilizao do mediador redox foi determinado fazendo medidas da corrente de pico andica (Ipa) do par redox R-NO/R-NHOH a cada 30 minutos em um perodo total de 3,0 h.

As espcies hidroxilamina foram eletrogeradas in situ a partir do cido 3,5-DNB aps ciclar o potencial entre 0,15 e -0,55 V versus ECS. Dois ciclos em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 com velocidade de varredura de 0,05 V s-1 foram suficientes para gerar o grupo hidroxilamina.


33

A rea eletroativa do eletrodo modificado foi estimada assim como reportado anteriormente [95] utilizando 1 mmol L-1 Fe[(CN)6]3/4 em 0,1 mol L-1 KCl empregando a teoria de Randles Sevcik [19]. Assim, a rea eletroativa foi de aproximadamente 0,250 cm2.

II.1.7 Micrografias

As micrografias foram obtidas utilizando um microscpio eletrnico de varredura (MEV) JEOL JSM-5610LV. As amostras foram preparadas sobre suportes (porta amostras) utilizando as mesmas condies empregadas nos itens II.1.5 e II.1.6. As micrografias foram obtidas empregando as condies otimizadas na construo dos sensores.

II.1.8 Preparo das amostras

Para a anlise cronoamperomtrica, as amostras de suplemento alimentar foram preparadas dissolvendo 3 cpsulas de 500 mg em 1000 mL de gua deionizada e ento a soluo foi filtrada com o auxlio de um papel de filtro quantitativo. Aps esta etapa, uma alquota de 1 mL da soluo filtrada foi diluda para 10 mL. Finalmente, 500 L desta soluo foram adicionados em uma cela eletroqumica contendo 5 mL de uma soluo tampo fosfato (PBS) 0,1 mol L-1 pH 7,0.

Para as medidas espectrofotomtricas, 500 L da soluo da amostra foram misturadas com 2 mL de DTNB. Outras etapas, foram realizadas de acordo com o procedimento j reportado [96], que baseada na reao da Cys com o DTNB, sendo o produto desta reao monitorado espectrofotometricamente em 412 nm.


34

II.1.9 Estudo de repetibilidade, estabilidade e tempo de vida do sensor

A estabilidade dos sensores foi avaliada fazendo 15 medidas sucessivas, sem renovar a superfcie, e as respostas ao final dos experimentos foram ento comparadas. O tempo de vida dos sensores foi avaliado fazendo medidas a cada 1-2 dias, totalizando 100 determinaes.

Para avaliar a repetibilidade das medidas, foram realizadas 8 determinaes sucessivas dos analitos selecionados. A interface foi construda 8 vezes seguindo o mesmo procedimento descrito na parte experimental e, atravs de medidas cronoamperomtricas, foi obtido o desvio padro de construo do sensor.


35

CAPTULO III

SENSOR PARA CISTENA


37

III.1 Apresentao do captulo Neste captulo sero apresentados os resultados referentes construo,

caracterizao, estudo das propriedades eletrocatalticas e aplicao do sensor destinado a deteco de cistena em amostras de interesse farmacolgico. Inicialmente, a otimizao do processo de construo da plataforma ser abordada visando obter a maior resposta na construo do sensor. Em seguida, sero discutidos ensaios de caracterizao por microscopia eletrnica de varredura e tambm caracterizaes eletroqumicas do par redox nitroso/hidroxilamina formado a partir do mediador redox DTNB (Figura III.1). A fim de ressaltar a atividade eletrocataltica do mediador redox utilizado aqui sero apresentados voltamogramas cclicos que mostram o efeito de cada etapa da construo do sensor na eletrooxidao de cistena. Sero apresentados tambm resultados obtidos por cronoamperometria que, alm de fornecerem indcios de

uma reao qumica acoplada, permitem a obteno da constante cintica (kobs) da reao qumica entre o mediador e o analito. Por fim, sero discutidos os resultados referentes aplicao do sensor em amostras reais.

SS

N+O-

O

N+O-

O

O

O

OO

H

H

Figura III.1. Frmula estrutural do cido 5,5-ditio-2-nitrobenzoico (DTNB).


39

III.2 Resultados e discusso

III.2.1 Planejamento fatorial A fim de otimizar a preparao da plataforma do Sen-Cys, fatores

considerados importantes do sistema foram analisados por meio de planejamento fatorial completo 23, o que significa 8 experimentos em duplicata. Estes fatores foram: concentrao dos MWCNTs (5 30 L), PEI (0,1 4,0%) e do DTNB (5 50 mmol L-1). Os valores entre parnteses representam os nveis mnimo e mximo para cada varivel estudada. A significncia dos fatores bem como as interaes entre os mesmos foi avaliada e representada pelo diagrama de Pareto (Figura III.2(A)) com intervalo de confiana igual a 95%.

Figura III.2. Diagrama de Pareto (A) e superfcies de resposta para PEI DTNB (B), MWCNTs PEI (C) e MWCNTs DTNB (D).


40

possvel observar na Figura III.2(A) que os efeitos principais da concentrao do DTNB e PEI assim como o efeito de interao MWCNTs-PEI foram os efeitos mais significativos e que os mesmos deveriam ser estudados em maiores nveis, j que os valores dos efeitos foram positivos. Sendo assim, uma matriz de Doehlert para 3 variveis experimentais j bem estabelecida [97] foi empregada e gerou as superfcies de resposta mostradas na Figura. III.2(B - D).

Analisando as superfcies de resposta ilustradas na Figura III.2(B - D), as condies timas dentro do domnio experimental que geraram a maior corrente de pico foram determinadas. Estas condies so: 20 L de MWCNTs, 2,2 % de PEI e 30 mmol L-1 da soluo do mediador redox DTNB.

III.2.2 Caracterizao da plataforma por MEV

As micrografias do MEV da superfcie modificada nas condies otimizadas com MWCNTs (A), MWCNTs+PEI (B), MWCNTs+PEI+NPAu (C) e MWCNTs+PEI+NPAu+DTNB (D) podem ser observados na Figura III.3.

A micrografia da Figura III.3(A) mostra um comportamento tpico de distribuio de MWCNTs sem qualquer tipo de modificao. No entanto, aps a adio do polmero, pode ser observado claramente na Figura III.3(B) que os nanotubos foram funcionalizados pelo polmero em torno de sua extenso. Em algumas regies pode se observar tambm um excesso de polmero mesmo aps vrias etapas de lavagem. Na micrografia da Figura III.3(C) no se observa uma mudana significativa na morfologia do material aps a modificao com as NPAu. No entanto, a caracterizao de uma superfcie de ouro pode ser obtida atravs da obteno de uma resposta eletroqumica em meio cido. Assim, aps a modificao com as NPAu, foi registrado um voltamograma cclico em uma soluo 0,5 mol L-1 de cido sulfrico na faixa de potencial de 0,1 at 1,4 V. Como pode ser visto no grfico inserido na Figura III.3(C), o pico que aparece em torno de 0,9 V na varredura reversa caracterstico de uma reduo do xido de ouro [98]. Assim, a plataforma nanoestruturada possui um perfil eletroqumico caracterstico que permite a formao de uma SAM com o DTNB.


41

Figura III.3. Micrografias da superfcie nas etapas de construo do sensor: (A) MWCNTs, (B) A+PEI, (C) B+NPAu e (D) C+DTNB. Grfico inserido: voltamograma cclico em H2SO4 0,5 mol L-1 e = 100 mV s-1.

Na micrografia da Figura III.3(D) pode ser observado que aps a formao SAM houve uma alterao na morfologia do material, indicando que o mediador redox foi imobilizado na superfcie da plataforma. Pode-se observar no canto superior esquerdo da mesma Figura um excesso de mediador mesmo aps a lavagem da superfcie com etanol e gua.

III.2.3 Ativao e caracterizao do par redox

Aps a formao da SAM, o par redox R-NO/R-NHOH foi eletrogerado in situ a partir do DTNB ancorado na superfcie da plataforma nanoestruturada atravs de uma ciclagem do potencial entre 0,1 e -0,7 V em uma soluo tampo


42

fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0. A Figura III.4 mostra os voltamogramas cclicos obtidos no processo de ativao nas condies otimizadas. Como pode ser observado na Figura III.4, no primeiro ciclo o grupo nitro reduzido irreversivelmente para R-NHOH e oxidado para R-NO na varredura reversa. No segundo ciclo possvel observar um pico de reduo em torno de 0,07 V versus ECS referente a reduo de R-NO para R-NHOH.

Figura III.4. Processo de ativao do mediador redox obtido em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0 e = 100 mV s-1.

Aps o processo de ativao, a faixa de potencial ao redor do par redox foi selecionada e foram obtidos voltamogramas cclicos em vrias velocidades de varredura (10 - 600 mV s-1) mostrados na Figura III.5. Nesta mesma Figura podem ser observados voltamogramas cclicos bem definidos e persistentes indicando que o DTNB foi ligado com sucesso na superfcie da plataforma. A Figura III.5(A) mostra um grfico da corrente de pico em funo da velocidade de varredura obtidos a partir dos voltamogramas cclicos. O grfico da corrente de pico andica


43

e catdica apresentou comportamento linear em funo da velocidade de varredura indicando assim que o DTNB-ativado mostra um comportamento eletroqumico caracterstico de espcies redox que esto confinadas na superfcie do eletrodo [19].

Laviron formulou expresses para a voltametria de varredura linear para o caso de espcies eletroativas confinadas na superfcie do eletrodo [99]. O grfico de Laviron pode ser obtido medindo-se E (definido como Ep Eo ; Ep o potencial de pico do processo andico e catdico, e Eo o potencial formal) em funo do log da velocidade de varredura (). Seguindo a Teoria, o coeficiente de transferncia de eltrons () e a constante de velocidade heterognea de transferncia de eltrons (ks) podem ser calculados empregando as Equaes III.1 e III.2 quando Ep > 200/n mV:

/(1 ) = a/c (Eq. III.1)

ks = nFc/RT = (1 )nFa/RT (Eq. III.2)

onde F a constant de Faraday, n o nmero de eltrons, RT apresentam seus valores usuais, e a e c representam as velocidades de varredura no intercepto das linhas retas do processo andico e catdico, respectivamente. Como pode ser visto na Figura III.5(B) quando ( 0) o E praticamente independente do log da velocidade de varredura sugerindo uma cintica de transferncia eletrnica rpida. No entanto, quando ( ) a separao dos picos comea a aumentar, indicando que uma limitao em decorrncia da cintica de transferncia de carga est ocorrendo. Assim como previsto por Laviron [99] e podendo ser observado na Figura III.5(B), para elevadas velocidades de varredura, os valores de E foram proporcionais ao log da velocidade de varredura.

A partir da extrapolao das retas para E = 0 o valor de = 0,5 foi obtido empregando a Equao III.1. Utilizando o coeficiente angular das retas para ambos os processos andico 2,3RT/(1-)nF e catdico -2,3RT/nF o valor de n =


44

1,94 foi encontrado. O valor obtido est prximo do valor esperado de 2 eltrons para o processo redox nitroso/hidroxilamina [100].

Figura III.5. Voltamogramas cclicos do eletrodo modificado com o DTNB-ativado em vrias velocidades de varredura (10 600 mV s-1). (A) Grfico de Ip vs. . (B) Grfico de Laviron.

Alm disso, utilizando a Equao III.2, a ks foi calculada empregando as

velocidades de varredura onde E = 0 (linha horizontal na Figura III.5(B)) apresentando um um valor de 43 s-1. O valor obtido para a constante maior do que muitos trabalhos j reportados, com excesso para o eletrodo modificado contendo riboflavina [101] (Tabela III.1). Uma das justificadas para a rpida


45

comunicao eletrnica DTNB-eletrodo deve estar relacionada com a presena dos nanotubos de carbono, que atravs do seu sistema pi, funcionam como uma espcie de ponte na transferncia de eltrons. Sendo assim, a comunicao eletrnica entre os stios redox ativos do mediador redox e a superfcie do ECV rpida, garantido que a etapa mediada no est limitando o processo que ocorre na interface da plataforma.

Tabela III.1. Parmetros eletroqumicos e cinticos de alguns eletrodos modificados com alguns mediadores redox.

Mediadores redox n kkkks (s-1) Riboflavina [101] 0,58 1,9 45,9 4-Nitroftalonitrila [102] 0,5 2,3 9,7 Nitrofluorenona [103]

4,5

Violeta de pirocatecol [104] 0,49 5,3 1,4-dihidroxiantraquinona [24] 0,66 4,5 cido clorognico [105] 0,44 2,0 8,6 Ftalocianina Fe(II) + porfirina Fe(III) [106] 0,50 3,8 Tetrabromo-p-benzoquinona [107] 0,55 2,0 3,8 Azul de meldola [108] 0,51

5,3

Catalisador de Doyle [109] 0,22

17,0

Este trabalho 0,5 1,9 43,0

Aps as caracterizaes em funo da velocidade de varredura foram feitos experimentos modificando o pH da soluo. Como os stios redox so derivados do grupo R-NO/R-NHOH, a reao redox que ocorre na superfcie da plataforma pode ser antecipada como sendo dependente do pH. O perfil voltamtrico do eletrodo modificado com o DTNB-ativado foi caracterizado em vrios pHs (5,0 a 8,0) por voltametria cclica. A Figura III.6 mostra os grficos da corrente de pico andica e do potencial formal em funo do pH em soluo


46

tampo fosfato 0,1 mol L-1. O coeficiente angular da reta ilustrada na Figura III.6(A) foi de 57,5 mV/pH na faixa de pH estudada. Este coeficiente angular muito prximo para reaes onde a razo e/H+ igual a um (59,2 (np/n)) mV / pH, onde np = n a 25 C [110]. Assim, o nmero de prtons deve ser tambm 2 porque o mesmo valor foi encontrado atravs do mtodo de Laviron para o nmero de eltrons. Adicionalmente, em pH 7,0 a corrente de pico andica apresentou o maior valor (Figura III.6(B)).

Figura III.6. Influncia do pH da soluo no potencial formal (A) e na corrente de pico (B) do mediador redox a partir de voltamogramas cclicos registrados em soluo tampo fosfato 0,1 mol L-1 e = 100 mV s-1.

Os valores de Ep (Epa Epc) em funo do pH da soluo tambm foram avaliados (Figura III.7) empregando os resultados obtidos por voltametria cclica. Este parmetro permaneceu praticamente constante at pH 7,0 e ento comeou a aumentar, trazendo indcios de que uma limitao do processo redox est ocorrendo quando o meio fica alcalino.


47

Figura III.7. Grfico de Ep versus pH.

III.2.4 Atividade eletrocataltica da plataforma nanoestruturada

A construo de plataformas nanoestruturadas visando melhoria dos processos interfaciais pode trazer inmeras vantagens ao sensor. Desta forma, alguns nanomateriais so to bem arquitetados que por si s j apresentam propriedades eletrocatalticas. Os nanotubos de carbono, por exemplo, possuem propriedades eletrocatalticas para a oxidao do NADH e Cys ilustradas em alguns trabalhos da literatura [111,112]. Assim, para ilustrar a eficincia do mediador redox na superfcie da plataforma, foram obtidos voltamogramas cclicos na presena de Cys aps cada etapa envolvida no procedimento de construo do sensor. O processo associado com a oxidao eletroqumica do analito pode ser observado

www.biq.iqm.unicamp.br arquivos teses 000768040

Documents