was bringt lebewesen zum leuchten? zentralkurs 2009chemie – einfach faszinierendthomas hari
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Was bringt Lebewesen zum Leuchten?
Zentralkurs 2009 Chemie – einfach faszinierend Thomas Hari
Das grün fluoreszierende Protein (GFP)
Übersicht
Das GFPExperimente/Idee
ResultateKosten
Das GFP
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
3 AS bilden das Chromophor
Weitere fluoreszierende Stoffe
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
Mutationen des GFP
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
Experimente / IdeenTransformation von Bakterien mit pGLO
Flüssig-kultur
Zellen lysieren
Isolation von Plasmid-DNA
Restrikitions-verdau
Gelelektro-phorese
Säulen-chromatographie
Native PAGE
SDS-PAGE
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
pGLO
Gene für araA, araB und araD wurden durch das GFP-Gen ausgetauscht
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
Aus: http://www.durham.edu.on.ca/s_links/schools/dunbart/staff/melegos/IDC4U5/pGLO%20Slide%20Presentation.ppt
Genregulation
RNA Polymerase
araC
ara GFP OperonGFP Gene
araC GFP Gene
araC GFP Gene
Effector (Arabinose)
B A DaraC
B A DaraC
RNA Polymerase
Effector (Arabinose)
araC B A D
ara Operon
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
Aus: http://www.durham.edu.on.ca/s_links/schools/dunbart/staff/melegos/IDC4U5/pGLO%20Slide%20Presentation.ppt
Resultate
GFP Experimente/Idee Resultate KostenBild: Olivier Brandenberger; Prima 2005/2006
Bakterienkulturen
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
LB-Medium LB / amp
Bakterienkulturen
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
LB / amp /araLB / amp /ara
Ohne UV-Licht Mit UV-Licht
Transformation von pGLO
Aus: http://www.westminster.edu/acad/sim/pdf/SpGLOTransformation.pdf
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
Kulturmedium mit Ampicillin
Kulturmedium mit Ampicillinund Arabinose
Flüssigkulturen
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
Zellen lysieren
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
Bakterienpellets
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
Werden nicht mehr verwendet
Säule auftragen
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
Säule auswaschen
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
3 Fraktionen
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
Säule auftragen
Säule waschen
GFP auswaschen
Native PAGE
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
Nicht ganz einfach…
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
2 fluoreszierende Banden
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
27 und 37 kDa
SDS-PAGE
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
Vor der SäuleNach der Säule
SDS-PAGE
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
250 kDa150 kDa
100 kDa
75 kDa50 kDa37 kDa25 kDa20 kDa15 kDa10 kDa
SDS-PAGE
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
SDS-PAGE
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
Plasmidverdau
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
pGEM1 mit Bcn1pGLO mit Bcn1 und Bam H1pGLO mit Bam H1
Färbung mit Azur Blau
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
GFP Experimente/Idee Resultate KostenBild: Olivier Brandenberger; Prima 2005/2006
GFP Experimente/Idee Resultate KostenBild: Olivier Brandenberger; Prima 2005/2006
Kosten
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
2 Kits mit Material wird geliefertRelativ teuer Zusätzliches Material:ZentrifugeGel-Apparatur vertikalGel-Apparatur horizontalHeizblockMikropipetten (bis 1 ml)Restriktionsenzym
Proteinelektrophorese: http://www3.bio-rad.com/cmc_upload/Literature/221305/1660023A.PDF
Alternative: Genspirale
• Apparaturen werden ausgeliehen(Ausnahme: SDS-PAGE)
• Kosten für Verbrauchsmaterial:SFr. 50.– (Kurs gemacht)
• Zusätzliches Material von BioRad:SäulenPlasmidPuffer selber herstellen
GFP Experimente/Idee Resultate Kosten
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