Western blot technikaWestern blot technika

Immunoblot vagy Immunoblot vagy Western blotWestern blot

- fehérjék vizsgálatára fejlesztették ki - módszer során az elektroforetikusan szétválasztott komponenseket szilárd hordozóra viszik - érzékenység vetekszik a radioimmunoassay-vel és nem igényli a vizsgál fehérje radioaktív jelölését

fehérjék membránra fehérjék membránra történőtörténő

átvitele –immunológiai átvitele –immunológiai azonosításaazonosítása

Előny:Előny:• Fehérje membránra történő átvitelekor részben visszanyeri ‐natív állapotát – alkalmas fehérje ligand vagy fehérje-fehérje kölcsönhatás kimutatására• Fehérjék a membránon koncentrálódnak, kimutatási lehetőségüket növeli• Fehérjék a membránon gyorsan és reverzibilien festhetők

Hátrány:Hátrány:• A fehérjék méretüktől és bázicitásuktól függően eltérő hatékonysággal vihetők át membránra• az antitestet a fehérje natív alakja ellen termeltették viszont a denaturált és redukált körülmények között az antitest nem mindig képes megkötődni a vizsgálandó fehérje (antigén) megfelelő epitópjához

Gél elektroforézis Gél elektroforézis - Az első lépés a gél elektroforézis.- A minta fehérjéit a gélen moláris tömegük alapján választják el, általában SDS-PAGE-et, azaz nátrium-dodeciszulfát-poliakrilamid-gél-elektroforézist használnak.- Az elektroforézis denaturáló körülmények között zajlik, így kiküszöbölődik az összecsapzódás jelensége, a nem megfelelő oldékonyság - A gélen több sáv van, így a minták párhuzamosan vizsgálhatók. - 2-D-s elektroforézist is kifejlesztettek, melyen a minták komponensei két irányban is képesek elválni egymástól, ezzel nagyobb felbontóképességet eredményezve, melyben az egyik irányban az izoelektromos pont alapján, a másik irányban pedig a moláris tömeg alapján szeparálódnak.

Jó tudni....Jó tudni....

- Az akrilamid vizes oldatban, megfelelő katalizátor (ammónium peroxidilszulfát, APS) és iniciátor (tetrametilén etilendiamin, TEMED) jelenlétében polimerizációra képes → poliakrilamid poliakrilamid keletkezik.- Az APS spontán bomlása szabad gyök keletkezéséhez vezet, de e szabad gyök nem képes az akrilamid kettős kötését felhasítva elindítani a polimerizációt, arra viszont képes, hogy gerjessze a TEMED molekulát és az így keletkező szabadgyök már képes beindítani a polimerizációt.

APSAPS - mindig frissen!!!!TEMEDTEMED - jellegzetes szagú!!!

Transzfer Transzfer

- Elektroforézis gél vékony és törékeny, ezért nehéz lenne véghezvinni a fehérjék kimutatásához szükséges minden lépést rajta.- A fehérjéket elektroferetikusan nitrcellulóz membránra vagy PVDF-re visszük át- Ez maga a blottolás folyamata, amikor a fehérjék a szondákat tartalmazó membránra kerülnek át. - A membránnak fehérje kötő részei vannak, melyek nem specifikusak, minden fehérjét azonos valószínűséggel kötnek. - A kötés pedig hidrofób kölcsönhatás alapján megy végbe, illetve elektromos hatások is fellépnek a membrán és a fehérje között.

A gélen a lyukak világos körök, a lyukak közti területek sötétek

A membránon fordítva a lyukak közti területek a világosak, hiszen ott kevésbé volt hatásos a transzfer. ??

BLOKKOLÁSBLOKKOLÁS

- a nitrocellulóz membránon a szabad helyek telítése a vizsgálatszempontjából közömbös fehérjével , mivel a membránon levő szabad kötőhely a specifikus antitestet megkötné- BSA; kazein, nem zsíros, száraz tejpor és detergensek (pl. Tween 20, vagy a kolloidális szén) oldata- a blokkoló ágens kötődjön jól a membránhoz, ne zavarja az antitest-antigén kölcsönhatást- a detektálási reakciókat és kellő mértékben oldódjon TRIS vagyfoszfát alapú pufferekben.

JelölésJelölés

Az első antitest ellen termelt második antitest jelölést hordoz(pl. radioizotóp, enzim (tormagyökérperoxidáz, alkalikus foszfatáz).

DetektálásDetektálás1. Radioaktív izotóp esetén: röntgenfilm előhívás

•érzékenység (pikogramm)

2. Enzimes (gyökértormaperoxidáz, alkalikus foszfatáz) jelölésesetén:

•Kromogén szubsztráttal amelyet az enzim színes csapadékká alakít•érzékenység: (nanogramm)

Kemilumineszcenciával (ECL; Enhanced-ChemiLuminescence)luminol peroxidáz katalizálta oxidációja közben fényt

bocsát ki, amelyet fényérzékeny lemezen rögzítjükérzékenység: pikogramm

Problémák...I.Problémák...I.

• Gyenge jel:

• Nincs jel:

Problémák...I.Problémák...I.• Gyenge jel:

– Blokkolás → a puffer reagál a fehérjével → másikat kell próbálni, vagy időt csökkenteni

– Inkubálási idő → növelni– Antitest koncentráció → fertőzés, fagyasztás ciklusok száma → növelni vagy újat– Transzfer → optimalizálás– Csapvíz!! → kromogén reagens inaktív → minőségi víz– Azid → gátolja a HRP-t → kerüljük– Antigén koncentráció alacsony → emelni kell a gélre felvitt mennyiséget

• Nincs jel:– Túl alacsony antitest koncentráció → növelni kell– HRP gátlás – azid kerülése!!!– Antitest csak natív fehérjével reagál → nem-denaturáló gélen kell futtatni vagy

másik antitest kell :(

Problémák...II.Problémák...II.

• Nem egyenletes blot

• Foltos háttér

• Erős háttér

Problémák...II.Problémák...II.

• Nem egyenletes blot– Ujjlenyomatok, foltok → hajtogatás, szabad kézzel érintés kerülése!

• Foltos háttér– A blokkoló pufferben vagy a másodlagos antitest pufferben nem

oldódott fel valamelyik összetevő → szűrés

Problémák...II.Problémák...II.• Erős háttér

– Mosás → mosási idő és mennyiség növelése, transzfer előtti szűrés– Másodlagos antitest koncentrációja magas → hígítás– Fehérje-fehérje aspecifikus kapcsolatok → detergens (Twwen 20) a mosó és

detekciós pufferbe– Immobilon membránon → NaCl és SDS koncentrációjának növelése, mosási

idő elnyújtása– Rossz minőségű reagens → reagensek és víz minőségének átnézése– Keresztkapcsolatok a blokkoló puffer reagensei és az antitest között →

detergens a mosó oldatba és másik blokkoló puffer– Expozíciós idő túl hosszú → csökkenteni– A membrán kiszáradt → figyelni kell a mennyiségekre, ne itt spóroljunk!– Rossz minőségű antitest– Feleslegesen sok detekciós reagens → csöpögtessük le mielőtt előhívnánk!

Problémák...III.Problémák...III.

• Egybefüggő háttér• Nem specifikus jelek• „inverz” kép• Kis fehérjék jelölése

Problémák...III.Problémák...III.• Egybefüggő háttér

– Nem specifikus kötődés → megemelt sótartalmú mosó puzfferek!• Nem specifikus jelek

– Túl magas primer antitest koncentráció → hígítani kell– Túl magas másodlagos antitest koncentráció → hígítás– Antigén koncentráció magas → kevesebbet kell felvinni

• „inverz” kép– Túl sok HRP-konjugált másodlagos antitest → csökkenteni kell

• Kis fehérjék jelölése– A BSA-val el lettek fedve → kazein vagy más alacsony molekulatömegű

fehérje használata– A Tween 20 vagy Triton-x mennyiségét minimalizálni kell– A túlzott inkubációs idők és mosások kerülése

ELISAELISA•Elisa immunreakción alapuló mérési eljárás, ahol az immunkomplex antitest tagja enzimatikusan jelölt. •Az immunkomplex egyik tagját szilárd fázishoz rögzítjük (ez lehet az antigén és az antitest is), amelyhez adjuk az immunkomplex másik jelzett tagját

• Az immunkomplex mennyiségét konjugált enzimének reakciója segítségével határozzuk meg.

• A jelzéshez olyan enzimek alkalmasak, amelyeknek stabil szerkezetű, könnyen hozzáférhetõ szubsztrátjuk van és amelyet az enzim színes jól oldódó termékké alakít.

•Az enzim-szubsztrát reakció mértékét, azaz az átalakult szubsztrát mennyiségét általában fotometriásan mérjük.

Az ELISA érzékenysége megközelíti a RIA érzékenységét (ng)

ELISAELISA

ELISA méréseket műanyag mikrotiter lemezen végezzük.Az antitest vagy az antigén rögzítése a szilárd fázishoz (mikrotiter lemez felszínéhez) történhet :

• felületi adszorpcióval (gyenge másodlagos, van der Waals kölcsönhatás-sal) ;

ELISA reagens immobilizálása mikrotiter lemez felszínéhez• a lemez felszínére már eleve kikötött molekulához nagy affinitású kötődéssel• és közvetlen kovalens kötés kialakításával

A szilárd fázishoz történõ kötés alapkövetelménye, hogy a reagensek a kötés után is megtartsák eredeti aktivitásukat.

A reaktáns megkötése után a nem specifikus helyeket blokkolni kellközömbös molekulával (BSA, kazein)

ELISA fajtáiELISA fajtái

•Elisa osztályozása számos szempont szerint történhet , •a módszer tartozhat kompetitív vagy nem kompetitív immunelemzések sorába.

•A jelölt reaktáns közvetlenül (direkt) vagy közvetten (indirekt) kapcsolódhat a meghatározandó antigénhez vagy antitesthez.

Direkt Elisánál a jelzett antitest esetén a kötődés arányos a szilárdfázishoz kötött antigén mennyiségével egy bizonyos koncentrációtartományban

Indirekt Elisánál az antigén-antitest komplexet az első ellenanyagelleni másodlagos ellenanyaggal mutatjuk ki.

Direkt ElisaDirekt Elisa

1. A meghatározandó antigént miktotiter lemezre kötjük nem specifikus kölcsönhatással

3. Inkubálás az enzimmel jelölt antitesttel

2. A lemezről lemossuk a nem kötődött antigént (általában fiziológiás sóoldattal, amelyhez detergenst is adagolnak pl. 0,2 % Triton X-100)

4. A lemezről lemossuk a nem kötődött jelölt antitestet

5. A szubsztrát-enzim reakció, a termék fotometriás detektálása

Nem kompetitívNem kompetitív

Nem kompetitív, szendvics ELISA kihasználja, hogy egy antigén molekulafelületén többféle epitóp is található; amelyek felhasználhatóka molekula azonosítására és megkötésre.

A módszer lényege, hogy a már megkötött makromolekulához olyan enzimmel jelölt antitestet adunk feleslegben, amely csak kizárólag az antitest-antigén komplexen, kialakítva a Antitest1-Antigén-Antitest2-Enzim hármas immunkomplexet.

A nem kötődő Antitest2-Enzim lemosása és az enzim/szubsztrátreakció lezajlása után a detektált jel nagysága arányos a megkötöttmérendő reaktáns koncentrációjával.

Előnyei:Előnyei:•nagy érzékenység

•nagy számú minta, gyors vizsgálata – automatizálás

•Természetes közegben, több antitest vagy antigénjelenlétében a kérdéses komponens mennyiségénekmeghatározása

HátrányaHátránya•aspecifikus reakciók okozta álpozitivitás (pozitív ésnegatív kontrollok tesztelése)

•Bizonytalan antigén vagy antitest tisztaság

http://www.millipore.com/immunodetection/id3/western_blottinghttp://www.millipore.com/publications.nsf/a73664f9f981af8c852569b9005b4eee/da0adc63990db630852576fe00515ade/$FILE/PB1033EN00_emd.pdf

http://www.millipore.com/userguides/tech1/mcproto451http://www.millipore.com/immunodetection/id3/antibodiestutorialhttp://www.millipore.com/userguides.nsf/a73664f9f981af8c852569b9005b4eee/6a1d6c46566d0d8c85257012004ac882/$FILE/P36599.pdf