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Vollautomatisierung von Fermentationen mittels FT-NIR Spektroskopie:
Eine Innovation mit signifikantem Potential
Ramón Mira de Orduña HeidingerHaute Ecole Spécialisée de Suisse Occidentale
Ecole d’Ingénieurs de Changins
Charles FrohmanCornell University, Takasago
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Haute Ecole Spécialisée de Suisse OccidentaleEcole d’Ingénieurs de Changins
Nyon
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Saccharomyces cerevisiaeAn excellent production organism
• Acid tolerant• Anaerobic / aerobic metabolism• Robust growth• Large number of molecular tools
• Traditional fermentations• wine, beer, bread
• Modern applications• bio-fuels• proteins• aromas
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Industrial Batch FermentationsExample: alcoholic fermentation
0 100 200 3000
100
200
300
0
5
10
15
Eth
anol
(% v
/v)
To
tal S
ugar
(g/L
)
Time (h)
• Large concentration gradients
• Substrate feedback inhibition• Sluggish / failed
fermentations• Increased spoilage risk
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• High gravity media• may be desriable for efficiency reasons• may be imposed
• hot climates, sweet wines• Increased by-product formation
• Acetic acid• Glycerol• Acetaldehyde
• Reduced Product yields• Fermentation failures
Industrial Batch FermentationsOsmotic stress response
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Fermentation Control in Enology • Temperature control• Measure fermentation rate manually
ThermostatSet-point: 14°CProcess variable: 16°C Cool!
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Current measurement units
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Fermentation rateSet-point: 1 Brix/dayProcess variable: 1.2 Brix/day Cool!
Fermentation monitor
0 2 4 6 8 1 00
2
4
6
8
1 0
1 2
1 4
1 6
1 8
2 0
2 2
AF
Rat
e
T im e
Automated Fermentation RateControl
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• Automated temperature & fermentation rate control– Remote monitoring of fermentations (cell phones)– Adapt temperature to fermentation– Recognize sluggish/stuck AF early on– Coordinate/reduce cooling energy utilization
across entire winery– Can not measure
sugar levels
Automated Fermentation RateControl
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Fully Automated Fermentation Control• Continuous in-line measurement of sugars /
other parametersFermentation monitorGlucose: 30 g/lFructose: 70 g/lTotal Sugars: 100 g/lEthanol: 6.5 % (vol.)
0 2 4 6 8 1 00
2
4
6
8
1 0
1 2
1 4
1 6
1 8
2 0
2 2
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Fully Automated Fermentation Control
• Continuous in-line measurement of sugars– Fermentation temperature control– Fermentation rate management– Automatic AF termination at certain residual
sweetness– Fed-batch fermentations
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Addition of carbon-source during fermentation
Advantages• Avoid substrate concentration extremes
– reduce osmotic stress– avoid feedback inhibition– reduce by-product formation
• Challenges– regulation of substrate feed
Fed-Batch Fermentations
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Control of feed addition• Fixed addition rate
– does not consider fermentation kinetics• Variable feed addition
– Empiric addition - manual adjustment• does not allow for process variations• may not consider actual kinetics
– Off-line (discontinuous) measurement • organizational, labour considerations
– On-line (continuous) measurement • based on actual metabolism• requires continuous metabolite analysis
– In-line (continuous) measurement and automatic control
Feeding Options
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A simple proposal
BATCH• Adding yeast to must
FED-BATCH• automatic, continuous, in-line• Adding must (slowly) to yeast
• yeast degrade sugar as it is provided
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Sugar measurement Options
• Chromatography• Segmented flow analysis, flow injection
analysis• CO2 mass flow or density sensors• Automated discrete analyzers• Bio/Chemo-sensors• Ultrasound• Vibrational Spectroscopy
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Processing Challenges• Specificity, cross sensitivity• Inhibitors• Diffusion limitations• Temperature sensitivity• Signal stability / drift• Sensor robustness / sterilization• Need for sample taking / pre-treatment• CO2 / air bubbles• Sample turbidity
• Yeast, nutrients: > 1'000 NTU
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FTNIR - Spectroscopy
• Direct insertion into tank • non-destructive• no sample taking
required• Not diffusion limited• No consumables• Autoclavable• Flexible metabolite range• Requires calibration with
reference method
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Bruker Multi-purpose FT-NIR Analyzer (MPA)
• 2 mm optical path length transflectance probe (1mm slit)
• 12,500 – 4,000 cm-1 spectral range• 16 cm-1 resolution• long acquisition times (> 500 spectra)• in-line control via Opus Quant / Process
– PROCESS > OPC > PLC > 4-20 mA signal
Equipment and Settings
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Sample spectra before processing
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Sample spectra after vector normalization
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Spectral regions (after vector normalization)
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Fermentation course
0 100 200 3000
1020304050607080
Eth
anol
(% v
/v)
Tot
al S
ugar
(g l-1
)
Time (h)
0246810121416
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Calibrations and Cross validationEthanol
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Calibrations and Cross validationTotal Sugars
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Yeast viability
0 200 400 6000
20
40
60
80
100
Li
ve Y
east
[% o
f tot
al y
east
]
Time [h]
Fed-batch
Batch
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0 50 100 150 200 250 300 350 40060
65
70
75
80
85
90
95
Liv
e Y
east
(%)
Time (h)
Yeast viability
Fed-batch
Batch
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Sugar concentrations
0 200 400 6000
100
200
300
Tota
l Sug
ar [g
/L]
Time [h]
BatchFed-batch
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50 100 150 200 250 300 350
50
100
150
200
250
300
Time [h]
Tot
al S
ugar
(g l-1
)
24681012141618
Eth
anol
(% v
/v)
Sugar/alcohol concentrations
Batch
Fed-batch
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Ethanol concentrations
0 200 400 6000
5
10
15
Eth
anol
[% v
/v]
Time [h]
Batch
Fed-batch
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Acetic acid
0 200 400 6000.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Ace
tic a
cid
[g/L
]
Time [h]
Batch
Fed-batch
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50 100 150 200 250 300 350
2
4
6
8
10
0 50 100 150 200 250 300 350 4000.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
Glycerol Acetic Acid
Glycerol / Acetic acid
Batch
Fed-batch
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Acetaldehyde
0 200 400 6000
50
100
150
200A
ceta
ldeh
yde
[mg/
L]
Time [h]
BatchFed-batch
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50 100 150 200 250 300 350
10
20
30
40
Ace
tald
ehyd
e (m
g l-1
)
50 100 150 200 250 300 3500
10
20
30
40
Pyru
vate
(mg
l-1)
Time (h)
50 100 150 200 250 300 3500
20
40
60
80
100
120
140
160
a-ke
togl
utar
ate
(mg
l-1)
Time (h)
50 100 150 200 250 300 350
10
20
30
40
50
60
Ace
toin
(mg
l-1)
Glycerol Acetic Acid
Carbonyls
Batch
Fed-batch
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Propionic acid ethyl ester
0 50 100 150 200 250 300 3500
100
200
300
400
500
600C
once
ntra
tion
[µg/
l]
Time [h]
Fed-batch
Batch
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0 50 100 150 200 250 300 3500
100
200C
once
ntra
tion
[µg/
l]
Time [h]
Hexanoic acid ethyl ester
Batch
Fed-batch
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0 50 100 150 200 250 300 3500
25
50
75
100
125
150
175
200C
once
ntra
tion
[µg/
l]
Time [h]
Octanoic acid ethyl ester
Batch
Fed-batch
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Dynamics of Volume(Volume/Time)
0 200 400 600 800
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000V
olum
e [m
l]
Process Time [h]
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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200123456789
101112
Alc
ohol
[% v
ol.]
V o lum e A dded (l)
Ethanol/Volume (at 50 g/l sugars)
0 200 400 600 800
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
Volu
me
[ml]
Process Time [h]
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Summary
• FT-NIR based system with ±5 g/l sugar accuracy under (turbid) production conditions• glucose, fructose, ethanol, glycerol
• Fully automated fermentations possible• Traditional batch fermentations• Fed-batch fermentations
• Higher yeast viability• Fundamentally altered yeast metabolism
• decreased formation of osmotic stress related compounds
• Reduced cooling requirements
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Outlook
• Process up-scaling• Process multiplication / platform transfer
• oenology - other analytes• production of
• organic acids• amino acids• proteins• aromas
• Process miniaturization / improvement
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Fed-batch in Process Development
FeedBeadsEnBase - EnPresso
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Acknowledgements• Canandaigua Wine Company, John Dyson, Mike Nolan,
Goichman Endowments
• Bruker Germany:
Dr. JP Conzen, Dr. A Niemöller, Dr. Taraschewski• Spectroscopic parameters, chemometrics, Opus script support
• Bruker USA:
Michael Surgeary, Stephen Medlin, Li Hui• Probe selection, calibrations, Opus scripts