Zeitschrift ffir Krebsforschung 66, 466--472 (1965)

Aus dem Pa~hologischen Institut der Universitgt Mfinchen (Direktor: Prof. Dr. W. Bi2~G~L~)

Verglelchende autoradiographisehe Untersuehungen iiber die Wirkung yon Careinogenen, Zigarettenrauehkondensaten

und Liisungsmitteln auf die M~iusehaut* Von

W. DONTENWILL, A. CHRISTOFORIS, B.WIEBECKE und P. FEACX DE LA CROIX

Mit 2 Textabbildungen

(Eingegangen am 9. O]~tober 1964)

Eindeutig verwertbare Aussagen fiber die careinogene Aktivit~t ehemischer Substanzen sind mit den heute bekannten Methoden nur durch sog. Langzeit- versuche an der Mi~usehaut oder am Subcutangewebe der Ratte mSglieh. Da die Langzeitversuche an der Ms die Testung nieht definier~er Stoffgemische wegen der sehr langen Versuchsdauer ersehweren, wurde immer wieder versueht, die Suehe nach earcinogenen Stoffen in nieht definierten Stoffgemisehen dutch Kurzzeitversuehe zu erleichtern. Der Talgdriisensehwundtest (Su~TZEFr U. Mit- arb., GU~RIN, KRACHT U. Mitarb.) hat bisher ebenso wie andere Tests (LAzy , LIBER~A~N, CHOUROUL~KOV und GUaRd) die Langzeitversuehe nieht ersetzen kSnnen. Die Untersuchungen yon K~AC~T u. Mitarb. haben gezeigt, dal~ das Ph~nomen Talgdrfisensehwund nicht zwangsli~ufig a!s Indicator caneerogener Potenz aufgefaf3t werden kann.

Wir stellten uns daher die Frage, ob der naeh einem Kurzzeittest ermittelte 3H-Markierungsindex der M~usehaut bei Anwendung versehiede:~er LSsungs- mittel unterschiedHehe Werte zeigt und eventuell eine genauere Aussage fiber eine potentielle cancerogene Aktivit~t von Stoffen und Stoffgemischen erlaubt. Der Markierungsindex ist nach Ov~Lv~T ein Gradmesser des Zellumsatzes nnd damit der Zellaktivit~tt. Er ist nach Einwirkung hyperplasiogener, eoeareinogener und carcinogener Substanzen erhSht (Do~R~R u. Os~RL~T).

Anlal~ zu unserer Fragestellung waren eigene Untersuchungen (DosT~W~LL) fiber die Wirkung yon Zigarettenrauehkondensaten auf die Mgusehaut. Dabei wurden bei Verwendung yon Glycerin-Alkohol als LSsungsmittel nur vereinzelte Tumoren an der Applikationsstelle beobachtet, wogegen andere Autoren (WYs- D ~ u. Mitarb., K ~ S s ~ u. ~.) bei Verwendung yon Aceton und anderen LSsungs- mitteln eine hShere Tumorrate erzielten.

Material und Methodik Die Un~ersuchungen wurden an etwa 20 g schweren m~nnlichen M~usen (NMRI) durch-

geffihrt. Dieser M~tusestamm wurde auch bei den friiheren Untersuchungen verwandt. Es wurden Versuchsgruppen und eine Kontrollgruppe yon je 10 Tieren zusammengeste]lt.

7 Tage vor Versuchsbeginn wurden bei allen Tieren die gaare der Riickenhaut mit einer e]ek- trischen H~arschneidemaschine entfernt. Die Tiere wurden meist einzeln, jedoch hSchs~ens in Dreiergruppen in den K~figen gehal~en. Tiere mit BiSverletzungen oder durch die Haar- schneidemaschine hervorgertffenen Verletzungen an der Riickenhaut wurden nicht in den Versuch genommen.

* Die Un~ersuchungen wurden mit Unterstfitzung der Deutschen Forschungsgemeinschaft durchgefiihrt.

Untersuchungen fiber die Wirkung yon Careinogenen usw. 467

Die zu priifenden Substanzen wurden mittels einer Mel3pipette auf die SteUe der Rficken- haut getropft, an der zuvor die Haare geschnitten worden waren. Die Tropfung erfolgte je- weils morgens gegen 7,30 Uhr, auch die Applikation yon aH-Thymidin und die TStung der Tiere wurde bei allen Versuchsgruppen jeweils zur gleiehen Tageszeit vorgenommen, um Schwankungen der Zellteilungsvorg~inge zu vermeiden. Bei den mit DMBA behandelten Tieren effolgte die :V[arkierung mit 3H-Thymidin 4, 8, 24, 48 bzw. 96 Std nach der letzten Tropfung, bei den iibrigen Gruppen jeweils 24 Std nach der letzten Behandiung.

ZurMarkierung derDNS-synthetisierendenZellen wurden 2,5/t C aH-Thymidin (spez.Akt. 1,9 C/ml~ol) pro Gramm KSrpergewicht intraperitoneal injiziert. Die Tiere wurden 40 rain naeh der Injektion getStet, die entnommenen Hautstficke in 4%igem, neutral gepuffertem Formol fixiert. Die 5 tt dicken Paraffinsclmitte wurden mit Photoemulsion (Iiford 65) fiber- sehiehtet und 14 Tage exponiert. Die entwickelten und fixierten Schnitte fi~rbten wit mit Hg, matoxylin. Von je 3 ~ Tieren aus jeder Versuchsgruppe wurden 2--3 cmder interfolliku- laren Epidermis ausgewertet. Als markierb ga]ten Zellen mit mindestens ffinf SilberkSrnern fiber dem Kernpunkt. Die angegebenen Werte sind die 3/Iittelwerte.

Es wt~rden lolgende Versuchsgruppen ausgewertet: I. Kontrollen, 7 Tage nach Rasur Autoradiographie. 2. Tropflmg mit 0,2 cm a Aceton. 3. Tropfung mit 0,2 em a Glycerin-Alkohol aa. 4. Tropfung mit 0,2 cm a Gesamtkondensat aus Zigarettenrauch, gel6st zu gleichen Teilen

in Glycerin-Alkohol. 5. Tropfung mit 0,2 cm 3 Gesamtkondensat aus Zigarettenrauch gelSst zu gleiehen Teilen

in Aceton. 6. Tropfung mit 0,2 cm 3 aromatenfreiem Kondensat aus Zigarettenrauch gelSst in Aceton

(gewonnen durch Herrn Doz. Dr. GBIYnViER 1, Chemisches Inst i tut der Universitat Hamburg). 7. Tropfung mit 0,2 cm 3 einer 1%igen L6sung yon 3--4-Benzpyren in Aceton.

Die Tropfung in den Gruppen 2---7 erfolgte ein-, drei- und seehsmal. Zwischen die ein- zelnen Tropfungen wurde je ein behand]ungsfreier Tag eingeschaltet.

I n einer weiteren Versuchsgruppe wurde zum Vergleich in gleicher Weise die Wirkung verschiedener Verdiirmungen yon 9,10-Dimethyl-l,2-Benzanthracen (DiKBA) getestet. Diese Tiere wurden nur einmal behandelt. Die Autoradiographie wurde 4, 8, 24, 48 und 96 Std nach einmaliger Trop~ung mit DMBA durchgefiihrt. Diese Versuchsreihe diente zur Kls einer m6gliehen Zeit- thud Dosisabh~ngigkeit des Markierungsindex. Die in der Tabelle angegebene Dosis bezieht sich auf die Gesamtmenge des applizierten Carcinogens in 0,2 cm ~ Aceton.

Versuehsergebnisse

I n den T a b e l l e n 1 u n d 2 is t jeweils der M/ t t e lwer t des M a r l d e r u n g s i n d e x an- gegeben, e r rechne t aus d en W e r t e n y o n 14 T ie ren bei den K o n t r o l l e n u n d y o n 3 bis

Tabelle 1

Applizierte Substanz

Aceton 0,2 cm a . . . . . . . . . . . . . . . . . Glycerin-Alkohol aa 0,2 cm 3 . . . . . . . . . . . Gesamtkondensa~ in Aceton aa 0,2 cm 3 . . . . . . Gesamtkondensat in Glycerin-Alkohol aa 0,2 cm ~ . /h'omatenfreies Gesamtkondensat in Aceton aa 0,2 em 3 Benzpyren in Aeeton 0,2 cm 3 einer 1%igen L6sung

3 H-MarMerungsindex der Kontrollen: 0,032.

3 H-Markierungsindex

n&oh e inmMiger Behandlun~

nach I n~ch dreimaliger sechsmaliger Behandlung Behandlung

0,028 0,038 t 0,042 0,028 0,123 0,105 0,107 0,108 0,167 0,093 0,13l 0,113

0,030 0,025 0,102 0,087 0,101 0,274

x Ffir die 0-berlassung der Kondensate danken wir Herrn Doz. Dr. G~IMMEg, Dr. N]~u~&~x uud Dr. EL~ElgHORSTo

468 W. DOgTESrWILL et a]. : Untersuehungen fiber die Wirkung yon Cacinogenen

6 Tieren der einzelnen Versuehsgruppen. Der Markierungsindex ( = Z~hl der markierten Zellen pro 1000 Zellen der interfollikul/~ren Epidermis) zeigt bei den L6sungsmitte]n Glycerin-Alkohol und Aceton gegenfiber den K ontrollen im Dureh- sehnitt keine Erh6hung. Bei den mit Gesamtkondensa~ behandelten Tieren ist die Erh6hung des Markierungsindex weitgehend unabh/~ngig yon der Art des L6sungs-

TabeUe 2

Appliz ier te Substanz

DMBA 1 ? DMBA 5 y D2iIBA 10 y DMBA 25 7 DMBA 100 7

._•4 Std

o,~6

aH -~r nach

8'S~d 24 Std 48 Std 96 Std

o,~7

0,108 0,112 0,0S~ 0,082 0,070

0,080 0,083 0,090 0,166 0,123

0,078 0,050 0,088 0,092 0,122

mittels. Die Behandlung mit aromatenfreiem Kondensat ergab einen etwa gleich hohen Markierungsindex wie die Behandlung mit Gesamtkondensat bei Ber/iek- sichtigung aller gewonnenen Werte. Der Index war bei Applik~tion yon in Aceton gel6stem Gesamtkondensat nach einmaliger Tropfung sehr hoch, bei Verwendung von aromatenfreiem Kondensat nach einmatiger Tropfung jedoch

Abb. i. Autor~diogrannn der unbeha~4elten i~useha.ut ~0 ~ nach In~ektion yon ~H-Thymidin

noch stgrker erhSht. Die H6he des Marlderungsindex is~ demnach nicht abh/~ngig vom Gehalt an aromatischen Kohlenwgsserstoffen. Der Markierungs- index war bei Behandlung mit Aeeton alleine gegenfiber den Kon~rollen nieht erh6ht.

Bei der Behandlung mit DMBA sinkt der Markierungsindex 4 Std naeh der Tropfung offenbar infolge einer anf/inghchen Hemmung der DNS-Synthese deutlich ab, steigt abet bereits nach weiteren 4 Std wieder an. Die H6he des Markierungsindex ist nieht signifikant abh~ngig yon der H6he der applizierten Dosis. Die gewonnenen Werte zeigen in den einzelnen Versnchsgruppen starke Schwankungen, so dab Iediglieh bei hoher Dosierung eine leichte Erh6hung des Marlfierungsindex erkennbar wird.

~ ~

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~

470 W. I)ONTENWILL, A. CHEISTOFOI~IS, B. WIEBECKE uItd P, FEAUX DE LA Ctr

Bespreehung der Befunde

Die bei der Autoradiographie mit ~H-Thymidin nachweisbare St~rke der DNS-Synthese nnd damit der Proliferation der Basalzellen ist nach unseren Ver- suehsergebnissen kein Gradmesser ffir eine carcinogene Ak~ivit~t bestimmter Stoffgemisehe. Die HShe des Markierungsindex und damit das Mag der Akti- vierung der Zellproliferation ist nicht eindeutig dosisabh~ngig. Erst eine sehr starke DosiserhShung bewirkt eine Steigerung des Markierungsindex. Stoff- gemische, wie z.B. Zigarettenrauchkondensate, ohne die als entscheidend ffir die Caneerisierung angesehenen Fraktionen (aromatisehe Kohlenwasserstoffe), zeigen keine geringere Aktiviti~t als Stoffgemische, die die aromatische Fraktion enthMten.

Ahnlich wie beim Talgdriisenschwundtest zeigt sieh eine deutliehe Diskrepanz zwischen dem Langzeit- und dem Kurzzeittest. Aueh in den Untersuehungen yon KI~AOI~T konnte die im Langzeitversueh gefundene Promoterwirkung yon Phe- nolen im Kurzzeitversuch nicht bestatigt werden. Die Diskrepanz wird besonders deutlieh beim Vergleieh der Untersuehungen fiber die Wirkung yon Zigaretten- rauchkondensaten in verschiedenen L6sungsmitteln. W~hrend wir bei Langzeit- versuehen bei Verwendung yon Glyeerin-Alkohol als L6snngsmittel kaum Tu- moren beobachteten, sahen WYNDEI~ U. Mitarb. bei Verwendung yon Aceton als LSsungsmittel eine wesentlich h6here Tumorrate. Eine unterschiedliche Wirknng wird bei Verwendung verschiedener LSsungsmittel bei Kurzzeitversuchen nicht sichtbar. DM~ der Markierungsindex bei Kurzzeitversuchen keine Aussage fiber eine potentielle eareinogene Wirkung erlaubt, zeigt am besten der Vergleieh zwisehen der Wirkung des Gesamtkondensats und des aromatenfreien Konden- sats. Der Markierungsindex ist beim aromatenfreien Kondensat eher h6her, eine Tatsache, die nur dutch die st/~rkere Wirkung der im Kondensat enthaltenen hyperplasiogenen bzw. coeareinogenen Stoffe erkl/~rt werden kann. Aueh DOEm M]~a und O~,H~E~T sahen bei Anwendung yon Coeareinogenen wie Phenol, Cro- tonS1 und Tween 60 die st~rkste Aktivierung der DNS-Synthese und damit der Zellproliferation.

Der l~arkierungsindex bzw. die Stgrke der DNS-Synthese und damit der Zellproliferation erlaubt nach nnseren Untersuchungen weder eine Aussage fiber die Stiirke der eareinogenen Aktivitat noch fiber den m6gliehen Careinogengehalt eines Stoffgemisehes. Die Untersuchungen yon DOE~MEa und OEHLE~T haben erkennen lassen, dab Mitoseindex oder Markierungsindex alleine keine eindeutige Aussage fiber eine spezifische careinogene Wirkung erlauben. Ob eine Hemmung der intermitotischen Zellen in der G2-Phase als Charakteristikum einer carcino- genen Aktiviti~t angesehen werden kann, mfissen weitere Versuehe zeigen. Die Antoradiographie erscheint uns wegen der Sehwankungsbreite der gefundenen Werte ffir eine eindeutige Definition der carcinogenen Aktivit/~t oder zum sicheren Naehweis eines CareinogengehMtes yon Stoffgemisehen nieht besonders geeignet. Der Versuch zeigt, dab Kurzzeitversuche nur sehr bedingt eine Aussage fiber die eareinogene Wirkung von nicht definierten Stoffgemisehen erlauben.

Zusammenfassung Zigarettenrauchgesamtkondens~t, ~romateiffreies Zigarettenrauchkondensat

und Benzpyren, jeweils in Aceton oder Glycerin-Alkohol gel6st~ sowie die L6sungs-

Untersuchungen fiber die Wirkung yon Carcinogenen usw. 471

mi t t e l wurden NMI~I-M~usen auf die Rf ickenhaut getropf t . Naeh ein-, drei- und sechsmaliger Behand lung erfolgte Auto rad iograph ie mi t aH-Thymid in . Der gefundene s t t -Mark ie rungs index der M~usehaut e r laubt keine Aussage fiber die caneerogene Akt iv i t i i t einzelner Substanzcn. I n einer wei teren Versuchsgruppe wurde 4 S td nach einmaliger Behandlung mi t versehiedenen Verdf innungen yon DMBA eine Ern iedr igung des Markierungs index gegenfiber den Kon t ro l l en ge- funden mi t e inem s t a rken Anst ieg naeh 8 bzw. 24 Std.

Comparative Autoradiographic Studies of the Action of Carcinogens, Condensates of Cigarette Smoke, and Solvents on the Mouse Skin

Summary

Tota l condensates of c igare t te smoke, a romat ic free condens~tes of c igare t te smoke, and benzpyrene dissolved respect ive ly in acetone or glycerine-alcohol, and the solvent-vehicles themselves were appl ied to the dorsal skin of N M R I mice. Af ter one, three, and six appl icat ions , au to r ad iog ra phy of the H3- thymidine was carr ied out. The ob ta ined labell ing index d id not pe rmi t a s t a t emen t regarding the cancerogenic ac t i v i t y of ind iv idua l agents. To ano ther group of exper imenta l animals , DMBA was appl ied only once using var ious di lut ions. Fou r hours l a te r the label l ing index was found to be decreased as compared wi th the controls, b u t af ter 8 and 24 hours i t was sha rp ly increased.

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Prof. Dr. W. DONTENWILL Pathologisches Insti tut der Universitiit

8 Mfinehen 15, Thalldrchner Str. 36