UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE DIN CRAIOVA

FACULTATEA DE MEDICINĂ

TEZĂ DE DOCTORAT REZUMAT

VALOAREA PROGNOSTICĂ A EXPLORĂRII IMUNOHISTOCHIMICE ÎN CANCERUL DE

COLON

DOCTORAND CRISTIAN ŞEARPE

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: PROF. UNIV. DR. TUDOREL CIUREA

CRAIOVA 2009

CUPRINS

INTRODUCERE

A. PARTEA GENERALĂ

CAPITOLUL I – EPIDEMIOLOGIA ŞI ETIOPATOGENIA CANCERULUI DE

COLON

CAPITOLUL II – ASPECTE ANATOMOPATOLOGICE ÎN CANCERUL DE

COLON

CAPITOLUL III – MANIFESTĂRI CLINICE ÎN CANCERUL DE COLON

CAPITOLUL IV – DIAGNOSTICUL PARACLINIC AL CANCERULUI DE

COLON

CAPITOLUL V – EVOLUŢIA ŞI PROGNOSTICUL CANCERULUI DE

COLON

B. PARTEA SPECIALĂ

CAPITOLUL VI – SCOPUL LUCRĂRII

CAPITOLUL VII – MATERIAL ŞI METODĂ

CAPITOLUL VIII – REZULTATE ŞI DISCUŢII

CAPITOLUL IX – CONCLUZII

BIBLIOGRAFIE

2

INTRODUCERE

Cancerul colonic reprezintă o importantă problemă de sănătate publică datorită numărului mare de pacienţi diagnosticaţi anual în întreaga lume. În ciuda tehnicilor chirurgicale inovatoare şi a tratamentelor medicale moderne rata de mortalitate prin cancer de colon rămâne încă ridicată, în mare parte datorită diagnosticării în faze avansate a afecţiunii.

Debutul insidios şi lipsa unor programe naţionale riguroase de screening a populaţiei reprezintă principalele cauze ale diagnosticării tardive a cancerului colonic. Deşi cercetarea genetică a cancerelor în general şi a cancerului colonic în mod particular a înregistrat un avans considerabil în ultimii 20 de ani, identificarea şi supravegherea corectă a familiilor cu predispoziţie genetică de a dezvolta cancer colonic este încă deficitară.

Conform statisticilor OMS, în medie, în anul 2000 în Europa mortalitatea prin cancer colonic a fost de 19,8 decese la 100000 de locuitori, cele mai ridicate valori înregistrându-se în ţări ca: Ungaria, Cehia, Slovacia, Croaţia, Slovenia, Norvegia, Austria, Germania. Pentru ţara noastră, ultima raportare statistică a OMS arată o valoare de 20,6 decese la 100000 de locuitori, situând cancerul de colon pe locul doi în ierarhia deceselor prin tumori maligne, fiind situat după cancerul bronho-pulmonar şi înaintea celui gastric.

Dacă în marea majoritate a ţărilor europene care se confruntă cu o mortalitate crescută prin cancer colonic (Germania, Austria, Norvegia, Ungaria, Finlanda, Marea Britanie) se înregistrează o tendinţă de scădere a mortalităţii ca rezultat al politicilor sanitare aplicate, în cazul României este alarmant faptul că mortalitatea prin cancer colonic înregistrează o tendinţă permanent crescătoare în ultimii 22 de ani.

Această situaţie particulară a incidenţei şi mortalităţii prin cancer colonic care se înregistrează în ţara noastră, alături de posibilităţile de explorare imagistică şi de analiză histopatologică au creat premisele necesare care m-au determinat să aleg studierea afecţiunilor tumorale colonice drept temă de cercetare.

Ca orice afecţiune neoplazică şi cancerul colonic recunoaşte ca mecanism patogenetic alterări ale genomului ce au ca rezultat pierderea controlului asupra ritmului de diviziune, alterarea mecanismelor implicate în moartea celulară şi exacerbarea acţiunii factorilor de creştere celulară. Studiile genetice au condus la caracterizarea riguroasă a numeroase alterări ale genomuloui celular ce s-au dovedit a determina apariţia cancerelor sporadice sau ereditare. Cu toate acestea, rămân încă numeroase cazuri de cancer colonic a căror cauză nu este elucidată. Una dintre ipotezele plauzibile ce a câştigat tot mai mulţi susţinători ar fi reprezentată de teoria mecanismului epigenetic. Conform acestei teorii, simpla modificare a conformaţiei spaţiale a genelor susceptibile a determina cancer colonic s-ar traduce prin alterarea expresiei genelor respective în lipsa oricărei leziuni structurale. În consecinţă rămân încă numeroase mecanisme implicate în etiopatogenia cancerului colonic ce nu sunt pe deplin înţelese.

Studiind diversele molecule ce reprezintă expresia genelor implicate în patogenia cancerului, examinarea imunohistochimică a înregistrat un avans important în ultimele decenii. La aceasta se adaugă inconvenientul pe care îl ridică extragerea, prelucrarea şi analizarea dificilă şi încă foarte costisitoare a materialului genetic. Un avantaj în plus în susţinerea cercetării imunohistochimice în cancerul de colon îl reprezintă explorarea relativ facilă a acestui organ prin intermediul examinării colonoscopice şi posibilitatea de a preleva cu uşurinţă material tisular.

Lucrarea de faţă are ca obiectiv studierea, cu ajutorul metodelor imunohistochimice, a markerilor celulari implicaţi în mecanismul de control al ciclului celular, în modularea apoptozei celulare, în reglarea adeziunii intercelulare, a mobilităţii celulare şi nu în ultimul rând în angiogeneză.

3

Am studiat modul în care aceşti markeri sunt implicaţi în influenţarea prognosticului pacienţilor cu cancer colonic încercând a identifica corelaţii între gradul de exprimare al acestor markeri celulari, extensia şi agresivitatea tumorală şi probabilitatea de supravieţuire a pacienţilor.

De asemenea, am urmărit pe parcursul studiului dacă există legătură între gradul de expresie al markerilor celulari luaţi în studiu şi anumite caracteristici clinice şi paraclinice ale bolnavilor cu cancer colonic.

În urma acestor studii şi cercetări am găsit fapte, incidenţe, dependenţe şi corelaţii interesante care vor fi prezentate în partea specială a tezei.

CAPITOLUL I – EPIDEMIOLOGIA ŞI ETIOPATOGENIA CANCERULUI DE COLON

I.1. Epidemiologia cancerului de colon Cancerul de colon prezintă un interes deosebit din punct de vedere al etiopatogenezei sale în

primul rând datorită incidenţei crescute pe care o înregistrează această neoplazie la nivel mondial. Astfel, analizând raportarea statistică GLOBOCAN a Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii se observă că la nivel mondial mortalitatea prin cancer de colon în 2003 a fost de aproximativ 529000, SUA raportând o mortalitate de 57100 la o incidenţă anuală de 147500 cazuri în 2003.

Din punct de vedere al incidenţei, la nivel mondial, cancerul de colon ocupă locul patru la sexul masculin (după cancerul pulmonar, de prostată şi cel gastric) în timp ce la femei ocupă locul al treilea (după cancerul mamar şi de col uterin). În ceea ce priveşte rata mortalităţii la nivel mondial, cancerul colonic ocupă locul patru în cazul sexului masculin (după cancerul pulmonar, de prostată şi cel gastric) şi locul cinci în cazul sexului feminin (după cancerul mamar, de col uterin, pulmonar şi gastric).

În Europa se raportează o rată de 19,8 decese prin neoplasm rectocolonic la 100000 de locuitori în 2000, rata cea mai mare a deceselor înregistrându-se în Cehia, Slovacia, Ungaria, statele fostei Yugoslavii şi Norvegia.

<= 42

<= 36

<= 30

<= 24

<= 18

<= 12

<= 6

No dataMin = 0

SDR, Malignant neoplasm of colon, rectum and anus, per 100000

2000

EUROPE19.86

Figura I.1 – Numărul de decese prin neoplasm de colon la 100000 de locuitori în Europa, anul 2000 (conform GLOBOCAN 2002)

4

În România neoplasmul de colon este responsabil pentru 16,9 decese la 100000 locuitori în

2002, valorile fiind uşor sub media ţărilor Uniunii Europene şi reprezentând a treia cauză de deces prin neopazie atât la bărbaţi (după plămân şi stomac) cât şi la femei (după sân şi col uterin). Cea mai recentă raportare statistică a OMS pentru România situează cancerul colonic pe locul doi (20,6 decese la 100000 de locuitori) în ierarhia cauzelor de deces prin cancer, după cancerul bronhopulmonar (39,8 decese la 100000 de locuitori) şi înaintea cancerului gastric (19,6 decese la 100000 de locuitori). Alarmantă pentru România este tendinţa crescătoare a numărului deceselor prin cancer de colon în comparaţie cu tendinţa descrescătoare înregistrată în majoritatea statelor europene.

10

11

12

13

14

15

16

17

1980 1985 1990 1995 2000 2005 2010

Romania

SDR, Malignant neoplasm of colon,rectum and anus, per 100000

10

15

20

25

30

35

40

1980 1985 1990 1995 2000 2005 2010

AustriaFinlandGermanyHungaryItalyNorwayPolandRomaniaSpainUnited Kingdom

SDR, Malignant neoplasm of colon,rectum and anus, per 100000

Figura I.3 – Evoluţia comparativă, în mai multe state europene, a numărului de

decese prin neoplasm de colon la 100000 de locuitori (conform GLOBOCAN

2002)

Figura I.2 – Evoluţia numărului de decese prin neoplasm de colon la 100000 de

locuitori în România (conform GLOBOCAN 2002)

La nivel mondial, principalele cauze de deces prin cancer sunt reprezentate de cancerul pulmonar, cancerul colorectal, cancerul gastric şi carcinomul hepatocelular. În timp ce majoritatea cazurilor pot fi prevenite prin renunţarea la fumat (în cazul cancerului bronhopulmonar), prin eradicarea infecţiei cu Helicobacter pylori (în cazul cancerului gastric) sau prin vaccinarea anti-hepatită B (în cazul hepatocarcinomului), prevenirea cancerului colorectal se poate realiza doar prin polipectomie.

Faptul că neoplasmul de colon reprezintă una din principalele cauze de deces prin neoplazie justifică importanţa acordată studiului interconexiunilor realizate între acţiunea factorilor de mediu şi modificările genetice ce conduc la apariţia acestei afecţiuni.

I.2. Etiopatogenia cancerului de colon I.2.1. Substratul genetic al neoplaziilor – Cancerul ca boală genetică Cancerul este definit ca expansiunea clonală necontrolată a celulelor ce va conduce în stadiile

avansate la invadarea ţesuturilor adiacente şi a metastazelor la distanţă. Evenimentele genetice iniţiale ce declanşează această proliferare aberantă sunt urmate de acumularea de modifcări genetice suplimentare la nivelul celulelor progenitoare şi în final de selectarea dintre acestea a unor “subclone” cu proprietăţi de creştere mai performante ce devin dominante în cadrul tumorii.

De aceea, în ultimul deceniu, s-a acordat o atenţie deosebită descoperirii modificărilor genetice ce stau la baza inducţiei şi a progresiei cancerelor, de cele mai multe ori aceste gene fiind implicate în controlul ciclului celular, transmiterea semnalului de creştere de la diverşi factori extracelulari, reglarea diferenţierii celulare şi a morţii celulare. Aceste modificări apar de cele mai multe ori la

5

nivelul genomului unei celule somatice şi mai rar la nivelul celulelor germinative, în acest ultim caz vorbindu-se despre cancere cu predispoziţie genetică.

Principalele evenimente genetice care stau la baza apariţiei fenotipului malign sunt: - mutaţii activatoare ale proto-oncogenelor; - mutaţii inactivatoare ale genelor supresoare ale fenotipului tumoral (antioncogene); - mutaţii ale genelor de stabilitate celulară (antimutatoare)[1].

I.2.1.1. Activarea proto-oncogenelor Oncogenele sau genele cauzatoare de cancer au fost descoperite de cercetători când s-a

constatat că anumite gene ale retrovirusurilor aviari pot induce proliferarea necontrolată a celulelor normale la mamifere. S-a dovedit ulterior ca aceste gene virale sunt omologii activaţi ai genelor mamiferelor pe care virusurile le-au furat, de-a lungul evoluţiei, de la celulele gazdă în vederea stimulării proliferării celulare.

Mecanismele prin care proto-oncogenele din celulele normale devin activate în celulele neoplazice sunt reprezentate de mutaţiile punctiforme, amplificarea genică sau translocaţiile cromozomiale. Aceste mutaţii se traduc prin sinteza unor proteine cu funcţii modificate, caracter ce este dominant faţă de alela normală.

1. Mutaţiile punctiforme 2. Amplificarea genică 3. Translocaţia cromozomială

I.2.1.2 Inactivarea genelor supresoare tumorale (antioncogenele) Genele supresoare tumorale reprezintă o familie de gene cu rol esenţial în controlul proliferării

celulare, inactivarea acestor gene reprezentând un eveniment cheie în promovarea proliferării maligne.

„Modelul în două trepte” elaborat de Knudson postulează inactivarea ambelor alele ale unei gene supresoare tumorale pentru ca fenotipul malign să devină manifest. Astfel, copiii cu neoplasme familiale prezintă din momentul concepţiei (de la nivelul celulelor germinative fie moştenită de la unul dintre părinţi fie poate apărea ca o mutaţie de novo interesând celulele germinative, mutaţie ce poate fi transmisă descendenţilor) inactivarea uneia dintre cele două alele ale unei gene supresoare tumorale. În cazul acestor copii mai este necesar doar un singur eveniment genetic, prin care să fie inactivată şi cea de-a doua alelă în oricare dintre celulele organului respectiv, pentru iniţierea neoplaziei.

Figura I.5 – „Modelul în două

trepte” elaborat de Knudson [79] Figura I.6 – Schema pierderii heterozigozităţii (LOH) [79]

6

I.2.1.3. Mutaţii ale genelor de stabilitate celulară (antimutatoare) Genele de stabilitate celulară (denumite şi antimutatoare sau reparatorii ale mutaţiilor genetice)

au rolul de a repara erorile genetice apărute de-a lungul vieţii unei celule în scopul de a menţine intact bagajul de informaţie genetică pe care îl lasă moştenire progenitorilor. Această clasă de gene este responsabilă de repararea erorilor apărute la nivelul unei singure perechi de nucleotide sau la nivelul zonelor de inserţie sau deleţie.

Cei mai importanţi reprezentanţi ai familiei genelor de stabilitate s-au dovedit a fi genele MSH2 şi MLH1, fără a neglija nici importanţa altor gene ca MSH6, PMS1, PMS2, MSH3, EXO1 etc.

I.2.1.4. Mecanismul epigenetic În ciuda cercetărilor asidue de identificare a mutaţiilor genelor implicate în oncogeneză, s-au

constatat modificări în expresia acestora în absenţa oricărei mutaţii. Astfel a fost descoperit mecanismul epigenetic de inactivare a genelor supresoare tumorale, mecanism ce presupune hipermetilarea citozinei din perechile C:G dispuse în regiunea promotoare a genei. Rezultatul este lipsa de exprimare a genei, fenomen întâlnit la numeroase gene supresoare tumorale dar şi la gena de stabilitate celulară MLH1 [88]. La fel cum hipermetilarea poate inactiva expresia anumitor gene, şi hipometilarea poate altera expresia unor gene ce necesită în mod normal un proces de metilare pentru a deveni active.

Fig. I.12 – Modelul Vogelstein de explicare a carcinogenezei colonice [79]

7

I.2.3. Aspecte genetice în cancerul de colon Din punct de vedere genetic cancerul de colon este o afecţiune heterogenă, cercetările din

ultimii ani aducând în discuţie numeroase modificări genetice cu rol deosebit de important în apariţia neoplasmului colonic, înregistrându-se diferenţe semnificative în funcţie de posibilitatea transmiterii ereditare şi a asocierii cancerului de colon cu alte neoplazii în cadrul anumitor sindroame.

Posibilitatea transmiterii ereditare a anomaliilor genetice ce stau la baza inducerii neoplasmului

colonic crează oportunitatea clasificării sale în: - ereditar – toate celulele epiteliului colonic dobândesc ereditar o instabilitate genomică

intrinsecă ce favorizează apariţia ulterioară de noi mutaţii genetice; reprezintă 20-25% din totalitatea cancerelor de colon;

- sporadic (non-ereditar) – afecţiunea apare în urma alterărilor genetice apărute în genomul unei singure celule sub acţiunea inductoare a factorilor de mediu; reprezintă 75-80% din totalitatea cancerelor de colon [79].

A. Cancerul colonic ereditar Au fost descoperite numeroase mutaţii cu penetranţă înaltă ce constituie substratul genetic al

cancerului colonic ereditar. În contrast cu acestea, rolul mutaţiilor genetice cu penetranţă incompletă/scăzută nu este încă bine definit, acestea putând sta la originea apariţiei unui procent important dintre neopasmele colonice considerate actual ca fiind sporadice.

Cancerul colonic ereditar este împărţit la rândul său, în funcţie de prezenţa polipilor, în: a. cancere ereditare ce apar în cadrul polipozelor colonice, reprezentate de:

• polipoza adenomatoasă familială • polipoza adenomatoasă colonică atenuată • sindromul Gardner • sindromul Turcot I • sindroamele de polipoză hamartomatoasă:

- sindromul Peutz-Jeghers - polipoza familială juvenilă - sindromul Cowden - sindromul Ruvalcaba-Myhre-Smith

b. cancere ereditare non-polipozice, reprezentate de: • cancerul colonic non-polipozic ereditar (HNPCC) = sindromul Lynch I şi II • sindromul Turcot II • sindromul Muir-Torre

B. Cancerul colonic sporadic Reprezintă 75-80% din totalitatea cancerelor colorectale, fiind consecinţa acumulării

anomaliilor genetice de-a lungul vieţii. Spre deosebire de cancerele ereditare în care toate celulele epiteliului colonic sunt purtătoarele unei tare genetice, modificările genetice din cancerele sporadice interesează doar un număr foarte mic de celule, probabilitatea apariţiei lor fiind egală cu probabilitatea de apariţie a mutaţiilor spontane la nivelul genelor implicate în oncogeneză. Astfel se explică durata mai îndelungată de parcurgere a etapelor oncogenezei, vârsta mai înaintată a pacienţilor cu cancer colonic sporadic precum şi importanţa mult mai mare a factorilor de mediu în inducerea carcinogenezei.

8

CAPITOLUL II - ASPECTE ANATOMOPATOLOGICE ÎN CANCERUL DE COLON

Din punct de vedere microscopic cancerul colonic are în 95% din cazuri structură de

adenocarcinom, restul de 5% fiind reprezentat de carcinoame epidermoide, melanoame, carcinoame adenoscoamoase, limfoame primitive colonice sau tumori carcinoide [76].

Adenocarcinoamele colonice pot prezenta o structură glandulară mai mult sau mai puţin diferenţiată. În 15-20% din cazuri aceste neoplasme secretă cantităţi importante de mucus ce poate fi evidenţiat prin reacţia PAS şi poate îmbrăca următoarele aspecte:

- carcinom mucinos sau coloid: mucusul se acumulează intercelular sub forma de “lacuri”; - carcinom cu celule în “inel cu pecete” – mucusul se acumulează intracelular, împingând

nucleul la periferie. Aceste tipuri mucinoase de adenocarcinom sunt asociate cu un prognostic rezervat şi se

întâlnesc mai frecvent la persoane tinere, la cei cu boli inflamatorii intestinale sau în cadrul sindromului Lynch [76].

Rareori adenocarcinoamele pot avea aspect schiros cu densitate glandulară scăzută şi componentă fibroasă importantă.

Aspectul macroscopic diferă în funcţie de localizarea tumorii. Neoplasmele cu localizare proximală au aspect predominent vegetant, de mari dimensiuni, cu tendinţă la necroză, ulcerare şi hemoragie consecutivă. În schimb, localizarea distală este mai frecvent asociată cu dezvoltarea circumferenţială a tumorii şi apariţia stenozelor clasic descrise de radiologi ca aspect de “cotor de măr”. Acest aspect poate fi explicat prin diametrul mai mic al lumenului la acest nivel, printr-o componentă fibroasă mai mare precum şi prin prezenţa circulaţiei limfatice cu distribuţie circulară ce favorizează extensia tumorală în această direcţie. Rareori tumorile pot îmbrăca un aspect plat ca urmare a extensiei predominant intramurale [77,78].

Neoplaziile multiple (sincrone sau metacrone) pot fi prezente în aproximativ 4% din cazuri fiind întâlnite mai ales la subiecţi cu PAF sau boli inflamatorii intestinale.

Localizarea tumorilor a fost considerată până nu demult ca fiind majoritară (70-75%) la nivel rectal şi sigmoidian. Studiile recente au evidenţiat însă o creştere a incidenţei cancerelor proximale, fenomen ce poate fi explicat şi prin imbunătăţirea tehnicilor imagistice de examinare [100].

Din punct de vedere al analizei imunohistochimice, în cancerul colonic sunt studiaţi multipli factori ce intervin prin mecanisme diferite în iniţierea, promovarea şi progresia tumorală:

- modularea căilor de semnalizare intercelulară: a. calea de semnalizare Wnt:

i. APC: joacă multiple roluri, în parte prin modularea activităţii β-cateninei, precum şi rol în controlul ciclului celular având rol de factor transcriptor mediat de factorul TCF/LEF [76,100,289];

ii. β-catenină: are rol de adeziune intercelulară şi de tabilizare a citoscheletului, având şi rol în cadrul în cadrul semnalizării intercelulare [100];

iii. GSK-3β: împreună cu APC şi Axin intră în componenţa complexului APC-Axin-GSK-3β ce are rolul de a degrada β-catenina [100];

b. receptorul pentru EGF (EGFR) şi receptorul pentru TGFβ (TGFβ-RII) – receptori celulari ai factorilor de creştere. Au rol de tirozin-kinază intracelular, stimulând diferenţierea şi proliferarea celulară [289];

c. MAP-kinaze (MAPK) – protein-kinază activată de mitogeni – are rol esenţial în angiogeneză prin stimularea proliferării celulare, inducţie genică şi creşterea permeabilităţii vasculare [290];

- modularea apoptozei:

9

a. proteina p53 – una dintre primele molecule studiate în cadrul procesului de reglare a ciclului celular. Rolul său principal este de a împiedica mitoza şi a orienta celula spre apoptoză în prezenţa leziunilor ireversibile ale ADN [291-296];

b. factori proapoptotici (bax, bak) – au rol de cofactori ai p53, favorizând declanşarea apoptozei [296,299];

c. factori antiapoptotici (bcl-2) – are rol de blocare a apoptozei şi creştere a duratei de supravieţuire celulară. Acţiunea sa antiapoptotică pare a fi legată de blocarea eliberării citocromului c în citosol, acesta din urmă având acţiunea de a induce apoptoza prin activarea caspazelor 3 şi 9 [296,299-301];

- modulatori ai ciclului celular: a. proteina p16 – sau CDK4, are rol în transcripţia unor proteine cu funcţie de

stabilizare a proteinei p53. În acest fel proteina p16 exercită un rol important în reglarea ciclului celular [289];

b. proteina p21/p27 – prezentă în majoritatea celulelor din organism, acţionând în faza G0 şi începutul fazei G1 cu rolul de a bloca kinazele dependente de cicline (CDK) rezultatul fiind blocarea progresiei ciclului celular către faza S. La nivel citoplasmatic acţiunea p27 se traduce prin inhibarea transcripţiei şi a modificărilor citoscheletului asociate cu adeziunea intercelulară şi migraţia celulelor neoplazice [100,289];

c. ciclina D1 şi E – ciclinele reprezintă una dintre cele mai importante elemente în reglarea ciclului celular acţionând prin intermediul kinazelor dependente de cicline (CDK). Ciclina D1 şi E pare a fi implicate în tranziţia din faza G1 în faza S a ciclului celular, reglând astfel procesul de mitoză [100,289,290];

d. PCNA – peptid nuclear nonhistonic cu rol de cofactor al ADN-polimerazei, concentraţia sa intracelulară fiind crescută spre sfârşitul fazei G1 şi în faza S a ciclului celular. Din acest motiv PCNA poate fi utilizat drept marker al proliferării celulare, valorile crescute ale concentraţiei sale intranucleare fiind asociate cu prognosticul nefavorabil [293,289,290];

e. factorul Ki-67 – polipeptid exprimat pe toată perioada ciclului celular cu excepţia fazei G0. Această caracteristică face ca valorile concentraţiei intratumorale a antigenului Ki67 să fie corelate cu ritmul de proliferare tumorală şi deci cu prognosticul pacienţilor. Mecanismele prin care Ki67 este implicat în controlul ciclului celular nu sunt pe deplin elucidate, existând însă ipoteza conform căreia valorile crescute ale Ki67 ar acţiona prin inhibarea ciclului celular, inducând o auto-stabilizare celulară [289,290];

- factori de tranziţie epitelio-mezenchimală: a. E-caderina – joacă rol în adeziunea intercelulară, activarea lor fiind dependenţă de

prezenţa ionului de Ca2+. Împreună cu alte proteine cum ar fi actina, vinculina, β-catenina, desmogleina, intră în structura joncţiunilor de aderenţă intercelulară de tip zonula adherens. Alterări ale expresiei E-caderinei sunt asociate cu mobilitatea celulară crescută, favorizând astfel progresia şi metastazarea tumorală [289,290,302];

b. Snail, Twist şi ZEB1 – molecule recent descoperite ce se presupune că blochează transcripţia anumitor gene la nivelul celulelor epiteliale, având ca rezultat dobândirea unor caractere celulare mezenchimale ce ar favoriza celula în procesul de metastazare [290];

- stimularea neoangiogenezei: a. VEGF – este unul dintre cei mai importanţi factori proangiogenetici studiaţi a cărui

supraexpresie a fost corelată cu prognosticul nefavorabil, tranziţia de la forma localizată la boala metastatică şi recurenţa postoperatorie în cazul pacienţilor cu

10

neoplasm colonic. În plus, receptorul celular al VEGF (VEGFR) s-a dovedit a fi exprimat atât pe suprafaţa celulelor endoteliale cât şi pe suprafaţa celulelor neoplazice, densitatea lor fiind corelată cu prognosticul [289,290,306];

b. BFGF – factorul de creştere fibroblastic bazal (localizat la nivelul membranei bazale). Are rol de stimulare a diviziunii celulare, de activare a angiogenezei şi de menţinere a celulelor într-o fază nediferenţiată [290];

c. TGFβ – factorul de transformare a creşterii celulare. Are rolul de a stimula diferenţierea celulară, de a inhiba proliferarea celulară. La nivelul celulelor tumorale mutaţiile interesând TGFβ sau receptorul său TGFβR sunt responsabile de pierderea controlului inhibitor asupra diviziunii celulare. De asemenea, TGFβ joacă rol important în stimularea sintezei de enzime ce degradează matrixul extracelular, favorizând astfel mobilizarea celulelor şi metastazarea. Nu în ultimul rând, TGFβ are rolul de a stimula angiogeneza [289,290,306];

d. MAP-kinaze (MAPK) – protein-kinaze activate de mitogeni. Activarea MAPK în celulele neoplazice determină activarea unor clase de serin-treonin-kinaze cu rolul de a bloca apoptoza celulară [290];

- factori asociaţi cu mobilitatea celulară şi metastazarea: a. CD44 – a s-a dovedit a fi supraexprimat pe suprafaţa celulelor diverselor tipuri de

neoplazii asociate cu metastaze la distanţă. Dacă în condiţii normale CD44 acţionează ca receptor pentru acidul hialuronic, având rol în adeziunea intercelulară şi celulă-stromă, în cazul neoplaziilor CD44 este asociat cu adeziunea celulelor neoplazice de endoteliul vascular şi cu metastazarea precoce [289,290,305];

b. PAI-1 – la nivel tumoral PAI-1 se leagă de complexul plasminogen – urokinază pe care îl fixează de vitronectină, facilitând acţiunea plasminei astfel rezultate asupra matricei extracelulare [290];

c. CD24 – este o proteină glicosilată mucin-like ce este exprimată în mod fiziologic în pancreas, creier, muşchi, keratinocite, tubi renali şi în precursorii limfocitelor B şi T. Rolurile sale par a fi reprezentate de controlul proliferării celulare, al apoptozei şi al adeziunii intercelulare. Informaţiile recente sugerează rolul de favorizare a metastazării al CD24 ca urmare a interacţiunii dintre aceasta şi P-selectine. În mod fiziologic P-selectinele sunt exprimate de către celulele endoteliale şi trombocitele activate. Astfel s-a emis ipoteza conform căreia celulele tumorale care exprimă pe suprafaţă CD24 vor disemina mai uşor datorită formării de trombi prin cuplare cu trombocitele şi de a adera mai uşor la endoteliu odată ce au fost vehiculate în torentul circulator [100,290];

d. inhibitorul kinazei RAF-1 (RKIP) – recent descoperit, acesta pare a fi asociat cu mobilitatea crescută a celulelor neoplazice [290];

e. NDP-kinaza şi factorul nm23 – fără a fi încă pe deplin elucidat rolul lor în cadrul metabolismului celular, prezenţa acestor noi molecule este asociată cu metastazarea precoce şi prognosticul nefavorabil [290].

CAPITOLUL IV – DIAGNOSTICUL PARACLINIC AL

CANCERULUI DE COLON

IV.3. Diagnosticul imagistic al cancerului de colon Mijloacele imagistice de diagnostic au capacitatea de a furniza clinicienilor informaţii

preţioase, utile în stabilirea strategiei optime de evaluare şi tratament. Odată cu descoperirea razelor X în urmă cu peste un secol, explorarea imagistică a devenit o unealtă esenţială în diagnosticarea neoplaziilor digestive. Pe măsură ce descoperirile ştiinţifice au îmbunătăţit mijloacele tehnice

11

precum şi capacitatea noastră de a înţelege mecanismele implicate în creşterea şi metastazarea tumorilor maligne, caracteristicile explorărilor imagistice şi indicaţiile acestora au cunoscut o evoluţie continuă.

Explorarea radiologică convenţională, furnizând informaţii anatomice şi morfologice despre formaţiunile tumorale, continuă să reprezinte principala explorare în majoritatea departamentelor radiologice datorită faptului că este uşor de executat, este ieftină, se realizează folosind o doză mică de radiaţii şi furnizează un volum important de informaţii. În ultimii 20 de ani arsenalul imagistic a fost îmbogăţit prin introducerea în prctică a ultrasonografiei, a tomografiei computerizate (TC), a rezonanţei magnetice nucleare (RMN) şi a scintigrafiei, acestea devenind parte integrantă a evaluării diagnostice.

Ultrasonografia convenţională este metoda de screening uzuală dar cu un rol limitat în diagnosticarea şi stadializarea neoplaziilor tubului digestiv. Introducerea în practică a ecografiei Doppler şi power-Doppler, a armonicilor tisulare, a ecografiei 3D şi chiar 4D şi mai ales a ecoendoscopiei a reprezentat un pas important în îmbunătăţirea managementului clinico-terapeutic al pacienţilor cu neoplazii ale intestinului gros.

Introducerea în practica recentă a tomografiei cu emisie de pozitroni (TEP) folosind un analog al glucozei (F-18-fluoro-2-deoxi-D-glucoză = FDG) a reprezentat un moment important datorită posibilităţii de a diferenţia leziunile benigne de cele maligne, de a le stadializa şi a evalua prognosticul acestora prin analiza metabolismului glucidic [102,103]. Astfel, pe lîngă descrierea anatomică şi morfologică, s-a adăgat şi posibilitatea de a obţine informaţii metabolice despre formaţiunile tumorale [104,105].

IV.3.2. Ultrasonografia Analiza ultrasonografică a colonului se poate realiza fie transabdominal fie endocavitar

(ecografie endocavitară sau ecoendoscopie). Ecografia transabdominală a colonului are drept obiective analiza structurii peretelui

intestinal şi evaluarea extensiei loco-regionale (relaţia perete intestinal-organe adiacente şi existenţa adenopatiilor regionale) şi la distanţă (determinări secundare hepatice).

Uzual se folosesc transductori cu frecvenţă de 3,5-5MHz şi pentru îmbunătăţirea condiţiilor de vizualizare pacienţii trebuiesc examinaţi “a jeun” sau la 4-6 ore de la ultima alimentaţie. În condiţii de meteorism accentuat se pot efectua clisme (cu 12 ore şi apoi cu 30 minute înainte = hidrosonografie), se poate administra Macrogol, antiflatulente (cărbune medicinal, enzime pancreatice) sau antispastice în cazul unui peristaltism accentuat.

Examinarea se face folosind secţiuni perpendiculare şi urmărind continuitatea intestinului gros de la nivelul cecului şi până la nivelul rectului. Astfel, ferestrele de abord optim sunt reprezentate de fosa iliacă dreaptă (pentru cec), flancul drept (pentru colonul ascendent), epigastru (pentru colonul transvers) şi flancul stâng (pentru colonul descendent). Datorită dispoziţiei anatomice, celelalte segmente colonice (flexura hepatică, flexura splenică, joncţiunea recto-sigmoidiană) se vizualizează mai dificil.

În condiţii normale peretele colonic are o grosime de 4-5mm şi o structură pentalaminară concentrică datorată ecogenităţii diferite a structurilor parietale:

- stratul 1 (intern): ecogen – interfaţa conţinut luminal-mucoasa superficială; - stratul 2: hipoecogen – mucoasa profundă şi musculara mucoasei; - stratul 3: hiperecogen – submucoasa; - stratul 4: hipoecogen – musculara proprie; - stratul 5 (extern): hiperecogen – interfaţa dintre seroasă şi ţesutul adipos peridigestiv [76].

IV.3.3. Endoscopia digestivă inferioară Începând din anii `60, este binecunoscută preocuparea gastroenterologilor japonezi în direcţia

prevenţiei cancerului gastric cu ajutorul clasificării morfologice a tumorilor superficiale. Prin

12

experienţa acumulată şi prin studiile efectuate, în scurt timp, specialiştii japonezi au extins aplicabilitatea acestei clasificări şi la cancerul colonic. Deşi concomitent cu demersurile medicilor japonezi, medicii vest-europeni şi nord-americani efectuau studii cu privire la identificarea leziunilor cu potenţial malign, aceştia din urmă considerau că formaţiunile tumorale superficiale ocupă doar un rol minor în apariţia cancerului colorectal iar clasificarea japoneză ar fi mult prea complexă pentru practica clinică. Mai mult, specialiştii vest-europeni şi nord-americani considerau că succesiunea leziuni superficiale → cancer ar fi o trăsătură specifică doar evoluţiei neoplaziei colonice din Japonia. A fost nevoie ca medicii japonezi să efectueze studii endoscopice pe pacienţi vest-europeni (Fujii T, 1998) [106] şi nord-americani (Saitoh Y, 2001) [107] pentru a demonstra o incidenţă a neoplaziilor superficiale aproximatv egală cu a pacienţilor asiatici şi astfel realizarea unui consens internaţional cu privire la clasificarea endoscopică a leziunilor superficiale (Paris 2003, publicată de American Society for Gastrointestinal Endoscopy) [108].

Astfel clasificarea macroscopică a cancerului gastric a fost extrapolată la cancerele întregului tract digestiv:

Tip Aspect endoscopic Superficial – tip 0 Leziuni superficiale protruzive sau non-protruzive

Avansat – tip 1 Carcinom protruziv cu bază largă de implantare Avansat – tip 2 Carcinom ulcerat cu margini elevate, ascuţite Avansat – tip 3 Carcinom ulcerat cu margini imprecis definite Avansat – tip 4 Carcinom infiltrativ difuz, neulcerat Avansat – tip 5 Carcinom avansat neclasificabil

Figura IV.10: carcinom

protruziv (tip 1) Figura IV.11: carcinom

ulcerat cu margini elevate (tip 2)

Figura IV.12: carcinom ulcerat cu

margini imprecis definite (tip 3) Figura IV.13: carcinom

avansat (tip 5)

13

La rândul său, tipul 0 (superficial) se împarte în trei categorii: leziuni protruzive, leziuni neprotruzive – neescavate şi leziuni escavate, fiecare cu mai multe subcategorii.

Aspect endoscopic Tip

Protruziv Pediculat 0-Ip

Sesil 0-Is Neprotruziv – neescavat

Uşor supradenivelat 0-IIa Plat 0-IIb

Uşor subdenivelat 0-IIc

Supra- şi subdenivelat 0-IIc + IIa 0-IIa + IIc

Escavat Ulcerat 0-III

Escavat şi subdenivelat 0-IIc + III 0-III + IIc

Tabelul IV.2 – Clasificarea cancerului gastric precoce [106] Proporţia diferitelor subtipuri ale formaţiunilor tumorale superficiale colonice a fost studiată

mai ales de către endoscopiştii japonezi [109,110,111] şi este prezentată în următorul tabel: Subtip Procent

0-I 50% 0-IIa 44% 0-IIb <1% 0-IIc 5% 0-III <1%

Tabelul IV.3 – Proporţia cancerelor colonice precoce [109,110,111] Profunzimea invaziei în submucoasă s-a dovedit a fi corelată cu prezenţa adenopatiilor

regionale. Iniţial aprecierea histopatologică a invaziei submucoasei se realiza semicantitativ prin împărţirea artificială a submucoasei în trei straturi (sm1, sm2, sm3). În cazul pieselor de rezecţie endoscopică această gradare nu mai este aplicabilă deoarece piesa de rezecţie (mucozectomie) nu poate ajunge până la musculara proprie. Din acest motiv s-a convenit utilizarea unei aprecieri cantitative folosind un micrometru ce măsoară profunzimea invaziei în submucoasă faţă de musculara mucoasei. Pentru aprecierea siguranţei mucozectomiei formaţiunilor tumorale sesile colonice a fost stabilită limita de 1000 μm.

Figura IV.19: Exemplificarea limitei de rezecabilitate endoscopică de 1000μm.

14

Aceiaşi autori japonezi [112,113,114] au studiat corelaţia dintre subtipurile de formaţiuni tumorale superficiale colonice şi prezenţa infiltrării submucoasei, după cum urmează:

Subtip Procent 0-Ip 5% 0-Is 34% 0-IIa 4% 0-IIb 0% 0-IIc 61%

Tabelul IV.4 – Prezenţa invaziei în submucoasă

în funcţie de tipul leziunii [112,113,114]

CAPITOLUL VI – SCOPUL LUCRĂRII Studiul cancerului colonic a atras atenţia cercetătorilor din întreaga lume datorită incidenţei

crescute a acestei afecţiuni, a posibilităţilor actuale de explorare imagistică a colonului în totalitate precum şi de prelevare de material bioptic atât de necesar studiului histologic şi genetic.

Debutul insidios şi deficienţa programelor naţionale de screening al populaţiei reprezintă principalele cauze care stau la baza diagnosticării cancerului colonic în stadii avansate, când rezervele terapeutice sunt limitate şi şansele de supravieţuire scăzute. Rezultatul este valoarea crescută a morbidităţii şi mortalităţii prin cancer de colon care se regăsesc încă în multe state, atât europene cât şi de la nivel mondial.

Conform statisticilor OMS, în medie, în anul 2000 în Europa mortalitatea prin cancer colonic a fost de 19,8 decese la 100000 de locuitori, cele mai ridicate valori înregistrându-se în ţări ca: Ungaria, Cehia, Slovacia, Croaţia, Slovenia, Norvegia, Austria, Germania. Pentru ţara noastră, ultima raportare statistică a OMS arată o valoare de 20,6 decese la 100000 de locuitori, situând cancerul de colon pe locul doi în ierarhia deceselor prin tumori maligne, fiind situat după cancerul bronho-pulmonar atât la bărbaţi cât şi la femei.

Dacă în marea majoritate a ţărilor europene care se confruntă cu o mortalitate crescută prin cancer colonic (Germania, Austria, Norvegia, Ungaria, Finlanda, Marea Britanie) se înregistrează o tendinţă de scădere a mortalităţii ca rezultat al politicilor sanitare aplicate, în cazul României este alarmant faptul că mortalitatea prin cancer colonic înregistrează o tendinţă permanent crescătoare în ultimii 22 de ani (vezi figura I.1.2 şi I.1.3).

Această situaţie particulară a incidenţei şi mortalităţii prin cancer colonic care se înregistrează în ţara noastră, alături de posibilităţile de explorare imagistică şi de analiză histopatologică au creat premisele necesare care m-au determinat să aleg studierea afecţiunilor tumorale colonice drept temă de cercetare.

Trecând în revistă literatura de specialitate din ţara noastră am constatat numărul redus al cercetărilor imunohistochimice referitoare la cancerul colonic. Spre deosebire de situaţia constatată în ţara noastră, în literatura internaţională se constată în ultimii 20 de ani existenţa unui real interes cu privire la abordarea imunohistochimică a neoplaziilor colonice fapt justificat prin caracterul accesibil al tumorilor odată cu dezvoltarea şi perfecţionarea tehnicilor endoscopice de examinare şi nu în ultimul rând datorită costului redus şi a duratei mai scurte de obţinere a rezultatelor comparativ cu studiile genetice.

Toate aceste argumente au stat la baza alegerii explorării imunohistochimice a cancerului de colon drept temă de cercetare pentru realizarea tezei de doctorat, scopul fiind identificarea unor corelaţii între aspectele imunohistochimice şi prognosticul pacienţilor cu cancer de colon.

15

CAPITOLUL VII – MATERIAL ŞI METODĂ

VII.1. Lotul de studiu Cercetările au fost efectuate pe un număr de 117 pacienţi diagnosticaţi cu cancer colonic

internaţi în cadrul Clinicii Medicale a Spitalului Clinic CF Craiova în intervalul 2004-2008. Studiul a fost prospectiv, pacienţii fiind evaluaţi clinic şi paraclinic în momentul internării, iar ulterior intervenţiei chirurgicale supravegherea s-a efectuat la intervale de 1 an. Pentru pacienţii care nu s-au prezentat la termenele de reevaluare, s-au obţinut informaţii prin intermediul Serviciului Public Comunitar de Evidenţă Informatizată a Populaţiei din cadrul Consiliului Local al Municipiului Craiova.

Diagnosticul s-a bazat pe explorările imagistice disponibile (irigografie, ultrasonografie, colonoscopie) şi a fost confirmat de examenul histopatologic al fragmentelor de biopsie colonică şi al pieselor de rezecţie chirurgicală. Ulterior intervenţiei chirurgicale, pacienţii au urmat tratament şi dispensarizare oncologică în conformitate cu protocoalele terapeutice în vigoare la momentul actual.

Piesele de rezecţie au fost iniţial examinate şi prelucrate în cadrul Laboratorului de Anatomie Patologică al Spitalului Clinic CF Craiova. Examinarea anatomopatologică a constat din evaluarea macroscopică a tumorii colonice şi celorlalte fragmente tisulare rezecate (ganglioni limfatici, peritoneu şi alte fragmente tisulare suspectate de invazie neoplazică) şi ulterior pregătirea materialului tisular în vederea evaluării histopatologice şi imunohistochimice.

Examinarea histopatologică a implicat includerea la parafină a fragmentelor tisulare şi ulterior obţinerea de secţiuni histologice colorate hematoxilină – eozină ce au fost examinate microscopic pentru definirea tipului histologic, al gradului de diferenţiere, a producţiei de mucus, a prezenţei zonelor de necroză şi supuraţie intratumorală, a extensiei vasculare şi perineurale, a invaziei marginilor de rezecţie, a prezenţei leziunilor neoplazice sincrone precum şi la aprecierea gradului de extensie loco-regional.

Examinarea imunohistochimică s-a efectuat la Centrul pentru Studii de Morfologie Microscopică şi Imunologie din cadrul Universităţii de Medicină şi Farmacie din Craiova folosind în principal reactivi imunohistochimici achiziţionaţi în cadrul proiectului de cercetare TD-42/2007 contractat de finanţare 474/03.10.2007 încheiat cu Unitatea Executivă pentru Finanţarea Învăţământului Superior şi a Cercetării Ştiinţifice Universitare.

Rezultatele obţinute au fost analizate folosind programul de analiză statistică Microsoft Excel la care s-a utilizat suplimentar programul WinSTAT proiectat special pentru analiză statistică în domeniul medical.

VII.2 Metodele de studiu

VII.2.3 Explorarea imagistică Ultrasonografia a fost prima explorare imagistică efectuată de rutină la toţi pacienţii. Aceasta

s-a efectuat în cadrul Clinicii Medicale a Spitalului Clinic CF Craiova utilizând ultrasonograful ALOKA ProSound SSD-4000 dotat cu transductor convex cu frecvenţă variabilă de 2,5 – 6 MHz.

Colonoscopia a fost efectuată în Laboratorului de Endoscopie Digestivă din cadrul Spitalului Clinic CF Craiova folosind sistemul de endoscopie marca Olympus EVIS-CLV145 la care s-a ataşat un colonoscop flexibil cu lungimea de 170 cm.

În cursul examinării colonoscopice au fost prelevate biopsii seriate atât din formaţiunea tumorală identificată (minim 4 biopsii) căt şi din celelalte leziuni patologice evidenţiate în timpul examinării (polipi, leziuni inflamatorii). În cazul formaţiunilor tumorale stenozante ce nu permit trecerea endoscopului, examinarea lumenului restant a fost indicată a se efectua la 6 luni postoperator.

16

În urma examinării colonoscopice formaţiunile tumorale au fost apreciate din punct de vedere al aspectului macroscopic ca vegetante, ulcero-infiltrative sau infiltrativ-stenozante precizându-se totodată localizarea cât mai exactă a acestora (cec, colon asecendent, unghi hepatic, colon transvers, unghi splenic, colon descendent, colon sigmoid, rect).

Figura VII.15 – Pacienta D.M. 58 ani; tumoră

infiltrativ-stenozantă sigmoidiană. Figura VII.16 – Pacienta R.M. 72 ani; polipi rectal

degenerat.

Figur asm a VII.17 – Pacienta N.D. 42 ani; neopl

infiltrativ stenozant al valvei ileo-cecale. Figura VII.18 – Pacientul M.N. 67 ani; tumoră

vegetantă sigmoidiană.

Figura VII.19 – Pacienta P.L. 67 ani; neoplasm

ulcero-infiltrativ recto-sigmoidian Figura VII.20 – Pacienta B.S. 66 ani;

neoplasm vegetant rectal

17

Figura VII.21 – Pacienta F.A. 51 ani; polip pediculat degenerat situat la nivelul colonului

descendent

Figura VII.22 – Pacienta V.F. 71 ani; neoplasm vegetant de unghi splenic

VII.2.4 Examinarea histopatologică După intervenţia chirurgicală, piesele de rezecţie au fost analizate histopatologic în cadrul

Laboratorul de Anatomie Patologică al Spitalului Clinic CF Craiova. Iniţial s-a efectuat descrierea macroscopică a piesei de rezecţie, identificându-se segmentul anatomic din care provine şi orientarea acestuia. Apoi a fost înregistrat aspectul macroscopic al formaţiunii tumorale: forma, dimensiunea, culoarea, consistenţa, gradul de invazie al peretelui colonic, relaţia formaţiunii tumorale cu capetele de rezecţie ale segmentului respectiv, identificarea ganglionilor limfatici locali prezenţi în blocul de rezecţie sau prezentaţi ca piese de rezecţie separată dacă aceştia au fost localizaţi la distanţă de tumora primară. Ulterior s-au obţinut fragmente tisulare tumorale care au fost prelucrate prin includere la parafină folosind staţia Leica EG1160. Blocurile astfel prelucrate au fost secţionate cu ajutorul microtomului semiautomat Leica RM2145 în vederea obţinerii materialului tisular necesar examinării microscopice după parcurgerea prealabilă a etapelor colorării hematoxilină-eozină. Aceasta s-a realizat folosind staţia de colorare automată Leica Autostainer XL.

Examinarea microscopică propriu-zisă a fost realizată cu ajutorul microscopului de cercetare Zeiss Axioscop 2 Plus.

În cazul formaţiunilor tumorale care s-au dovedit intraoperator ca fiind inoperabile au fost prelevate cu această ocazie câteva fragmente tisulare necesare confirmării anatomopatologice a diagnosticului.

Examinarea microscopică a urmărit stabilirea următoarelor caracteristici tisulare: - tipului histologic al tumorii; - gradului de diferenţiere (G) – a fost apreciat ca nediferenţiat (G0), slab diferenţiat (G1),

moderat diferenţiat (G2) şi bine diferenţiat (G3); - aprecierea producţiei de mucus – tumorile secretante de mucus au fost apreciate ca tumori

mucinoase atunci când mucusul a fost prezent în cantitate mare extracelular şi tumori cu celule în „inel cu pecete” atunci când mucusul a fost prezent în cantitate mare intracelular, împingând nucleul celulei la periferie şi luând astfel aspectul caracteristic;

- aprecierea componentei fibro-conjunctive – când componenta fibro-conjunctivă a predominat în detrimentul componentei glandulare, tumorile au fost apreciate ca schiroase;

- prezenţa invaziei vasculare – absenţa invaziei vasculare a fost notată V0 în timp ce prezenţa invaziei a fost notată cu V1;

- extensia perineurală – prezenţa extensiei perineurale a fost notată cu Nv1 iar absenţa ei a fost notată cu Nv0;

18

- invazie microscopică a extremităţilor piesei de rezecţie – absenţa invaziei microscopice a capetelor de rezecţie a fost notată cu R0, prezenţa invaziei microscopice a fost notată cu R1 iar prezenţa invaziei macroscopice a fost notată cu R2;

- aprecierea gradului de extensie al tumorii – a fost realizată conform clasificării TNM în care Tis reprezintă tumoră „in situ”, T1 reprezintă invazia tumorală la nivelul mucoasei şi submucoasei, T2 reprezintă invazia muscularei propri, T3 invazia seroasei peritoneale dar fără extindere la organele adiacente iar T4 invazia seroasei peritoneale cu extensia directă la organele adiacente sau perforarea peritoneului visceral;

- evaluarea extensiei tumorale la nivelul ganglionilor limfatici – s-a realizat conform clasificării TNM: N0 absenţa invaziei ganglionare, N1 când sunt invadaţi maxim 3 ganglioni limfatici regionali şi N2 când sunt invadaţi minim 4 ganglioni limfatici regionali;

- prezenţa extensiei tumorale la distanţă – absenţa ei a fost notată cu M0 iar prezenţa metastazelor cu M1.

Examinarea histopatologică s-a închieat cu aprecierea stadiului de extensie tumoral pTNM. Astfel au fost încadraţi în stadiul I pacienţii cu T1 sau T2 şi N0M0, în stadiul IIA pacienţii cu T3N0M0, în stadiul IIB pacienţii cu T4N0M0, în stadiul IIIA pacienţii cu T1 sau T2 şi N1M0, în stadiul IIIB pacienţii cu T3 sau T4 şi N1M0, în stadiul IIIC pacienţii cu orice T şi N2M0 şi în stadiul IV pacienţii cu orice T, orice N şi M1.

VII.2.5 Analiza imunohistochimică După examinarea anatomopatologică, secţiunile tisulare, fixate în prealabil pe lame impregnate

cu polilizină, au fost analizate imunohistochimic în Centrului pentru Studii de Morfologie Microscopică şi Imunologie din cadrul Universităţii de Medicină şi Farmacie din Craiova. Au fost cercetaţi următorii markeri celulari:

- Proteina p53 – pusă în evidenţă cu ajutorul reactivului imunohistochimic Mo a Hu p53 Protein, Clone DO-7, Ready-to-Use, Autostainer, ce conţine anticorpi monoclonali murini de tip IgG anti-proteină p53 umană. Proteina p53 este o fosfoproteină nucleară cu masa moleculară de 53kD ce joacă un rol important în replicarea ADN şi în controlul ciclului celular. În prezenţa leziunilor genomului proteina p53 poate induce apoptoza celulară, acţionând astfel ca supresor tumoral. Proteina p53 este prezentă în toate celulele dar din cauza timpului de înjumătăţire foarte scurt, la analiza imunohistochimică ea este prezentă în cantităţi foarte mici. Spre deosebire de varianta normală, proteinele p53 mutante sunt mult mai stabile şi astfel pot fi evidenţiate în concentraţii mari în celulele neoplazice [289].

- Proteina bcl2 - pusă în evidenţă cu ajutorul reactivului imunohistochimic Mo a Hu BCL2 Oncoprotein, Clone 124, Ready-to-Use, Autostainer, ce conţine anticorpi monoclonali murini de tip IgG1, lanţuri kappa, anti-proteină bcl2 umană. Proteina bcl2 are o masă moleculară de 26kD şi este localizată la nivelul suprafeţei externe a membranei mitocondriale, a reticulului endoplasmatic sau a nucleului. Proteina bcl2 este o oncoproteină care are rolul de a bloca apoptoza celulară ce poate fi indusă de absenţa factorilor de creştere, alterări ale ADN, infecţie virală, acţiunea limfokinelor, medicaţia citostatică sau radioterapie. Cu toate acestea, s-au raportat rezultate paradoxale, în sensul în care exprimarea marcată a bcl2 în cancerul pulmonar, tiroidian sau mamar a fost asociată cu prognosticul favorabil [290].

- E-caderina (cunoscută anterior ca LCAM) – pusă în evidenţă cu ajutorul reactivului imunohistochimic E-Cadherin MAb MxH Clone NCH-38 RTU, ce conţine anticorpi monoclonali murini orientaţi împotriva E-caderinei umane. E-caderina este o moleculă de adeziune intercelulară ce intră în principal în componenţa joncţiunilor de aderenţă şi având masa moleculară de 120kD. Segmentul extracelular al E-caderinei este implicat în

19

adeziunea intercelulară modulată de ionul de calciu, în timp ce segmentul intracelular este ataşat de actina din citoschelet prin intermediul cateninei. Astfel E-caderina joacă rol important în stabilirea polarizării epiteliale, a stratificării celulare şi a diferenţierii glandulare. Absenţa E-caderinei din celulele neoplazice a fost corelată cu progresia tumorală şi metastazarea [290].

- CD44 - pusă în evidenţă cu ajutorul reactivului imunohistochimic Mo a Hu CD44, Phagocytic Glycoprotein-1, Clone DF1485, ce conţine anticorpi monoclonali murini de tip IgG1, lanţuri kappa, orientaţi împotriva CD44 umane. CD44 este o glicoproteină cu masa moleculară de 85-90kD cu rol de moleculă de adeziune transmembranară. De asemenea CD44 joacă rol de receptor celular pentru acidul hialuronic, având astfel rol în reglarea interacţiunilor dintre celule şi matrixul extracelular precum şi în migrarea celulară [290,304].

- α1-fetoproteină (AFP) – este o glicoproteină cu masa moleculară de 70kD ce poate fi pusă în evidenţă cu ajutorul reactivului imunohistochimic Rb a Hu AFP, Autostainer, ce conţine anticorpi policlonali de iepure orientaţi împotriva AFP umane. AFP este o proteină embrionară sintetizată în mod normal la nivelul sacului fetal, a ficatului fetal şi a tractului intestinal fetal, fiind absentă în celulele normale ale adultului. Prezenţa AFP a fost identificată în neoplaziile hepatice, gonadale şi ale tractului digestiv [290].

- Receptorul VEGF (VEGF-R) – pus în evidenţă cu ajutorul reactivului imunohistochimic Flt-4 (C-20), ce conţine anticorpi murini orientaţi împotriva receptorului pentru factorul de creştere al endoteliului vascular (VEGF) uman. Prezenţa VEGF şi a VEGF-R sunt markeri importanţi ai angiogenezei neoplazice [289,290,306].

- TGFβ-RI şi TGFβ-RII – puşi în evidenţă cu ajutorul reactivilor V-22 respectiv L-21, ce conţin anticorpi murini orientaţi împotriva receptorului de tip I şi II ai TGFβ uman. TGFβ sau factorul de transformare a creşterii este o proteină conţinând 112 aminoacizi cu rol de factor de creştere. Sintetizat îniţial ca monomer inactiv, TGFβ se activează în urma procesului de dimerizare. TGFβ îşi exercită efectul de inhibare a creşterii celulare prin legarea de receptorul transmembranar TGFβ-RII al cărui segment intracitoplasmatic joacă rolul de serin-treonin-kinază. Pentru ca acest mecanism să fie activ este necesară şi prezenţa TGFβ-RI cu rol de stabilizare a legăturii dintre TGFβ şi TGFβ-RII [289,290,309].

- PCNA – pus în evidenţă cu ajutorul reactivului imunohistochimic Mo a Hu PCNA, Clone PC10, care conţine anticorpi monoclonali murini de tip IgG2, lanţuri kappa, orientaţi împotriva PCNA uman. PCNA sau antigenul nuclear de proliferare celulară este o proteină de 36kD cu următoarele funcţii: rol de proteină accesorie pentru ADN-polimeraza δ implicată în sinteza ADN, rol de cofactor pentru ADN-polimeraza ε implicată în recombinarea ADN şi rol de reparare a leziunilor ADN. Este folosită în practică pentru studiul tumorilor cu rată înaltă de diviziune, în special a celor radiorezistente [290,297,298].

Pentru corecta interpretare a rezultatelor, aprecierea microscopică a gradului de fixare la nivelul celulelor neoplazice al fiecărui reactiv în parte a fost realizată folosind ca termen de comparaţie fragmente de ţesut epitelial colonic obţinute de la indivizi fără patologie tumorală. Rezultatele obţinute au fost interpretate, in funcţie de intensitatea fixării reactivului imunohistochimic, astfel:

- fixare absenă în cazul absenţei colorării (gradul 0); - fixare de intensitate redusă când s-a obţinut o coloraţie de intensitate slabă (gradul 1); - fixare de intensitate moderată când s-a obţinut o coloraţie de intensitate medie (gradul2);

fixare de intensitate crescută când s-a obţinut o coloraţie intensiă a specimenului tisular (gradul3).

20

CAPITOLUL IX – CONCLUZII

1. Analiza caracteristicilor demografice ale lotului de studiu a relevat: vârsta medie a fost de 62,84 ± 12,19 ani, (cu limite de 21 respectiv 82 de ani.), cu incidenţa maximă la grupa de vârstă 70-80 de ani (29,91%). În privinţa repartiţiei pe sexe se remarcă predominanţa sexului masculin în rândul pacienţilor cu cancer colonic – 52,14% versus 47,86%. Pentru sexul masculin incidenţa maximă (32,79%) a cancerului de colon s-a înregistrat la grupa de vârstă 60-70 de ani în timp ce pentru sexul feminin incidenţa maximă (37,50%) s-a înregistrat la grupa de vârstă 70-80 de ani. Se remarcă existenţa unei corelaţii înalt semnificative statistic (p=0,008390099) între sexul femin şi vârsta avansată a pacienţilor cu cancer colonic.

2. În funcţie de mediul de provenienţă s-a observat că 56,41% dintre pacienţi provin din mediul urban iar 43,59%, provin din mediul rural. Majoritatea pacienţilor de sex masculin provin din mediul urban (62,30%) în timp ce pentru sexul feminin repartiţia este aproximativ egală. Pentru pacienţii din mediul urban incidenţa maximă (28,79%) se înregistrează la grupa de vârstă 50-60 de ani în timp ce pentru cei din mediul rural incidenţa maximă (37,25%) se înregistrează la grupa de vârstă 70-80 de ani.

3. Pe durata celor cinci ani de studiu, incidenţa maximă anuală a cancerului de colon s-a înregistrat în anul 2007 (37,61%). Atât pentru bărbaţi cât şi pentru femei, anul 2007 a coincis nu numai cu maximul de incidenţă a canceului de colon (31,15%, respectiv 44,64 %) cât şi cu maximul incidenţei anuale pentru rezidenţii din mediul urban şi rural (40,91%, respectiv 33,33%).

4. Analiza factorilor de risc a relevat existenţa unei corelaţii foarte înalt semnificative statistic între vârsta tânără a pacienţilor şi existenţa afecţiunilor oncologice în antecedentele heredocolaterale (p=2,33868E-08). S-au consemnat corelaţii semnificative statistic între sexul masculin şi prezenţa în antecedentele heredocolaterale a afecţiunilor neoplazice (p=0,047126534). Antecedentele personale de colecistectomie s-au dovedit a fi seminificative statistic la pacienţii cu cancer colonic proveniţi din mediul rural (p=0,039045105). Fumatul a fost frecvent întâlnit la pacienţii de sex masculin diagnosticaţi cu cancer colonic (p=8,27973E-08) iar folosirea cronică a laxativelor a fost frecvent întâlnită la vârstele înaintate (p=6,33377E-06). A fost identificată o corelaţie semnificativă statistic între prezenţa polipilor colonici în antecedente şi localizarea distală a cancerului colonic (p=0,030205109).

5. Simptomatolgia clinică a fost dominată de prezenţa tulburărilor de tranzit (62,39%), urmate de durerea abdominală (59,83%), scăderea ponderală semnificativă (57,26%) şi hemoragia digestivă inferioară (52,99%). Prezenţa obezităţii (IMC>30) a fost înregistrată la 63,25% dintre pacienţi, fiind mai frecvent întâlnită odată cu înaintarea în vârstă (p=0,070117546) şi prevalent la cei cu antecedente de colecistectomie (p=0,045775573). Hemoragia digestivă inferioară a fost evenimentul asociat mai frecvent cu existenţa unui tranzit intestinal accelerat (p=0,044621548), durerea abdominală fiind consemnată mai ales la pacienţii fără semne de hemoragie digestivă inferioară (p=0,001005331) iar scăderea ponderală a fost frecvent întâlnită în cazul pacienţilor cu mase tumorale abdominale palpabile (p=0,042536645). Durerea abdominală s-a asociat mai frecvent localizării proximale a tumorii (p=0,000300958) în timp ce hemoragia digestivă inferioară a fost caracteristică mai ales localizării distale (p= 0,00104033). Tranzitul intestinal încetinit sau absent a fost asociat frecvent cu topografia distală a leziunilor (p=0,026368876) precum şi cu tipul tumoral infiltrativ-stenozant (p=0,037694231). Localizarea proximală a tumorii a fost frecvent simptomatică prin mase tumorale abdomniale palpabile (p=0,00581232).

6. Topografic cancerele localizate la nivelul rectului şi colonului sigmoid au totalizat 71,79%, formele ulcerativ-infiltrative fiind predominante - 41,03%. Pattern-urile ulcerativ-infiltrative şi infiltrativ-stenozante au caracterizat predilect cancerele sigmoidiene şi rectale, cele vegetante fiind comune mai ales topografiei ceco-ascendentului (p=0,072902367).

21

Tumorile de tip infiltrativ au fost mai frecvent identificate în cazul coexistenţei unei neoplazii colonice sincrone (p=0,035710981).

7. Din punct de vedere histopatologic dominante au fost formele de adenocarcinom (99,15%), cele mai frecvente fiind cele moderat diferenţiate (85,47%).Tumorile slab diferenţiate au avut frecvent aspect infiltrativ (p=0,000991731).

8. În conformitate cu stadializarea TNM, diagnosticul a fost confirmat mai ales în stadiul T4 (76,07%), cu extensie limfatică absentă N0 (45,30%) şi metastazare absentă M0 (77,78%). Topografia metastazelor a fost prevalentă la nivel peritoneal (11,11%). Ponderea cea mai mare au înregistrat-o stadiile IIB şi IV, totalizând 47,01%. Pattern-ul tumoral infiltrativ a fost frecvent identificat în stadii avansate TNM (p=3,89388E-05). A fost înregistrată o corelaţie foarte înalt semnificativă statistic între cancerele slab diferenţiate şi stadiile TNM avansate (p=2,96738E-05), diferenţierea precară asociind frecvent invazie vasculară (p=0,028850125).

9. Analiza imunohistochimică a evidenţiat o densitate moderat-crescută a PCNA şi o densitate moderată a E-caderinei la nivelul celulelor neoplazice iar ceilalţi markeri tumorali au înregistrat o densitate moderat scăzută (ca în cazul P53) sau scăzută (ca în cazul BCL2, CD44, AFP, VEGFR, TGFβRI, TGFβRII).

10. Imunomarcajul VEGRF este mai bine exprimat la pacienţii tineri (p=0,036784814) iar BCL2 s-a dovedit a fi mai frecvent exprimat la pacienţii proveniţi din mediul rural (0,032194209). Ceilalţi markeri nu s-au dovedit a fi influenţaţi de sexul, vârsta sau mediul de provenienţă al pacienţilor. Markerii P53 şi VEGRF au fost frecvent întâlniţi la paceinţii nefumători (p=0,048093975 respectiv p=0,08765064) în timp ce markerii CD44 şi TGFβRII la pacientele cu antecedente personale de neoplasm uterin (p=0,015849768 respectiv p=0,013082801). Densitatea BCL2 a fost mai mare la pacienţii colecistectomizaţi (p=0,01628123). Markerii P53 şi CD44 au fost mai frecvent exprimaţi în cazul pacienţilor cu IMC normal (p=0,003997589, respectiv p=0,02661489).

11. Localizarea proximală a cancerului de colon a fost mai frecvent asociată cu exprimarea VEGFR (p=0,00978234), BCL2 (p=0,09163479) sau PCNA (p=0,114216678), în timp ce localizarea distală cu a fost asociată cu exprimarea TGFβRII (p=0,04912224). Markerul E-caderină a fost prezent predominant în cazul tumorilor infiltrativ-stenozante (p=0,000737747) iar VEGFR a înregistrat o densitate mai mare în cazul tumorilor infiltrative (p=0,08566541).

12. Stadiile avansate TNM au fost asociate cu o exprimare crescută a PCNA, CD44 şi VEGFR (p=0,015942516, p=0,000499204 respectiv p=4,8078E-07). Markerii PCNA, BCL2 şi VEGFR au avut o densitate mai mare respectiv E-caderina a fost mai puţin exprimată în cazul tumorilor slab diferenţiate (p=1,29931E-07, p=0,028917833, p=0,03354764 respectiv p=0,010455963). Markerii PCNA şi VEGFR au fost mai bine exprimaţi în cazul stadiilor avansate de extensie ale tumorii primare (p=0,001677491 respectiv p=0,01359097). Markerii CD44 şi VEGFR au avut o exprimare crescută în cazul tumorilor cu extensie limfatică (p=0,01383172 respectiv p=0,00490929) sau în prezenţa metastazelor la distanţă (p=0,00043875 respectiv p=4,6081E-08). Markerul BCL2 a fost mai bine exprimat în cazul invaziei vasculare şi a prezenţei neoplaziilor sincrone (p=0,001813436 respectiv p=0,010386377). Exprimarea simultană a mai multor markeri tumorali a fost constatată în cazul asocierii dintre P53 şi CD44 (p=0,00147674), între AFP şi PCNA (p=0,013292528), între BCL2, CD44 şi AFP (p=0,018341376 respectiv p=0,028688822), între CD44 şi VEGFR (p=0,00046619).

13. Analiza statistică Kaplan-Meier a evidenţiat o probabilitate de supravieţuire de 0,6962155 pe durata studiată în timp ce analiza regresiilor Cox a furnizat o valoare de 0,7173687. Probabilitatea de supravieţuire nu a fost influenţată de sexul pacienţilor. S-a observat o probabilitate mai mare de deces în rândul pacienţilor din mediul urban iar din punct de vedere al vârstei probabilitatea cea mai mare de deces s-a înregistrat la grupele de vârstă 30-40 de ani (0,50) şi 70-80 de ani (0,6338).

22

14. Nu a fost probată influenţa unor variabile precum fumatul, antecedentele heredocolaterale, cele personale patologice asupra probabilităţii de supravieţuire. De asemenea, datele clinice nu au valoare de predicţie a supravieţuirii.

15. Cea mai scăzută probabilitate de supravieţuire s-a observat în cazul localizării tumorii la nivelul colonului ascendent sau a rectului (0,24609 respectiv 0,57997). Tumorile de tip ulcero-infiltrativ s-au dovedit a determina cea mai scăzută supravieţuire (0,55416).

16. Supravieţuirea pacienţilor nu s-a dovedit a fi influenţată de gradul de diferenţiere tumorală, de extensia locală a tumorii primare sau de invazia limfoganglionară. Prezenţa metastazelor la distanţă a redus însă semnificativ probabilitatea de supravieţuire a pacienţilor (0,544871 în prezenţa metastazelor faţă de 0,741336 în absenţa acestora) (p=0,016174). Conform calculului regresiei Cox, tumorile cu producţie crescută de mucus s-au asociat cu o scădere a probabilităţii de supravieţuire (0,704502) (p= 0,022229).

17. Stadiile IIIB şi IV (TNM) au fost asociate cu cele mai reduse probabilităţi de supravieţuire (0,59423 respectiv 0,54453), fără a avea însă semnificaţie statistică (p=0,078633819).

18. Gradul de exprimare al markerului PCNA nu s-a dovedit a avea influenţă semnificativă statistic asupra supravieţuirii pacienţilor (p=0,312961949), deşi exprimarea la nivel înalt a acestuia a fost corelată cu o probabilitate de 0,7150496 de supravieţuire. Nici exprimarea markerilor E-caderină sau TGFβRII nu s-a dovedit a avea influenţă semnificativă statistic asupra supravieţuirii pacienţilor (p=0,649971726 respectiv p=0,355495431) cu toate că, în cazul TGFβRII, densitatea mai mare a fost asociată cu o probabilitate mai mică de supraveiţuire (0,466666).

19. Datorită numărului insuficient de rezultate pozitive obţinute în urma analizei imunohistochimice a markerilor P53, BCL2, CD44, AFP, VEGFR şi TGFβRI nu a fost posibilă calcularea, cu ajutorul funcţiei Kaplan-Meier, a influenţei pe care o determină aceştia asupra supravieţuirii pacienţilor. Calculând regresia Cox pentru aceşti markeri nu s-au evidenţiat influenţe semnifiactive statistic asupra probabilităţii de supravieţuire. Cu toate acestea, riscul de deces calculat a fost supraunitar pentru markerii: PCNA (1,27522983), BCL2 (1,224023342), CD44 (1,555042093), AFP (1,437898935), TGFβRI (1,450602303), TGFβRII (1,340474536).

20. Ca o concluzie generală, cercetarea markerilor imunohistochimici poate fi utilă în depistarea precoce a formelor agresive de cancer colonic, chiar dacă doar o parte dintre markerii studiaţi şi doar într-un număr limitat de studii s-au dovedit a influenţa probabilitatea de supravieţuire a pacienţilor. Se impun însă studii populaţionale mult mai ample şi cercetarea unei varietăţi cât mai mari de markeri tumorali în scopul obţinerii unor rezultate cu o înaltă semnificaţie statistică.

23

Bibliografie

1. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M et al. Molecular Biology of the Cell. 4th ed. New York: Garland

Publishing; 2002; 2. Strachan T and Read AP. Human Molecular Genetics 2. 2nd ed. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers,

Ltd; 1999; 3. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P et al. Molecular Cell Biology. 4th ed. New York: W. H.

Freeman & Co.; c2000.; 4. Howe GR, Aaronson KJ, Benito E, et al: The relationship between dietary fat intake and risk of colorectal

cancer: evidence from the combined analysis of 13 case control studies. Cancer Causes Control 8:215, 1997; 5. Atillasoy E, Fein B, Weinstein IB, et al: Fecal diacylglycerol concentrations and calcium supplementation.

Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 4:795, 1997; 6. Slattery ML, Schemacker MC, Smith KR, et al: Physical activity, diet and risk of colon cancer in Utah. Am J

Epidemiol 128:989, 1988; 7. Colon and Rectum. Food, Nutrition and the Prevention of Cancer: A Global Perspective. World Cancer

Research Fund/American Institute for Cancer Research, Washington, DC, 1997; 8. Neugut AI, Jacobson JS, De Vivo I: Epidemiology of colorectal adenomatous polyps. Cancer Epidemiol

Biomarkers Prev 2:159, 1993; 9. Neagoe Adina, Ana-Maria Molnar, Monica Acalovschi, Andrada Seicean, Alexandru Şerban: Risk factors for

colorectal cancer – an epidemiologic descriptive study of a series of 333 patients. Romanian Journal of Gastroenterology, vol. 13, No. 3, 2004, pag. 187-193;

10. Willett SC, Stampler MJ, Colditz GA, et al: Relation of meat fat and fiber intake to the risk of colon cancer in a prospective study among women. N Engl J Med 323:1664, 1990;

11. Thun MJ, Calle EE, Namboodiri MM, et al: Risk factors for fatal colon cancer in a large prospective study. J Natl Cancer Inst 84:1491, 1992;

12. Bostick RM, Potter JD, Sellers TA, et al: Relation of calcium, vitamin D and dairy food intake to incidence of colon cancer among older women: the Iowa Women's Health Study. Am J Epidemiol 137:1302, 1993;

13. Shike M, Winawer S, Greenwald P. Primary prevention of colorectal cancer. Bull WHO 1990, 68: 377; 14. Potter JD. Colorectal cancer: molecules and populations. J Natl Cancer Inst 1999;91:916-32; 15. Corpet D, Stamp D, Medline A, et al. Promotion of colonic microadenoma growth in mice and rats fed

cooked sugar or casein and fat. Cancer Res 1990;5:6955-8; 16. Ito N, Hasegawa R, Sano M, et al. A new colon and mammary carcinogen in cooked food, 2-amino-1-methyl-

6-phenylimidazo (4,5-b) pyridine (PhIP). Carcinogenesis 1991;12:1503-6; 17. Probst-Hensch , Sinha R, Longnecker MP, et al. Meat preparation and colorectal adenomas in a large

sigmoidoscopy-based case-control study in California (United States). Cancer Causes Control 1997;8:175-83; 18. Calle EE, Rodriguez C, Walker-Thurmond K, et al: Overweight, obesity and mortality from cancer in a

prospectively studied cohort of U.S. adults. N Engl J Med 348:1625, 2003; 19. Colon and Rectum. Food, Nutrition and the Prevention of Cancer: A Global Perspective. World Cancer

Research Fund/American Institute for Cancer Research, Washington, DC, 1997; 20. Steinmetz KA, Potter JD: Vegetables, fruit and cancer II: mechanisms. Cancer Causes Control 2:427, 1991; 21. Howe GR, Benito E, Castelleto R, et al: Dietary intake of fiber and decreased risk of cancers of the colon and

rectum: evidence from the combined analysis of 13 case-control studies. J Natl Cancer Inst 84:1887, 1992; 22. Fuchs CS, Giovannucci EL, Colditz GA, et al: Dietary fiber and the risk of colorectal cancer and adenoma in

women. N Engl J Med 340:169, 1999; 23. Schatzkin A, Lanza E, Corle D, et al: Lack of effect of a low-fat, high-fiber diet on the recurrence of

colorectal adenomas. N Engl J Med 342:1149, 2000; 24. Alberts DS, Martinez ME, Roe DJ, et al: Lack of effect of a high-fiber cereal supplement on the recurrence of

colorectal adenomas. N Engl J Med 342:1146, 2000; 25. Terry P, Giovannucci E, Michels KB, et al: Fruit, vegetables, dietary fiber, and risk of colorectal cancer. J

Natl Cancer Inst 93:525, 2001; 26. American Gastroenterological Association. AGA technical review: impact of dietary fiber on colon cancer

occurrence. Gastroenterology 2000;118:1235-57; 27. Martinez ME, Willett WC: Calcium, vitamin D and colorectal cancer: a review of the epidemiologic

evidence. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 7:163, 1998;

24

28. Calcium supplements for the prevention of colorectal adenomas. Calcium Polyp Prevention Study Group. N Engl J Med 340:101, 1999;

29. Wu K, Willett WC, Fuchs CS, et al. Calcium intake and risk of colon cancer in women and men, J Natl Cancer Inst 2002;94:437-46;

30. Martinez ME, Willett WC. Calcium, vitamin D, and colorectal cancer: a review of epidemiologic evidence. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1998;7:163-8;

31. Newmark HL, Wargovich MJ, Bruce WR. Colon cancer and dietary fat, phosphate, and calcium: a hypothesis. J Natl Cancer Inst 1984;72:1323-5;

32. Terry P, Gionvannucci E, Berkvist L, et al. Body weight and colorectal cancer risk in a cohort of Swedish women: relation varies by age of cancer and site. Br J Cancer 2001;51:191-4;

33. Terry PD, Miller AB, Rohan TE. Obesity and colorectal cancer risk in women. Gut 2002;51:191-4; 34. Chow WH, Malker HS, Hsing AW, et al. Occupational risks for colon cancer in Sweden. J Occup Med

1994;36:647-51; 35. Slattery M, Benson J, Curtin K, et al. Carotenoids and colon cancer. Am J Clin Nutr 2000;71:575-82; 36. McKeown-Eyssen G, Hollowey C, Jazmaji V et al. A randomized trial of vitamins A, C and E in the

prevention of recurrence of colorectal polyps. Cancer Res. 1988; 48:4701; 37. Giovannucci E, Stampfer MJ, Colditz GA, et al: Folate, methionine and alcohol intake and risk of colorectal

adenoma. J Natl Cancer Inst 85:875, 1993; 38. Choi SW, Mason JB: Folate and carcinogenesis: an integrated scheme. J Nutr 130:129, 2000; 39. Giovannucci E, Stampfer MJ, Colditz GA, et al: Multivitamin use, folate and colon cancer in women in the

Nurses' Health Study. Ann Intern Med 129:517, 1998; 40. Houlston RS, Tomlinson IPM. Polymorphisms and colorectal tumor risk. Gastroenterology 2001;121:282-

301; 41. Fuchs CS, Willett WC, Colditz GA, et al. The influence of folate and multivitamin use on the familial risk of

colon cancer in women. Cancer Epidemiol Biomark Prev 2002; 11: 227-34; 42. Pufulete M, Al Ghnaniem R, Leather AJ, et al. Folate status, genomic DNA hypomethylation, and risk of

colorectal adenoma and cancer: a case control study. Gastroenterology 2003; 124: 1240-8; 43. Seo YR, Kelley MR, Smith ML. Selenomethionine regulation of p53 by a ref1-dependent redox mechanism.

Proc Natl Acad Sci 2002; 99: 14 548-53; 44. Becker K, Gromer S, Schirmer RH, Muller S. Thioredoxin reductase as a pathophysiological factor and drug

target. Eur J Biochem 2000; 267: 6118-25; 45. Ganther HE. Selenium metabolism, selenoproteins and mechanisms of cancer prevention: complexities with

thioredoxin reductase. Carcinogenesis 1999; 20: 1657-66; 46. Moore LL, Bradlee ML, Singer MR, Splansky GL, Proctor MH, Ellison RC, Kreger BE. BMI and waist

circumference as predictors of lifetime colon cancer risk in Framingham Study adults. Int J Obes Relat Metab Disord. 2004 Apr;28(4):559-67;

47. Baron JA, Sandler RSHRW, Mandel JS, et al. Folate intake, alcohol consumption, cigarette smoking, and risk of colorectal adenomas. J Natl Cancer Inst 1998;90:57-62;

48. Longnecker MP, Orza MJ, Adams ME, et al. A meta-analysis of alcoholic beverage consumption in relation to risk of colorectal cancer. Cancer Causes Control 1990;1:59-68;

49. World Cancer Research Fund (WCRF) Panel. Diet, nutrition, and the prevention of cancer: a global perspective. Washington (DC): WCRF/American Institute of Cancer Research; 1997;

50. Gionvannucci E, Stampfer MJ, Colditz CA, et al. Folate, methionine, and alcohol intake and risk of colorectal adenoma. J Natl Cancer Inst 1993;85:875-84;

51. Baron JA, La Vecchia C, Levi F. The antiestrogenic effect of cigarette smoking in women. Am J Obstet Gynecol 1990; 162: 502–14;

52. Sopori ML, Kozak W. Immunomodulatory effects of cigarette smoke. J Neuroimmunol 1998; 83: 148–56; 53. Giovannucci E, Rimm EB, Stampfer MJ, Colditz GA, Ascherio A, Kearney J, et al. A prospective study of

cigarette smoking and risk of colorectal adenoma and colorectal cancer in U.S. men. J Natl Cancer Inst 1994;86: 183–91;

54. Knekt P, Hakama M, Jarvinen R, Pukkala E, Heliovaara M. Smoking and risk of colorectal cancer. Br J Cancer 1998;78:136–9;

55. Kakiuchi H, Watanabe M, Ushijima T, Toyota M, Imai K, Weisburger J, et al. Specific 58-GGGA-38®58-GGA-38 mutation of the Apc gene in rat colon tumors induced by 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5- b]pyridine. Proc Natl Acad Sci U S A 1995; 92:910–4;

25

56. Eaden JA, Abrams KR, Mayberry JF: The true risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gastroenterology 2001, 48:526-535;

57. Gillen CD, Walmsley RS, Prior P, et al.: Ulcerative colitis and Crohn's disease: a comparison of the colorectal cancer risk in extensive colitis. Gut 1994, 35:1590-1592;

58. Gyde SN, Prior P, Macartney JC, et al.: Malignancy in Crohn's disease. Gut 1980, 21:1024-1029; 59. Weedon DD, Shorter RG, Ilstrup DM, et al.: Crohn's disease and cancer. N Engl J Med 1973, 289:1099-1103; 60. Podolsky DK: Inflammatory bowel disease (2). N Engl J Med 1991, 325:1008-1016; 61. Tarmin L, Yin J, Harpaz N, et al.: Adenomatous polyposis coli gene mutations in ulcerative colitis-associated

dysplasias and cancers versus sporadic colon neoplasms. Cancer Res 1995, 55:2035-2038; 62. Yin J, Harpaz N, Tong Y, et al.: p53 Point mutations in dysplastic and cancerous ulcerative colitis lesions.

Gastroenterology 1993, 104:1633-1639; 63. Brentall TA, Crispen DA, Rabinovitch PS, et al.: Mutations in the p53 gene: an early marker of neoplastic

progression in ulcerative colitis. Gastroenterology 1994, 107:369-378; 64. Ezaki T, Watanabe M, Inoue N, et al.: A specific genetic alteration on chromosome 6 in ulcerative colitis-

associated colorectal cancers. Cancer Res 2003, 63:3747-3749; 65. Mikami T, Yoshida T, Akino F, et al.: Apoptosis regulation differs between ulcerative colitis-associated and

sporadic colonic tumors. Am J Clin Pathol 2003, 119:723-730; 66. Sato F, Shibata D, Harpaz N, et al.: Aberrant methylation of the HPP1 gene in ulcerative colitis-associated

colorectal carcinoma. Cancer Res 2002, 62:6820-6822; 67. Azarschab P, Porschen R, Gregor M, et al.: Epigenetic control of the E-Cadherin gene (CDHI) by CpG

methylation in colectomy samples of patients with ulcerative colitis. Genes Chromosomes Cancer 2002, 35:121-126;

68. Soetikno RM, Lin OS, Heidenreich PA, et al.: Increased risk of colorectal neoplasia in patients with primary sclerosing cholangitis and ulcerative colitis: a meta-analysis. Gastrointest Endosc 2002, 56:48-54;

69. Fausa O, Schrumpf E, Elgjo K: Relationship of inflammatory bowel disease and primary sclerosing cholangitis. Semin Liver Dis 1991, 11:31-39;

70. Sonnenberg A, Muller AD. Constipation and cathartics as risk factors of colorectal cancer: a meta-analysis. Pharmacology. 1993 Oct;47 Suppl 1:224-33;

71. Roberts MC, Millikan RC, Galanko JA, Martin C, Sandler RS. Constipation, laxative use, and colon cancer in a North Carolina population. Am J Gastroenterol. 2003 Apr;98(4):857-64;

72. Barone M, Berloco P, Ladisa R, Ierardi E, Caruso ML, Valentini AM, Notarnicola M, Di LA, Francavilla A. Demonstration of a direct stimulatory effect of bile salts on rat colonic epithelial cell proliferation. Scand J Gastroenterol. 2002 Jan;37(1):88-94;

73. Shimamoto C, Hirata I, Takao Y, Takiuchi H, Morikawa H, Nakagawa Y, Katsu K. Alteration of colonic mucin after ureterosigmoidostomy. Dis Colon Rectum. 2000 Apr;43(4):526-31;

74. Bayerdorffer E, Mannes GA, Ochsenkuhn T, Dirschedl P, Wiebecke B, Paumgartner G. Unconjugated secondary bile acids in the serum of patients with colorectal adenomas. Gut 1995; 36: 268-73;

75. Ochsenkuhn T, Bayerdorffer E, Meining A, et al. Colonic mucosal proliferation is related to serum deoxycholic acid levels. Cancer 1999; 85: 1664-9;

76. Grigorescu M. Tratat de gastroenterologie, vol.2, Editura Medicală Naţională, 2001; 77. Gherasim L. Medicină internă, vol. 3, Editura Medicală, 1999; 78. Ciurea T, Pascu O, Stanciu C. Gastroenterologie şi hepatologie - actualităţi 2003, Editura Medicală, 2003; 79. Oncology: Molecular genetics of cancer - Daniel A. Haber. ACP Medicine, WebMD Inc. June 2004; 80. Albert de la Chapelle: Genetic predisposition to colorectal cancer. Nature Reviews Cancer, 10/25/2004; 81. John D. Potter. Colorectal cancer: moleculs and populations. Journal of the National Cancer Institute, vol. 91,

no. 11, June, 1999; 82. Gryfe R, Kim H, Hsieh ETK, et al. Tumor microsatellite instability and clinical outcome in young patients

with colorectal cancer. N Engl J Med 2000;342:69–77; 83. Vasen HF, Mecklin JP, Khan PM, Lynch HT. The International Collaborative Group on Hereditary Non-

Polyposis Colorectal Cancer (ICG-HNPCC). Dis Colon Rectum 1991;34:424–425; 84. Vasen HF, Watson P, Mecklin JP, Lynch HT. New clinical criteria for hereditary nonpolyposis colorectal

cancer (HNPCC, Lynch syndrome) proposed by the International Collaborative group on HNPCC. Gastroenterology 1999;116:1453–1456;

26

85. Rodriguez-Bigas MA, Boland CR, Hamilton SR, Henson DE, Jass JR, Khan PM, et al. A National Cancer Institute Workshop on Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer Syndrome: meeting highlights and Bethesda guidelines. J Natl Cancer Inst 1997; 89:1758–1762;

86. Giardiello FM, Brensinger JD, Petersen GM. AGA medical position statement and technical review on hereditary colorectal cancer and genetic testing. Gastroenterology 2001;121:195–213;

87. Gosden RG, Feinberg AP. Genetics and Epigenetics - Nature’s Pen-and-Pencil Set. N Engl J Med 2007;356:731-733;

88. Hitchins MP, Wong JJL, Suthers G, et al. Inheritance of a cancer-associated MLH1 germ-line epimutation. N Engl J Med 2007;356:697-705;

89. Nilsen TIL, Romundstad PR, Troisi R et al. Birth size and colorectal cancer risk: a prospective population based study. Gut 2005;54;1728-1732;

90. Newsome CA, Shiell AW, Fall CH, et al. Is birth weight related to later glucose and insulin metabolism?—A systematic review. Diabetes Med 2003;20:339–48;

91. Schoen RE, Tangen CM, Kuller LH, et al. Increased blood glucose and insulin, body size, and incident colorectal cancer. J Natl Cancer Inst 1999;91:1147–54;

92. Yamada K, Araki S, Tamura M, et al. Relation of serum total cholesterol, serum triglycerides and fasting plasma glucose to colorectal carcinoma in situ. Int J Epidemiol 1998;27:794–8;

93. Hu FB, Manson JE, Liu S, et al. Prospective study of adult onset diabetes mellitus (type 2) and risk of colorectal cancer in women. J Natl Cancer Inst 1999;91:542–7;

94. Will JC, Galuska DA, Vinicor F, et al. Colorectal cancer: another complication of diabetes mellitus? Am J Epidemiol 1998;147:816–25;

95. Corpet DE, Jacquinet C, Peiffer G, et al. Insulin injections promote the growth of aberrant crypt foci in the colon of rats. Nutr Cancer 1997;27:316–20;

96. Watkins LF, Lewis LR, Levine AE. Characterization of the synergistic effect of insulin and transferrin and the regulation of their receptors on a human colon carcinoma cell line. Int J Cancer 1990;45:372–5;

97. Sandhu MS, Dunger DB, Giovannucci EL. Insulin, insulin-like growth factor-I (IGF-I), IGF binding proteins, their biologic interactions, and colorectal cancer. J Natl Cancer Inst 2002;94:972–80;

98. Mandel JS, Bond JH, Church TR, Snover DC, Bradley GM, Schuman LM, et al. Reducing mortality from colorectal cancer by screening for fecal occultblood. Minnesota Colon Cancer Control Study. N Engl J Med 1993;328:1365–1371;

99. Regueiro CR. AGA Future Trends Committee Report: Colorectal Cancer: A Qualitative Review of Emerging Screening and Diagnostic Technologies. Gastroenterology 2005;129:1083–1103;

100. Boland CR. Malignant tumors of the colon. In: Yamada T, Alpers DH, Laine L. Textbook of gastroenterology. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins Publishers. 1999: 2023-2082;

101. Rex DK, Johnson DA, Liebman DA et al. Colorectal cancer prevention 2000: screening recomandations of the American College of Gastroenterology. Am J Gastroenterology 2000; 95: 868-877;

102. Bomanji JB, Costa DC, Ell PJ. Clinical role of positron emission tomography in oncology. Lancet Oncol 2001;2:157-64;

103. Nabi HA, Zubeldia JM. Clinical applications of (18)F-FDG in oncology. J Nucl Med Technol 2002;30:3-9; 104. Price P. PET as a potential tool of imaging molecular mechanisms of oncology in man. Trends Mol Med

2001;7:442-6; 105. Czernin J, Phelps ME. Positron emission tomography scanning: current and future applications. Annu Rev

Med 2002;53:89-112; 106. Fujii T, Rembacken BJ, Dixon MF et al. Flat adenomas in the United Kingdom: are treatable cancers being

missed? Endoscopy 1998; 30: 437-443; 107. Saitoh Y, Waxman I, West AB et al. Prevalence and distinctive biologic features of flat colorectal

adenomas in the North American population. Gastroenterology 2001; 120: 1657-1665; 108. The Paris endoscopic classification of superficial neoplastic lesions. Esophagus, stomach and colon:

November 30 to December 1, 2002. Gastrointest Endosc 2003; 58: S3-S43; 109. Kudo S, Kashida H, Tamura T et al. Colonoscopic diagnosis and management of non polypoid early

colorectal cancer. World J Surg 2000; 24: 1081-1090; 110. Hurlstone DP, Fujii T, Lobo AJ. Early detection of colorectal cancer using high−magnification

chromoscopic colonoscopy. Br J Surg 2002; 89: 272-282; 111. Kato S, Fujii T, Koba I et al. Assessment of colorectal lesions using magnifying colonoscopy and mucosal

dye spraying: can significant lesions be distinguished? Endoscopy 2001; 33: 306-310;

27

112. Yokoyama J, Ajioka Y, Watanabe H et al. Lymph node metastasis and micrometastasis of submucosal invasive colorectal carcinoma: an indicator of the curative potential of endoscopic treatment. Acta Med Biol 2002; 50: 1-8;

113. Egashira Y, Yoshida T, Hirata I et al. Analysis of pathological risk factors for lymph node metastasis of submucosal invasive colon cancer. Mod Pathol 2004; 17: 503-511;

114. Kobayashi M, Watanabe H, Maeo S et al. Correlation of histological atypia and cancer−sprouting with vascular permeation and lymph nodal metastasis by our new histological classification of submucosal invasion by colorectal carcinomas [in Japanese]. Stomach Intest 1994; 29: 1151-1160;

115. Lambert R et al. Superficial Neoplastic Lesions in the Digestive Tract. Endoscopy 2005; 37: 570-578; 116. Kudo S. Endoscopic mucosal resection of flat depressed type of early colorectal cancer. Endoscopy 1993;

25: 455-461; 117. Terai T, Miwa H, Imai Y et al. Analysis of the depressed area of small flat depressed-type colorectal

tumors as a marker of malignant potential. Gastrointest Endosc 1997; 45: 412-414; 118. Sano Y et al. Endoscopic detection and diagnosis of 0-IIc neoplastic colorectal lesions. Endoscopy 2005;

37: 261-267; 119. Okuno T, Sano Y, Ohkura Y, Kudo S. Incidence and clinicopathological characteristics of depressed type

lesions: baseline findings of multicenter retrospective cohort study. Early Colorect Cancer 2004; 8: 21-27; 120. Fujii T, Hasegawa RT, Saitoh Y et al. Chromoscopy during colonoscopy. Endoscopy 2001; 33:1036-1041; 121. Kawamura YJ, Togashi K, Sasaki J, Konishi F. Acetic acid spray in colonoscopy: an alternative to

chromoendoscopy. Gut. 2005 Feb;54(2):313; 122. R. Kiesslich, M. von Bergh, M. Hahn, G. Hermann, M. Jung. Chromoendoscopy with Indigocarmine

Improves the Detection of Adenomatous and Nonadenomatous Lesions in the Colon. Endoscopy 2001; 33: 1001-1006;

123. Fu K.-I., Sano Y., Kato S. et al. Chromoendoscopy Using Indigo Carmine Dye Spraying with Magnifying Observation Is the Most Reliable Method for Differential Diagnosis between Non-Neoplastic and Neoplastic Colorectal Lesions: A Prospective Study. Endoscopy 2004; 36: 1089-1093;

124. Monserat R. Chromoendoscopy without magnification using acetic acid and methylene blue for detection of small colonic tumors. Gastrointest Endosc 2005; 61: AB228;

125. Togashi K, Hewett D, Whitaker D et al. Does the use of indigo carmine spray increase the colonoscopic detection rate of advanced adenomas? Gastrointest Endosc 2005; 61: AB265;

126. Kudo Shin-ei. Early colorectal cancer - Detection of depressed types of colorectal carcinoma. IGAKU-SHOIN Medical Publishers, Inc., New York, 1996;

127. Kudo S, Rubio CA, Teixeira CR et al. Pit pattern in colorectal neoplasia: endoscopic magnifying view. Endoscopy 2001; 33: 367-373;

128. Hurlstone DP et al. High−Magnification Chromoscopic Colonoscopy for Screening in Chronic Ulcerative Colitis. Endoscopy 2005; 37: 1186-1192;

129. Hurlstone DP, Cross SS, Adam I et al. Efficacy of high magnification chromoscopic colonoscopy for the diagnosis of neoplasia in flat and depressed lesions of the colorectum: a prospective analysis. Gut 2004; 53: 284-290;

130. Fujii T, Nagata K, Saito Y. The correspondence of magnifying endoscopic diagnosis and pathological diagnosis. Stomach Intest 1999; 34: 1653-1664;

131. Konishi K, Kaneko K, Kurahashi T et al. A comparison of magnifying and nonmagnifying colonoscopy for diagnosis of colorectal polyps: a prospective study. Gastrointest Endosc 2003; 57: 48-53;

132. Tung SY, Wu CS, Su MY. Magnifying colonoscopy in differentiating neoplastic from nonneoplastic colorectal lesions. Am J Gastroenterol 2001; 96: 2628-2632;

133. Longacre TA, Fenoglio-Preiser CM. Mixed hyperplastic adenomatous polyps – serrated adenomas. A distinct form of colorectal neoplasia. Am J Surg Pathol 1990; 14: 524-537;

134. Morita T, Tamura S, Miyazaki J et al. Evaluation of endoscopic and histopathological features of serrated adenoma of the colon. Endoscopy 2001; 33: 761-765;

135. Oka S, Tanaka S, Hiyama T et al. Clinicopathologic and endoscopic features of colorectal serrated adenoma: differences between popyloid and superficial types. Gastroeintest Endosc 2004; 59: 213-219;

136. Levy MJ, Reddy RP, Alberts SR et al. Prospective assessment of rectal cancer staging and clinical management with both radial and linear EUS [abstract]. Gastrointest Endosc 2005; 61 (5): AB82;

137. Bounds BC, Matthes K, Brugge WR. EUS staging of upper GI malignancies: results of a prospective, randomized trial [abstract]. Gastrointest Endosc 2005; 61 (5): AB271;

138. Hurlstone DP et al. EUS Miniprobe Staging of Colorectal Cancer. Endoscopy 2005; 37: 710-714;

28

139. Tseng LJ, Jao YT, Mo LR. Preoperative staging of colorectal cancer with a balloon−sheathed miniprobe. Endoscopy 2002; 34: 564-568;

140. Stergiou N, Haji−Kermani N, Schnekler C et al. Staging of colonic neoplasms by colonoscopic miniprobe ultrasonography. Int J Colorectal Dis 2003; 18: 445-449;

141. Hunerbein M, Totkas S, Bijan M, Ghadimi BM, Schlag PM. Preoperative evaluation of colorectal neoplasms by colonoscopic miniprobe ultrasonography. Ann Surg 2000; 232: 46-50;

142. Hamada S, Akahoshi K, Chijiiwa Y. Preoperative staging of colorectal cancer by a 15−MHz ultrasound miniprobe. Surgery 1998; 123: 264-269;

143. Kim NK, Kim MJ, Yun SH et al. Comparative study of transrectal ultrasonography, pelvic computerized tomography and magnetic resonance imaging in preoperative staging of colorectal cancer. Dis Colon Rectum 1999; 42: 770-775;

144. Vanagunas A, Lin DE, Stryker SJ. Accuracy of endoscopic ultrasound for restaging rectal cancer following neoadjuvant chemoradiation therapy. Am J Gastroenterol 2004; 99: 109-112;

145. ASGE guideline: the role of endoscopy in the diagnosis, staging, and management of colorectal cancer. Gastrointest Endosc 2005; 61: 1-7;

146. Rex DK, Cutler CS, Lemmel GT et al. Colonoscopic miss rates of adenomas determined by back-to-back colonoscopies. Gastroenterology 1997; 112: 24-28;

147. Hixson LJ, Fennerty MB, Sampliner RE et al. Prospective blinded trial of the colonoscopic miss-rate of large colorectal polyps. Gastrointest Endosc 1991; 37: 125-127;

148. Rex DK, Rahmani EY, Haseman JH et al. Relative sensitivity of colonoscopy and barium enema for detection of colorectal cancer in clinical practice. Gastroenterology 1997; 112: 17-23;

149. Leaper M, Johanson MJ, Barclay M et al. Reasons of failure to diagnose colorectal carcinoma at colonoscopy. Endoscopy 2004; 36: 499-503;

150. Pinsky PF, Schoen RE, Weissfeld JL et al. Predictors of advanced proximal neoplasia in persons with abnormal screening flexible sigmoidoscopy. Gastroenterol Hepatol 2003; 1: 103-110;

151. Gondal G et al. Colorectal Polyps and Grading of Neoplasia. Endoscopy 2005; 37: 1193-1197; 152. Watari J, Inaba Y, Okamoto K et al. Usefulness of narrow band imaging system as a digital

chromoendoscopy in screening colonoscopy: a prospective pilot study. Gastrointest Endosc 2005; 61: AB228;

153. Kobayashi K, Igarashi M, Sada M et al. Clinical significance of adaptive index of hemoglobbin color enhancement for endoscopic diagnosis of superficial type colorectal tumors. Dig Endosc 2002; 14: S62-S64;

154. Igarashi M et al. Adaptive IHb color enhancement for diagnosis of colorectal disease. Endoscopy 2005; 37: 386-388;

155. Advences in diagnostics, therapies and procedures in treating colorectal cancer. Digestive Diseases Week, Chicago, May 2005;

156. Arnesen RB et al. Controlled Prospective Analysis of CT Colonography. Endoscopy 2005; 37: 937-944; 157. Gluecker TM, Fletcher JG, Welch TJ et al. Characterization of lesions missed on interpretation of CT

colonography using a 2D search method. AJR Am J Roentgenol 2004; 182: 881-889; 158. Tassios PS, Ladas SD, Grammenos I et al. Acquisition of competence in colonoscopy: the learning curve of

trainees. Endoscopy 1999; 31: 702-706; 159. Ajaj W, Lauenstein TC, Pelster G et al. MR colonography in patients with incomplete conventional

colonoscopy. Radiology 2005; 234: 452-459; 160. Hartmann D et al. MR Colonography in the Proximal Colon. Endoscopy 2005; 37: 816-820; 161. Yasuda S, Fujii H, Nakahara T, et al. 18F-FDG PET detection of colonic adenomas. J Nucl Med.

2001;42:989-992; 162. Kostakoglu L, Agress H, Goldsmith SJ. Clinical role of FDG PET in evaluation of cancer patients.

Radiographics. 2003;23:315-340; 163. Delbeke D, Martin WH, Sandler MP. Colorectal, pancreatic, and hepatobiliary In: Wahl RL, Buchanan JW,

eds. Principles and Practice of Positron Emission Tomography. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2002:217-233;

164. Flanagan FL, Dehdashti F, Ogunbiyi OA, et al. Utility of FDG-PET for investigating unexplained plasma CEA elevation in patients with colorectal cnacer. Ann Surg. 1998;227:319-232;

165. Valk PE, Abella-Columna E, Haseman MK, et al. Whole-body PET imaing with [18F]Fluorodeoxyglucose in management of recurrent colorectal cancer. Arch Surg. 1999;134:503-511;

29

166. Findaly M, Young H, Cunningham D, et al. Noninvasive monitoring of tumor metabolism using fluorodeoxyglucose and positron emission tomography in colorectal cancer liver metsases: correlation with tumor response to fluorouracil. J Clin Oncol. 1996;14:700-708;

167. Vitola JV, Delbeke D, Meranze SG, et al. Positron emission tomography with F-18-fluorodeoxyglucose to evaluate the results of hepatic chemoembolization. Cancer. 1996;78:2216-2222;

168. Yoo−Kyung C, Sung−Ae J, Su−Jung B et al. Is 18F FDG−PET useful in detecting colonic adenoma? Gastrointest Endosc 2005; 61: AB268;

169. Yasuda S5, Fujii H, Nakahara T, et al. 18F-FDG PET detection of colonic adenomas. J Nucl Med. 2001;42:989-992;

170. Drenth JPH, Nagengast FM, Oyen WJG. Evaluation of (pre) malignant colonic abnormalities: endoscopic validation of FDG-PET findings. Eur J Nucl Med. 2001;28:1766-1769;

171. Kitabatake S, Yasumasa N, Hoshiki H et al. Confocal laser endoscopy for the diagnosis of gastric diseases in vivo. Gastrointest Endosc 2005; 61: AB231;

172. Evan G, Vousden K. Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer. Nature 2001;411:342-8; 173. Decristoforo C, Melendez-Alafort L, Sosabowski JK, Mather SJ. 99mTc-HYNIC-Tyr3-octreotide for

imaging somatostatin-receptor-positive tumors: preclinical evaluation and comparison with 111In-octreotide. J Nucl Med 2000;41:1114-9;

174. Pearson DA, Lister-James J, McBride WJ, et al. Somatostatin receptor-binding peptides labeled with technetium-99m: chemistry and initial biological studies. J Med Chem 1996;39:1361-71;

175. Rao P, Thakur M, Pallela V, et al. 99mTc-labeled VIP analog: evaluation for imaging colorectal cancer. Nucl Med Biol 2001;28:445-50;

176. Breeman W, Hofland L, de Jong M, et al. Evaluation of radiolabelled bombesin analogues for receptor-targeted scintigraphy and radiotherapy. Int J Cancer 1999;81:658-65;

177. Eliceiri B, Cheresh D. Adhesion events in angiogenesis. Curr Opin Cell Biol 2001;13:563-8; 178. Fadok V, Bratton D, Rose D, et al. A receptor for phosphatidylserine-specific clearance of apoptotic cells.

Nature 2000;405:85-90; 179. Gottesman M. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med 2002;53:615-27; 180. Conlin A, Smith G, Carey F A, Wolf C R, Steele R J C. The prognostic significance of K-ras, p53, and

APC mutations in colorectal carcinoma. Gut 2005;54;1283-1286; 181. Andreyev HJN, Norman AR, Cunningham D, et al. Kirsten ras mutations in patients with colorectal cancer:

the ‘RASCAL II’ study. Br J Cancer 2001;85:692–6; 182. Goh HS, Yao J, Smith DR. p53 point mutation and survival in colorectal cancer patients: effect of disease

dissemination and tumour location. Int J Oncol 1999;15:491–8; 183. Soong R, Powell B, Elsaleh H, et al. Prognostic significance of TP53 gene mutation in 995 cases of

colorectal carcinoma. Influence of tumour site, stage, adjuvant chemotherapy and type of mutation. Eur J Cancer 2000;36:2053–60;

184. Hardingham JE, Butler WJ, Roder D, Dobrovic A et al. Somatic mutation, acetylator status and prognosis in colorectal cancer. Gut 1998;42:669-672;

185. Remvikos Y, Laurent-Puig P, Salmon RJ et al. simultaneous monitoring of p53 protein and DNA content of colorectal adenocarcinomas by flow cytometry. Int J Cancer 1990;45:450-456;

186. Cohen AM, Minsky BD, Schilsky RL. Cancer of the colon. In: De Vita VT, Hellman S, Rosenberg SA. Cancer. Principles and practice of oncology. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1997;1144-1197;

187. Kirkland SC. Clonal origin of columnar, mucous, and endocrine cell lineages in human colorectal epithelium. Cancer 1988;61:1359–63;

188. Novello P, Duvillard P, Grandjouan S, et al. Carcinomas of the colon with multidirectional differentiation. Dig Dis Sci 1995;40:100–6;

189. van der Wurff AAM, Kate J, Marx PTJ et al. Expression of a marker for colonic crypt base cells is correlated with poor prognosis in human colorectal cancer. Gut 1998;42;63-70;

190. Tytgat KMAJ, Büller HA, Opdam FJM, et al. Biosynthesis of human colonic mucin: Muc2 is the prominent secretory mucin. Gastroenterology 1994;107:1352–63;

191. Garcia JM, Rodriguez R, Dominguez G et al. Prognostic significance of the allelic loss of the BRCA1 gene in colorectal cancer. Gut 2003;52;1756-1763;

192. Gryfe R, Kim H, Hsieh ETK, et al. Tumor microsatellite instability and clinical outcome in young patients with colorectal cancer. N Engl J Med 2000;342:69–77;

193. Compton C, Fenoglio-Preiser CM, Pettigrew N, et al. American Joint Committee on Cancer Prognostic Factors Consensus Conference: Colorectal Working Group. Cancer 2000;88:1739–57;

30

194. Levin B, Raijman I. Malignant tumors of the colon and rectum. In: Haubrich WS, Schaffner F, Berk JE, eds. Bockus Gastroenterology. Philadelphia: Saunders Company. 1995: 1744-1772;

195. Gheorghe L, Gheorghe C, Mircea C. Cancerul colorectal. În: Grigorescu M eds. Tratat de gastroenterologie. Bucureşti: Editura medicală naţională. 2001: 139-173;

196. Folkman J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? J Natl Cancer Inst. 1990; 82: 4-6; 197. Folkman J. The role of angiogenesis in tumor growth. Seminars in Cancer Biology. 1992; 3: 65-71; 198. Reinmuth N, Parikh AA, Ahmad SA, et al. Biology of angiogenesis in tumors of the gastrointestinal tract.

Microsc Res Tech. 2003; 60: 199-207; 199. Lee J, Chow N, Want S, et al. Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in

colorectal cancer patients. Eur J Cancer. 2000; 36: 748-753; 200. Masood R, Cai J, Zheng T, et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) is an autocrine growth factor

for VEGF receptor-positive human tumors. Blood. 2001; 98: 1904-1913; 201. Hurwitz H, Fehrenbacher L, Cartwright T, et al., eds. Results of a phase III trial of bevacizumab in

combination with bolus irinotecan, 5-fluourouracil, leucovorin as first-line therapy in subjects with metastatic CRC. Chicago, IL, 2003;

202. Ferrara N, Gerber H-P and LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nature Medicine. 2003; 9: 669-676;

203. Keyt BA, Berleau LT, Nguyen HV, et al. The carboxyl-terminal domain(111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency. J. Biol. Chem. 1996; 271: 7788-7795;

204. Wey JS, Stoeltzing O, Ellis LM. Vascular Endothelial Growth Factor Receptors: Expression and Function in Solid Tumors. Clinical Advances in Hematology & Oncology 2004; 2:37-45;

205. Soker S, Takashima S, Miao HQ, et al. Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform-specific receptor for vascular endothelial growth factor. Cell. 1998; 92: 735-745;

206. Gluzman-Poltorak Z, Cohen T, Shibuya M, et al. Vascular endothelial growth factor receptor-1 and neuropilin-2 form complexes. J Biol Chem. 2001; 276: 18688-18694;

207. Matsumoto T and Claesson-Welsh L. VEGF receptor signal transduction. Sci STKE. 2001; 2001: RE21; 208. Wei SC, Tsao PN, Yu SC et al. Placenta growth factor expression is correlated with survival of patients

with colorectal cancer. Gut 2005;54;666-672; 209. Autiero M, Luttun A, Tjwa M, et al. Placental growth factor and its receptor, vascular endothelial growth

factor receptor-1: novel targets for stimulation of ischemic tissue revascularization and inhibition of angiogenic and inflammatory disorders. J Thromb Haemost 2003;1:1356–70;

210. Andersen PA, Georg B, Lund LR et al. Plasminogen activator inhibitors:hormonally regulated serins. Mol Cell Endocrinol 1990;68:1-19;

211. Nielsen HJ, Pappot H, Christensen IJ et al. Association between plasma concentration of plasminogen activator inhibitor-1 and survival in patients with colorectal cancer. BMJ 1998;316:829-830;

212. Neumayer R, Rosen HR, Reiner A, Sebesta C, Schmid A, Tuchler H, Schiessel R. CD44 expression in benign and malignant colorectal polyps. Dis Colon Rectum 1999; 42: 50-55;

213. Yue SQ, Yang YL, Dou KF, Li KZ. Expression of PCNA and CD44mRNA in colorectal cancer with venous invasion and its relationship to liver metastasis. World J Gastroenterol 2003;9(12):2863-2865;

214. Lavezzi AM, Ottaviani G, De Ruberto F, Fichera G, Matturri L. Prognostic significance of different biomarkers (DNA content, PCNA, karyotype) in colorectal adenomas. Anticancer Res 2002; 22: 2077-2081;

215. Isola JJ, Helin HJ, Helle MJ, Kallioniemi OP. Evaluation of cell proliferation in breast carcinoma. Comparison of Ki-67 immunohistochemical study, DNA flow cytometric analysis and mitotic count. Cancer 1990; 65: 1180-1184;

216. Kimura T, Tanaka S, Haruma K, Sumii K, Kajiyama G, Shimamoto F, Kohno N. Clinical significance of MUC1 and Ecadherin expression, cellular proliferation, and angiogenesis at the deepest invasive portion of colorectal cancer. Int J Oncol 2000; 16: 55-64;

217. Salminen E, Palmu S, Vahlberg T, Roberts PJ, Söderström KO. Increased proliferation activity measured by immunoreactive Ki67 is associated with survival improvement in rectal/recto sigmoid cancer. World J Gastroenterol 2005;11(21):3245-3249;

218. Duchrow M, Ziemann T, Windhövel U, Bruch HP, Broll R. Colorectal carcinomas with high MIB-1 labelling indices but low pKi67 mRNA levels correlate with better prognostic outcome. Histopathology 2003; 42: 566-574;

31

219. Lacy ER, Filippov I, Lewis WS, Otieno S, Xiao L, Weiss S, Hengst L, Kriwacki RW. p27 binds cyclin-CDK complexes through a sequential mechanism involving binding-induced protein folding. Nat Struct Mol Biol 2004; 11: 358-364;

220. Ridley AJ, Schwartz MA, Burridge K, Firtel RA, Ginsberg MH, Borisy G, Parsons JT, Horwitz AR. Cell migration: integrating signals from front to back. Science 2003; 302: 1704-1709;

221. Palmqvist R, Stenling R, Oberg A, Landberg G. Prognostic significance of p27(Kip1) expression in colorectal cancer: a clinico-pathological characterization. J Pathol 1999; 188: 18-23;

222. Gunther K, Jung A, Volker U, Meyer M, Brabletz T, Matzel KE, Reymond MA, Kirchner T, Hohenberger W. p27(kip1) expression in rectal cancer correlates with disease-free survival. J Surg Res 2000; 92: 78-84;

223. Hoos A, Nissan A, Stojadinovic A, Shia J, Hedvat CV, Leung DH, Paty PB, Klimstra D, Cordon-Cardo C, Wong WD. Tissue microarray molecular profi ling of early, node-negative adenocarcinoma of the rectum: a comprehensive analysis. Clin Cancer Res 2002; 8: 3841-3849;

224. Li GQ, Zhang HF. Mad2 and p27 expression profiles in colorectal cancer and its clinical significance. World J Gastroenterol 2004; 10: 3218-3220;

225. Bahnassy AA, Zekri ARN, El-Houssini S, El-Shehaby AMR, et al. Cyclin A and cyclin D1 as significant prognostic markers in colorectal cancer patients. BMC Gastroenterology 2004, 4:22;

226. Handa K, Yamakawa M, Takeda H, Kimura S, Takahashi T: Expression of the cell cycle markers in colorectal carcinoma: Superiority of cyclin A as an indicator of poor prognosis. Int J cancer 1999, 84:225-233;

227. Aigner S, Ruppert M, Hubbe M, et al. Heat stable antigen (mouse CD24) supports myeloid cell binding to endothelial and platelet P-selectin. Int Immunol 1995;7:1557^65;

228. Weichert W, Denkert C, Burkhardt M, Gansukh T et al. Cytoplasmic CD24 Expression in Colorectal Cancer Independently Correlateswith Shortened Patient Survival. Clin Cancer Res 2005;11:6574-6581;

229. Greene FL, Balch CM, Fleming ID, et al. eds. AJCC cancer staging handbook, 6th edn. New York: Springer, 2002;

230. Compton C, Fenoglio-Preiser CM, Pettigrew N, et al. American Joint Committee on Cancer Prognostic Factors Consensus Conference: Colorectal Working Group. Cancer 2000;88:1739–57;

231. Friedenreich CM, Orenstein MR. Physical activity and cancer prevention: etiologic evidence and biological mechanisms. J Nutr 2002;132(suppl 11):3456–64S;

232. Haydon AM, MacInnis RJ, English DR, et al. The effect of physical activity and body size on survival after diagnosis with colorectal cancer. Gut 2006;55:62–7;

233. Meyerhardt JA, Heseltine D, Niedzwiecki D, et al. The impact of physical activity on patients with stage III colon cancer: Findings from Intergroup trial CALGB 89803. Proc Am Soc Clin Oncol 2005;24:abstract 3534;

234. Haydon AM, MacInnis RJ, English DR, et al. Physical activity, insulin-like growth factor 1, insulin-like growth factor binding protein 3, and survival from colorectal cancer. Gut 2006;55;689-694;

235. Westerlind KC. Physical activity and cancer prevention—mechanisms. Med Sci Sports Exerc 2003;35:1834–40;

236. Giovannucci E. Insulin, insulin-like growth factors and colon cancer: a review of the evidence. J Nutr 2001;131(suppl 11):3109–20S;

237. Kaaks R, Toniolo P, Akhmedkhanov A, et al. Serum C-peptide, insulin-like growth factor (IGF)-I, IGF-binding proteins, and colorectal cancer risk in women. J Natl Cancer Inst 2000;92:1592–600;

238. Giovannucci E, Pollak MN, Platz EA, et al. A prospective study of plasma insulin-like growth factor-1 and binding protein-3 and risk of colorectal neoplasia in women. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2000;9:345–9;

239. Nomura AM, Stemmermann GN, Lee J, et al. Serum insulin-like growth factor I and subsequent risk of colorectal cancer among Japanese-American men. Am J Epidemiol 2003;158:424–31;

240. Baxter RC, Turtle JR. Regulation of hepatic growth hormone receptors by insulin. Biochem Biophys Res Commun 1978;84:350–7;

241. Suikkari AM, Koivisto VA, Rutanen EM, et al. Insulin regulates the serum levels of low molecular weight insulin-like growth factor-binding protein. J Clin Endocrinol Metab 1988;66:266–72;

242. Yu H, Rohan T. Role of the insulin-like growth factor family in cancer development and progression. J Natl Cancer Inst 2000;92:1472–89;

243. Warren RS, Yuan H, Matli MR, et al. Induction of vascular endothelial growth factor by insulin-like growth factor 1 in colorectal carcinoma. J Biol Chem 1996;271:29483–8;

32

244. Freier S, Weiss O, Eran M, et al. Expression of the insulin-like growth factors and their receptors in adenocarcinoma of the colon. Gut 1999;44:704–8;

245. Williams AC, Collard TJ, Perks CM, et al. Increased p53-dependent apoptosis by the insulin-like growth factor binding protein IGFBP-3 in human colonic adenoma-derived cells. Cancer Res 2000;60:22–7;

246. Rajah R, Valentinis B, Cohen P. Insulin-like growth factor (IGF)-binding protein-3 induces apoptosis and mediates the effects of transforming growth factor-beta1 on programmed cell death through a p53-and IGF-independent mechanism. J Biol Chem 1997;272:12181–8;

247. Hall NR. Survival in colorectal cancer: impact of body mass and exercise. Gut 2006;55;8-10; 248. Dray X, Boutron-Ruault MC, Bertrais S et al. Influence of dietary factors on colorectal cancer survival. Gut

2003;52;868-873; 249. Renehan AG, Egger M, Saunders MP, O'Dwyer ST. Impact on survival of intensive follow up after

curative resection for colorectal cancer: systematic review and meta-analysis of randomised trials. BMJ 2002:324;1-8;

250. Mandel JS, Bond JH, Church TR, Snover DC, Bradley GM, Schuman LM, Ederer F. Reducing mortality from colorectal cancer by screening for fecal occult blood. Minnesota colon cancer control study. N Engl J Med 1993; 328: 1365 – 1371;

251. Hermanek P, Wiebelt H, Staimmer D, Riedl S. Prognostic factors of colorectal carcinoma – experience of the German Multicentre Study SGCRC. German Study Group Colo-Rectal Carcinoma. Tumori 1995; 81: 60 – 64;

252. Abulafi AM, Williams NS. Local recurrence of colorectal cancer: the problem, mechanisms, management and adjuvant therapy. Br J Surg 1994;81:7-19;

253. Kjeldsen BJ, Kronborg O, Fenger C, Jorgensen OD. A prospective randomized study of follow-up after radical surgery for colorectal cancer. Br J Surg 1997; 84: 666 – 669;

254. Galandiuk S, Wieand HS, Moertel CG, Cha SS, Fitzgibbons RJJ, Pemberton JH, Wolff BG. Patterns of recurrence after curative resection of carcinoma of the colon and rectum. Surg Gynecol Obstet 1992; 174: 27 – 32;

255. Bruinvels DJ, Stiggelbout AM, Kievit J, van Houwelingen HC, Habbema JD, van de Velde CJ. Follow-up of patients with colorectal cancer. A meta-analysis. Annals of Surgery 1994; 219: 174 – 182;

256. Kjeldsen BJ, Kronborg O, Fenger C, Jorgensen OD. The pattern of recurrent colorectal cancer in a prospective randomised study and the characteristics of diagnostic tests. Int J Colorectal Dis 1997; 12: 329– 334;

257. Adloff M, Arnaud JP, Ollier JC, Schloegel M. Can the prognosis of patients treated surgically in cancer of the rectum or colon be improved by follow-up? Prospective study of 909 patients. Chirurgie 1989; 115: 228– 236;

258. Ovaska JT, Jarvinen HJ, Mecklin JP. The value of a follow-up programme after radical surgery for colorectal carcinoma. Scan J Gastroenterol 1989; 24: 416 – 422;

259. Makela JT, Laitinen SO, Kairaluoma MI. Five-year follow-up after radical surgery for colorectal cancer. Results of a prospective randomized trial. Archives of Surgery 1995; 130: 1062 – 1067;

260. Richard CS, McLeod RS. Follow-up of patients after resection for colorectal cancer: a position paper of the canadian society of surgical oncology and the canadian society of colon and rectal surgeons. Canadian Journal of Surgery 1997; 40: 90 –100;

261. Kronborg O. Optimal follow-up in colorectal cancer patients: what tests and how often? Semin Surg Oncol 1994; 10: 217 – 224;

262. Rex DK. Surveillance colonoscopy after resection of colorectal polyps and cancer. ASGE Clinical Update 1998; 6: 1 – 4;

263. Makela JT, Laitinen SO, Kairaluoma MI. Five-year follow-up after radical surgery for colorectal cancer. Results of a prospective randomized trial. Arch Surg 1995;130:1062-7;

264. Ohlsson B, Breland U, Ekberg H, Graffner H, Tranberg KG. Follow-up after curative surgery for colorectal carcinoma. Randomized comparison with no follow-up. Dis Colon Rectum 1995;38:619-26;

265. Schoemaker D, Black R, Giles L, Toouli J. Yearly colonoscopy, liver CT, and chest radiography do not influence 5-year survival of colorectal cancer patients. Gastroenterology 1998;114:7-14;

266. Pietra N, Sarli L, Costi R, Ouchemi C, Grattarola M, Peracchia A. Role of follow-up in management of local recurrences of colorectal cancer: a prospective, randomized study. Dis Colon Rectum 1998;41:1127-33;

267. Kjeldsen BJ, Kronborg O, Fenger C, Jorgensen OD. A prospective randomized study of follow-up after radical surgery for colorectal cancer. Br J Surg 1997;84:666-9;

33

268. Renehan AG, O'Dwyer ST, Whynes DK. Cost effectiveness analysis of intensive versus conventional follow up after curative resection for colorectal cancer. BMJ 2004;328;81- 85;

269. McArdle C. ABC of colorectal cancer: Effectiveness of follow up. BMJ 2000;321;1332-1335; 270. Eckardt VF, Stamm H, Kanzler G, Bernhard G. Improved survival after colorectal cancer in patients

complying with a postoperative endoscopic surveillance program. Endoscopy 1994; 26: 523 – 527; 271. Louhimo J, Carpelan-Holmstrom M, Alfthan H et al. Serum HCG beta, CA 72-4 and CEA are

independent prognostic factors in colorectal cancer. Int J Cancer. 2002;101(6):545-8; 272. Reiter W, Stieber P, Reuter C et al. Multivariate analysis of the prognostic value of CEA and CA 19-9

serum levels in colorectal cancer. Anticancer Res. 2000;20:5195-8; 273. Chung YC, Chaen YL, Hsu CP. Clinical significance of tissue expression of interleukin-6 in colorectal

carcinoma. Anticancer Res. 2006;26:3905-11; 274. Feng B, Xu WB, Zheng MH, Ma JJ et al. Clinical significance of human kallikrein 10 gene expression in

colorectal cancer and gastric cancer. J Gastroenterol Hepatol. 2006;21:1596-603; 275. Holten-Andersen MN, Nielsen HJ, Sorensen S, Jensen V, Brunner N, Christensen IJ. Tissue inhibitor of

metalloproteinases-1 in the postoperative monitoring of colorectal cancer. Eur J Cancer. 2006;42:1889-96; 276. Wang WS, Chen PM, Wang HS, Liang WY, Su Y. Matrix metalloproteinase-7 increases resistance to Fas-

mediated apoptosis and is a poor prognostic factor of patients with colorectal carcinoma. Carcinogenesis. 2006;27:1113-20;

277. Odin E, Wettergren Y, Carlsson G, Danenberg PV, Termini A, Willen R, Gustavsson B. Expression and clinical significance of methylenetetrahydrofolate reductase in patients with colorectal cancer. Clin Colorectal Cancer. 2006;5:344-9;

278. Endo K, Kohnoe S, Tsujita E, Watanabe A, Nakashima H, Baba H, Maehara Y. Galectin-3 expression is a potent prognostic marker in colorectal cancer. Anticancer Res. 2005;25:3117-21;

279. Wang WS, Lin JK, Lin TC, Chiou TJ, Liu JH, Yen CC, Chen PM. Plasma von Willebrand factor level as a prognostic indicator of patients with metastatic colorectal carcinoma. World J Gastroenterol. 2005;11:2166-70;

280. Koga R, Yamamoto J, Saiura A, Yamaguchi T, Hata E, Sakamoto M. Surgical resection of pulmonary metastases from colorectal cancer: four favourable prognostic factors. Jpn J Clin Oncol. 2006;36(10):643-8;

281. Machi J, Oishi AJ, Sumida K, Sakamoto K, Furumoto NL, Oishi RH, Kylstra JW. Long-term outcome of radiofrequency ablation for unresectable liver metastases from colorectal cancer: evaluation of prognostic factors and effectiveness in first- and second-line management. Cancer J. 2006;12(4):318-26;

282. Berrino F, Capocaccia R, Estève J, et al. Survival of cancer patients in Europe: the EUROCARE Study II. IARC Scientific Publication No 151. Lyon: International Agency for Research on Cancer, 1999;

283. Sant M, Capocaccia R, Verdecchia A, et al. Comparisons of colon-cancer survival among European countries: the EUROCARE study. Int J Cancer1995;63:43–8;

284. Gatta G, Faivre J, Capocaccia R, Ponz de Leon M and the EUROCARE Working Group. Survival of colorectal cancer patients in Europe during the period 1978–89. Eur J Cancer 1998;34:2176–83;

285. Ciccolallo L, Capocaccia R, Coleman MP et al. Survival differences between European and US patients with colorectal cancer: role of stage at diagnosis and surgery. Gut 2005;54;268-273;

286. Cohen J. Advanced Digestive Endoscopy: Comprehensive Atlas of High Resolution Endoscopy and Narrowband Imaging. Blackwell Publishing, 2007;

287. Cotton P. Advanced Digestive Endoscopy: Practice and Safety. Blackwell Publishing, 2008; 288. Cotton P, Williams C. Practical Gastroeintestinal Endoscopy – The Fundamentals. 6-th edition, Wiley

Blackwell, 2008; 289. Jankowski J, Sampliner R, Kerr D, Fong Y. Gastrointestinal Oncology: A Clinical Multidisciplinary Team

Approach. Blackwell Publishing, 2008; 290. McLeod HL, Murray GI. Tumour markers of prognosis in colorectal cancer. Br J Cancer 1999;79:191-203; 291. Brett MC, Pickard M, Green B et al. p53 protein overexpression and response to biomodulated 5-

fluorouracil chemotherapy in patients with advanced colorectal cancer. Eur J Sur Oncol 1996;22:182–185; 292. Costa A, Doci R, Machen C et al. Cell proliferation-related markers in colorectal liver metastases:

correlation with patients prognosis. J Clin Oncol 1997;15:2008–2014; 293. Paradiso A, Rabinovich M, Vallejo C et al. p53 and PCNA expression in advanced colorectal cancer:

response to chemotherapy and long-term prognosis. Int J Cancer 1996;69:437–441; 294. Goh H-S, Yao J, Smith DR. p53 point mutation and survival in colorectal cancer patients. Cancer Res

1995;55:5217–5221;

34

35

295. Leahy DT, Salman R, Mulcahy H et al. Prognostic significance of p53 abnormalities in colorectal carcinoma detected by PCR-SSCP and immunohistochemical analysis. J Pathol 1966;180:364–370;

296. Manne U, Myers RB, Moron C et al. Prognostic significance of Bcl-2 expression and p53 nuclear accumulation in colorectal adenocarcinoma. Int J Cancer 1997;74:346–358;

297. Neoptolemos JP, Oates GD, Newbold KM et al. Cyclin/proliferation cell nuclear antigen immunohistochemistry does not improve the prognostic power of Dukes’ or Jass’ classifications for colorectal cancer. Br J Surg 1995;82:184–187;

298. Sun XF, Carstensen JM, Stal O, Zhang H, Nordenskjold B. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in relation to ras, c-erbB-2, p53, clinicopathological variables and prognosis in colorectal adenocarcinoma. Int J Cancer 1996;69: 5–8;

299. Bosari S, Moneghini L, Graziani D et al. Bcl-2 oncoprotein in colorectal hyperplastic polyps, adenomas, and adenocarcinomas. Human Pathol 1995;26: 534–540;

300. Schneider HJ, Sampson SA, Cunningham D et al. Bcl-2 expression and response to chemotherapy in colorectal adenocarcinomas. Br J Cancer 1997;75: 427–431;

301. Baretton GB, Diebold J, Christoforis G et al. Apoptosis and immunohistochemical bcl-2 expression in colorectal adenomas and carcinomas. Aspects of carcinogenesis and prognostic significance. Cancer 1996;77: 255–264;

302. Dorudi S, Hanby AM, Poulsom R, Northover J, Hart IR. Level of expression of E-cadherin mRNA in colorectal cancer correlates with clinical outcome. Br J Cancer 1995;71: 614–616;

303. Kitadai Y, Ellis LM, Tucker SL et al. Multiparametric in situ mRNA hybridization analysis to predict disease recurrence in patients with colon carcinoma. Am J Path 1996;149: 1541–1551;

304. Mulder JWR, Kruyt PM, Sewnath M et al. Colorectal cancer prognosis and expression of exon-v6 containing CD44 proteins. Lancet 1994;344: 1470–1472;

305. Yamaguchi A, Urano T, Goi T et al. Expression of a CD44 variant containing exons 8 to 10 is a useful independent factor for the prediction of prognosis in colorectal cancer patients. J Clin Oncol 1996;14: 1122–1127;

306. Takahashi Y, Tucher SL, Kitadai Y et al. Vessel counts and expression of vascular endothelial growth factor as prognostic factors in node-negative colon cancer. Arch Surg 1997;132: 541–546;

307. Kang SM, Maeda K, Chung YS et al. Vascular endothelial growth factor expression correlates with hematogenous metastasis and prognosis in colorectal carcinoma. Oncol Rep 1997;4: 381–384;

308. Amaya H, Tanigawa N, Lu C et al. Association of vascular endothelial growth factor expression with tumor angiogenesis, survival and thymidine phosphorylase/plateletderived endothelial cell growth factor expression in human colorectal cancer. Cancer Lett 1997;119: 227–235;

309. Robson H, Anderson E, James RD, Schofield PF. Transforming growth factor beta 1 expression in human colorectal tumours: an independent prognostic marker in a subgroup of poor prognosis patients. Br J Cancer 1996;74: 753–758.