Qumico Frmaco BilogoVirologaLOS VIRUS Y LA BIOTECNOLOGA Presenta:Braulio Jos Vaca Yez

Para lograr desarrollar terapia gnica contra el cncer se

necesitan vectores que acten a nivel sistmico y marquenespecficamente clulas tumorales en cualquier parte del cuerpo. Los mayores obstculos radican en que el vector se distribuya por todo el cuerpo, y que slo infecte a las clulas tumorales, sin daar a las sanas. Estas dos condiciones las

cumplen los vectores virales Sindbis, los cuales proceden delvirus Sindbis pero con modificaciones, para que no sean capaces de replicarse y sean seguros y controlables.Los virus y la Biotecnologa 2

El virus Sindbis se transmite a las clulas de mamferosmediante las picaduras de mosquito, y se distribuye por el organismo a travs del torrente sanguneo. Esta capacidad de

distribuirse la mantiene el vector modificado, y su vida media esrelativamente grande. Por otra parte, el receptor de este virus en clulas de mamferos es el receptor de laminina de alta afinidad (LAMR), el cual est sobreexpresado en las clulas tumorales, y se le relaciona con la

invasividad de muchos tipos de cncer.Los virus y la Biotecnologa 3

VECTORES VIRALES SINDBIS PROCEDEN DEL VIRUS SINDBIS, PERO SON DEFECTIVOS PARA LA REPLICACIN. (Incapaces de formar nuevas partculas vricas). EN SU GENOMA TRANSPORTAN UN GEN QUE CODIFICA UNA PROTENA FACILMENTE DETECTABLE: LUCIFERASA

-GALACTOSIDASA SE DISTRIBUYEN POR EL ORGANISMO A TRAVS DE LA SANGRE. LAMR (Receptor de laminina de alta afinidad), ES SU RECEPTOR EN CLULAS DE MAMFEROS. LAMR en tumores: Sobreexpresado Permite distinguir clulas Sin unir lamininaLos virus y la Biotecnologa

Permite distinguir clulas tumorales de sanas.4

VECTORES GENERADOS POR PASES SUCESIVOS DEL VIRUS SILVESTRE EN CLULAS DE MAMFEROS. INDUCEN APOPTOSIS EN LAS CLULAS QUE INFECTAN. ERRADICACIN DEL TUMOR. RECONOCEN ESPECIFICAMENTE CLULAS TUMORALES, NO INFECTAN LAS SANAS. EL MARCAJE DE TUMORES ES MUY RPIDO. DETECCIN Y MARCAJE DE METSTASIS. Ventaja sobre los vectores con promotor especfico de tumor, cuya eficacia de infeccin es mucho menor.

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En este experimento se inducen tumores en ratones y luegose les trata con el vector Sindbis, y se sigue el proceso de marcaje y erradicacin de los tumores a lo largo de varios das. Para poder detectar el vector se utilizan dos mtodos, uno de ellos es un mtodo no invasivo, que consiste en que el vector lleve el gen de la luciferasa, as se puede detectar sin matar al animal.

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Para la visualizacin de los tumores se le inyecta al ratnluciferina, luego se le anestesia y se observa con el sistema de imagen IVIS. En las clulas tumorales marcadas, la luciferasa cataliza la reaccin de oxidacin de la luciferina, y posteriormente, cuando la luciferina vuelve a su estado

reducido emite luz, que se detecta con el sistema IVIS. Lasclulas sanas no son infectadas por el vector, de manera que carecen de luciferasa y, por tanto, no emiten luz.

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El mtodo de la luciferasa permite monitorizar la distribucin del vector, la infeccin y la erradicacin de los tumores. Pero tambin puede resultar til en la deteccin

sistmica de metstasis.

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El otro mtodo usado en este experimento para detectar lostumores consiste en que el vector, en vez del gen de la luciferasa, lleva el gen LacZ, cuyo producto es una -galactosidasa bacteriana. Para detectar este producto hay que sacrificar al animal, y marcar secciones de tejido con un anticuerpo

monoclonal de ratn especfico contra -galactosidasa.

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Sindbis/luc infecta especficamente tumores BHK subcutneos, produciendo su muerte.Para probar el potencial de estos vectores para distribuirse por el organismo e infectar especficamente tumores se les inyecta va intraperitoneal en los ratones, cuando los tumores tienen un tamao

de 500 mm3. Luego se observa la luminiscencia durante varios das,resultando sta muy visible en la zona del tumor desde el 5 al 10 da, pero disminuyendo significativamente hasta el da15. Y en las

zonas sanas no aparece marcaje. Tambin se usa un ratn control,que posee tumores pero sin administrarle vectores, y no se aprecia bioluminiscencia de fondo.Los virus y la Biotecnologia 10

Se observa una reduccin de bioluminiscencia y de

crecimiento tumoral como resultado de la apoptosis mediadapor Sindbis. Lo cual se corrobora al analizar cortes histolgicos de tumores (da 15) teidos con hematoxilina eosina. La

hematoxilina tie tejido tumoral viable, de color morado;mientras que la eosina tie tejido tumoral necrtico, de color rosa. As, vemos que en los ratones tratados con el vector aparecen zonas necrticas homogneas, que ocupan la mayora del tumor.Los virus y la Biotecnologia 11

Pero en los ratones control, las zonas necrticas son pequeas e irregulares, y estn en la parte central del tumor. En este ltimo caso la necrosis se debe a la hipoxia y desnutricin asociada al tumor. Todo esto se puede ver en las dos imgenes siguientes:

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Infeccin especfica de tumores BHK SINLuc2 intrapancreticos.

Con el fin de comprobar si los vectores sindbis pueden

infectar especficamente tumores con otras localizacionesdistintas a la subcutnea, que era el caso anterior, se crea una lnea celular que produce tumores caracterizada por transcribir, de forma estable, un replicn Sindbis defectivo que contiene el gen de la luciferasa de lucirnaga.

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Estas clulas se inyectan en el pncreas y all producen tumores, los cuales expresan luciferasa en respuesta a la infeccin por virus Sindbis. Para revelar la infeccin del vector (administrado mediante inyeccin intraperitoneal) se usa

Sindbis/lacZ, as la luminiscencia slo puede proceder de lasclulas tumorales, no del vector.

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ratn control que tambin posee tumores en el pncreas

no hay seal bioluminicente.ratn tratado con el vector hay seal bioluminicente

se comprueba la existencia de tumores en ambos al hacer la autopsia de los animales

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Mediante un anlisis inmunohistoqumico se ve la distribucin del vector (color

marrn

en

la

imagen),

que

casa

exactamente con la distribucin del tumor (teido de azul ms claro que el tejido sano,

con hematoxilina eosina). Lo que muestrapor qu los vectores Sindbis son efectivos al erradicar tumores: porque infectan y matan

a la mayora de clulas tumorales sin afectara las clulas normales.Los virus y la Biotecnologia 16

VISUALIZACIN DE TUMORES Y METSTASIS EN ANIMALES VIVOS CON

VIRUS PORTADORES DE TRANSGENES DE PROTENAS EMISORAS DE LUZ Virus recombinante: rVV-RUC-GFP.

Insertado por recombinacin homloga, el cual contiene las secuencias de cDNAde una luciferasa y de la protena verde fluorescente, (GFP).Bajo el control de promotores sintticos de expresin temprana/tarda del virus de la vacuna. La luciferasa y la GFP es una protena que emite fluorescencia verde al ser expuesta a luz ultravioleta o azul. Virus mantiene todas sus funciones. Analizando la luminosidad se sigue la localizacin, supervivencia y replicacin del virus.Los virus y la Biotecnologia 17

se inyecta en los ratones hasta los tejidos tumorales, donde sobrevive y se replica durante semanas . no produce viremia. tanto en ratones inmunocompetentes como en

inmunodeprimidos; y en tumores propios del ratn y en inyectados.EN RATONES SANOS: Virus se distribuye por el cuerpo a travs de la sangre. No infecta ningn rgano. Disminuye progresivamente por la

Virus es eliminado por el sistema inmune

eliminacin de los virus por parte del sistema inmune.

EN RATONES CON TUMORES: Tejidos sanos no se marcan. Tumores emiten luz. Virus se replica en los tumoresLos virus y la Biotecnologa

La luminosidad se va incrementando progresivamente, seal de que el virus se est replicando.18

Virus infecta slo las clulas tumorales, porque all el sistema inmune no acta. Luminosidad presenta ms intensidad en la periferia de los tumores, donde la expresin gnica es ms activa. VIRUS DE LA VACUNA PARA VISUALIZAR METSTASIS Se inyecta el virus en ratones con tumores de carcinoma mamario metastsico. Se observa fluorescencia en la regin de las mamas, y luego se analizan secciones de ese tejido, donde aparecen seales como islas por todo l, de 0.5 mm de dimetro cada una. Pero en el resto del cuerpo no aparece seal.Los virus y la Biotecnologia 19