webinário: "nanoparticle tracking analysis (nta): contagem, visualização e tamanho de...
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Apresentadora: Msc. Geisi Rojas Barreto Applications Scientist Malvern Instruments, Inc.
Moderador: Henrique Kajiyama
Technical Manager Malvern Instruments, Inc.
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Nanoparticle Tracking Analysis (NTA): Contagem, visualização e análise de tamanho de nanopartículas
Sumário
› Introdução à Tecnologia NTA
› Princípios Básicos do DLS
› Técnicas Complementares: NTA & DLS
› Capacidades Adicionais do NTA
› Aplicações e Benefícios
Nanoparticle Tracking Analysis
Arranjo Óptico para os Instrumentos Nanosight
› VISUALIZAÇÃO da luz espalhada das
nanopartículas no caminho da fonte do laser
Microscópio
Partículas espalham quando laser incide
Partículas para serem visualizadas estão suspensas em um líquido
Fonte de Laser (aprox. 50 µm)
Vidro Superfície Metalizada
Líquido
Princípio de Medição – NTA
› Nanopartículas se movem
› Movimento Browniano
› Partículas pequenas se movem mais
rápido do que partículas maiores
› Coeficiente de Difusão pode ser
calculado acompanhando e analisando
o movimento de cada partícula
separadamente, mas simultaneamente
Tamanho!
Como calcular tamanho?
Mede o Movimento Browniano em tempo real
Obtém o Coeficiente de Difusão
d(H) = 3 p h D
KB T
Princípio de Medição – NTA
KB = Constante de Boltzmann h= Viscosidade T = Temperatura
Princípio de Medição – NTA
› “Rastreamento” do Movimento Browniano de partículas individuais
para medir o coeficiente de difusão
› A aplicação da equação de Stokes-Einstein resulta no diâmetro
hidrodinâmico
Captura do vídeo
Acompanha movimento
Análise
Software em Ação – NTA
Resolução de Pico-a-Pico do NTA
-5,00E+06
0,00E+00
5,00E+06
1,00E+07
1,50E+07
2,00E+07
2,50E+07
0,00 100,00 200,00 300,00 400,00 500,00 600,00
Part
icle
co
ncen
trati
on
Particle Size (nm)
Tamanho Concentração
MÍNIMO: 10 – 40 nm Tipo de material
Comprimento de onda e potência da
iluminação
Sensibilidade da câmera
MÁXIMO: 1000 – 2000 nm Movimento Browniano
Viscosidade do solvente
MÍNIMA: Aprox 106 / mL Requer maior duração da análise
MÁXIMA: Aprox 109 / mL Dificuldade de distinção das
partículas ao seu redor
Limites de Detecção do NTA
Regulamentação
Definição de Nanomaterial pela União Europeia (2011)
European Commission - IP/11/1202, 18/10/2011
Revisão em 2014
Nanomaterial é qualquer material que contenha 50% ou mais das
partículas, na distribuição de tamanho baseada em número, com uma
ou mais dimensões externas entre 1 nm e 100 nm.
http://europa.eu/rapid/press-release_IP-11-1202_pt.htm
Dynamic Light Scattering
Dynamic Light Scattering (DLS)
› DLS é uma técnica estabelecida em vários tipos
de indústrias e em inúmeras aplicações por mais
de 40 anos
› Rapidez, Reprodutibilidade e Precisão
Laser
Particle Size Distribution Correlation Function Intensity Fluctuation
Princípio de Medição – DLS
• Amostras polidispersas: tamanho médio 1
• Distribuição de tamanho: razão > 3:1 2
• Sem informação de concentração 3
Limitações do DLS
quando o NTA pode ajudar
Comparação entre
DLS e NTA
NTA vs. DLS – Amostra Monodispersa
Análise DLS Resultado Equivalente no NTA
100 nm polystyrene reference particles in water
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
50 100 200 400
Me
as
ure
d p
art
icle
dia
me
ter
in n
m
Standard Latex Particle size in nm
NTA
DLS
Validação do NTA por DLS
Comparação esferas de referência: 50, 100, 200 e 400 nm
NTA vs DLS – Amostra Bimodal
Esferas de poliestireno referência dispersas em água (100nm e 200nm)
Equipamento: Zetasizer Nano
? › No DLS as
nanopartículas de
100 nm não são
detectadas
› Sua presença é
“mascarada” pelo
espalhamento das
nanopartículas de
200 nm
Data reproduced from Filipe, Hawe and Jiskoot (2010) “Critical Evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the Measurement of Nanoparticles and Protein Aggregates”, Pharmaceutical Research, DOI: 10.1007/s11095-010-0073-2
NTA (curva vermelha) vs. DLS (barra azul) para misturas de poliestireno de diferentes tamanhos
Mistura PSL
Capacidades Adicionais
do NTA
Para aqueles que precisam mais do que tamanho
Capacidades Adicionais
do NTA
CONCENTRAÇÃO
Medindo Concentração…
Distribuição de partículas mostra
contagem em número vs tamanho da
partícula
Mistura de esferas de 100 nm e
200 nm de látex dispersas em
água na proporção de 1:1
Com NanoSight, a análise mostra os picos tanto para 100 nm quanto para 200 nm
Cálculo da Concentração
› NTA mede partículas individuais em um volume
conhecido
› Extrapola-se os valores obtidos para estimar a
concentração da amostra
› Quantos agregados há na amostra?
› Qual o tamanho do meu lipossomo? (onde ele
pode ser entregue)
› Quantos existem? (quantos serem entregues)
Cálculo da Concentração
› NTA mede a concentração em partículas/mL
› A concentração estimada é medida por unidade
de tempo
› Portanto, partículas movendo-se para fora e
dentro do campo de visão não irão afetar na
concentração estimada
Concentration Measurement Of 100 nm Duke Latex
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 10 20 30 40 50 60
Theoritical concentration (E+08)particles/ml
Mea
su
red
NT
A c
on
cen
trat
ion
(E+
08)p
arti
cles/m
l
concentration of
100 nm Duke
sample
Linear
(concentration
of 100 nm Duke
sample)
Concentration Measurement Linearity
Tamanho vs. Intensidade vs. Número
NanoSight possui habilidade única de plotar cada tamaho de
partícula em função da intensidade de espalhamento de luz
Capacidades Adicionais
do NTA
INTENSIDADE DE ESPALHAMENTO
• Gráficos de alta resolução:
tamanho/número/intensidade
• Alterações mínimas de
tamanho levam a altas
variações na intensidade
• Pode identificar diferentes
materiais
• Qualitativa, mas valiosa
Nú
me
ro
200 nm
100 nm
100 nm
dímeros?
Intensidade de Espalhamento – Um parâmetro
adicional
Separando Populações de Tamanhos Similares?
Mistura de Poliestireno (92nm) e Nanopartícula de ouro (90nm)
Au NP
Poliestireno
Capacidades Adicionais
do NTA
FLUORESCÊNCIA
Modo de Fluorescência
Câmera
CCD
Objetiva do
Microscópio As partículas espalham o feixe de laser
e se ela é fluoresente irá fluorescer
Sem filtro de fluorescência, toda luz é transmitida
Com o filtro de fluorescência, a luz espalhada é
bloqueada
Opção com ou sem filtro de fluorescência:
› 4 opções de laser disponíveis
405nm
488nm
532nm
635nm
Aumenta
Sensibilidade
para Partículas
Menores
Modo de Fluorescência
› Permite a medição de partículas específicas
Esferas de 100nm em 100% FBS (Fetal Bovine Serum)
Modo de luz espalhada Modo de fluorescência
(565 nm long pass)
Modo de Fluorescência
Moda: 103 nm
Concentração: 9.5 x108 partículas/mL
• Marcadores fluorescentes são
fotodegradados em um curto período de
tempo.
• A Bomba de Seringa, introduz
continuamente amostras novas na
câmara, expulsando o marcador “gasto”.
• Software pode distinguir o movimento
do fluxo da bomba do Movimento
Browniano e ainda calcular o tamanho da
partícula.
Modo de Fluorescência – em fluxo
APLICAÇÕES NTA
1. Vesículas Extracelulares/ Exossomos
2. Carreamento de Fármacos
3. Virologia/ Vacinas
4. Agregação de Proteínas
5. Nanomateriais/ Nanotoxicologia
APLICAÇÕES: Fluorescência
› Carreamento de fármacos
– a nanopartícula agrega no sangue?
› Vírus
› Exossomos / Microvesículas
– Identificar populações
› Marcação de anticorpos
› Fluorescência inerente
– Quantum dots
APLICAÇÕES: Vesículas Extracelulares
› O quê são? – partículas em Nanoescala provenientes de células
de mamíferos.
Exossomos: 30-100 nm
Microvesículas ou Micropartículas: 100-1000 nm
› O que fazem? Estão envolvidos na sinalização celular.
A “mensagem na garrafa”
Aplicações: Vesículas Extracelulares
› O quê exatamente?
› Por exemplo, doenças como o câncer, pré-eclâmpsia,
etc.
› Mas, pode me explicar um pouco mais?
› Se você entende a mensagem e de onde ela veio e para
onde ela vai, então você talvez pode diagnosticar e
tratar mais efetivamente.
Vesículas Extracelulares
O que
foi?
Socorro! Preciso de
estrógeno. Vou
ovular!
› NTA “CONTA”– Pico da população de exossomos
pode estar relacionado ao aparecimento da doença
(i.e. Células que sinalizam outras de que algo está
errado)
Vesículas Extracelulares
› NTA mede FLUORESCÊNCIA – marcadores
exossomais alertam os pesquisadores de que a
partícula é um exossomo e não um agregado de
proteínas
› Marcadores também podem indicam a origem do
exossomo, por exemplo
Vesículas Extracelulares
› Alta Resolução de TAMANHO
› Subpopulações de exossomos e microvesículas
pode ter funções diferentes
› Todos esses parâmetros em APENAS UMA
MEDIÇÃO – tamanho, concentração e tipo
da população do exossomo
› Citômetros de Fluxo: medem partículas
vesiculares acima de 300 nm
Mistura de partículas fluorescentes
de 50 nm e de 200 nm não
fluorescentes analisadas no modo
de luz espalhada
A mesma mistura quando a luz
espalhada foi removida pelo filtro de
fluorescência
Detecção de Partículas Fluorescentes em
uma Mistura
VÍRUS – Desenvolvimento de Vacina +
Gene Delivery
Mistura complexa: Influenza:
Ensaios biológicos alternativos levam de 5-7 dias para
determinar a concentração viral
Agregação de Proteínas: Indução pelo
aquecimento 1 mg/mL de IgG – 50ºC
Agregação de Proteínas: Indução pelo
aquecimento
Instrumentos NTA Nanosight em todo o mundo
18
700+ equipamentos
1440+ publicações
Matrix de Complementaridade
Faixa de Tamanho
Amostras monodispersas
Fluorescência
Concentração
(partículas/mL)
Ver é crer!
DLS NTA Técnicas
Complementares
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