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Vectores Plásmidos Plásmidos . Son moléculas pequeñas de . Son moléculas pequeñas de ADN ADN doble cadena y circular. doble cadena y circular. vectores de clonado vectores de clonado , son pequeñas moléculas de ADN, con capacidad , son pequeñas moléculas de ADN, con capacidad autoreplicativa. Se introducen dentro de la célula hospedadora y en autoreplicativa. Se introducen dentro de la célula hospedadora y en general, producen un gran numero de copias. general, producen un gran numero de copias. vectores de expresión, vectores de expresión, poseen toda la poseen toda la información necesaria para lleg información necesaria para lleg expresar una secuencia aminoacídica. expresar una secuencia aminoacídica.

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Page 1: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

Vectores

PlásmidosPlásmidos. Son moléculas pequeñas de . Son moléculas pequeñas de ADN ADN doble cadena y circular. doble cadena y circular.

vectores de clonadovectores de clonado, son pequeñas moléculas de ADN, con capacidad, son pequeñas moléculas de ADN, con capacidad autoreplicativa. Se introducen dentro de la célula hospedadora y en autoreplicativa. Se introducen dentro de la célula hospedadora y en general, producen un gran numero de copias. general, producen un gran numero de copias.

vectores de expresión,vectores de expresión, poseen toda la poseen toda la información necesaria para llegar información necesaria para llegar expresar una secuencia aminoacídica.expresar una secuencia aminoacídica.

Page 2: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

Características: Características:

•Son pequeños (miles de pares de bases) Son pequeños (miles de pares de bases)

•son circulares son circulares

•tienen un único origen de replicacióntienen un único origen de replicación

•sitios únicos de clivaje para enzimas de restricciónsitios únicos de clivaje para enzimas de restricción

•gran numero de copiasgran numero de copias

•marcadores que permitan su reconocimientomarcadores que permitan su reconocimiento

VECTORES DE CLONADOVECTORES DE CLONADO

PLASMIDOSPLASMIDOS : : moléculas moléculas de DNA que se encuentran ende DNA que se encuentran en bacteriasbacterias y se replican en forma independiente del cromosomareplican en forma independiente del cromosoma

Page 3: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

Características generales de un vectores de clonado:Características generales de un vectores de clonado:

pBR322pBR3224361 bp4361 bp

Orígen de replicación

Marcadores genéticos(permiten selección de transformantes)

Sitios de restricción únicos

Tamaño pequeño (mayor eficiencia de transformación)

mcs

Page 4: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

• sitios de corte de enzimas de sitios de corte de enzimas de restricciónrestricción

• un promotorun promotor

Características generales de un Vector de Expresión:Características generales de un Vector de Expresión:

Page 5: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

• sitios de corte de enzimas de sitios de corte de enzimas de restricciónrestricción

• un promotorun promotor

Características generales de un Vector de Expresión:Características generales de un Vector de Expresión:

Page 6: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

• sitios de corte de enzimas de sitios de corte de enzimas de restricciónrestricción

• un promotorun promotor

Características generales de un Vector de Expresión:Características generales de un Vector de Expresión:

Sec Enhancer Tata Box Sec. KosakSec Enhancer Tata Box Sec. Kosak

atgatg

MCSMCS

Page 7: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

• sitios de corte de enzimas de sitios de corte de enzimas de restricciónrestricción

• un promotorun promotor

Características generales de un Vector de Expresión:Características generales de un Vector de Expresión:

• un sitio de unión a un sitio de unión a ribosoma ribosoma

• un terminador y sitio de un terminador y sitio de poliadenilaciónpoliadenilación

• marcadores de marcadores de selección selección

• origen de replicaciónorigen de replicación

• tamaño pequeñotamaño pequeño

Page 8: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?

Proteína de fusión en el N o en el C terminal?Proteína de fusión en el N o en el C terminal?

Page 9: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?

Que este en fase con la proteína de fusiónQue este en fase con la proteína de fusión

Proteína de fusión en el N o en el C terminal?Proteína de fusión en el N o en el C terminal?

aataatacGacGttaagCTTAAttaagCTTAA GtacagGtacag

AATTCAATTCatgatgtcctcc

Ej: Vectores serie 1Ej: Vectores serie 1

GtacagGtacagAATTCAATTCatgatgtcctcc

cgatG AATTCcgatG AATTCatgatgtcctccgcatCTTAA GtacaggcatCTTAA Gtacag

InsertoInsertoaataatacG AATTCtacG AATTCtaaccccttaagCTTAA GatggttaagCTTAA Gatgg

aataatacGacGttaagCTTAAttaagCTTAA

VectorVector

Page 10: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?

Que este en fase con la proteína de fusiónQue este en fase con la proteína de fusión

Proteína de fusión en el N o en el C terminal?Proteína de fusión en el N o en el C terminal?

aataatactGactGttaagaCTTAAttaagaCTTAA GtacagGtacag

AATTCAATTCatgatgtcctcc

Ej: Vectores serie 2Ej: Vectores serie 2

GtacagGtacagAATTCAATTCatgatgtcctcc

cgatG AATTCcgatG AATTCatgatgtcctccgcatCTTAA GtacaggcatCTTAA Gtacag

InsertoInsertoaataatactG AATTCtactG AATTCtaaccccttaagaCTTAA GatggttaagaCTTAA Gatgg

aataatactGactGttaagaCTTAAttaagaCTTAA

VectorVector

Page 11: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?

Que este en fase con la proteína de fusiónQue este en fase con la proteína de fusión

La resistencia del plasmidoLa resistencia del plasmido

Proteína de fusión en el N o en el C terminal?Proteína de fusión en el N o en el C terminal?

Page 12: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar?

Que este en fase con la proteína de fusiónQue este en fase con la proteína de fusión

La resistencia del plasmidoLa resistencia del plasmido

El nivel de expresión de la proteínaEl nivel de expresión de la proteína

Proteína de fusión en el N o en el C terminal?Proteína de fusión en el N o en el C terminal?

Page 13: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

ConstitutivosConstitutivos: siempre están transcribiéndose.Ej : siempre están transcribiéndose.Ej SV40, RSV,CMVSV40, RSV,CMV

PromotoresPromotores

El nivel de expresión depende del promotor

InduciblesInducibles: se mantienen “apagados” y son inducidos por algún : se mantienen “apagados” y son inducidos por algún cambio en el medio (inductor, cambio de T).Ej: cambio en el medio (inductor, cambio de T).Ej:

Tet o T-Rex inducilbe por tetraciclinaTet o T-Rex inducilbe por tetraciclina

Olac inducible por IPTGOlac inducible por IPTG

Metalotioneína inducible por metales pesadosMetalotioneína inducible por metales pesados

GAL4-E1b inducible por mifepristonaGAL4-E1b inducible por mifepristona

Page 14: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

 

Proceso de clonadoProceso de clonado::

-se corta el ADN de interés se corta el ADN de interés y el vector con la misma y el vector con la misma enzima de restricciónenzima de restricción

-se ligan los fragmentos se ligan los fragmentos generándose un vector generándose un vector recombinanterecombinante

-se transforman células se transforman células del organismo huéspeddel organismo huésped

- se seleccionan las que portan - se seleccionan las que portan el plásmidoel plásmido

- - Obtención de grandes Obtención de grandes cantidades de plásmidocantidades de plásmido

Page 15: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

TransfecciónTransfección: proceso por el cual un gen de interés es introducido : proceso por el cual un gen de interés es introducido dentro de la célula eucariota por métodos químicos y físicosdentro de la célula eucariota por métodos químicos y físicos

Métodos químicos: DEAE-DextranoMétodos químicos: DEAE-Dextrano

Coprecipitados de CaPOCoprecipitados de CaPO44

Lípidos cationicosLípidos cationicos

Métodos físicos: BiobalisticaMétodos físicos: Biobalistica

MicroinyecciónMicroinyección

ElectroporaciónElectroporación

Page 16: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

•Expresión de proteínas para su purificaciónExpresión de proteínas para su purificación

•Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el fenotipo celularExpresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el fenotipo celular

•Estudio de promotores y elementos regulatoriosEstudio de promotores y elementos regulatorios

•Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del RNA, Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del RNA,

•postraduccionales, etc.postraduccionales, etc.

•Interacción de proteínasInteracción de proteínas

•ClonadoClonado

•Terapia génicaTerapia génica

Objetivo de la transfecciónObjetivo de la transfección

Page 17: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

Métodos químicosMétodos químicos

Page 19: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

Consideraciones para transfección con lípidos cationicosConsideraciones para transfección con lípidos cationicos

Tansfección en presencia de suero Tansfección en presencia de suero

Antibióticos en el medio de cultivoAntibióticos en el medio de cultivo

Densidad celularDensidad celular

Elección del promotor Elección del promotor

Cantidad de DNACantidad de DNA

Page 20: Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de

Transfección estable y transienteTransfección estable y transiente