validierung ausgewählter koproskopischer

Aus dem Institut für Parasitologie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

___________________________________________________________________________

Validierung ausgewählter koproskopischer Untersuchungsmethoden zum

direkten Nachweis parasitärer Stadien verschiedener Parasitenspezies der

Haussäugetiere

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Amelie Kraemer geb. Reese

aus

Düren

Hannover 2005

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. T. Schnieder

1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. T. Schnieder

2. Gutachter: Prof. Dr.med. vet. R. Mischke

Tag der mündlichen Prüfung: 14. November 2005

- II -

Meiner Familie

- III -

- IV -

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

A.c. Ancylostoma caninum

A.p. Anoplocephala perfoliata

A.s. Ascaris suum

bzw. beziehungsweise

ca. zirka

cm Zentimeter

C.o. Cooperia oncophora

Cyath. Cyathostominae

d.h. das heißt

EpG Eier pro Gramm Kot

et al. und andere

etc. und so weiter

evtl. eventuell

Fa. Firma

g Gramm

h Stunde

komb. Sed.-Flot. kombinierte Sedimentation–Flotation

LpG Larven pro Gramm Kot

µl Mikroliter

µm Mikrometer

M.e. Moniezia expansa

min Minute

ml Milliliter

mm Millimeter

neg. negativ

OR Odds Ratio

p Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier

Datengruppen

- V -

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

pos. positiv

SD Standartabweichung (engl.)

s.o. siehe oben

syn. Synonym

T.c. Toxocara canis

T.ca. Toxocara cati

T.l. Toxascaris leonina

T.v. Trichuris vulpis

Tab. Tabelle

U/min Umdrehungen pro Minute

U.s. Uncinaria stenocephala

vgl. vergleiche

z.B. zum Beispiel

- VI -

INHALTSVERZEICHNIS

Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG .............................................................................................................................1

2 LITERATURÜBERSICHT........................................................................................................3

2.1 Methoden ................................................................................................................................3

2.1.1 Kombiniertes Sedimentations-Flotations-Verfahren .......................................................3

2.1.2 Eizählung nach McMaster ...............................................................................................9

2.1.3 Sedimentationsverfahren................................................................................................14

2.1.4 Auswanderverfahren nach Baermann ............................................................................18

2.1.5 Interpretation der durch Kotuntersuchungstechniken gewonnenen Ergebnisse ............24

3 MATERIAL UND METHODEN ............................................................................................29

3.1 Verwendete Parasiten und Eigewinnung ..............................................................................29

3.1.1 Übersicht über die verwendeten Parasiten .....................................................................29

3.1.2 Eigewinnung von Ancylostoma caninum, Uncinaria stenocephala, Cooperia

oncophora und den Cyathostominae ...........................................................................................30

3.1.3 Eigewinnung von Toxocara canis, Toxocara cati und Toxascaris leonina...................30

3.1.4 Eigewinnung von Trichuris vulpis, Moniezia expansa und Anoplocephala perfoliata .31

3.1.5 Eigewinnung von Ascaris suum .....................................................................................31

3.1.6 Eigewinnung von Fasciola hepatica..............................................................................32

3.2 Herstellung der Kotproben ...................................................................................................32

3.3 Durchführung der Methoden ................................................................................................33

3.3.1 Kombiniertes Sedimentations-Flotationsverfahren mit Zinksulfatlösung .....................33

3.3.2 Eizählung nach McMaster .............................................................................................34

3.3.3 Auswander- (Trichter-) verfahren nach Baermann........................................................35

3.3.4 Sedimentationsverfahren................................................................................................36

3.4 Statistik .................................................................................................................................37

4 ERGEBNISSE ...........................................................................................................................39

4.1 Kombinierte Sedimentation - Flotation ................................................................................39

4.1.1 Sensitivität......................................................................................................................39

4.1.1.1 Einzelne Parasiten...................................................................................................39

4.1.1.2 Parasitenordnungen ................................................................................................43

4.1.1.3 Durchschnittliche Sensitivität..................................................................................44

- VII -

INHALTSVERZEICHNIS

4.1.2 Effektivität .....................................................................................................................46



4.1.2.3 Durchschnittliche Effektivität..................................................................................50

4.2 McMaster-Methode ..............................................................................................................51

4.2.1 Sensitivität......................................................................................................................51



4.2.1.3 Durchschnittliche Sensitivität..................................................................................56

4.2.2 Effektivität .....................................................................................................................57



4.2.2.3 Durchschnittliche Effektivität..................................................................................61

4.3 Sedimentationsmethode........................................................................................................63

4.3.1 Sensitivität......................................................................................................................63

4.3.2 Effektivität .....................................................................................................................63

4.4 Auswanderverfahren nach Baermann...................................................................................65

4.4.1 Sensitivität......................................................................................................................65

4.4.2 Effektivität .....................................................................................................................66

5 DISKUSSION ............................................................................................................................69

5.1 Kombiniertes Sedimentations-Flotationsverfahren ..............................................................69

5.2 McMaster-Methode ..............................................................................................................72

5.3 Unterschiede im Nachweis einzelner Parasiten und Parasitenordnungen ............................75

5.4 Sedimentationsmethode........................................................................................................77

5.5 Auswanderverfahren nach Baermann...................................................................................79

5.6 Schlussfolgerungen...............................................................................................................80

6 ZUSAMMENFASSUNG...........................................................................................................83

7 SUMMARY................................................................................................................................85

8 ANHANG ...................................................................................................................................87

8.1 Sensitivität der kombinierten Sedimentations-Flotationsmethode für einzelne Parasiten ...87

8.2 Effektivität der kombinierten Sedimentations-Flotationsmethode für einzelne Parasiten ...89

- VIII -

INHALTSVERZEICHNIS

8.3 Sensitivität der McMaster-Methode für einzelne Parasiten..................................................92

8.4 Effektivität der McMaster-Methode für einzelne Parasiten .................................................94

9 LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................................97

10 TABELLEN- UND ABBILDUNGSVERZEICHNIS .......................................................121

- IX -

INHALTSVERZEICHNIS

- X -

EINLEITUNG

1 EINLEITUNG

Schon in der frühen Geschichte der Tierhaltung war man sich der Existenz und Problematik

gastrointestinaler Helminthen bewusst (Hoeppli, 1956). Mit der zunehmenden Nutzung und

Verbreitung mikroskopischer Techniken Mitte des 19. Jhd. entwickelte sich ein weitgehendes

Verständnis für deren Biologie und Fortpflanzung. Diese Erkenntnisse versetzten Mediziner und

andere Wissenschaftler fortan in die Lage, bestehende Infektionen anhand des Nachweises von

spezifischen parasitären Stadien aus den Fäzes des Wirtes exakt zu diagnostizieren. Vielen davon ist

auch heute noch eine große Bedeutung beizumessen. Sie können zu Erkrankungen sowie

wirtschaftlichen Verlusten führen und für den Menschen als Verbraucher und Tierhalter ein

gesundheitliches Risiko durch die Übertragung von Parasitenstadien darstellen. Die mikroskopische

Untersuchung von Kotproben gehört auch heute noch, trotz vielfältiger anderer diagnostischer

Möglichkeiten, zum festen Bestandteil medizinischer Diagnostik weltweit (Ward et al. 1997) und

wird in den meisten human- und veterinärmedizinischen Labors praktiziert. Die Suche nach

Möglichkeiten zum zuverlässigen, schnellen, qualitativen und quantitativen Nachweis parasitärer

Stadien hat eine Vielzahl verschiedener Methoden hervorgebracht, die sich in den direkten

Nachweis durch Schmierpräparate, Konzentrations- und Verdünnungstechniken klassifizieren

lassen. Bewährte Methoden sind z.T. schon Jahrzehnte alt und beruhen trotz unterschiedlicher

methodischer Abwandlungen auf dem prinzipiell gleichen Protokoll. Sie gehören zum festen

Repertoire parasitologischer Labors. Um so überraschender ist die Tatsache, dass eine Validierung

dieser Methoden vergleichsweise selten und nur in kleinem Rahmen durchgeführt und beschrieben

wurde. Aus Praktikabilitätsgründen wurde in diesen Arbeiten nur eine begrenzte Auswahl und

Anzahl an Parasiten verwendet, so dass eine umfassende, vergleichende Validierung zwischen

morphologisch unterschiedlichen und auch gleichen Gruppen bisher nicht bekannt ist. Der Mangel

an Validierungsdaten zur Sensitivität und Reproduzierbarkeit zusätzlich zur sicheren Detektion

wurde aufgrund der in letzter Zeit vermehrt verlangten Qualitätssicherungs- und -

managementsysteme in Labors zunehmend bewusst.

Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit soll ein Teil dieser Daten geliefert werden. Es werden das

Auswanderverfahren nach Baermann, das kombinierte Sedimentations-Flotationsverfahren mit

Zinksulfatlösung, die Eizählung nach McMaster sowie das einfache Sedimentationsverfahren

- 1 -

EINLEITUNG

untersucht. Erfasst werden die relevanten Haussäuger (Hund, Katze, Pferd, Schwein, Rind) und ein

Teil deren bedeutsamsten Parasiten (Ancylostoma caninum, Toxocara cati und Toxocara canis,

Trichuris vulpis, Ascaris suum, Monizia expansa, Toxascaris leonina, Anoplocephala perfoliata,

Uncinaria stenocephala, Cooperia oncophora, Dictyocaulus viviparus, Fasciola hepatica und

Arten der Unterfamilie Cyathostominae).

- 2 -

LITERATURÜBERSICHT

2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 Methoden

2.1.1 Kombiniertes Sedimentations-Flotations-Verfahren

Diese Methode ergibt sich aus der Kombination des zentrifugalen Flotationsverfahrens mit dem

unten beschriebenen Sedimentationsverfahren.

Die Flotationsmethode wurde zum ersten Mal von Bass (1909) beschrieben und gehört zu den

sogenannten Konzentrationstechniken. Man nutzt dabei Lösungen hoher spezifischer Dichte, die

dem zu untersuchenden Kot beigefügt werden. Die Eier flotieren dann aufgrund ihres geringeren

spezifischen Gewichtes an die Oberfläche, schwerere Kotbestandteile sinken im Gegensatz zu

Boden. Bei der Flotation durch Gravitationskräfte wird die Kotsuspension über einen bestimmten

Zeitraum stehen gelassen, während dessen sammeln sich vorhandene Eier an der

Flüssigkeitsoberfläche, welche anschließend abgenommen werden können. Dies kann mittels

Pipette (Bass, 1909), Drahtöse (Kofoid und Barber, 1918) oder Deckglas (Willis, 1921; Lane, 1922)

erfolgen. Faust et al. (1939) verglichen die Abnahme von Eiern von der Flüssigkeitsoberfläche nach

zentrifugaler Flotation mit Zinksulfat mittels Deckglas, Drahtöse und bereits vor der Zentrifugation

aufgelegtem Deckglas. Sie empfehlen bei der Flotation (mit Zentrifugation und Zinksulfat als

Medium) die anschließende Abnahme der oberen Flüssigkeitsschicht mittels Drahtöse. Kofoid und

Barber (1918) mischten Kot und konzentrierte Kochsalzlösung im Verhältnis 1:2, wobei sie den

Detritus mittels einer Stahldrehspanscheibe niederzuhalten versuchten. Fülleborn (1920) erzielte mit

einer Kot-Kochsalzmischung von 1:20 bessere Ergebnisse. Er verzichtete auf die Scheibe und

schöpfte flotierende Kotbestandteile nach 15 min von der Oberfläche ab, erst nach weiteren 15 min

nahm er Eier mit Hilfe einer Drahtöse ab. Fülleborn (1920) gab ebenso wie Fehtkötter (1926) und

Woelk (1966) 20 min für das Aufsteigen von Eiern in konzentrierter Kochsalzlösung an. Nach

Seifert (1955) reichen 10 min aus, mit Ausnahme von Trichuris- und Capillaria-Eiern.

Schuchmann und Kiefer (1922) verglichen die Anreicherung von Wurmeiern in einem Zylinder und

in einem Erlenmeyerkolben und fanden in letzterem wesentlich mehr Eier. Zum gleichen Ergebnis

- 3 -

LITERATURÜBERSICHT

kamen auch Otten (1922), Nöller (1921) und Bauer (1923). Jaeger (1921) kann dagegen zwischen

beiden Gefäßen keinen Unterschied entdecken. Hobmaier und Taube (1921) beschreiben als erste

den Nutzen der Zentrifugalkraft, um das Aufsteigen der Eier an die Flüssigkeitsoberfläche zu

beschleunigen. Sie fanden direkt nach der Zentrifugation mehr Eier als nach 2 h einfacher Flotation.

Lane (1922) platzierte ein Deckglas unmittelbar auf dem Zentrifugenröhrchen, um dadurch ein

Anheften der Eier an das Glas nach dem Aufsteigen zu erreichen. Faust et al. (1939) empfiehlt die

Flotation (mit Zinksulfat als Medium) durch Zentrifugation als beste Methode zum Nachweis von

Oozysten und Helmintheneieren in humanen Fäzes. Durch die Nutzung einer Zentrifuge wird neben

einer Zeitersparnis außerdem ein genaueres Ergebnis erreicht (Soulsby, 1968). Zajac et al. (2002)

heben ebenfalls die signifikant besseren Ergebnisse der Flotation in Verbindung mit Zentrifugation

in der Diagnose von Parasitenstadien im Vergleich zur einfachen Flotation hervor. Besonders

deutlich ist dieser Unterschied bei Eiern von Trichuris spp.. Diese Eier haben ein höheres

spezifisches Gewicht (1,14) als andere üblicherweise durch Flotation detektierte Eier und flotieren

daher ohne Zentrifugation des Ansatzes in einem angemessenen Zeitraum nur sehr langsam und

unvollständig.

Die angewendeten Flotationslösungen variieren stark in ihrem spezifischen Gewicht. Jede Lösung

birgt Vor- und Nachteile (Stoll, 1930; Koutz, 1941; Ray, 1953; Levine et al. 1960; Gibson, 1965).

Lane (1925) untersuchte Kalziumchlorid-, Zinksulfat- und Kochsalzlösung als Flotationsmedien

und fand in einer Kotprobe mit ungefähr bekannter Eizahl mit Zinksulfat (spez. Gew. 1,2) 99 % der

Eier wieder. Diese Ergebnisse wurden durch Sawitz (1942) bestätigt. In den Untersuchungen von

Faust et al. (1939) stellte sich im Vergleich mit anderen Flotationslösungen und Methoden die

zentrifugale Flotation mit Zinksulfat (spez. Gew. 1,18) als die effektivste heraus. Dünnschalige

Helmintheneier und Protozoenoozysten wurden im Gegensatz zur Salzlösung von Zinksulfat nicht

verändert oder zerstört. Sie empfehlen deshalb die Zinksulfatlösung mit einem spez. Gew. von 1,18

als geeignetes Mittel zur Flotation von Protozoenoozysten und Helmintheneiern. Pesigan (1940)

untersuchte Zinksulfat- und Kupfersulfatlösungen als Flotationsmedien für Helmintheneier und

Protozoenoozysten und bestimmte für beide eine Effektivität (Wiederfindungsrate) von ungefähr

90 %. Farr und Luttermoser (1941) mischten bekannte Eizahlen von Ascaridia lineata und

Heterakis gallinae in Hühnerkot und zentrifugierten bei aufgelegtem Deckglas jeweils mit

Zinksulfat (spez. Gew. 1,2) und zwei Zuckerlösungen (spez. Gew. 1,2 und 1,27). Sie erhielten mit

Zinksulfat 78 % der Eier auf dem ersten Deckglas, mit der einen Zuckerlösung (spez. Gew. 1,27)

- 4 -

LITERATURÜBERSICHT

82 % und mit der anderen Zuckerlösung (spez. Gew. 1,2) 90 %. In Versuchen mit Oozysten

erreichten sie mit Zinksulfat die höchste Effektivität. Ihrer Meinung nach eignet sich Zuckerlösung

als Flotationsmedium besser, da sie nicht so schnell auskristallisiert, leichter herzustellen ist und auf

dem Deckglas die Eier gleichmäßiger verteilt liefert. Rebrassier (1940), Koutz (1941), Soifer

(1967), Wilkins (1973) und Alcaino und Baker (1974) stellten mittels Natriumnitratlösungen höhere

Nachweisraten von Eiern fest als mit Zucker-, Kochsalz-, Mangnesiumsulfat-, Zinksulfat- oder

Natriumdichromatlösungen. Vasters (1974) stellt diese Ergebnisse in Frage. Er untersuchte die

kombinierte Sedimentations-Flotationsmethode und fand, dass die wässrige Zinksulfatlösung bei

einer Dichte von 1,3 eine signifikant höhere Leistungsfähigkeit bei dem Nachweis von Spul-,

Haken- und Peitschenwurm sowie beschalten Taenienonkosphären, hat als eine wässrige

Natriumnitratlösung gleicher Dichte. Parfitt (1958) empfiehlt der gesättigten Kochsalzlösung zum

Nachweis von Nematoden, Moniezia spp. und Kokzidien den Vorzug vor gesättigter

Zinksulfatlösung zu geben, da diese in seinen Untersuchungen höhere und konstantere

Erfassungsraten ergab. Levine et al. (1960) konnten zwischen konzentrierter Zuckerlösung, 33

%iger (spez. Gew. 1,18) Zinksulfatlösung, gesättigter Zinksulfatlösung (45 %ig, spez. Gew. 1,24)

sowie gesättigter Natriumnitratlösung keine statistisch signifikanten Unterschiede finden. Sie

empfehlen aber die konzentrierte Zuckerlösung, da man mit dieser die saubersten Präparate erhält.

Mayhew (1962) befindet in 45 Vergleichsgängen die Zuckerlösung (spez. Gew. 1,15) der

Zinksulfatlösung (spez. Gew. 1,18) sowie einigen anderen Lösungen als überlegen, da er mit ihr die

größte Menge an Strongylideneiern flotierten konnte. Castelino und Herbert (1972) empfehlen

gesättigte Magnesiumsulfatlösung zum Nachweis von Hyostrongylus rubidus einer gesättigten

Zinksulfat- oder Natriumchloridlösung vorzuziehen. Henriksen und Aagaard (1977) verglichen

jeweils gesättigte Zinksulfat-, Kochsalz-, Natriumnitrat-, Kochsalz + Zinkchlorid- (2:1), sowie

gesättigte Kochsalzlösung mit differentem Glukosezusatz. Als bestes Medium erwies sich dort eine

gesättigte Kochsalzlösung, welche 50 g Glucose pro 100 ml enthielt. Raynaud et al. (1979)

berichten über die Gleichwertigkeit von Zinksulfat- und Kaliumjodomerkuratlösung. Sie plädieren

für den Ersatz der gebräuchlichen Kochsalzlösung durch Zinksulfat-, Magnesiumsulfat- oder

Zuckerlösung. Wade und Gaafar (1985) halten Natriumnitratlösung für effizienter als gesättigte

Zinksulfat-, gesättigte Kochsalz- oder Zuckerlösung. In Untersuchungen von Keferböck (1982),

Mayerhofer (1985), Supperer und Hinaidy (1985) und Schragner (1986) wurde konzentrierte

Zuckerlösung (spez. Gew. 1,26) als leistungsfähigstes Medium im Vergleich mit Zinksulfatlösung

- 5 -

LITERATURÜBERSICHT

(spez. Gew. 1,24) und anderen Lösungen herausgestellt. Untersucht wurden verschiedene

Flotationsmedien im Vergleich hinsichtlich Erfassungsraten und Anzahl parasitärer Objekte sowie

der Präparatequalität bei Schwein, Wildschwein, Rind, Hund und Katze. Zajac et al. (2002)

verglichen Zinksulfat- (spez. Gew. 1,18) mit Sheathers Zuckerlösung (spez. Gew. 1,25) und fanden

mit der Zinksulfatlösung mehr positive Proben als mit der Zuckerlösung, obwohl das geometrische

Mittel gezählter Eier in den Proben mit der Zuckerlösung in einigen Fällen höher lag. Die Resultate

ihrer Studie zeigten auch, dass sich die vergleichsweise schwer zu flotierenden Trichuris-Eier mit

Zuckerlösung nicht effektiver diagnostizieren lassen als mit Zinksulfatlösung. Sie empfehlen daher

Zinksulfatlösung als Routineflotationslösung, da es die beste Alternative für das einfache,

gleichzeitige Screening von Helmintheneiern und Protozoenoozysten ist.

Die direkte zentrifugale Flotation (DCF), welche Lane (1928) zur Diagnose von Hakenwurmeiern

in humanen Fäzes gebrauchte, wurde von Stoll (1930) für die Untersuchung von Schafkot

modifiziert. O´Grady und Slocombe (1980) untersuchten verschiedene Einflüsse auf eine

Flotationsmethode ohne Zentrifugierung. Bei dieser wurden 4 g Kot mit 60 ml einer

Natriumnitratlösung (spez. Gewicht 1,22-1,38) gemischt und durch ein Teesieb gegossen. Die

erhaltene Lösung wurde geschüttelt und in ein Röhrchen (24 ml) so überführt, dass sich darauf ein

Meniskus bildete, auf dem ein Deckglas platziert wurde. Nach einer bestimmten Flotationsdauer

wurde das Deckglas vertikal abgenommen und auf einem Objektträger mikroskopisch untersucht.

Mit dem verbleibenden Rest der durch das Sieb gespülten Lösung konnte ein zweites Röhrchen

befüllt werden, welches in gleicher Art untersucht wurde. Die Autoren untersuchten die Einflüsse

des spezifischen Gewichtes einer Natriumnitratflotationslösung, der Dauer der Flotationszeit und

der Maschenweite des verwendeten Siebes auf die beschriebene Methode. Für

Routineuntersuchungen empfehlen sie für die Flotationslösung ein spezifisches Gewicht von 1,22–

1,35. Bei einer Dichte von 1,27 ergaben ihre Untersuchungen keine Unterschiede in der

Eiwiederfindung nach vier, acht und zwölf Minuten Flotationszeit. Sie konnten nur 3–7 % der Eier

aus einer 4 g Kotprobe unter dem Deckglas wiederfinden, etwa 50 % der Eier verblieben in dem

Kotanteil auf dem Sieb. Des Weiteren gelangte nur die Hälfte der durch das Sieb gefilterten

Kotsuspension mit etwa 25 % der Eier zur Untersuchung. Von diesen wiederum konnten nur 16–29

% unter dem Deckglas gezählt werden. Sie empfehlen bei einer großen Menge Kottrümmer in der

Probe auf jeden Fall die Untersuchung eines zweiten Röhrchens. Die Verwendung feinerer Siebe als

- 6 -

LITERATURÜBERSICHT

zwischen 250 und 500 µm Maschenweite sowie die Zugabe geringer Mengen Detergens

verbesserten die Eizählungen nicht.

Egwang und Slocombe (1981) verglichen anhand von Kotproben mit 7, 30 und 60 Eiern pro

Gramm Kot (EpG) von Haemonchus contortus u.a. die Wisconsin Direct Centrifugal Flotation -

Methode (WDCF) (Rogar / STB 1978) und die leicht modifizierte Cornell Direct Centrifugal

Flotation - Methode (CDCF) (Georgi, 1969) unter Gebrauch eines Deckglases mit einer auf

Schwerkraft beruhenden Konzentrationstechnik, der Standard Vial Technik (O´Grady und

Slocombe, 1980). Bei 7 EpG konnten mit der WDCF- Methode im Mittel 4,3 und mit der CDCF-

Methode 4,2 EpG gefunden werden, es gab bei beiden keine falsch negativen Proben. Mit der

Standard Vial Technik ermittelten sie im Durchschnitt 0,13 EpG, 9 Proben wurden falsch negativ

bewertet. Bei 30 EpG ermittelten die WDCF- und die CDCF-Methode im Mittel 19,2 und 19,3

EpG, die Standard Vial Technik lag im Mittel bei 9 EpG, keine der Methoden lieferte ein falsch

negatives Ergebnis. Bei 60 EpG lagen die WDCF- und die CDCF-Methode bei im Schnitt 41,4 und

38,0 EpG, die Standard Vial Technik ermittelte 6,7 EpG, auch hier lagen keine falsch negativen

Ergebnisse vor.

Egwang und Slocombe (1982) evaluierten die Cornell-Wisconsin Centrifugal Flotation Methode

anhand von Eiern von H. contortus und stellten fest, dass weder der Mischungsmodus, die Zugabe

verschiedener Wasservolumina (15–60 ml) zur Herstellung der Kotsuspension, noch die spezifische

Dichte der Zuckerlösung (1,20–1,33) einen Einfluss auf die Wiederfindung der Eier hat. Optimale

Zentrifugationszeiten sind ihren Untersuchungen nach 3 bis 5 Minuten, erst von der Kot-Wasser-

Suspension und dann von der Kot-Zuckerlösung-Suspension. Unter diesen Bedingungen betrug die

Wiederfindungsrate für die eingerührten Eier 62,6 % und es liess sich eine lineare Beziehung

zwischen der Anzahl in die Fäzes eingerührter Eier und wiedergefundener Eier herstellen. In

Bereichen zwischen 3 und 70 EpG traten keine falsch negativen Proben auf, bei 1,44 EpG war eine

Probe von 14 falsch negativ. Etwa 30 % der nicht in der Probe gefundenen Eier wurden in den im

Sieb verbleibenden Kotresten gefunden, weitere 3–5 % gingen beim Abgießen des Überstandes

nach der ersten Zentrifugation oder anschließend in der Zuckerlösung verloren. Die Zugabe des

Detergens Triton X –100 führte zu einer verminderten Wiederfindungsrate.

Die von Proudman und Edwards (1992) validierte Zentrifugations-/Flotationstechnik zum Nachweis

von A. perfoliata ist eine modifizierte Form der Methode von Beroza et al. (1986) und Carmel

(1988). Die Autoren untersuchten mit der genannten Methode Kotproben von 80 Pferden mit

- 7 -

LITERATURÜBERSICHT

bekanntem Bandwurmstatus und ermittelten eine Sensitivität von 61 %. Viele der falsch negativen

Ergebnisse wurden bei Tieren mit geringen Bandwurmzahlen diagnostiziert. Williamson et al.

(1998) setzten eine bekannte Anzahl Eier von A. perfoliata einer definierten Menge Kot zu und

ermittelten die Wiederfindungsrate für zwei Flotations- (F1 und F2) und eine

Sedimentationsmethode, indem sie den Mittelwert aus jeweils drei untersuchten Proben je

Eierkonzentrationsstufe und Methode bildeten. Bei der F1-Methode wurden aus 50 g Kot mit

100 ml Wasser ein Sediment hergestellt, von dem 20 ml auf zwei Zentrifugenröhrchen verteilt und

zentrifugiert wurden. Der Überstand wurde abgegossen und das Sediment mit Zuckerlösung (Dichte

1,28) aufgefüllt, anschließend wurde erneut zentrifugiert. Von der Oberfläche wurde dann 1 ml

abgenommen, in ein Zentrifugenröhrchen überführt und mit 8 ml Wasser versetzt. Nach

Durchmischung wurde erneut zentrifugiert und der Überstand bis auf 2 ml abgenommen. Diese

wurden dann mikroskopisch untersucht. Bei der F2-Methode wurde aus 5 g Kot mit 50 ml Wasser

ein Sediment gewonnen, welches mit 8 ml Zuckerlösung (Dichte 1,28) versetzt und in ein

Zentrifugenröhrchen überführt wurde. Nach gründlicher Durchmischung wurde die Probe

zentrifugiert. Anschließend wurde 1 ml von der Oberfläche abgenommen und in einem frischen

Röhrchen mit 9 ml Leitungswasser verdünnt. Nach erneuter Durchmischung und Zentrifugation

wurde der Überstand entfernt und das Sediment in 500 µl Leitungswasser gelöst und mikroskopisch

untersucht. Für insgesamt 7 Eikonzentrationsstufen von 0–200 EpG wurde die Wiederfindungsrate

der Methoden ermittelt. Mit der F2-Methode wurden 0,6 von 1 EpG gefunden (60 %), die F1-

Methode war bei 1 EpG negativ; ab 2 EpG waren bei beiden Methoden die Befunde positiv (F1

0,18 Epg = 9,1 % und F2 1 EpG = 50 %). Bei 200 EpG wurden mit F1 im Mittel 3,9 Eier ( = 2 %)

gefunden und mit F2 31,9 Eier ( = 15,9 %). Auffallend ist, dass mit zunehmender Eizahl der

Prozentsatz an gefundenen Eiern sank.

- 8 -

LITERATURÜBERSICHT

2.1.2 Eizählung nach McMaster

Die Konzentration von Nematodeneiern in Fäzes (EpG) ist einer der wichtigsten Parameter in der

parasitologischen Diagnostik (Mes et al., 2001). Methoden zur quantitativen Bestimmung von

Parasiteneiern in Fäzes spielen daher in der experimentellen und epidemiologischen Parasitologie

eine große Rolle und werden vor allem zur Prüfung der Effektivität von Anthelminthika (Peters und

Leiper, 1940; Waller, 1989) und zur Bestimmung des korrekten Behandlungsintervalls mit

Anthelminthika zur Vermeidung zu starker Weidekontamination mit Wurmeiern (Herd, 1992)

eingesetzt. McKenna (1987) und McKenna und Simpson (1987) schreiben über den Nutzen der

nachfolgend beschriebenen McMaster-Methode zur Abschätzung der Wurmbürde von Jungschafen.

Die Bedeutung der Eizahl pro Gramm Kot in der Diagnostik parasitär bedingter Gastroenteritis bei

Rindern wird von Roberts et al. (1951) diskutiert. Besonders aber auch in der Routinediagnostik ist

die Bestimmung der EpG zur laufenden Überwachung von Tierbeständen hinsichtlich der

strategischen Erfassung und Kontrolle der parasitären Belastung, der Einleitung von

Bekämpfungsmaßnahmen und der Kontrolle des Therapieerfolges (Nicholls und Obendorf, 1994;

Heile und Schein, 2004) eine maßgebliche Größe. Gordon (1967) beschreibt die ermittelte Quantität

von Strongylideneiern in Schafkot als weit verbreitetes Mass zur Bestimmung der

Weidekontamination mit Helmintheneiern.

Viele der quantitativen Methoden, mit denen die Anzahl Eier pro Gramm Kot ermittelt werden, sind

Verdünnungstechniken. Die prinzipielle Vorgehensweise ist bei allen gleich und beruht darauf, dass

ein Aliquot einer Kotsuspension, welche durch gründliche Durchmischung einer bekannten Menge

Fäzes mit einer bestimmten Menge Lösung entsteht, mikroskopisch untersucht wird. Der EpG –

Wert wird durch Multiplikation der gezählten Eier im Aliquot mit dem Verdünnungsfaktor

errechnet. Bei hohen Eizahlen im Kot resultieren unter Anwendung anderer Methoden Tausende

von Eiern im Gesichtsfeld des Mikroskopes, welche es dem Untersucher unmöglich machen, die

Eier exakt zu zählen. Diese Schwierigkeit lässt sich mit Hilfe der Verdünnungstechniken umgehen

(Gibson, 1965; Peters und Leiper, 1940).

Das Prinzip der Verdünnungstechnik wurde erstmals von Stoll (1923) für die Untersuchung

menschlicher Fäzes beschrieben. Er verbrachte 3 g Fäzes in ein Röhrchen, füllte dies mit

Natriumhydroxydlösung auf 45 ml auf und gab Glasperlen dazu. Diese Mischung wurde dann eine

- 9 -

LITERATURÜBERSICHT

Minute geschüttelt, wobei die Glasperlen die Homogenisierung der Fäzes verbessern sollten. Mit

Hilfe einer Pipette entnahm er der entstandenen Suspension 0,15 ml und verbrachte diese auf einen

Objektträger. Die Zahl der gezählten Eier multiplizierte er mit 100 und errechnete so die Eier pro

Gramm Kot in der Originalprobe. Später wurde sie von Monnig (1928) und Stoll (1930) zum

Gebrauch für Schafkot verändert. Stolls eigene Modifikation bestand darin, dass er die untersuchte

Kotmenge auf 10 g und die Lösungsmenge auf 300 ml erhöhte. Zschucke (1931) entwickelte eine

Zählkammer mit graduiertem Boden, um die Auszählung der Eier in der Verdünnungslösung nach

kurzer Sedimentationszeit zu erleichtern. Gordon und Whitlock (1939) modifizierten die Technik

von Stoll, indem sie Verdünnung und Flotation kombinierten und entwickelten die am weitesten

verbreitete Methode (Rossanigo und Gruner, 1991; Nicholls und Oberndorf, 1994) zur quantitativen

Bestimmung von Helmintheneiern in Fäzes, die nach dem Labor ihrer Entwicklung benannte

McMaster-Methode. Sie verwendeten 2 g Kot, welche sie in einem Becherglas mit 30 ml Wasser

für ca. 1 Stunde einweichten. Anschließend gaben sie 30 ml einer gesättigten Kochsalzlösung und

einige Stahlkugeln dazu und schüttelten die Mischung gründlich. Danach wurden Aliquots in

Zählkammern überführt. Gordon und Whitlock (1939) führten eine Zählkammer, die sogenannte

McMasterkammer, ein, bei der die Deckplatte über den Zählkammern graduiert ist. In ihr flotieren

vorhandene Eier in der Verdünnungslösung an die Oberfläche der Kammer, während andere,

schwerere Kotbestandteile nach unten sanken. Dem Untersuchenden wird durch die dadurch

verbesserte Sicht das Auszählen der Eier erleichtert. Aufgrund dieser Vorzüge sind die

Zählkammern nach McMaster ein fester Bestandteil jedes parasitologischen Labors geworden.

Wellensiek (1954) führte einen Vergleich zwischen der Zschucke- und McMaster-Kammer durch.

Schwierigkeiten ergaben sich im Nachweis der Trematoden-Eier, da diese aufgrund ihres hohen

spezifischen Gewichtes in der McMaster-Kammer schlecht flotieren. Seiner Meinung nach ist einer

Kombination des Verfahrens nach Telemann (1908) mit der Zschucke-Kammer im Hinblick auf die

Erfassung aller Eier der Vorzug zu geben. Er gibt jedoch zu Bedenken, dass die Untersuchungen

mittels der Zschucke-Kammer die dreifache Zeit in Anspruch nehmen als es mit der McMaster-

Kammer der Fall ist, jedoch sind mit ihr bei hohen Eizahlen auch Teilzählungen möglich. Gibson

(1965) empfiehlt, größere Kotbestandteile der Suspension durch eine Gazelage heraus zu filtern, da

sie in größerer Menge den Lichteinfall durch die Kammerunterseite vermindern und somit die Sicht

beeinträchtigen. Er weist ebenfalls daraufhin, dass die Methode mit Kochsalzlösung als

Flotationsmedium nicht dazu geeignet ist, die schweren Trematodeneier nachzuweisen, da jene

- 10 -

LITERATURÜBERSICHT

aufgrund ihrer hohen Dichte nicht in dieser flotieren. Whitlock (1941) entwickelte eine

Modifikation der Kammer, welche das Zählen besonders kleiner Eizahlen vereinfachen sollte. Eine

Modifikation der McMaster-Methode, die Cornell-McMaster-Methode beschreibt Georgi (1969).

Roberts und O´Sullivan (1951) beschrieben, dass bei Wurminfestationen geringen Ausmaßes häufig

nur 15 bis 50 EpG im Kot gefunden werden können und somit durch die bis dahin herkömmliche

Methode, deren Nachweislimit im Bereich von 66 EpG liegt, nicht erfasst werden. Sie etablierten

deshalb eine Modifikation der Methode, in der, statt 2 g, 4 g Kot verwendet werden, so dass die

Nachweisgrenze auf 33 Eier pro Gramm Kot gesenkt wird. Noch größere Probenmengen

beeinträchtigen nach ihren Erfahrungen die Qualität der Probe durch starke Trübung der

Suspension.

Dunn und Keymer (1986) beschrieben, dass unterschiedliche Flotationszeiten und

Probenverdünnungen die Zuverlässigkeit der Ergebnisse der McMaster-Methode maßgeblich

beeinflussen. So stieg die Zahl der gezählten Eier zwischen 0 und 30 min Flotationszeit

kontinuierlich an, während sie nach 40 min Flotationszeit wieder sank. Die Autoren führen dieses

Verhalten auf das langsame Aufsteigen der Eier in der Kammer, bzw. auf den osmotischen Effekt

der Kochsalzlösung, welcher die Eier verformt und sie so durch Wasserverlust zum Sinken bringt,

zurück. Ein ähnliches Ergebnis erhielten sie für unterschiedliche Grade der Probenverdünnung. Die

Eizahl stieg bis zu einer Verdünnung von 14-16 ml Kochsalzlösung pro Gramm Fäzes und sank

danach wieder ab. Dunn und Keymer (1986) empfehlen daher eine Flotationszeit von 30 min und

eine Probenverdünnung mit 15 ml 50 % gesättigter Salzlösung pro Gramm Fäzes (1:15). Die

Versuche wurden alle mit Heligmosomoides polygyrus durchgeführt, ein Vergleich mit anderen

Parasiten fand nicht statt. Cringoli et al. (2004) untersuchten den Einfluss der Flotationslösung, der

Probenverdünnung und des untersuchten Volumens auf die Auffindung von Strongylideneiern und

Eiern von Dicrocoelium dendriticum in Schafkot mittels der McMaster-Methode. Die verwendete

Flotationslösung beeinflusste die Menge an gefundenen Eiern signifikant, die meisten

Strongylideneier flotierten in Lösungen auf Zuckerbasis mit einer Dichte zwischen 1,2 und 1,35, die

meisten Eier von D. dendriticum flotierten in Kaliumiodomerkuratlösung (Dichte 1,44), hier

stimmen die Resultate mit denen von Rehbein (1999) überein. Die Zuverlässigkeit der Methode in

Bezug auf die Probenverdünnung war bei einem Verhältnis von 1:10 und 1:15 für beide Parasiten

am höchsten. Die Autoren untersuchten die Volumina unter einem Gitternetzbereich (0,15 ml),

unter zwei Gitternetzbereichen (0,3 ml), das Volumen einer kompletten Kammer (0,5 ml) und das

- 11 -

LITERATURÜBERSICHT

Volumen zweier kompletter Kammern (1,0 ml). Die besten Ergebnisse für beide Parasiten wurden

bei einem untersuchten Volumen von 1,0 ml ermittelt. Aus geringeren Volumina resultierte eine

falsch überhöhte Eizahl, welches die Autoren darauf zurückführen, dass sich die flotierten Eier

vermehrt im Zentrum der McMaster-Kammer sammeln, welches im (üblicherweise gezählten)

Gitternetzbereich liegt. Egwang und Slocombe (1981) untersuchten die Effektivität und Sensitivität

verschiedener Methoden, darunter einer modifizierten Cornell-McMaster- und einer modifizierten

McMaster-Methode, anhand von Kotproben mit 7, 30 und 60 H. contortus-Eiern pro Gramm Kot.

Bei 60 EpG wurde die Eizahl mit den untersuchten Verdünnungsmethoden tendenziell überschätzt

(Mittelwert 121) und mehr Eier wurden gefunden als mit anderen Techniken (88%). Die

modifizierte Cornell-McMaster-Methode fand Eier in 90 % und die modifizierte McMaster -

Methode in 100 % aller Proben. Bei 30 EpG waren alle untersuchten Techniken vergleichbar, mit

den Verdünnungstechniken wurden jeweils 67 % (modifizierte Cornell – McMaster - Methode) und

63 % (modifizierte McMaster - Methode) der Eier gefunden. Die modifizierte Cornell-McMaster-

Methode fand Eier in 40 % und die modifizierte McMaster-Methode in 100 % der Proben. Bei 7

EpG wurden mit der modifizierten Cornell-McMaster-Methode 94 % und mit der modifizierten

McMaster - Methode 16 % der Eier gefunden, erstere fand in 21 % der gesamten Proben Eier,

letztere in 11 %. Deplazes und Eckert (1988) validierten in einem Wiederauffindungsversuch die

McMaster-Methode nach Wetzel (1951) unter der Verwendung von 4 g Kot und 60 ml

Zinkchloridlösung (Dichte 1,4) anhand von Eiern von Taenia hydatigena. Sie mischten dazu

163.000 reife Eier in 15 ml Wasser in 80 g Kot homogen ein und erreichten so eine Eizahl von 1716

Eiern pro Gramm Kot. Aus den 80 g wurden 11 Stichproben gewonnen und untersucht. Die

wiedergefundene Eizahl in den 11 Proben betrug im Mittel 70 % (± 6) der eingerührten Eizahl. Der

Nutzen von Eizählungen im Kot von Tieren zur Abschätzung der Wurmbürde beruht auf der

Annahme einer Verhältnismäßigkeit zwischen gefundenen Eiern pro Gramm Kot und der Anzahl

der durch das Individuum beherbergten Helminthen. Männliche Würmer und immature Stadien

können aber aufgrund fehlender Eiausscheidung durch die Methode nicht erfasst werden.

Tatsächlich besteht daher vielmehr eine Korrelation zwischen adulten weiblichen Helminthen und

dem EpG-Wert (Gibson, 1965), welche allerdings durch den Einfluss unten genannter Kriterien sehr

starken Schwankungen unterliegt. Einzelne, individuelle Eizählungen haben wenig Aussagekraft,

die Höhe der Wurmbürde kann realistischer durch eine Serie von Zählungen über mehrere Tage

abgeschätzt werden, eine im Feld kaum zu erfüllende Maßgabe (Roberts et al., 1951). Trotz aller

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LITERATURÜBERSICHT

Nachteile kann die McMaster-Methode eine wertvolle Hilfe in der Diagnostik sein, zum einen,

wenn ein ausführlicher Vorbericht der Krankengeschichte vorliegt und die Faktoren, welche die

Eiausscheidung beeinflussen, berücksichtigt werden (Gibson, 1965), zum anderen, wenn eine

genügend große Anzahl an Einzelproben aus einer Tiergruppe entnommen wird, bei der der

Wurmbefall ein Bestandsproblem darstellt (Roberts et al., 1951). Zu berücksichtigen ist hier, dass

oft nur eine geringe Anzahl der Tiere eine große Menge an Eiern ausscheidet, während der Großteil

eines Bestandes niedrige Eizahlen in den Fäzes aufweist (Borgsteede et al. 2000; Uhlinger, 1993).

- 13 -

LITERATURÜBERSICHT

2.1.3 Sedimentationsverfahren

Das Sedimentationsverfahren beruht prinzipiell darauf, dass Helmintheneier in Lösungen von

geringerer spezifischer Dichte absinken. In einer Kot-Wasser-Aufschwemmung sammeln sich die

Eier infolge dessen nach einer Sedimentationsphase am Grunde des Gefäßes. Die

Sedimentationszeit hängt dabei vor allem von dem spezifischen Gewicht der Eier ab. Durch

mehrmaliges Dekantieren der Wassersäule über dem Bodensatz können noch schwebende, leichtere

Kotbestandteile entfernt werden. Seiht man die Probe vor dem Sedimentieren zusätzlich durch ein

Sieb, werden größere Kotbestandteile zurückgehalten und die Suspension dadurch verfeinert. Dann

noch vorhandene Kotbestandteile im Sediment können die Beurteilung des Präparates erschweren.

Um die Eier optisch von ebenfalls sedimentierten Kottrümmern besser unterscheiden zu können,

können Färbemittel zugesetzt werden. Die reine Sedimentation hat sich nur zum Nachweis von

Trematodeneiern etabliert, die aufgrund ihrer hohen spezifischen Dichte sehr schwer sind und in

Wasser relativ schnell vor anderen Kotbestandteilen und Nematodeneiern sedimentieren. Außerdem

werden sie durch konzentrierte Flotationslösungen schnell zerstört oder so verändert, dass man sie

nur schwer diagnostizieren und differenzieren kann. (Van Someren, 1947, Happich und Boray,

1969).

Dieses Grundprinzip der Sedimentation wurde verschieden variiert:

Lutz (1893) siebte eine Kotaufschwemmung durch einen Gazefilter und ließ das Filtrat

sedimentieren. Dann spülte er das Sediment mit Wasser so oft aus, bis das Wasser klar blieb. In

dem so entstandenen Sediment wies er Leberegeleier in einem Objektträgerausstrich nach. Ehrlich

(1927) empfiehlt, 35–40 g Kot mit der 5–8 -fachen Menge Wasser aufzuschwemmen und durch ein

Sieb in eine Petrischale zu seihen. Abschließend soll die Suspension 10 min sedimentieren, danach

wird der Überstand so abgekippt, dass nur die am Boden haftende Schicht übrig bleibt, die dann

mikroskopisch untersucht werden kann. Benedek (1943) verrührte 5 g Kot mit 100 ml Wasser,

seihte die Suspension durch ein Sieb in ein Becherglas und ließ sie sedimentieren. Er stellte fest,

dass die Eier in einem 14 cm hohen Becherglas schon nach 2 min sedimentiert waren. Anschließend

wurde der Überstand dekantiert und 1–2 ml Bodensatz erneut mit 15 ml Wasser aufgeschwemmt.

Nach 3 Minuten wurde die Flüssigkeit wiederum bis auf 0,5 ml Sediment abgegossen, welches mit

1-2 Tropfen Karbolfuchsin versetzt wurde. Dieses Gemisch untersuchte er auf dem Objektträger.

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LITERATURÜBERSICHT

Van Someren (1947) stellte eine spezielle Apparatur zum schnellen Nachweis von Fasciola- und

Paramphistomum-Eiern vor. Benedek und Nemeseri (1953) sedimentierten in einem Spitzglas,

dekantierten die Flüssigkeit, sedimentierten ein zweites Mal in einem Reagenzglas und untersuchten

anschließend das Sediment. Sie stellten fest, dass die Sedimentation nach 2 min beendet ist und sich

anschließend absetzende Fäzesteilchen die Eier wieder bedecken. Nach ihren Untersuchungen

bleiben ca. 35–45 % der Eier bei der Sedimentation in Spitzgläsern an den Wänden haften. Lechner

(1955) gab in seinen Untersuchungen der sog. Abschwemm-Methode vor anderen Methoden den

Vorzug. Er verrührte eine Menge zerkleinerten Kotes mit Wasser, seiht sie durch und läßt sie in

einer Petrischale 1 h sedimentieren. Der Überstand wird dekantiert. Nach seinen Untersuchungen ist

die Verwendung warmen Wassers nicht zu empfehlen. Er stellte fest, dass die Menge der Eier im

Kot annähernd im direkten Verhältnis zur Anzahl der Egel in der Leber des Wirtes stehen,

allerdings konnten 25 % der von ihm untersuchten egelbefallenen Schafe koprologisch nicht als

positiv erfasst werden. Er stellte eine starke jahreszeitliche Schwankung in der Ausscheidung der

Leberegeleier fest, so dass in den Monaten März/April der Einachweis bei 89 % der Probanden

gelang, während in den Monaten August/September nur 55,5 % der Fälle positiv waren. Teuscher

und Schuler (1959) favorisieren die von ihnen entwickelte Methode, welche auf Sedimentation und

Flotation in 44,4 %iger Zinksulfatlösung beruht. Diese eignet sich aber nur zum Nachweis von

Fasciola. Boray und Pearson (1960) schwemmten Kot auf und ließen ihn in einem Zylinder

sedimentieren, dessen Ende spitz ausgezogen war. Anschließend gossen sie das Wasser ab und

verbrachten den Bodensatz in ein Reagenzglas, wo er mit Wasser nochmals aufgeschwemmt wurde.

Nach 3 min Sedimentation wurde mittels einer Pipette ein Teil des Bodensatzes auf einen

Objektträger verbracht. Die Autoren bewiesen in Blindversuchen, dass Leberegeleier nach 3 min in

reinem Wasser zu 98 % am Boden des Zylinders sedimentiert sind. Bei natürlich infiziertem Kot

lagen die Ergebnisse nur geringfügig niedriger. Bei Einsatz eines Gefäßes, dessen Wände schräg

waren, blieben 35–45 % der Eier bei der Sedimentation an diesen hängen. Döbel (1963) untersuchte

26 Methoden zum Nachweis von F. hepatica–Eiern, darunter 10 Sedimentationsverfahren. Als

beste Methode für wissenschaftliche Untersuchungen befand sie die Methode nach Boray und

Pearson (1960). Mit ihr konnte sie im Mittel 98 % der zugefügten Eier nach einer

Sedimentationszeit von 3 min nachweisen und diese Methode lieferte sehr gute quantitative

Ergebnisse. Nemeseri und Gesztessy (1965) ließen 2 x à 5 min sedimentieren und verbrachten vom

letzten Sediment 0,15 ml auf einen Objektträger. Henrikson (1966) ließ 2 x 10 min sedimentieren

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LITERATURÜBERSICHT

und brachte nach Aufschwemmen des Bodensatzes mit Färbemittel schwere Kotpartikel durch

leichtes Routieren zur Ablagerung. Die noch schwebenden Leberegeleier dekantierte er in ein

Reagenzglas und ließ sie dort 3–4 min sedimentieren. Happich und Boray (1969) verglichen die

Flotationsmethode nach Whitlock (1950) mit der Sedimentation nach Boray und Pearson (1960).

Sie stellten fest, dass in Fällen, in denen die Fäzes unter 1000 EpG enthielten, die

Sedimentationsmethode die sensitivere und genauere Methode zum Nachweis von Trematodeneiern

ist. Adulte Rinder wiesen aufgrund ihrer Immunitätslage eine gewisse Resistenz gegenüber der

Infektion mit Trematoden auf und scheiden deshalb in der Regel eine geringe Eizahl aus, so dass

die Sedimentationsmethode im Allgemeinen die zuverlässigere Methode in der Trematoden-

Diagnostik ist. Die Autoren zeigten, dass etwa ein Drittel der im Kot enthaltenen Eier durch die

Methoden gefunden wurde. Sie empfahlen daher, bei quantitativen Studien einen

Multiplikationsfaktor von 3 anzuwenden. Des Weiteren untersuchten sie den Zusatz von

Detergentien bei der Sedimentationsmethode, kamen aber zu dem Schluß, dass die dadurch erhöhte

Wiederfindungsrate durch die ebenfalls größere Menge an Kottrümmern, welche das Auszählen

sehr erschweren, nicht zum Vorteil gereicht.

Das Anfärben des Sedimentes erleichtert das Auffinden der Eier in den ebenfalls sedimentierten

Kottrümmern. Benedek (1943) nutzte zum Anfärben der Kotbestandteile Karbol-Fuchsin, welches

Kotteile rot anfärbt. Die Leberegeleier stellen sich dagegen im Kontrast gelbgrün dar. Pusch et al.

(1950) färbten die Eier mit 2 %iger wässriger Eosinlösung grün, wodurch sie sich gegen den rötlich

gefärbten Rest des Sedimentes abheben. Lechner (1955) färbte das Sediment seiner Abschwemm-

Methode mit einigen Tropfen Tinte. Boray und Pearson (1960) und McGaughey und Hatch (1964)

verwendeten wenige Tropfen Methylenblaulösung, welche die Kotbestandteile bläulich färben und

von denen sich die Leberegeleier dann goldgelb abheben. Henrikson (1966) färbte mit

Malachitgrün, welches den Kot grünblau färbt, während die Eier gelblich bleiben.

McCaughey und Hatch (1964) verglichen das Verfahren nach Boray und Pearson (1960) mit sechs

weiteren Methoden zum Nachweis von Fasciola-Eiern. Sie stellten fest, dass die Methode von

Boray und Pearson (1960) die sensitivste war, mit der sie die meisten positiven Ergebnisse bei einer

Eizahl von unter 2 EpG erreichten. Bei Eizahlen über 2 EpG erreichten sie auch mit

Modifizierungen der Methode nach Boray und Pearson (1960), mit der Methode nach Dennis, Stone

und Swanson (1954) und mit einer modifizierten einfachen Sedimentation durchgehend positive

Resultate. Nickel (1962) führte Untersuchungen durch, in denen er 10 g Kot mit einer vorher

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LITERATURÜBERSICHT

abgezählten Menge Eier versetzte. Mit dem Sedimentationsverfahren nach Benedek und Nemeseri

(1953) erhielt er bei 11–20 Eiern in 10 g Kot (1,1–2 EpG) in 75 % der untersuchten Proben positive

Befunde. Ab 30 Eiern in 10 g Kot (3 EpG) waren alle Proben sicher positiv. Mit der quantitativen

Methode nach Stoll (1923) konnten von ihm bis 100 Eier in 10 g Kot (10 EpG) nicht nachgewiesen

werden. Bei 100–300 Eiern (10–30 EpG) wurden nur einzelne Proben als positiv erkannt. Erst ab

400 Eiern (40 EpG) in 10 g Kot konnten in allen Proben Eier nachgewiesen werden. Mit höherem

Eigehalt näherten sich die Befunde mehr und mehr den realen Werten. Eine längere

Sedimentationszeit als 3 min hält Nickel (1962) für ungünstig, da sich dann auch vermehrt

Kotbestandteile absetzen und mit den sedimentierten Eiern vermischen. Er untersuchte ebenfalls ein

kombiniertes Sedimentations-Wasserglas-Flotationsverfahren, mit welchem er gute Resultate

erzielte (ab 31 Eier in 10 g Kot waren alle Proben positiv), welches aber in Arbeitsmaterial und

Aufwand dem Sedimentationsverfahren unterlegen war. Six (1968) untersuchte eine Abwandlung

des Benedek´schen Verfahrens, bei dem er an Stelle von reinem Wasser eine schwache

Detergentienlösung verwendete. Mit dieser Modifikation waren in künstlich infiziertem Kot bei 4

Eiern in 40 g Kot (0,1 EpG) alle 5 untersuchten Proben negativ, und ab 35 Eiern in 40 g Kot (0,9

EpG) alle 5 Proben positiv. Conceicao et al. (2002) evaluierten eine modifizierte Methode der

Sedimentationsmethode nach Gonzalez-Lanza et al. (1989) zum Nachweis von boviner Fasciolose.

Die Sensitivität der Methode lag bei mehr als 1,5 EpG bei 100 %, bei weniger als 1,5 EpG bei

33,3 %. Bei geringen Eizahlen empfahlen sie deshalb, die zu untersuchende Kotmenge auf 30 g zu

erhöhen.

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LITERATURÜBERSICHT

2.1.4 Auswanderverfahren nach Baermann

Beim Auswanderverfahren macht man sich die Eigenschaft lebender Nematodenlarven zu Nutze,

aus Kot- und Erdproben in umgebendes Wasser auszuwandern. Da diese nach dem Auswandern

aufgrund der Schwerkraft in Wasser absinken, kann man sie leicht in einem konisch zulaufenden

Gefäß anreichern.

Das Auswanderverfahren wurde erstmalig von Baermann (1917) zum Nachweis von

Hakenwurmlarven aus Erdproben beschrieben. Er nutzte einen Glastrichter, auf dessen Stutzen ein

Gummischlauchstück gestülpt war, das er mit einer Klemme verschloss. Der Trichter wurde bis

knapp unter den Rand mit gefiltertem, sterilisiertem Wasser gefüllt. Im oberen Teil des Trichters

platzierte er ein Sieb mit 1 mm Maschenweite, bedeckt durch ein grobes Tuch, im Wasser, in dem

sich die zu untersuchende Kot- oder Erdprobe befand. Proben wurden durch Lösen der Klemme aus

dem Gummistutzen entnommen und auf das Vorhandensein von Larven untersucht. Dieses

Verfahren hat sich seit dem als weit verbreitete Technik zur Auffindung von Larven parasitischer

Helminthen aus Kot-, Erd- und Grasproben etabliert.

Cort et al. (1922) untersuchten einige Variablen der Methode zur Diagnose von Hakenwurmlarven

aus Erdproben. Sie stellten fest, dass das verwendete Wasser mindestens 10° F (=5,5° C) wärmer

als die Erdprobe sein muss. Aus groben Erdproben konnten sie eine höhere Prozentzahl an Larven

anreichern als aus fein zerteilten. Eine geringfügig höhere Prozentzahl an Larven konnten sie aus

feuchter im Vergleich zu nasser Erde gewinnen. Nach ihren Untersuchungen wandern die meisten

Larven in den ersten 6 Stunden aus. Unter günstigen Bedingungen fanden die Autoren im

Durchschnitt 52 % der Larven aus den Proben, wobei der Prozentsatz der gefundenen Larven in den

einzelnen Proben großen Schwankungen unterlag. Stoll (1923) infizierte 100 g–Proben

unterschiedlicher Erdtypen künstlich mit einer bekannten Anzahl Hakenwurmlarven. Mit dem

Auswanderverfahren nach Baermann lag die Wiederfindungsrate aus den Humusproben bei 90–

95 %, aus Sand- und Lehmbodenproben bei 80 % und aus Tonerde bei 33–50 %. Cort et al. (1926)

beschreiben eine Wiederfindungsrate von 58,1±1,6 % nachdem sie 200 g-Proben eines Lehmbodens

mit 1900–3750 Larven von Ancylostoma und Necator infizierten. Die Wassertemperatur betrug

45° C, die Trichter wurden über Nacht inkubiert, die Lufttemperatur betrug 27–32° C. Parnell

(1936) isolierte Larven von Pferdestrongyliden mit der Apparatur nach Baermann und infizierte

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LITERATURÜBERSICHT

dann mit den gewonnenen Larven in bekannter Menge 40 g-Proben sterilisierten Pferdekotes.

Anschließend bestimmte er die Wiederfindungsrate mit der Auswandermethode. Untersucht wurden

jeweils 500 ml eines Ansatzes. Bei Proben, die er mit 75–100 Larven infizierte, betrugen die

Wiederfindungsraten 12,5, 25 und 45 %. Bei den Proben, die er mit 700–1000 Larven infizierte,

fand er 35, 35 und 50 % wieder und bei den Proben der Infektionsdosis mit mehr als 10.000 Larven

betrug die Wiederfindungsrate 45, 65 und 90 %. Kauzal (1940) untersuchte verschiedene Einflüsse

auf die Effektivität der Methode. Er nutzte dazu Larven von H. contortus und Trichostrongylus spp.

Im Vergleich zu 37° C warmem Wasser konnte er mehr Larven wiederfinden, wenn das genutzte

Wasser Raumtemperatur hatte (15–22° C). Bei der Untersuchung verschiedener Probenmengen und

Trichtergrößen betrug die durchschnittliche Wiederfindungsrate eines 6-Inch-Trichters (1 Inch =

2,54 cm) mit einer 50 g-Erdprobe 33,6 %, mit einer 100 g-Erdprobe 17 %. Die Verwendung eines

9-Inch-Trichters mit einer 100 g-Erdprobe erbrachte eine durchschnittliche Wiederfindungsrate von

43 %. Die Inkubationszeit betrug bei allen Untersuchungen 48 Stunden. In weiteren Experimenten

erzielte er bei der Verwendung eines Drahtnetzes, auf dem die Probe platziert wurde, eine

Wiederfindungsrate von 36,7 %, ohne Drahtnetz 58,3 %. Generell zieht er das Fazit, dass mit dieser

Methode nur ein niedriger Prozentsatz der Larven entdeckt wird und dieser in individuellen

Experimenten stark schwankt. Dinaburg (1942) untersuchte die Effizienz der Baermann-Apparatur,

ebenfalls am Beispiel von H. contortus. Er bestimmte den Prozentsatz wiedergefundener

ausgewanderter Larven und schuf unterschiedliche Voraussetzungen, indem er Larven aus einer

Kultur entweder direkt auf ein Tuch über dem Sieb im Baermann-Trichter pipettierte oder auf dem

Tuch zuvor eine Schafkot- bzw. Lehmbodenprobe (100 g) platzierte, die dann mit den Larven

künstlich infiziert wurde. Aus derselben Kultur wurden zwei Fläschchen mit Kontrollproben befüllt.

Die Versuche wurden alle bei 40° C Wassertemperatur mit 7 5/8-Inch Glastrichtern unter gleichen

Rahmenbedingungen und mit gleichen sonstigen Materialien durchgeführt. Die Inkubationszeit

betrug 48 Stunden. In 7 Experimenten mit 150 bis 420 Larven betrug der durchschnittlich

wiedergefundene Prozentsatz nur durch das Tuch ausgewanderter Larven 24 %, aus der

Lehmbodenprobe 11 % und aus Schafkot 5 %. Die Ergebnisse schwankten bei den nur auf das Tuch

pipettierten Larven zwischen 3–45 %, bei der Bodenprobe zwischen 0–31 % und bei der Kotprobe

zwischen 0–23 %. In den Experimenten, bei denen mit 600 bis 95.400 Larven beimpft wurde,

betrug die durchschnittliche Wiederfindungsrate aus dem Tuch 69 %, aus Erde 34 % und aus

Schafkot 11 %. Todd et al. (1970) evaluierte die Methode nach Baermann mit infektiösen Larven

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LITERATURÜBERSICHT

von H. contortus. Er untersuchte den Einfluß der Inkubationszeit, des Filtertypes, der Temperatur,

der Lösung, der Beleuchtung, der Trichtergröße, der Menge und Länge von Grasproben, des

Gewichtes und der Beschaffenheit von Erdproben auf die Wiederfindungsrate der Larven. Seine

Untersuchungen ergaben, dass bei der Verwendung von Mullgaze ein höherer Prozentsatz Larven

auswanderte als bei der Verwendung von Zellstoff. Ebenfalls mehr Larven wanderten bei einer

Wassertemperatur von 4, 10, 20 und 25° C aus als bei 30–50° C. Leitungswasser, physiologische

Kochsalzlösung, Ringerlösung und 0,2 %ige Salzsäure erwiesen sich als gleich gute Medien,

während ein nichtionisches und zwei anionische Detergentien als unzureichend eingestuft wurden

und in einigen Konzentrationen toxisch für die Larven waren. Zwischen den Lichtverhältnissen

(hell und dunkel) ergaben sich keine signifikanten Unterschiede in der Wiederfindungsrate.

Versuche, in denen verschiedene Trichtergrößen verwendet wurden, zeigten, dass mit

zunehmendem Trichterdurchmesser die Zahl der gefundenen Larven abnahm. Ebenso sank die

wiedergefundene Larvenzahl mit steigendem Gewicht einer Grasprobe. Walters und Andersen

(1973) stellten eine Modifikation der Baermann-Methode mit Einwegmaterialien vor. In ihrem

Artikel weisen sie auf die Komplikationen in der Diagnose von D. viviparus hin, wenn Larven

anderer Arten ebenfalls präsent sind. Um diese Schwierigkeiten zu minimieren, empfehlen sie den

zu untersuchenden Kot rektal zu entnehmen und frisch zu untersuchen (die Kontamination mit

Larven wie denen von Strongyloides papillosus, welche innerhalb von 12 h schlüpfen, soll

vermieden werden). Sollte eine sofortige Untersuchung nicht möglich sein, muss die Probe gekühlt

werden, welches die Zahl der Lungenwurmlarven zwar reduzieren kann, aber das Schlüpfen bzw.

die Embryonierung vorhandener Eier anderer Parasiten verzögert. Andersen und Walters (1973)

untersuchten die Effizienz der Baermann-Methode in der Wiederfindung von D. viviparus Larven

aus Rinderkot. Sie evaluierten die Methode bei 10 unterschiedlichen Temperaturen (5, 10, 15, 20,

25, 30, 35, 40, 45 und 50° C) und untersuchten die Proben am 1. Tag in vierstündigen Abständen,

danach für drei weitere Tage einmal täglich. Die maximale Wiederfindungsrate erreichten sie bei

25° C. Bei dieser Temperatur waren nach 8 h 42 % der insgesamt in 24 h ausgewanderten Larven

wiederzufinden, nach 12 h 79 % und nach 20 h 99 %. Nach einem Zeitraum von 24 h konnten keine

lebenden Larven mehr gefunden werden, wenige tote gefundene Larven fanden keinen Eingang in

die Bewertung. In zusätzlichen Experimenten fanden die Autoren im Dunkeln 91 % der unter

gleichen Bedingungen bei künstlichem Licht gefundenen Larven. Im Vergleich zu einer Lage

Zellstoff konnten bei Verwendung von einer Lage Mullgaze 82 % der mit Zellstoff ermittelten

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LITERATURÜBERSICHT

Larven gefunden werden. Der Gebrauch von Einwegsektgläsern im Vergleich zu 3-Inch-

Glastrichtern verschlechterte die Ergebnisse ebenfalls, mit den Sektgläsern wurden 87 % der per

Glastrichter ermittelten Larven gefunden. Cremers (1981) untersuchte die Auswirkung der

Lagerung auf die Auswanderung der Larven von D. viviparus. Er stellte fest, dass bereits nach

einem Tag Lagerung der Kotprobe in einem Plastikbeutel bei Raumtemperatur die Anzahl

ausgewanderter Larven deutlich abnahm. Eine große Anzahl Larven ließ sich dagegen an den

Wänden des Plastikbeutels finden. Wurde die Kotprobe bei 4–6° C gelagert, so fanden sich mehr

Larven im Kot, welches der Autor auf die geringere Motilität der Larven bei niedrigeren

Temperaturen zurückführt, während die Larven bei Raumtemperatur in das an den Wänden des

Plastikbeutels kondensierte Wasser auswandern. Er empfahl deshalb, Kotproben immer sofort zu

untersuchen. Falls dies nicht möglich ist, sollte die Kotprobe bis zu ihrer Untersuchung in einem

Kühlschrank gelagert werden. Ist eine Lagerung bei Raumtemperatur unumgänglich (z.B. wenn die

Proben auf dem Postweg versendet werden), so sollte man das Behältnis, in dem die Kotprobe

eingeschickt wird, ebenso wie die Kotprobe auf Larven untersuchen. Wird die Kotprobe für eine

längere Zeit gelagert, so verfügen die Larven für das Auswanderverfahren nach Baermann nicht

mehr an ausreichend Motilität. Fox (1981) verbesserte die Anzahl an Larven, die mit der Methode

nach Baermann gefunden werden konnten, indem er die Kotproben bei 8° C für 1–2 Wochen

lagerte. Er beobachtete, dass sich im frisch gesammelten Kot nur Larven I befanden, während nach

6–7 Tagen Lagerung bei 8° C ein Teil der Larven gehäutet hatte. Eine weitere Woche später hatten

sich die meisten Larven gehäutet. Der Autor hält es für möglich, dass die gehäuteten Larven II von

D. viviparus über eine größere Motilität verfügen als die Larve I und aufgrund dessen eine größere

Anzahl Larven aus dem Trichter auswandert. Dies bedeutet eine gesteigerte Sensitivität des

Auswanderverfahrens nach Baermann nach einer Lagerung der Kotproben bei 8° C für 10 Tage.

Samuel und Gray (1982) evaluierten die Baermann-Methode mit Larven I von Parelaphostrongylus

odocoilei (vom Maultierhirsch, Odocoileus hemionus hemionus) und Protostrongylus spp. (vom

amerikanischen Mufflon, Ovis canadensis) hinsichtlich des Effektes der Kotbeschaffenheit und -

menge, der Zeit, der Trichtergröße und Wassermenge auf die Widerfindungsrate von Larven. Die

höchste Wiederfindungsrate von P. odocoilei resultierte aus 10 g frischem Kot mit 100 ml Wasser

in einem Glastrichter mit 10–15 cm Durchmesser nach 24 h. Die höchste Wiederfindungsrate von

Protostrongylus spp. Larven erhielten die Autoren mit 10 g leicht zerdrückten, trockenen

Kotbohnen mit 280 oder 490 ml Wasser in einem Glastrichter mit 15 cm Durchmesser nach 24 h.

- 21 -

LITERATURÜBERSICHT

Rode und Jorgensen (1989) untersuchten an rektal gewonnenen Kotproben von Kälbern (infiziert

mit D. viviparus), Lämmern (infiziert mit D. filaria) und Pferden oder Eseln (infiziert mit D.

arnfieldi) den Einfluss der Temperatur vor der Untersuchung der Proben und die Zeit, die die

unterschiedlichen Larven zur Auswanderung und Sedimentation aus einer 10 g-Probe benötigen.

Die Wiederfindungsrate für D. viviparus betrug bei 4° C oder 16° C nach 24 h ungefähr 80 %, bei

einer Temperatur von 20° C nur noch 40 %. Nach 48 Stunden bei 20° C konnten nur noch 20 %

wiedergefunden werden. Hier bestätigen die Autoren die Ergebnisse von Cremers (1981), nach

denen der diagnostische Wert einer im Baermann-Trichter untersuchten Probe rapide sinkt, wenn

die Probe länger als wenige Stunden bei Raumtemperatur gelagert wird. Larven von D. viviparus

verblieben nach Ansetzen einer Probe im Baermann-Trichter für ca. 10 h in den Fäzes. Jorgensen

(1980) geht davon aus, dass es sich bei dem Entwicklungsstadium in frischen Fäzes bereits um die

Larve II handelt, welche sich noch von der alten Scheide befreien muss, bzw. sich gerade häutet

oder um die Larve I in einem Stadium der Inaktivität, welches der Häutung vorausgeht. Deshalb

zeige sie bei der Untersuchung im Baermann-Trichter eine geringere Motilität als die Larven von D.

filaria und D. arnfieldi und wandere in Folge weniger schnell aus. Die Wiederfindungsraten für

Larven von D. filaria sanken innerhalb der ersten 12 h bei 4° C, 16° C und 20° C so ausgesprochen

deutlich, dass eine Lagerung, auch im Kühlschrank, nicht empfohlen werden kann, da sie zum

Verlust eines Großteils der Larven führt. Die Autoren postulieren deshalb, dass ein diagnostischer

Wert nur besteht, wenn die Probe sofort nach der Entnahme untersucht wird. Im Baermann-Trichter

angesetzt verlassen die Larven die Kotprobe innerhalb der ersten paar Stunden. In der

Wiederfindung von D. arnfieldi zeigten sich nach 48 h bei 4° C keine signifikanten Verluste, jedoch

bei 16° C und 20° C. Eine Untersuchung dieser Kotproben kann deshalb 1–2 Tage aufgeschoben

werden, vorausgesetzt, die Lagerung erfolgt in einem Kühlschrank. Diese Larven liegen in der

Auswanderungszeit zwischen den beiden erstgenannten. Diese Beobachtung stimmt mit der

Feststellung von Andersen und Fogh (1981) überein, dass die Larven von D. arnfieldi zum Großteil

im Dickdarm des Wirtes schlüpfen oder kurz darauf, so das es sich bei der Untersuchung im

Baermann-Trichter um frisch geschlüpfte erste Larven handelt. Diese wandern schnell aus,

allerdings langsamer als die Larven von D. filaria. Es ist anzunehmen, dass die Sedimentationszeit

der Larven durch einen kombinierten Effekt aus deren spezifischen Gewicht, Größe und Motilität

beeinflusst wird. In diesem Zusammenhang ist zu erklären, warum die relativ großen Larven von D.

filaria mit großer Motilität im Vergleich zu den kleineren Larven von D.viviparus und D. arnfieldi

- 22 -

LITERATURÜBERSICHT

schneller sedimentieren. Die Larven von D. arnfieldi sind von ähnlicher Größe wie die von D.

viviparus, verfügen aber über wesentlich lebhaftere Motilität, was ihre vergleichsweise schnelle

Sedimentation erklären könnte. Eysker (1997) infizierte 20 Kälber (3–4 Monate alt) experimentell

mit 20 D. viviparus Larven und stellte eine hohe Sensitivität (zwischen 5 und 7 Wochen nach der

Erstinfektion kann die Präsenz von nur einem weiblichen Wurm detektiert werden) der Baermann-

Methode für patente Infektionen (3,5–4 Wochen nach der Infektion und später) in Jungrindern bei

der Verwendung einer 30 g-Kotprobe fest. Er konnte bei max. 19 weiblichen Würmern/Kalb bis zu

300 Larven/30 g Kot finden. Die hohe Sensitivität erhält sich über ca. 3 Monate nach der

Erstinfektion und ist nur gültig für Erstinfektionen in jungen Tieren. Bei älteren Tieren liegt die

Sensitivität weitaus niedriger (1 Larve/30 g Kot, Eysker et al. 1994). Der Autor bestätigte die

Ergebnisse von Cremers (1981), Fox (1981) und Rode und Jorgensen (1989). Er sprach sich bei der

Untersuchung von Kotproben auf Lungenwürmer für den Gebrauch steil abfallender

Glasmaterialien, die frühestmögliche Untersuchung der Proben, falls dies nicht möglich ist für die

Kühlung, die Inkubation im Baermann-Trichter über Nacht und eine genügend große Probenmenge

aus. Hernández-Chavarria und Avendano (2001) verglichen die Standardmethode nach Baermann

mit der Agarplattenmethode, dem direkten Ausstrich und einer Modifikation der Baermann-

Methode anhand von Strongyloides stercoralis. In ihren Untersuchungen waren die Baermann-

Methode bzw. ihre Modifikation die sensitivsten Methoden.

- 23 -

LITERATURÜBERSICHT

2.1.5 Interpretation der durch Kotuntersuchungstechniken gewonnenen

Ergebnisse

Bei der Interpretation der durch Kotuntersuchungstechniken gewonnenen Ergebnisse sind einige

Faktoren, welche das Ergebnis beeinflussen, zu berücksichtigen. Diese ergeben sich zum einen aus

Schwankungen in der Eiausscheidung durch den Wirt und zum anderen aus Varianzen in der

Methode auch unter standardisierten Bedingungen.

Die Eiausscheidung durch den Wirt schwankt innerhalb eines Tages und von Tag zu Tag, selbst

unter kontrollierten Bedingungen (Roberts et al., 1951; Düwel und Reisenleiter, 1990), sowie

jahreszeitlich (Michel, 1968). Sie hängt zum einen von der Produktivität und Regelmäßigkeit des

Eiabsatzes durch die weiblichen Helminthen ab, welche maßgeblich durch Faktoren wie Alter und

Anzahl der Helminthen, Immunitätslage und Allgemeinzustand (Roberts et al.,1951; Michel, 1968;

Egwang, 1980), Genetik (Gasbarre et al., 2001) und Alter des Wirtes (Herlich, 1960; Waruiru et al.,

2000) sowie durch Umweltfaktoren (Dimander et al., 2003) und die Gabe von Anthelminthika

(Gibson, 1965) beeinflusst wird. So scheiden z.B. weibliche Würmer in Kälbern mehr Eier aus als

in adulten Tieren, weil erstere noch keine Immunität ausgebildet haben (Herlich, 1960) und in

Schafen und Schweinen einige Wochen prae und post partum, da der hohe Energiebedarf den

Körper unter Stress setzt, infolge dessen die Abwehrkräfte nachlassen (Field et al. 1960; Connan,

1967; Schillhorn van Veen et al., 1978). Dieses wird auch bei Rindern beobachtet, welche in der

späten Trächtigkeit und in der Laktation in ihrer Immunantwort gegen den Parasiten suprimiert sind

(Gutierres et al., 1979). Ein immunes Tier kann Träger einer großen Helminthenpopulation sein und

trotzdem eine geringe Anzahl an Eiern pro Gramm Kot ausscheiden und einige Anthelminthika

können die Ausscheidung von Eiern durch die Helminthen hemmen (Gibson, 1965). Zum anderen

beeinflussen auch Faktoren wie die Menge und Qualität des Futters und die Kotkonsistenz (Peters

und Leiper, 1940; Roberts et al., 1951; Kelley, 1955; Gibson, 1965) die Eiausscheidung durch den

Wirt. Nilsson et al. (1995) konnten für A. perfoliata zeigen, dass die Eier nicht in allen

Kotportionen gleichmäßig verteilt ausgeschieden werden. Der Möglichkeit aus der Anzahl

ausgeschiedener Wurmeier Rückschlüsse auf Befallsintensität oder Behandlungsnotwendigkeit zu

ziehen, sollte daher mit Vorsicht begegnet werden. Proudman und Edwards (1992) zeigten, das die

ausgeschiedene Zahl von Eiern von A. perfoliata nicht mit der vorhandenen Wurmbürde korreliert.

- 24 -

LITERATURÜBERSICHT

Nazzaro (1979) konnte für T. vulpis zeigen, dass die Eizahl pro Gramm Kot zwar mit zunehmender

Wurmbürde steigt, aber nicht proportional. Michel (1968) zeigte anhand von mit Ostertagia

ostertagi infizierten Kälbern, dass die ausgeschiedene Eizahl pro Gramm Kot bei allen Tieren

gleich war, unabhängig vom Grad der Wurmbürde. Herd (1992) mass der gemessenen Eizahl pro

Gramm Kot bei Pferden geringe Bedeutung zu, da hier ebenfalls die Eizahl pro Gramm Kot nicht

mit der Wurmbürde des Wirtes korrelieren. Jungersen et al. (1997) zeigten für A. suum, dass falsch

negative Ergebnisse dadurch entstehen können, dass bei Infektionen mit nur einem Wurmgeschlecht

oder mit immaturen Würmern keine Eier ausgeschieden werden. Das gleiche gilt für alle anderen

Parasiten. Die Ausscheidung nur geringer Eizahlen wird durch die koproskopischen Methoden nicht

sicher erfasst und kann ebenfalls zu falsch negativen Ergebnissen führen. Falsch positive

Ergebnisse bei der koproskopischen Untersuchung auf A. suum können aus der Aufnahme und

intestinalen Passage unembryonierter Eier, welche von infizierten Schweinen ausgeschieden

wurden, durch nicht infizierte Tiere im gleichen Stall resultieren. Die Anzahl falsch positiver

Eizählungen beruht dann auf Kontakten mit A. suum-positiven Fäzes infizierter Tiere (Eriksen et al.,

1992) und somit auf Haltungsform und -hygiene (Boes et al., 1997).

Die Ausscheidung der Larven von D. viviparus unterliegt ähnlichen Faktoren. Die meisten Larven

werden im Frühjahr ausgeschieden, erstinfizierte Jungrinder scheiden größere Larvenmengen pro

Gramm Kot aus als ältere Tiere (Eysker et al., 1994). Die Menge der ausgeschiedenen Larven hängt

auch von der Schwere der Infektion, der Regelmäßigkeit, mit der ein infiziertes Tier hustet und der

Anzahl der dabei abgeschluckten Larven ab. So werden, unabhängig vom Zeitpunkt der

Probennahme, in den meisten Fällen bei weniger als 30 % der Tiere einer infizierten Herde

Lungenwurmlarven von D. viviparus gefunden (Walters und Andersen, 1973). Duffy et al (1999)

beschrieben die Entstehung falsch positiver Ergebnisse in der Diagnose der Protostrongylose bei

Cerviden mit der Methode nach Baermann. Sie konnten zeigen, dass die Larven I von

Parelaphostrongylus tenuis, welche durch Regenwasser gut aus dem Kot infizierter Tiere

ausgewaschen werden, die Magen-Darm-Passage nach oraler Aufnahme durch ein nicht infiziertes

Tier unbeschadet lebend überstehen und anschließend in dessen Kot nachgewiesen werden können.

Schwankungen in den Ergebnissen von Eizählungen und Unterschiede in der qualitativen Diagnose

von Helminthosen können neben Varianzen aufgrund falscher Probennahme oder Laborfehler

- 25 -

LITERATURÜBERSICHT

(Ward, 1997) auch in der Methode begründet sein, zum einen durch die Varianz innerhalb einer

Methode, zum anderen durch Modifikationen in der Durchführung.

Die Varianzbreiten innerhalb der oben beschriebenen Methoden sind bisher nur bei der McMaster-

Methode untersucht worden. Peters und Leiper (1940) untersuchten die Schwankungsbreite in

Eizählungen mittels der Verdünnungsmethode nach Stoll. Sie werteten die Ergebnisse

aufeinanderfolgender Zählungen derselben Kotsuspension aus und stellten fest, dass der

Variationskoeffizient (std/meanX100) zwischen 10 % bei hohen und 80 % bei niedrigen Eizahlen in

der Suspension variiert. Andererseits nimmt die Standardabweichung mit zunehmender

Durchschnittseizahl zu. Diese starken Schwankungen stellen Resultate der Untersuchungen zur

Effektivität von Anthelminthika und Resistenzstudien in Frage, da nicht differenziert werden kann,

ob die Reduktion der gefundenen Eier im Kot durch eine tatsächliche Eizahlreduktion verursacht

oder nur Folge der großen Schwankungsbreite innerhalb der Methode ist. Sie liegen allen

Experimenten, die sich der Verdünnungstechniken bedienen, zu Grunde. Peters und Leiper (1940)

untersuchten weitere Faktoren, welche die Ergebnisse einer Studie beeinflussen könnten, nämlich

die Schwankungen der Ergebnisse in Kotportionen von Tag zu Tag und in unterschiedlichen Proben

derselben Kotportion. Ebenfalls untersucht wurden Unterschiede in den Ergebnissen gleicher

Proben, welche zum einen mit der Stoll- und zum anderen mit der McMaster-Methode untersucht

wurden. Für letztere Untersuchung wurde für den Vergleich ein Standardergebnis mittels einer

Methode zur Eikonzentration (Flotation mit Zuckerlösung) formuliert. Es wurde gezeigt, dass die

Schwankungen von einem Tag auf den anderen und von einer Probe zur nächsten der gleichen

Kotportion signifikant größer waren als die Schwankungen der Eizahl in unterschiedlichen

Zählungen der gleichen Suspension. Die Schwankung der Ergebnisse aus Kotproben welche zu

unterschiedlichen Tageszeitpunkten gewonnen wurden, unterschieden sich an den meisten Tagen

signifikant, während die Unterschiede von Probe zu Probe der gleichen Portion bis auf eine

Ausnahme nicht signifikant waren. Mit der McMaster Methode ließen sich signifikant höhere

Eizahlen nachweisen als mit der Methode nach Stoll. Im Vergleich mit den durch die

Konzentrationsmethode ermittelten Ergebnissen konnte jedoch keine Aussage getroffen werden,

welche der beiden Methoden genauer arbeitet. Peters und Leiper (1940) konnten zeigen, dass die

Ergebnisse der Methode nach Stoll sowie die Ergebnisse, welche mit der McMaster-Methode erzielt

wurden, der Poissonverteilung entsprechen und somit als zuverlässig zu beurteilen sind. Sie weisen

jedoch darauf hin, dass in Experimenten, in welchen Verdünnungstechniken verwendet werden,

- 26 -

LITERATURÜBERSICHT

unbedingt die Probleme der Variation innerhalb der Methode berücksichtigt werden müssen, so

dass etwaig auftretende signifikante Unterschiede zwischen Proben eingeschätzt werden können.

Deshmukh et al. (1980) verglich ebenfalls die Stoll- mit der McMaster-Methode. Beide Methoden

ergaben ähnliche Ergebnisse, welche sich nicht signifikant unterschieden. Er kam jedoch zu der

Schlussfolgerung, dass die Methode nach Stoll sensitiver ist als die McMaster-Methode, da durch

sie in allen Proben Eier nachgewiesen wurden, während mit der McMaster-Methode 4 von 25

Fällen nicht erkannt wurden.

Rossanigo und Gruner (1991) verglichen die Effizienz der McMaster-Methode modifiziert nach

Raynaud (1970) mit einer Extraktionsmethode für Helmintheneier (EE), welche die mehrfache

Zentrifugation mit MgSO4--Lösung beinhaltet. Verwendet wurden acht verschiedene Nematoden

von Schafen, Rindern und Rotwild. Nur 16,5 % der Eier wurden mit der McMaster-Methode

unabhängig von der Helminthenart und der Eianzahl gezählt. Der durchschnittliche

Variationskoeffizienz lag bei 24,4 %, bei der EE-Methode nur bei 8,9 % . Wie auch Peters und

Leiper (1940) und Mes (2003) stellten die Autoren fest, dass die Variabilität bei geringen Eizahlen

besonders groß ist. Uhlinger (1993) untersuchte die Spannweite der mit McMaster ermittelten

Ergebnisse mittels zehn Untersuchungen der gleichen Kotprobe. Sie mischte in der McMaster-

Methode 1g Kot mit 30 ml gesättigter NaCl-Lösung, schüttete die Lösung durch ein Sieb und füllte

die Zählkammer mit 0,15 ml der erhaltenen Lösung. Das Ergebnis berechnete sie, indem sie die

gezählten Eier mit 100 multiplizierte. Sie stellte eine schlechte Reproduzierbarkeit der Ergebnisse

fest. Ihre statistischen Erhebungen ergaben eine geringe Zuverlässigkeit der Methode, welche sich

durch Unterschiede zwischen den Ergebnissen der gleichen Probe von bis zu 50 % darstellte. Dem

Problem der technischen Variabilität und der erforderlichen Probenzahl zur Detektion signifikanter

Unterschiede zwischen zwei Gruppen widmet sich Mes (2003). Er kritisiert ebenso wie Peters und

Leiper (1940), dass bei den meisten parasitologischen Studien die Variabilität der verwendeten

Methode als Fehlerquelle nicht berücksichtigt wird. Durch die technische Variabilität einer

Methode wird klar die Menge der zu untersuchenden Proben (z.B. um Differenzen zwischen zwei

Gruppen zu detektieren) definiert. Mes (2003) verglich die McMaster-Methode mit einer leichten

Modifizierung der von ihm entwickelten (Mes et al., 2001) Salz-Zucker-Flotation (SSF-Methode)

und dokumentierte die Auswirkung technischer Variabilität. Er zeigte, dass die Varianz der

ermittelten Eizahl bei der McMaster-Methode signifikant größer war als bei der verwendeten SSF-

Methode. Übereinstimmend mit Peters und Leiper (1940) war die Variation in Fäzes mit wenigen

- 27 -

LITERATURÜBERSICHT

Eiern am größten. Er empfiehlt deshalb die Verwendung der SSF-Methode. Morrison (2004)

wertete die Daten von Mes (2003) neu aus und kam zu dem Schluss, dass die statistische

Auswertung der Daten nicht korrekt durchgeführt worden war und sich in der Varianz zwischen der

McMaster– und der SSF–Methode keine nennenswerte Unterschiede ergeben.

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MATERIAL UND METHODEN

3 MATERIAL UND METHODEN

3.1 Verwendete Parasiten und Eigewinnung

3.1.1 Übersicht über die verwendeten Parasiten

Tabelle 1: Übersicht über die Zugehörigkeit der untersuchten Parasiten zu Klassen, Ordnungen und

Familien (modifizierter Auszug aus Eckert. Friedhoff, Zahner, Deplazes 2005)

KLASSE CESTODA KLASSE SECERNENTA KLASSE ADENOPHOREA

Ordnung Cyclophyllida Ordnung Strongylida Ordnung Enoplida

Familie Anoplocephalidae Familie Strongylidae Familie Trichuridae

- M. expansa Unterfamilie Cyathostominae Unterfamilie Trichurinae

- A. perfoliata - T. vulpis

Ordnung Echinostomida Familie Ancylostomidae

Familie Fasciolidae - A. caninum

- F. hepatica - U. stenocephala

Familie Trichostrongylidae

- C. oncophora

Familie Dictyocaulidae

- D. viviparus

Ordnung Ascaridida

Familie Ascarididae

Unterfamilie Ascaridinae

- A. suum

- T. leonina

Unterfamilie Toxocarinae

- T. cati

- T. canis

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3.1.2 Eigewinnung von Ancylostoma caninum, Uncinaria stenocephala, Cooperia

oncophora und den Cyathostominae

Die Eier von A. caninum und U. stenocephala wurden aus gesammeltem Kot, welcher nicht älter als

24 h war, gewonnen. Die Eier von den Cyathostominae und C. oncophora wurden aus vom Pferd

bzw. Rind rektal frisch entnommenem Kot gewonnen. Die Tiere wurden experimentell infiziert und

waren im Tierhaus des Institutes für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover so

untergebracht, dass sie sich nicht sekundär mit anderen Parasiten infizieren konnten. Der frische

Kot wurde in einer Plastikschüssel mit gesättigter NaCl-Lösung (spez. Gew. 1,24) aufgeschwemmt

und gut durchgerührt, so dass er eine breiig-wäßrige Konsistenz annahm. Anschließend wurde er

mit NaCl-Lösung portionsweise durch ein Haarsieb in einen 10-Liter-Eimer gespült. Der Eimer

wurde bis zum Rand mit NaCl-Lösung aufgefüllt und 30 min stehen gelassen, so dass die Eier

flotieren konnten. Die aufgestiegenen Eier wurden mit einer großen Mehrfachöse in einen 1-Liter-

Plastikmaßbecher abgeöst, welcher mit Leitungswasser gefüllt war. Trübte sich das Wasser des

Maßbechers bevor die komplette Oberfläche des Eimers abgeöst war, wurde ein weiterer

Maßbecher verwendet. Nach 30 min Sedimentationszeit wurde der Überstand aus dem Maßbecher

dekantiert, falls mehrere Maßbecher verwendet wurden, wurde der Inhalt jetzt in einen

zusammengegossen, mit Leitungswasser aufgefüllt und erneut 30 min stehen gelassen. Der

Überstand wurde dekantiert, das Sediment in ein Becherglas verbracht und nach dem Auffüllen mit

Leitungswasser nochmals 30 min sedimentieren gelassen. Der Überstand wurde anschließend ein

letztes Mal dekantiert. Die Ermittlung der Eizahl in 10 µl erfolgte, indem auf zwei Objektträger je

6x je 10 µl getropft und in jeder Portion die vorhandenen Eier mikroskopisch ausgezählt werden.

Aus der Summe aller Eier beider Objektträger wurde der Mittelwert gebildet und so die

durchschnittliche Anzahl Eier/10 µl Lösung bestimmt.

3.1.3 Eigewinnung von Toxocara canis, Toxocara cati und Toxascaris leonina

Der eihaltige Kot mit T.canis, T.cati oder T. leonina stammte von experimentell infizierten Hunden

bzw. Katzen des Institutes für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Der

gesammelte Kot war nicht älter als 24 h. Er wurde ca. 1 h mit lauwarmem Wasser eingeweicht und

- 30 -


anschließend mit Wasser durch ein Sieb von 200 µm Maschenweite in einen 5-Liter-Eimer gespült,

um grobe Kotbestandteile zurück zu halten. Der Inhalt dieses Eimers wurde mit einem Wasserstrahl

durch ein Sieb mit 50 µm Maschenweite gespritzt, welches seinerseits die Eier zurückhält. Durch

gründliches Durchspülen mit Leitungswasser wurden die Eier von kleineren Kotbestandteilen

gereinigt. Die auf dem Sieb verbleibenden Eier wurden vorsichtig in ein Becherglas gespült,

welches mit Leitungswasser aufgefüllt wurde. Anschließend sedimentierten die Eier 30 min, danach

wurde der Überstand abgegossen und das Sediment ausgezählt (s.o.).

3.1.4 Eigewinnung von Trichuris vulpis, Moniezia expansa und Anoplocephala

perfoliata

Aus einem im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule frisch entnommenem

Darmstück eines Hundes bzw. Schafes oder Pferdes mit adulten Exemplaren von T. vulpis,

M. expansa oder A. perfoliata wurden die Würmer herausgespült und in einen Mörser verbracht.

Bei den Cestoden wurden vorher die hinteren, reifen Proglottiden vorsichtig abgetrennt und nur

diese weiter verwendet. Die Würmer bzw. Proglottiden wurden im Mörser mit etwas Wasser fein

zerrieben. Die entstandene Suspension wurde dann durch ein feines Sieb in einen Glasstandzylinder

gegossen, der bis zum oberen Rand mit Wasser aufgefüllt wurde. Die Eier wurden über Nacht im

Standzylinder sedimentieren gelassen und der Überstand am nächsten Tag mit einer

Wasserstrahlpumpe abgesogen. In der verbleibenden Flüssigkeit wurde die Eizahl wie oben

beschrieben bestimmt, bei zu hoher Eidichte wurde mit Leitungswasser verdünnt. Unreife Eier

wurden in der Zählung nicht berücksichtigt.

3.1.5 Eigewinnung von Ascaris suum

Die Eier von A. suum wurden aus adulten Weibchen entnommen, welche aus Darmteilen frisch

geschlachteter Schweine stammten. Der Wurm wurde im Kopfbereich mit einer Pinzette

festgehalten und der hintere Abschnitt mit einem Scherenschlag abgetrennt. Sodann wurde mit einer

zweiten Pinzette der Inhalt von Darm und Uterus in eine Petrischale ausgestrichen, wo er mit etwas

- 31 -


Wasser gerührt und homogenisiert wurde. Das weitere Vorgehen entsprach dem bei T. vulpis

beschriebenen.

3.1.6 Eigewinnung von Fasciola hepatica

Die Gallenblasen von mit F. hepatica befallenen Lebern frisch geschlachteter Rinder wurden in ein

großes Becherglas entleert. Anschließend wurden je ca. 10 ml Gallenflüssigkeit in zum Ende hin

spitz zulaufende Plastikgefäße verbracht, mit Leitungswasser aufgefüllt und sedimentieren gelassen,

bis der Überstand nur noch leicht getrübt war (ca. 30 min). Der Überstand wurde dekantiert und das

Gefäß mit dem verbleibenden Sediment erneut mit Wasser aufgefüllt und zur Sedimentation stehen

gelassen. Dieser Vorgang wurde so lange wiederholt, bis der Überstand klar war, die Lösung

wässrig (vorher durch Galle etwas schleimig) und die Gallestoffe ausgewaschen (vorher durch

Eiweiß schaumig). Dann wurde das erhaltene Sediment aller Gefäße in einem Becherglas

zusammengeführt und ausgezählt (s.o.).

3.2 Herstellung der Kotproben

Kot wurde von der entsprechenden Tierart entweder aus dem Stall gesammelt (nicht älter als 24 h)

oder rektal entnommen. Die Tiere waren im Institut für Parasitologie untergebracht, es handelte sich

um für den zu untersuchenden Parasiten negative Tiere. Eine Kotprobe der zur Verwendung

bestimmten Portion wurde zusätzlich mittels der unten beschriebenen kombinierten Sedimentation-

Flotation auf parasitologische Stadien untersucht, um eine Kontamination mit den zu

untersuchenden oder davon schwer zu unterscheidenden Parasiten weitgehend auszuschließen. Mit

Hilfe einer Pipette wurde die benötigte Anzahl Eier enthaltende Eilösung (max. Volumen 16 ml) in

eine so bemessene Kotmenge einpipettiert, dass sie später in 15 Einzelproben (für die kombinierte

Sedimentation-Flotation und das Sedimentationsverfahren in 5 g-Portionen, für die McMaster-

Methode in 4 g-Portionen und für das Auswanderverfahren nach Baermann in 2 g-Portionen)

aufgeteilt werden konnte. Anschließend wurde die Eilösung gründlich mit dem Kot vermischt. Der

Kot wurde dann in 15 Einzelportionen abgewogen. Bei Herstellung der Proben mit D. viviparus

wurden zwei Titrationsreihen aus infiziertem Kot und larvenfreiem Kot (welcher am Tage vorher

- 32 -


mit dem Auswanderverfahren nach Baermann untersucht worden war) hergestellt, indem zu einer

definierten Menge positiven Kotes eine bestimmte Menge negativen Kotes zugerührt wurde. Der

verwendete positive Kot der ersten Titrationsreihe blieb vor Herstellung der Proben unbehandelt,

der für die zweite Titrationsreihe verwendete positive Kot wurde vor der Verarbeitung 3 min mit

einem Handmixer gerührt. Eine Versuchsreihe wurde mit dem unverdünnten positiven Kot als

Kontrolle und zur Errechnung der Larvenzahl pro Gramm Kot in der positiven Ausgangskotprobe

der Titrationsreihe angesetzt.

3.3 Durchführung der Methoden

3.3.1 Kombiniertes Sedimentations-Flotationsverfahren mit Zinksulfatlösung

Aus der hergestellten Kotmenge wurden 15 Proben à 5 g jeweils in ein Teesieb (positioniert auf

einem Becherglas) abgewogen und mittels eines scharfen Wasserstrahles durch das Teesieb in das

Becherglas (250 ml) gespritzt, bis dieses vollständig gefüllt war. Die im Sieb zurückbleibenden

groben Kotbestandteile wurden verworfen. Die Suspension wurde anschließend 30 min stehen

gelassen, damit vorhandene Eier sedimentieren konnten. Der Überstand wurde dann ohne Absetzen

dekantiert, 2–3 ml des Sediments wurden in ein Zentrifugenröhrchen (15 ml) verbracht. Das

Zentrifugenröhrchen wurde bis ca. 5 mm unter den oberen Rand mit Zinksulfat-Lösung (ZnSO4,

spezifisches Gewicht 1,3) gefüllt und anschließend 5 min bei 1.500 U/min zentrifugiert (Megafuge

1.0, Fa. Heraeus). Mit einer Drahtöse (rechtwinkelig gebogen, Durchmesser ca. 4 mm) wurde die

Flüssigkeitsoberfläche vollständig auf einen Objektträger überführt und ein Deckglas aufgelegt. Die

Probe wurde sofort unter dem Mikroskop bei mittlerer Vergrößerung (63fach oder 160fach)

durchgemustert und alle Eier erfasst.

Die verwendete Zinksulfatlösung wurde wie folgt hergestellt:

76 g ZnSO4 (ZnSO4-Heptahydrat, 5 kg, Fa. Merck) werden in 100 ml Wasser mit Hilfe eines

Magnetrührers so lange gerührt, bis eine klare Lösung entstanden ist (Dichte 1,3). Die Dichte wurde

anschließend mit einem entsprechenden Densitometer überprüft.

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Zur Bestimmung der Sensitivität der kombinierten Sedimentation-Flotation wurden

Konzentrationsstufen mit jeweils 1, 5, 10, 20, 40, 60 und 80 EpG untersucht. Von A. caninum

wurden insgesamt 155 Proben untersucht, in den Konzentrationsstufen 5 und 80 EpG je 15 Proben,

in allen anderen Konzentrationsstufen je 25 Proben. Von T. canis wurden insgesamt 125 Proben

untersucht, davon je 25 in den Konzentrationsstufen 10 und 20 EpG, in allen anderen

Konzentrationsstufen je 15 Proben. Bei allen anderen Parasiten wurden pro Parasit 105 Proben

untersucht, je 15 pro Konzentrationsstufe. Die Konzentrationsstufen zur Berechnung der

Effektivität beziehen sich bei dem kombinierten Sedimentations-Flotationsverfahren auf die

zugefügte Eizahl/Probe und umfassten die folgenden Werte: 5, 25, 50, 100, 200, 300 und 400

Eier/Probe. Es wurden die gleichen Probenzahlen pro Parasit untersucht wie zur Bestimmung der

Sensitivität der Methode.

3.3.2 Eizählung nach McMaster

Aus der hergestellten Kotmenge wurden 15 Proben á 4 g jeweils in einen Mörser abgewogen und

dann mit etwa 10 ml Natriumchloridlösung (NaCl, spezifisches Gewicht 1,24) mittels Pistill

verrührt. Die Kot-Kochsalz-Suspension wurde dann durch ein Teesieb und einen Trichter in einen

Standzylinder (100 ml) gegossen und mit Kochsalzlösung auf 60 ml aufgefüllt. Die entstandene

Lösung wurde in eine Schliffstopfenflasche (100 ml) überführt. Nach gründlicher Durchmischung

der Suspension durch Schwenken und Einblasen von Luft durch eine Transferpipette (3,5 ml, Fa.

Sarstedt), wurden mit Hilfe der Pipette jeweils drei Abteilungen von Zählkammern nach McMaster

in der Modifikation nach Wetzel beschickt. Dabei wurde für jede Abteilung die Pipette neu gefüllt,

nachdem vorher erneut Luft in die Schliffstopfenflasche geblasen wurde, um eine ausreichend

gleichmäßige Durchmischung der Probe zu gewährleisten. Nach der Befüllung wurden die

Kammern drei Minuten liegen gelassen, damit vorhandene Eier an die Oberfläche flotieren konnten.

Anschließend wurden die Kammern bei 63facher oder 25facher Vergrößerung unter dem

Mikroskop durchgemustert und alle gefundenen Eier pro Probe vermerkt. Beim Auszählen wurden

die Linienflächen der Zählfelder links und unten mitgezählt. Die Berechnung der Eizahl pro Gramm

Kot wurde wie folgt vorgenommen:

Eizahl pro Gramm Kot = Eizahl aus 3 Zählfeldern x 100 / 3

- 34 -


Die verwendete NaCl-Lösung wurde wie folgt hergestellt:

Siede-Speisesalz (25 kg, Fa. European Salt Company) wurde solange in einen mit 10 Liter Wasser

gefüllten Eimer auf einem Magnetrührer eingerührt, bis kein Salz mehr in Lösung ging und die

Lösung klar war. Die entstandene NaCl-Lösung besaß eine Dichte von 1,18-1,20. Die Dichte wurde

anschließend mit einem entsprechenden Densitometer überprüft.

Zur Bestimmung der Sensitivität der McMaster-Methode wurden je 15 Proben untersucht, die

jeweils 1, 30, 50, 80, 100, 500 und 1000 EpG umfassten. Pro Parasit wurden 105 Proben untersucht

(7 Konzentrationsstufen à 15 Proben) außer bei A. perfoliata, hier gelangten nur 90 Proben zur

Untersuchung (6 Konzentrationsstufen à 15 Proben). Bei der Untersuchung der Effektivität der

McMaster-Methode beziehen sich die Konzentrationsstufen auf die zugefügte Eizahl/g Kot, da mit

der McMaster-Methode und anderen quantitativen Verfahren die Eizahl/g Kot erfasst wird und sich

die Effektivität unterschiedlicher quantitativer Verfahren so leichter vergleichen lässt. Zur

Bestimmung der Effektivität der McMaster-Methode wurden die gleichen Probenzahlen pro Parasit

untersucht wie zur Bestimmung der Sensitivität der Methode. Pro Parasit und Konzentrationsstufe

waren dies 15 Proben.

3.3.3 Auswander- (Trichter-) verfahren nach Baermann

15 am unteren Ende mit einem Schlauchstück versehene Trichter wurden in ein Metallgitter über

ein Waschbecken gehängt. Die spitzwinkelig zulaufenden Schlauchenden wurden mit

Schlauchklemmen parallel zur Schnittkante so verschlossen, dass der Klemmgriff zum Boden

zeigte. Dann wurden die Trichter bis 1–2 cm unter den Rand mit Wasser gefüllt. Anschließend

wurden sie sorgfältig auf ihre Dichtheit überprüft und über Nacht stehen gelassen. Am nächsten Tag

wurde nochmals die Dichtheit kontrolliert und dann in den Trichter ein Sieb so eingesetzt, dass die

Unterseite in das Wasser eintauchte. Aus der hergestellten Kotprobe wurden 15 Proben à 2 g

abgewogen und in die Siebe verbracht. Die Proben wurden über Nacht bei Raumtemperatur stehen

gelassen. Am nächsten Tag wurden die Klemmen langsam gelöst und so einige Tropfen aus der

Schlauchspitze auf eine Zählkammer entnommen. Die Zählkammer wurde bei einer 25fachen

Vergrößerung unter dem Mikroskop durchgemustert. Die Anzahl gefundener Larven wurde

dokumentiert und in Beziehung zu der Verdünnungsreihe gesetzt. Die Sensitivität des

- 35 -


Auwanderverfahrens nach Baermann wurde ebenfalls nur für einen Parasiten bestimmt und zwar für

D. viviparus , da die Methode im Nachweis der Larven dieses Parasiten die bedeutsamste Rolle

spielt.

Hier wurde die Sensitivität mit einer Titrationsreihe positiven Kotes ermittelt, welcher durch die

Zugabe bestimmter Mengen negativen Kotes zu verschiedenen Verdünnungsstufen aufbereitet

wurde. Eine Versuchsreihe wurde mit dem unverdünnten Kot als Kontrolle und zur Errechnung der

Larven der Titrationsreihe angesetzt. Die Errechnung der ursprünglich in den Konzentrationsstufen

enthaltenen Larvenzahlen erfolgte, indem die im rein positiven Kot gefundene Larvenzahl im Maße

der erfolgten Verdünnung mit negativem Kot in Beziehung gesetzt wurde. Es wurden insgesamt

zwei Versuchsansätze durchgeführt. Im ersten wurde der zur Probenherstellung verwendete Kot

vorher nicht gerührt, im zweiten wurde er über drei Minuten möglichst homogen gemischt. Der

erste Versuchsansatz umfasst fünf Konzentrationsstufen und zwar 0,7, 3,4, 6,7, 10,1 und 13,4 LpG,

der zweite drei und zwar 1,6, 3,2 und 6,3 LpG. Pro Konzentrationsstufe wurden 15 Proben

untersucht. Die Ergebnisse wurden wie zuvor als negativ bewertet, wenn keine Larve zu finden war

und als positiv, wenn mindestens eine Larve gefunden wurde. Zur Ermittlung der Effektivität des

Auswanderverfahrens nach Baermann wurden die gleichen Versuchsansätze, Probenzahlen und

Konzentrationsstufen herangezogen wie zur Ermittlung der Sensitivität. Wie bei den oben

aufgeführten Ergebnissen anderer Methoden wurde dabei der durchschnittliche prozentuale Anteil

wiedergefundener Larven (statt bei anderen Verfahren Eier) von den in verschiedenen

Konzentrationsstufen zugefügten Eizahlen der Proben errechnet. Die Spannweiten der einzelnen

Konzentrationsstufen wurden ebenfalls in Standardabweichungen und Variationskoeffizienten

ausgedrückt.

3.3.4 Sedimentationsverfahren

Aus der hergestellten Kotprobe wurden 15 Proben à 5 g jeweils in ein Teesieb auf einem Becherglas

(250 ml) abgewogen. Anschließend wurde die Probe mittels eines scharfen Wasserstrahles durch

das Sieb in das Becherglas gespritzt, bis dieses vollständig gefüllt war. Der zurückbleibende Rest

im Sieb wurde verworfen. Die Lösung wurde 30 min stehen gelassen, anschließend wurde der

Überstand ohne Absetzen dekantiert und das Sediment in ein trichterförmig zulaufendes

- 36 -


Plastikgefäß (500 ml, Fa. Brand) verbracht, welches mit Wasser aufgefüllt wurde. Die Lösung

wurde drei Minuten stehen gelassen und erneut dekantiert. Diese Prozedur wurde so lange

wiederholt, bis der Überstand klar war. Das nach der letzten Dekantierung übrig gebliebene

Sediment wurde mit einem Tropfen Methylenblau-Lösung (1 %) versetzt und sodann in eine

Zählkammer überführt und unter dem Mikroskop bei 63facher Vergrößerung untersucht. Alle

gefundenen Eier wurden dokumentiert.

Die Sensitivität der Sedimentationsmethode wurde nur für F. hepatica bestimmt, da die Methode

primär zum Nachweis dieses Parasiten eingesetzt wird. Die Eikonzentrationen umfassten Eizahlen

von 1, 5, 10, 15, 20, 25 und 30 EpG. Pro Konzentrationsstufe wurden 15 Proben untersucht. Zur

Ermittlung der Effektivität der Sedimentationsmethode wurden die gleichen Probenzahlen und

Konzentrationsstufen herangezogen wie bei der Ermittlung der Sensitivität. Wie bei den oben

aufgeführten Ergebnissen anderer Methoden wurde dabei der durchschnittliche prozentuale Anteil

wiedergefundener Eier von den in verschiedenen Konzentrationsstufen zugefügten Eizahlen der

Proben errechnet. Die Spannweiten der einzelnen Konzentrationsstufen wurden ebenfalls in

Standardabweichungen und Variationskoeffizienten ausgedrückt.

3.4 Statistik

Zur Ermittlung der Sensitivität wurden künstlich mit einer bestimmten Anzahl Eier eines Parasiten

infizierte Kotproben untersucht. Dabei wurden sieben Konzentrationsstufen gebildet, die jeweils 15

bzw. 25 Proben umfassten. Die Ergebnisse wurden in negativ (kein Ei/Probe) und positiv

(mindestens ein 1 Ei/Probe) klassifiziert. Die Sensitivität wurde für die einzelnen Parasiten in

verschiedenen Konzentrationsstufen und für die Parasiten zusammengefasst nach ihren Ordnungen

bestimmt. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Parasiten wurden zur Erhöhung der

Testgüte aus den mittleren zusammengefassten Konzentrationsstufen (5, 10, 20, 40, 60 Eier/g Kot)

durch den χ2 – Test ermittelt. Bei der Darstellung der Ergebnisse wurde zwischen geringer,

mittlerer und hoher Signifikanz differenziert. Um die durchschnittliche Sensitivität der Methode

angeben zu können, wurden die für alle Parasiten bestimmten Sensitivitätswerte einer

Konzentrationsstufe gemittelt.

- 37 -


Die Sensitivität (P) einer Methode wurde folgendermassen errechnet:

P(+/+) = Anzahl positiv getesteter Proben / Gesamtanzahl untersuchter positiver Proben

Die Bestimmung der Effektivität (Wiederfindungsrate) erfolgte ebenfalls über die Untersuchung

künstlich mit Eiern eines Parasiten infizierter Kotproben in sieben verschiedenen

Konzentrationsstufen. Die Klassifizierung der Ergebnisse erfolgte hier jedoch nach dem

prozentualen Anteil wiedergefundener Eier aus der ursprünglich in der Kotprobe vorhandenen

Menge. Die Effektivität wurde für die einzelnen Parasiten in den verschiedenen

Konzentrationsstufen und für die Parasiten zusammengefasst nach ihren Ordnungen bestimmt. Die

durchschnittliche Effektivität der Methode wurde in Form der Durchschnittswerte aller Parasiten

pro Konzentrationsstufe ermittelt.

Die Effektivität (E) einer Methode wurde wie folgt berechnet:

E = Anzahl wiedergefundener Eier aus einer Probe x 100 / Anzahl in die Probe eingerührter Eier

Die Varianz (V) wurde aus der Summe der Abweichungsquadrate, dividiert durch den um eins

verminderten Umfang der Probe bestimmt. Die Standardabweichung (SD) wurde durch das Ziehen

der Wurzel aus der Varianz berechnet, der Variationskoeffizient (Vk) errechnet sich aus

100 x SD / M.

- 38 -

ERGEBNISSE

4 ERGEBNISSE

4.1 Kombinierte Sedimentation - Flotation

4.1.1 Sensitivität

4.1.1.1 Einzelne Parasiten

In den Abbildungen 1-4 ist für jeden Parasiten der prozentuale Anteil positiver Proben pro

Konzentrationsstufe dargestellt. In einer Konzentration von einem EpG waren bei den

Cyathostominae bereits 6,6 % der Proben positiv, bei allen anderen Parasiten waren bei einem EpG

alle Proben negativ. Ab 5 EpG ließen sich außer bei A. suum bei allen Parasiten in wenigen Proben

(zwischen 6,7 und 46,6 %) bereits Eier nachweisen. A. suum bildete eine Ausnahme, hier waren

auch bei 5 EpG alle Proben negativ. Ab einer Eikonzentration von 10 EpG war bei jedem Parasiten

ein Anteil positiver Proben zu erhalten, der zwischen 12 und 86,6 % schwankte. In der

Konzentration von 20 EpG schwankten die prozentualen Anteile positiver Proben zwischen 20 und

86,6 %. Bei einer Konzentration von 40 EpG ergaben bei den Cyathostominae bereits 100 % der

Proben ein positives Ergebnis, bei allen anderen Parasiten mehr als 50 % der Proben (zwischen 53,3

und 93,3 %). In der Konzentrationsstufe 60 EpG waren bei T. vulpis, den Cyathostominae, und C.

oncophora 100 % der Proben positiv, bei den anderen Parasiten zwischen 86 % und 96 % der

Proben. Bei 80 EpG waren alle Proben aller Parasiten positiv (100 %).

- 39 -

ERGEBNISSE

0102030405060708090

100

0 20 40 60 80 1

zugefügte Eizahl/g Kot

Anz

ahl p

ositi

ver P

robe

n [%

]

00

A. caninum U. stenocephala Cyathostominae C. oncophora

Abbildung 1: Sensitivität des kombinierten Sedimentations-Flotationsverfahrens für die

Strongylida: A. caninum, U. stenocephala (Hund), C. oncophora (Rind) und den Cyathostominae

(Pferd) für verschiedene Eikonzentrationen/g Kot

0102030405060708090

100

0 20 40 60 80 10


Anz

ahl p

ositi

ver P

robe

n [%

]

0

T. canis T. cati A.suum T. leonina


Ascaridida: T. cati, T. leonina (Katze), T. canis (Hund) und A. suum (Schwein) für verschiedene

Eikonzentrationen/g Kot

- 40 -

ERGEBNISSE

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 10


Anz

ahl p

ositi

ver P

robe

n [%

]

0

M. expansa A. perfoliata


Cyclophyllida: M. expansa (kleiner Wiederkäuer) und A. perfoliata (Pferd) für verschiedene


0102030405060708090

100

0 20 40 60 80 10


Anz

ahl p

ositi

ver P

robe

n [%

]

0

T. vulpis

Abbildung 4: Sensitivität des kombinierten Sedimentations-Flotationsverfahrens für die Enoplida:

T. vulpis (Hund) für verschiedene Eikonzentrationen/g Kot

- 41 -

ERGEBNISSE

Besonders auffallende, meistens hochsignifikante, Unterschiede im Nachweis einzelner Parasiten

wurden im Vergleich der Cyathostominae mit den anderen untersuchten Parasiten festgestellt, sowie

zwischen einigen Strongyliden und Ascariden. U. stenocephala und A. caninum unterschieden sich

in ihrem Nachweis hochsignifikant.

Tabelle 2: Sensitivität der einzelnen Parasiten in den Konzentrationsstufen 1, 40 und 80 EpG (%)

und signifikante Unterschiede in der Sensitivität zwischen den Parasiten aus zusammengefassten

Konzentrationsstufen (5, 10, 20, 40, 60 EpG) in der kombinierten Sedimentatios-Flotationsmethode

A.c. U.s. C.o. Cyath. A.s. T.l. T.c. T.ca. T.v. M.e. A.p.

Sensitivität

bei 1, 40, 80

EpG (%)

0

92

100

0

60

100

0

93

100

7

100

100

0

67

100

0

53

100

0

67

100

0

67

100

0

80

100

0

93

100

0

80

100

A.c. 0, 92, 100 +++ − + ++ +++ ++ − + − −

U.s. 0, 60, 100 ++ +++ − − − − − + +

C.o. 0, 93, 100 + + +++ + + + − −

Cyath. 7, 100, 100 +++ +++ +++ +++ +++ ++ ++

A.s. 0, 67, 100 − − − − − −

T.l. 0, 53, 100 − + − ++ ++

T.c. 0, 67, 100 − − − −

T.ca. 0, 67, 100 − − −

T.v. 0, 80, 100 − −

M.e. .0, 93, 100 −

A.p. 0, 80, 100

+++ : p < 0,001 ++: p < 0,01 + : p < 0,05 − : p > 0,05

A.c.= A. caninum, U.s.= U. stenocephala, C.o.= C. oncophora, Cyath.= Cyathostominae, A.s.=

A. suum, T.l.= T. leonina, T.c.= T. canis, T.ca.= T. cati, T.v.= T. vulpis, M.e.= M. expansa, A.p.=

A. perfoliata

- 42 -

ERGEBNISSE

4.1.1.2 Parasitenordnungen

In Abbildung 5 ist der arithmetische Mittelwert des prozentualen Anteils positiver Proben aller

Parasiten einer Ordnung zu sehen. Zusätzlich ist der Anteil positiver Proben an insgesamt

untersuchten Proben für jeden Parasiten in Prozent dargestellt. Die Ordnung der Cyclophyllida

umfasst die Ergebnisse von M. expansa und A. perfoliata, von denen insgesamt 210 Proben

untersucht wurden, 122 Proben davon waren positiv. Die Ordnung der Strongylida umfasst die

Cyathostominae, A. caninum, U. stenocephala und C. oncophora. Insgesamt wurden in dieser

Ordnung 470 Proben untersucht, 286 davon waren positiv. Aus der Ordnung der Ascaridida wurden

Eier von A.suum, T. leonina, T. canis und T. cati untersucht. Von insgesamt 440 untersuchten

Proben konnten 218 als positiv klassifiziert werden. In der Ordnung der Enoplida wurde die

Sensitivität von T. vulpis bestimmt. Aus einem Umfang von 105 Proben waren 55 positiv. Für die

Cyclophyllida besitzt die kombinierte Sedimentations-Flotationsmethode eine gemittelte

Sensitivität von 58 % , für die Strongylida von 61 %, für die Ascaridida von 51 % und für die

Enoplida von 52 %. Nach Berechnung mit dem χ2–Test war die Sensitivität für den Nachweis der

Cyclophyllida (p<0,05) und Strongylida (p<0,005) signifikant höher als die Sensititivität für den

Nachweis derAscaridida. Alle anderen unterschieden sich nicht signifikant (p>0,05).

- 43 -

ERGEBNISSE

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%M

. exp

ansa

A. p

erfo

liata

C. n

assa

tus

A.c

anin

um

U. s

teno

ceph

ala

C. o

ncop

hora

A. s

uum

T. le

onin

a

T. c

anis

T. c

ati

T. v

ulpi

s

Cyclophyllida Strongylida Ascaridida Enoplida

Parasiten in Ordnungen

Anz

ahl p

ositi

ver P

robe

n

Mittel

Abbildung 5: Sensitivität des kombinierten Sedimentations-Flotationsverfahrens für verschiedene

Parasiten, gemessen an dem Anteil positiver Proben an der Gesamtzahl positiver Proben, mit

arithmetischem Mittel der Parasitenordnungen

4.1.1.3 Durchschnittliche Sensitivität

Um die durchschnittliche Sensitivität der Methode angeben zu können, wurden die für alle Parasiten

bestimmten Sensitivitätswerte einer Konzentrationsstufe gemittelt und in Abbildung 6 dargestellt.

Die auftretenden Spannweiten zwischen den Parasiten wurden durch Berechnung der

Standardabweichungen und der Variationskoeffizienten für die jeweilige Konzentrationsstufe

quantifiziert und sind in Tabelle 2 zu sehen. In den Konzentrationsstufen 1 und 5 EpG kamen 175

bzw. 165 Proben zur Untersuchung, davon waren bei 1 EpG 0 % und bei 5 Epg 18 % der Proben

positiv. Bei 10 und 20 EpG wurden je 185 Proben untersucht, davon waren bei 10 EpG 38 % und

bei 20 EpG 61 % positiv. In den Konzentrationsstufen 40 und 60 EpG gelangten je 175 Proben zur

- 44 -

ERGEBNISSE

Untersuchung, bei 40 EpG wurden davon 78 % und bei 60 EpG 94 % als positiv klassifiziert. In der

Konzentrationsstufe 80 EpG wurden 165 Proben untersucht, davon waren 100 % positiv.

0102030405060708090

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80


Anz

ahl p

os. P

robe

n [%

]

Abbildung 6: Arithmetischer Mittelwert der Sensitivität des kombinierten Sedimentations-

Flotationsverfahrens: alle in Konzentrationsstufen zusammengefassten Parasiten und die

Spannweite zwischen verschiedenen Parasiten in den verschiedenen Konzentrationsstufen.

Tabelle 3: Standardabweichungen (SD) und Variationskoeffizienten (Vk) der einzelnen

Konzentrationsstufen, zusammengefasst aus allen untersuchten Parasiten, für die durchschnittliche

Sensitivität der kombinierten Sedimentations-Flotationsmethode

zugefügte

Eizahl /g Kot

1

5

10

20

40

60

80

SD 2,0 13,7 20,0 22,1 15,7 5,3 0

Vk % 332 75 55 37 20 7 0

- 45 -

ERGEBNISSE

4.1.2 Effektivität


In den Abbildungen 7–10 sind für jeden Parasiten der prozentuale Anteil wiedergefundener Eier aus

den Proben verschiedener Konzentrationsstufen dargestellt. In einer Konzentration von 5

Eiern/Probe konnten lediglich bei den Cyathostominae 1,2 % der zugefügten Eier wiedergefunden

werden, in den Proben aller anderer Parasiten wurden gar keine Eier gefunden. Ab 25 Eiern/Probe

ließen sich außer bei A. suum bei allen Parasiten in einigen Proben Eier in sehr geringen

Prozentzahlen der ursprünglichen Menge finden. Der höchste Prozentsatz wurde hier bei den

Cyathostominae gefunden (2,1 %). Ab 50 zugefügten Eiern/Probe konnten ohne Ausnahme in

einigen Proben aller Parasiten ein gewisser Anteil Eier wiedergefunden werden, die Werte

schwankten hier zwischen 0,3 (T. canis) und 3,5 % (Cyathostominae). In der Konzentration von 100

Eiern/Probe schwankten die Anteile wiedergefundener Eier zwischen 0,3 % (T. leonina) und 2,0 %

(Cyathostominae). Bei einer zugefügten Eizahl von 200 Eiern/Probe wurden bei den

Cyathostominae ein Maximum an 4,1 % der Eier wiedergefunden, am wenigsten Eier wurden bei

T. leonina mit 0,2 % ermittelt. In der Konzentrationsstufe 300 Eier/Probe schwankten die

wiedergefundenen Anteile zwischen 2,8 % (C. oncophora) und 0,8 % (U. stenocephala). Bei 400

zugefügten Eiern/Probe wurden die wenigsten bei T. vulpis wiedergefunden (0,6 %) und die

meisten bei den Cyathostominae (3,5 %).

- 46 -

ERGEBNISSE

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 100 200 300 400 500

zugefügte Eizahl/Probe

durc

hsch

nittl

ich

gefu

nden

e Ei

zahl

[%

]


Abbildung 7: Effektivität des kombinierten Sedimentations-Flotationsverfahrens für die

Strongylida: A. caninum, U. stenocephala (Hund), C. oncophora (Rind) und den

Cyathostominae(Pferd) für verschiedene Eikonzentrationen/g Kot

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

0 100 200 300 400 500


durc

hsch

nittl

ich

gefu

nden

e Ei

zahl

[%]

T. canis T. leonina T. cati A. suum


Ascaridida: T. cati, T. leonina (Katze), T. canis (Hund) und A. suum (Schwein) für verschiedene


- 47 -

ERGEBNISSE

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

0 100 200 300 400 500


durc

hsch

nittl

ich

gefu

nden

e Ei

zahl

[%]



Cyclophyllida: M. expansa (kleiner Wiederkäuer) und A. perfoliata (Pferd) für verschiedene


00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

0 100 200 300 400 500


durc

hsch

nittl

ich

gefu

nden

e Ei

zahl

[%]

T. vulpis

Abbildung 10: Effektivität des kombinierten Sedimentations-Flotationsverfahrens für die Enolpida:

T.vulpis (Hund) bei verschiedenen Eikonzentrationen/g Kot

- 48 -

ERGEBNISSE


In Abbildung 11 ist der arithmetische Mittelwert des prozentualen Anteils wiedergefundener Eier

aller Parasiten einer Ordnung zu sehen. Zusätzlich ist der in allen Konzentrationsstufen

durchschnittlich wiedergefundene prozentuale Anteil der zugefügten Eizahl/Probe einzelner

Parasiten dargestellt. Die Ordnungen umfassen hier die gleichen Parasiten und Probenzahlen wie

bei der Sensitivität aufgeführt (siehe Kapitel 4.1.1.2.). In der Ordnung der Cyclophyllida wurde im

Mittel eine Effektivität der kombinierten Sedimentation-Flotation von 1,0 %, in der Ordnung der

Strongylida 1,4 % und in den Ordnungen der Ascaridida und Enoplida von je 0,7 % der

ursprünglich in der Probe vorhandenen Eizahl ermittelt.

0,0%

0,5%

1,0%

1,5%

2,0%

2,5%

3,0%

M. e

xpan

sa

A. p

erfo

liata

C. n

assa

tus

A.c

anin

um

U. s

teno

ceph

ala

C. o

ncop

hora

A. s

uum

T. le

onin

a

T. c

anis

T. c

ati

T. v

ulpi

s



durc

hsch

nittl

ich

gefu

nden

e Ei

er

Mittel

Abbildung 11: Arithmetischer Mittelwert der Effektivität des kombinierten Sedimentations-

Flotationverfahrens für verschiedene Parasiten mit arithmetischem Mittel der Parasitenordnungen

- 49 -

ERGEBNISSE

4.1.2.3 Durchschnittliche Effektivität

Zur Angabe der durchschnittlichen Effektivität des kombinierten Sedimentations-

Flotationsverfahrens wurden die für alle Parasiten bestimmten Werte einer Konzentrationsstufe

gemittelt und in Abbildung 12 dargestellt. Die Spannweiten zwischen den Parasiten wurden wie bei

der Ermittlung der durchschnittlichen Sensitivität durch die Berechnung der Standardabweichungen

und der Variationskoeffizienten für die jeweilige Konzentrationsstufe quantifiziert und sind in

Tabelle 3 aufgeführt. In den Konzentrationsstufen von 5 und 25 Eiern/Probe kamen 175 bzw. 165

Proben zur Untersuchung, davon waren bei 5 Eiern/Probe im Durchschnitt 0 % der Eier

wiederzufinden und bei 25 Eiern/Probe 0,9 %. Bei 50 und 100 Eiern/Probe wurden je 185 Proben

untersucht, davon wurden bei 50 Eiern/Probe 1,2 % und bei 100 Eiern/Probe 1 % der

ursprünglichen Eizahl gefunden. In den Konzentrationsstufen 200 und 300 Eier/Probe gelangten je

175 Proben zur Untersuchung, die Wiederfindungsraten betrugen für beide je 1,3 %. Bei 400

Eiern/Probe wurden 165 Proben untersucht, der durchschnittlich wiedergefundene Anteil an Eiern

lag hier bei 1,5 %.

Abbildung 12: Arithmetischer Mittelwert der Effektivität des kombinierten Sedimentations-

Flotationsverfahrens: alle in Konzentrationsstufen zusammengefassten Parasiten und die

Spannweite zwischen verschiedenen Parasiten in den Konzentrationsstufen

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5

0 50 100 150 200 250 300 350 400zugefügte Eizahl / Probe

durc

hsch

nittl

ich

gefu

nden

e Ei

zahl

[%

]

- 50 -

ERGEBNISSE



Effektivität des kombinierten Sedimentations-Flotationsverfahrens

zugefügte

Eizahl /Probe

5

25

50

100

200

300

400

SD 0,4 0,7 0,9 0,6 1,2 0,6 0,9

Vk % 331 77 73 59 91 48 62

4.2 McMaster-Methode

4.2.1 Sensitivität


In den Abbildungen 13–16 sind für jeden Parasiten der prozentuale Anteil positiver Proben pro

Konzentrationsstufe dargestellt. In der Konzentration von 1 EpG konnte in keiner der Proben aller

Parasiten eine positive Probe gefunden werden. Bei 30 EpG ließen sich außer bei T. canis bei allen

Parasiten positive Proben finden, ihr prozentualer Anteil schwankte zwischen 12 (M. expansa) und

47 % (U. stenocephala). Ab einer Eikonzentration von 50 EpG waren bei allen Parasiten

ausnahmslos positive Proben zu finden, ihr Anteil schwankte hier zwischen 67 (T. vulpis) und 27 %

(A. perfoliata). In der Konzentration von 100 EpG schwankten die prozentualen Anteile positiver

Proben zwischen 94 % (T. cati, U. stenocephala) und 54 % (T. canis, A. caninum, A. suum). Ab 500

EpG waren die Proben aller Parasiten zu 100 % positiv.

- 51 -

ERGEBNISSE

0

20

40

60

80

100

120

0 200 400 600 800 1000 1200


Anz

ahl p

ositi

ver P

robe

n [%

]


Abbildung 13: Sensitivität der McMaster-Methode für die Strongylida: A. caninum,

U. stenocephala (Hund), C. oncophora (Rind) und den Cyathostominae (Pferd) für verschiedene


0

20

40

60

80

100

120

0 200 400 600 800 1000 1200


Anz

ahl p

ositi

ver P

robe

n [%

]

A. suum T. leonina T. cati T. canis

Abbildung 14: Sensitivität der McMaster-Methode für die Ascaridida: T. cati, T. leonina (Katze),

T. canis (Hund) und A. suum (Schwein) für verschiedene Eikonzentrationen/g Kot

- 52 -

ERGEBNISSE

0

20

40

60

80

100

120

0 200 400 600 800 1000 1200


Anz

ahl p

ositi

ver P

robe

n [%

]

A. perfoliata M. expansa

Abbildung 15: Sensitivität der McMaster-Methode für die Cyclophyllida: M. expansa (kleiner

Wiederkäuer) und A. perfoliata (Pferd) für verschiedene Eikonzentrationen/g Kot

0

20

40

60

80

100

120

0 200 400 600 800 1000 1200


Anz

ahl p

ositi

ver P

robe

n [%

]

T. vulpis

Abbildung 16: Sensitivität der McMaster-Methode für die Enoplida: T. vulpis (Hund) für

verschiedene Eikonzentrationen/g Kot

- 53 -

ERGEBNISSE

Tabelle 5: Sensitivität der einzelnen Parasiten in den Konzentrationsstufen 1, 80 und 500 EpG (%)

und signifikante Unterschiede in der Sensitivität zwischen den Parasiten aus zusammengefassten

Konzentrationsstufen (30, 50, 80, 100 500 EpG) in der McMaster-Methode

A.c. U.s. C.o. Cyath. A.s. T.l. T.c. T.ca. T.v. M.e. A.p.

Sensitivität

bei 1, 80,

500 EpG

(%)

0

60

100

0

47

100

0

60

100

0

60

100

0

53

100

0

73

100

0

53

100

0

93

100

0

53

100

0

47

100

0

60

100

A.c. 0, 60, 100 - - - - - + + - - -

U.s. 0, 47, 100 - - − − ++ − − + -

C.o. 0, 60, 100 - - - + + - - -

Cyath. 70 60, 100 - - + + - - -

A.s. 0, 53, 100 - - ++ - - -

T.l. 0, 73, 100 ++ - - + -

T.c. 0, 53, 100 +++ + - -

T.ca. 0, 93, 100 - +++ ++

T.v. 0, 53, 100 − −

M.e. .0, 47, 100 −

A.p. 0, 60, 100

+++ : p < 0,001 ++: p < 0,01 + : p < 0,05 − : p > 0,05

A.c.= A. caninum, U.s.= U. stenocephala, C.o.= C. oncophora, Cyath.= Cyathostominae, A.s.=

A. suum, T.l.= T. leonina, T.c.= T. canis, T.ca.= T. cati, T.v.= T. vulpis, M.e.= M. expansa, A.p.=

A. perfoliata


In Abbildung 17 ist der arithmetische Mittelwert des prozentualen Anteils positiver Proben aller

Parasiten einer Ordnung zu sehen. Zusätzlich ist der Anteil positiver Proben an insgesamt

untersuchten Proben für jeden Parasiten in Prozent dargestellt. Die Ordnungen umfassen die

gleichen Parasiten wie in Kapitel 4.1.1.2 aufgführt. Von den Cyclophyllida wurden insgesamt 195

Proben untersucht, 96 Proben davon waren positiv. Bei den Strongylida wurden 420 Proben

- 54 -

ERGEBNISSE

untersucht, 253 davon waren positiv. In der Ordnung der Ascaridida wurden von insgesamt 420

untersuchten Proben 249 als positiv klassifiziert. Die Ordnung der Enoplida umfasste einem

Umfang von 105 Proben, 65 davon waren positiv. Für die Cyclophyllida besitzt die McMaster-

Methode eine gemittelte Sensitivität von 49 % , für die Strongylida von 60 %, für die Ascaridida

von 59 % und für die Enoplida von 62 %. Die Sensitivität für den Nachweis der Strongylida

unterschied sich nicht signifikant von der der Enoplida (p>0,05) und der Ascaridida (p>0,05). Alle

anderen Ordnungen unterschieden sich in der Sensitivität ihres Nachweises mit mittlerer

Signifikanz (p<0,01).

0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

70,0%

80,0%

M. e

xpan

sa

A. p

erfo

liata

C. n

assa

tus

A.c

anin

um

U.

sten

ocep

hala

C. o

ncop

hora

A. s

uum

T. le

onin

a

T. c

anis

T. c

ati

T. v

ulpi

s



Anz

ahl p

ositi

ver P

robe

n

Mittel

Abbildung 17: Sensitivität der McMaster-Methode für verschiedene Parasiten, gemessen an dem

Anteil positiver Proben an der Gesamtzahl positiver Proben, mit arithmetischem Mittel der

Parasitenordnungen

- 55 -

ERGEBNISSE

4.2.1.3 Durchschnittliche Sensitivität

In Abbildung 18 wird die durchschnittliche Sensitivität der McMaster-Methode dargestellt, die

Standardabweichungen und Variationskoeffizienten für die einzelnen Konzentrationsstufen sind in

Tabelle 5 zu sehen. In den Konzentrationsstufen 1-500 EpG kamen je 165 Proben zur

Untersuchung, bei 1000 EpG 150 Proben. Während bei 1 EpG 0 % der Proben positiv waren, waren

bei 30 EpG 29 % positiv. In den Konzentrationsstufen 50 und 80 EpG waren 49 bzw. 60 % der

Proben positiv, bei 100 EpG waren es 73 %. Ab 500 EpG waren 100 % der Proben positiv.

010

2030

40

5060

7080

90

100

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000


Anz

ahl p

ositi

ver P

robe

n [%

]

Abbildung 18: Arithmetischer Mittelwert der Sensitivität der McMaster-Methode: alle in

Konzentrationsstufen zusammengefassten Parasiten und die Spannweite zwischen verschiedenen

Parasiten in den verschiedenen Konzentrationsstufen



Sensitivität der McMaster-Methode zugefügte

Eizahl /g Kot

1

30

50

80

100

500

1000

SD 0 15,5 14,7 13,3 15,3 0 0

Vk % 0 57 30 22 21 0 0

- 56 -

ERGEBNISSE

4.2.2 Effektivität


In den Abbildungen 19–22 sind für jeden Parasiten der prozentuale Anteil wiedergefundener Eier

aus den Proben verschiedener Konzentrationsstufen dargestellt. In einer Konzentration von 1 EpG

konnten in keiner Probe der unterschiedlichen Parasiten Eier gefunden werden. Ab 30 EpG ließen

sich außer bei T. canis bei allen Parasiten Eier in einigen Proben finden. Der höchste Prozentsatz

wurde hier bei T. leonina gefunden (74 %). Ab 50 EpG konnten ohne Ausnahme in einigen Proben

aller Parasiten ein gewisser Anteil Eier wiedergefunden werden, die Werte schwankten hier

zwischen 62 % (T. vulpis) und 18 % (T. canis). In der Konzentration von 80 EpG schwankten die

Anteile wiedergefundener Eier zwischen 28 % (T. canis) und 166 % (T. cati). Bei einer zugefügte

Eizahl von 100 EpG wurden bei T. cati 138 % der Eier wiedergefunden, am wenigsten Eier wurden

bei A. suum mit 22 % ermittelt. In der Konzentrationsstufe 500 EpG schwankten die

wiedergefundenen Anteile zwischen 15 % (A. perfoliata) und 76 % (U. stenocephala). Bei 1000

EpG wurden die wenigsten Eier bei T. canis wiedergefunden (33 %) und die meisten bei T. leonina

(91 %).

- 57 -

ERGEBNISSE

0102030405060708090

100

0 200 400 600 800 1000 1200


durc

hsch

nittl

ich

gefu

nden

e Ei

zahl

[%

]


Abbildung 19: Effektivität der McMaster-Methode für die Strongylida: A. caninum, U.

stenocephala (Hund), den Cyathostominae (Pferd) und C. oncophora (Rind) für verschiedene


0102030405060708090

100

0 200 400 600 800 1000 1200


durc

hsch

nittl

ich

gefu

nden

e Ei

zahl

[%]

A. suum T. leonina T. cati T. canis

Abbildung 20: Effektivität der McMaster-Methode für die Ascaridida: T. cati, T. leonina (Katze),

T. canis (Hund) und A. suum (Schwein) für verschiedene Eikonzentrationen/g Kot

- 58 -

ERGEBNISSE

0102030405060708090

100

0 200 400 600 800 1000 1200


Anz

ahl p

ositi

ver P

robe

n [%

]


Abbildung 21: Effektivität der McMaster-Methode für die Cyclophyllida: M. expansa (kleiner

Wiederkäuer) und A. perfoliata (Pferd) für verschiedene Eikonzentrationen/g Kot

0102030405060708090

100

0 200 400 600 800 1000 1200


Dur

chsc

hnitt

lich

gefu

nden

e Ei

zahl

[%]

T. vulpis

Abbildung 22: Effektivität der McMaster-Methode für die Enoplida: T. vulpis (Hund) für

verschiedene Eikonzentrationen/g Kot

- 59 -

ERGEBNISSE


In Abbildung 23 ist der arithmetische Mittelwert des prozentualen Anteils wiedergefundener Eier

aller Parasiten einer Ordnung zu sehen. Zusätzlich ist der in allen Konzentrationsstufen

durchschnittlich wiedergefundene prozentuale Anteil der zugefügten Eizahl/Probe einzelner

Parasiten dargestellt. In der Ordnung der Cyclophyllida wurde im Mittel eine Effektivität der

McMaster-Methode von 38 %, in der Ordnung der Strongylida 44 % und in den Ordnungen der

Ascaridida und Enoplida je 47 % und 48 % der ursprünglich in der Probe vorhandenen Eizahl

ermittelt.

0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

70,0%

80,0%

90,0%

M. e

xpan

sa

A. p

erfo

liata

C. n

assa

tus

A.c

anin

um

U.

sten

ocep

hala

C. o

ncop

hora

A. s

uum

T. le

onin

a

T. c

anis

T. c

ati

T. v

ulpi

s



durc

hsch

nittl

ich

gefu

nden

e Ei

zahl

Mittel

Abbildung 23: Effektivität der McMaster-Methode für verschiedene Parasiten mit arithmetischem

Mittel der Parasitenordnungen

- 60 -

ERGEBNISSE

4.2.2.3 Durchschnittliche Effektivität

In Abbildung 24 ist die durchschnittliche Effektivität der McMaster-Methode dargestellt, die

Standardabweichungen und Variationskoeffizienten der einzelnen Konzentrationsstufen sind

Tabelle 6 zu entnehmen. In allen Konzentrationsstufen wurden 165 Proben untersucht, mit

Ausnahme der Konzentrationsstufe 1000 EpG, dort gelangten nur 150 Proben zur Untersuchung.

Bei 0 EpG konnten gar keine Eier nachgewiesen werden, bei 30 EpG wurden im Schnitt 45 % der

Eier gefunden. In den Konzentrationsstufen 50 und 80 EpG konnten im Mittel 44 % und 53 % der

Eier wiedergefunden werden, bei 100 EpG waren dies 52 %. Bei einer zugefügte Eizahl von 500

bzw. 1000 EpG betrugen die durchschnittlichen Werte 46 % und 52 %.

0

20

4060

80

100

120140

160

180

0 200 400 600 800 1000zugefügte Eier/g Kot

durc

hsch

nittl

ich

gefu

nden

e Ei

zahl

[%

]

Abbildung 24: Arithmetischer Mittelwert der Effektivität der McMaster-Methode: alle in

Konzentrationsstufen zusammengefassten Parasiten und die Spannweite zwischen verschiedenen

Parasiten in den verschiedenen Konzentrationsstufen

- 61 -

ERGEBNISSE



Effektivität der McMaster-Methode

zugefügte

Eizahl /Probe

1

30

50

80

100

500

1000

SD 0 18,8 14 39,1 32,1 18,2 18,8

Vk % 0 38 32 73 61 39 36

- 62 -

ERGEBNISSE

4.3 Sedimentationsmethode

4.3.1 Sensitivität

Bei 1 EpG war keine der untersuchten Proben positiv. In den Konzentrationsstufen 5 und 10 EpG

waren 27 % bzw. 73 % der Proben positiv, bei 15 EpG wurden bereits 93 % der Proben als positiv

klassifiziert. Ab 20 EpG waren durchgängig 100 % der Proben positiv (Abbildung 25).

0102030405060708090

100

0 5 10 15 20 25 30


Anz

ahl p

ositi

ver P

robe

n [%

]

Abbildung 25: Sensitivität der Sedimentationsmethode für F. hepatica (Rind) in Abhängigkeit von

der Eikonzentration/g Kot

4.3.2 Effektivität

Bei 1 EpG waren alle Proben negativ und somit keine Eier nachzuweisen. Bei 5 EpG waren im

Schnitt 7 % der Eier zu finden, bei 10 und 15 EpG 12 bzw. 16 %. Bei 20 EpG wurde eine maximale

- 63 -

ERGEBNISSE

Wiederfindungsrate von 20% ermittelt. In den Konzentrationsstufen 25 und 30 EpG fanden sich 19

bzw. 18 % der zugefügten Eier einer Probe wieder.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15 20 25 30 35


durc

hsch

nittl

ich

gefu

nden

e Ei

zahl

/g

Kot

[%]

Abbildung 26: Effektivität der Sedimentationsmethode für F. hepatica (Rind) in Abhängigkeit von

der Eikonzentration/g Kot


Konzentrationsstufen für die Effektivität der Sedimentationsmethode für F. hepatica

Zugefügte

Eier/g Kot

1

5

10

15

20

25

30

SD 0 0,6 0,9 1,3 2,2 1,4 2,1

Vk % 0 185 78 53 56 29 38

- 64 -

ERGEBNISSE

4.4 Auswanderverfahren nach Baermann

4.4.1 Sensitivität

Die Sensitivität der Methode für die ungerührte Kotprobe lag für 0,7 LpG bei 46,7 %, für 3,4 LpG

bei 86,7 % und für 6,7 LpG bei 93,3 %. Ab 10,1 LpG waren 100 % der Proben positiv. (Abbildung

27). Die Sensitivität für die gerührte Kotprobe lag bei 46,7 % für 1,6 LpG, bei 80 % für 3,2 LpG

und bei 100 % für 6,3 LpG (Abbildung 28).

0

20

40

60

80

100

0 5 10

Larvenzahl/g Kot

Anz

ahl p

ositi

ver P

robe

n [%

]

15

Abbildung 27: Sensitivität des Auswanderverfahrens nach Baermann für D. viviparus in einer

ungerührten Kotprobe in Abhängigkeit von der Larvenkonzentration/g Kot

- 65 -

ERGEBNISSE

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15

Larvenzahl/g Kot

Anz

ahl p

ositi

ver P

robe

n [%

]

Abbildung 28: Sensitivität des Auswanderverfahrens nach Baermann für D. viviparus in einer

3 min gerührten Kotprobe in Abhängigkeit von der Larvenkonzentration/g Kot

4.4.2 Effektivität

Die Effektivität der Methode in Bezug auf die ungerührte Kotprobe (Abbildung 29) stellt sich

folgendermaßen dar: Bei einer Konzentration von 0,67 LpG wurden im Schnitt 64 % der Larven

wiedergefunden. Bei den Verdünnungsstufen 3,36 und 6,72 LpG konnten mit der Methode ein

durchschnittlicher Anteil von 91 % und 96 % der Larven gefunden werden. Bei 10,08 und 13,44

LpG wurden 254 % bzw. 220 % der Larven ermittelt.

Bei der Untersuchung der Effektivität der Methode für die gerührte Kotprobe (Abbildung 30)

wurden folgende Werte ermittelt: In den Konzentrationsstufen 1,6 und 3,2 LpG wurden 27 % bzw.

39 % der Larven gefunden. In einer Konzentration von 6,3 LpG wurden mit der Methode im Schnitt

67 % der Larven wiedergefunden.

- 66 -

ERGEBNISSE

05

101520253035404550

0,67 3,36 6,72 10,08 13,44

Larvenzahl/g Kot

durc

hsch

nittl

ich

gefu

nden

e La

rven

zahl

/g K

ot

Abbildung 29: Effektivität des Auswanderverfahrens nach Baermann für D. viviparus aus einer

ungerührten Kotprobe in Abhängigkeit von der Larvenkonzentration/g Kot


Konzentrationsstufen für die Effektivität des Auswanderverfahrens nach Baermann für D. viviparus

aus einer ungerührten Kotprobe

Zugefügte

Larven/g Kot

0,67

3,36

6,72

10,08

13,44

SD 1,1 10 6,2 30,4 52,9

Vk % 130 78 101 59 89

- 67 -

ERGEBNISSE

05

101520253035404550

1,58 3,15 6,3

Larvenzahl/g Kot

durc

hsch

nittl

ich

gefu

nden

e La

rven

/g K

ot

Abbildung 30: Effektivität des Auswanderverfahrens nach Baermann für D. viviparus aus einer

3 min gerührten Kotprobe in Abhängigkeit von der Larvenzahl/g Kot


Konzentrationsstufen für die Effektivität des Auswanderverfahrens nach Baermann für D. viviparus

aus einer 3 Minuten gerührten Kotprobe Zugefügte

Larven/g Kot

1,6

3,2

6,3

SD 1,1 2,2 4,5

Vk % 129 89 54

- 68 -

DISKUSSION

5 DISKUSSION

Ziel dieser Arbeit war die Gewinnung von Daten zur Validierung des kombinierten Sedimentations-

Flotationsverfahrens wie in Kapitel 3.3.1 beschrieben, der McMaster-Methode nach Wetzel, der

Sedimentationsmethode nach Benedek und dem Auswanderverfahren nach Baermann. Dabei

wurden bei den beiden erstgenannten Methoden möglichst viele verschiedene, mit diesen Methoden

üblicherweise nachgewiesene, Parasiten berücksichtigt. Dies geschah, um einen repräsentativen

Querschnitt für die Methode sowie Daten zur Beurteilung von unterschiedlichem Verhalten

einzelner Parasiten innerhalb der Methode zu erhalten.

Die Aussagekraft einer koproskopischen Methode lässt sich anhand zweier Kriterien bewerten:

Erstens an der Anzahl falsch negativer Proben (Sensitivität) und zweitens an dem Anteil in der

Probe wiedergefundener Eier (Effektivität) (Egwang und Slocombe, 1981). Unterschiede zwischen

einzelnen Parasitenstadien ergeben sich aus den gleichen Kriterien.

5.1 Kombiniertes Sedimentations-Flotationsverfahren

Das kombinierte Sedimentations-Flotationsverfahren wird fast ausschließlich in der qualitativen

Routinediagnostik von Kotproben einzelner oder weniger Tiere angewendet. Der Schwerpunkt liegt

hier darin, dass ein positives Tier mit größtmöglicher Sicherheit auch als solches erkannt werden

soll, die Sensitivität dieser Methode ist deshalb von besonderer Bedeutung. Die vorliegenden

Untersuchungen wurden mit geringen Eimengen pro Gramm Kot durchgeführt, um verlässliche

Daten für die Grenze der Sensitivität der Methode zu erhalten, da der Aspekt der Effektivität im

Vergleich zur Sensitivität von untergeordneter Bedeutung ist und in der Routinediagnostik die

gefundene Eizahl nur semiquantitativ klassifiziert wird.

Den vorliegenden Ergebnissen zufolge kann für alle in dieser Arbeit untersuchten Parasiten ab einer

Eizahl von 80 EpG eine 100 %ige Sensitivität der kombinierten Sedimentation-Flotationsmethode

(also keine falsch negativen Proben) erwartet werden, darunter schwankt die Menge der falsch

negativ getesteten Proben in Abhänigkeit von dem untersuchten Parasiten. Die Spannweite ist für

die mittleren Konzentrationsstufen besonders groß. Sie und der Variationskoeffizient zeigen, dass

- 69 -

DISKUSSION

sich Unterschiede in der Nachweisbarkeit durch die Methode zwischen den Parasiten mit

zunehmender Eizahl pro Gramm Kot relativieren bzw. ab 80 EpG unrelevant sind. Egwang und

Slocombe (1981) (vgl. Kapitel 2.2.1) erreichten mit der Cornell DCF- und der Wisconsin-DCF-

Methode, bei denen es sich ebenfalls um Konzentrationsmethoden handelt, die die Zentrifugation

und Flotation beinhalten, deutlich höhere Sensitivitäten, welche für 7, 30 und 60 EpG bei 100%

lagen. Die Effektivität der hier verwendeten kombinierten Sedimentation-Flotation erweist sich in

den untersuchten Konzentrationsstufen als gering, sie liegt in der Konzentration 60 EpG bei 1,3 %,

der Variationskoeffizient ist erheblichen Schwankungen unterworfen. Mit zunehmender Eizahl pro

Gramm Kot ist allerdings eine kontinuierliche Steigerung der Effektivität der Methode zu

verzeichnen. Egwang und Slocombe (1981) erreichten mit der Cornell-DCF- und der Wisconsin-

DCF-Methode eine höhere Effektivität, welche in der Konzentration 60 EpG bei 63 % bzw. 69 %

lag, der Variationskoeffizient lag bei ihren Untersuchungen bei 19 % bzw. 10,6 %, in vorliegenden

Untersuchungen betrug er bei 60 EpG 48 %. Die durch Egwang und Slocombe (1981) mit den von

ihnen untersuchten Methoden deutlich besseren erreichten Ergebnisse lassen sich allerdings nicht

direkt mit den hier vorliegenden Ergebnissen vergleichen, da sich die Methoden in wesentlichen

Punkten von der kombinierten Sedimentations-Flotattionsmethode unterscheiden (z.B. im

Verhältnis von Wasser zur Kotprobe, Flotationslösungen und Zentrifugation) und die Autoren die

Methoden anhand eines anderen, als in vorliegender Arbeit verwendeten, Parasiten, nämlich H.

contortus in Rinderkot untersuchten. Die höhere Sensitivität bzw. Effektivität der Cornell-DCF-

und der Wisconsin-DCF-Methode kann sowohl in den Unterschieden in den Modifikationen der

Methoden als auch in unterschiedlichem Verhalten des Parasiten begründet sein.

Die Auswirkungen verschiedener Methodenmodifikationen wurden von Egwang und Slocombe

(1982) anhand der Cornell-Wisconsin Centrifugal Flotation Methode ebenfalls unter der

Verwendung von H. contortus untersucht (vgl. Kapitel 2.2.1). Sie stellten in ihren Untersuchungen

fest, dass die zweifache Zentrifugation, erst der Kot-Wasser-Suspension und anschließend der Kot-

Zuckerlösung-Suspension, die Sensitivität (zwischen 3 und 7 EpG traten keine falsch negativen

Proben auf) und die Effektivität (sie lag dann für die untersuchte Methode bei 62,6 %) verbesserte.

Williamson et al. (1998) ermittelte die Effektivität von zwei Flotationsmethoden anhand von dem in

vorliegender Arbeit ebenfalls untersuchten Parasiten A. perfoliata (vgl. Kapitel 2.2.1) und erreichte

ab 2 EpG mit beiden Methoden positive Befunde, das entspricht einer höheren Sensitivität als in

vorliegenden Untersuchungen mittels der kombinierten Sedimentation-Flotation. Die Effektivität

- 70 -

DISKUSSION

betrug 9,1 % bzw. 50 % und lag für diesen EpG-Bereich ebenfalls höher. Bei der Durchführung der

Methoden wurden drei bzw. zwei Zentrifugationen durchgeführt. Eine deutliche Verbesserung der

hier beschriebenen Methode hinsichtlich ihrer Sensitivität könnte evtl. durch die von Egwang und

Slocombe (1982) beschriebene zusätzliche Zentrifugation der Kot-Wasser-Suspension erreicht

werden, da auch Williamson et al. (1998) mit mehreren Zentrifugationen ebenfalls bessere

Ergebnisse erzielten. Die Praktikabilität der Methode würde durch den damit verbundenen

Mehraufwand allerdings eingeschränkt. Egwang und Slocombe (1982), konnten keinen Einfluss des

Kot-Wasser-Verhältnisses bei Verhältnissen zwischen 1:3 und 1:12 auf die Sensitivität bzw.

Effektivität einer Methode nachweisen, in der Arbeit von Williamson et al (1998) betrug das

Verhältnis von Kot zu Wasser 1:2 bzw. 1:10. Beide Autoren erreichten mit der, im Gegensatz zu

der in der kombinierten Sedimentation-Flotation verwendeten (1:50), geringen Verdünnug der

Kotprobe mit Wasser, höhere Sensitivitäten und Effektivitäten. Deshalb kann eine Verbesserung der

Sensitivität und Effektivität der kombinierten Sedimentation-Flotation evtl. auch mit einer

geringeren Verdünnung der Kotprobe erreicht werden. Egwang und Slocombe (1982) fanden in

ihren Untersuchungen, dass bei Gebrauch eines Siebes zum Rückhalt grober Kotbestandteile immer

ein Eianteil von ca. 30 % im Sieb bzw. den zurückgehaltenen Kotbestandteilen und dem darin

enthaltenen Rest an Flüssigkeit hängen bleibt. Eine Erhöhung der Eiausbeute und damit verbesserte

Sensitivität der hier vorgestellten Methode könnte auch durch das Ausdrücken der Flüssigkeit aus

den Kotresten im Sieb z.B. mittels eines Spatels versucht werden. Proudman und Edwards (1992)

validierten eine Zentrifugations-/Flotationstechnik ebenfalls zum Nachweis von A. perfoliata. Sie

ermittelten eine Sensitivität von 61 %, welche aber nicht in Vergleich zu den vorliegenden Daten

gesetzt werden kann, da die von den Autoren verwendten Kotproben von infizierten Pferden mit

unterschiedlicher Befallsintensität stammten und daher die genaue Eizahl in den Kotproben nicht

bekannt war.

Keferböck (1982), Mayerhofer (1985) und Schragner (1986) ermittelten in umfangreichen Arbeiten

eine konzentrierte Zuckerlösung (spez. Gewicht 1,26) als effektivstes Flotationsmedium für die Eier

verschiedener Parasitenarten bei verschiedenen Tierarten. Auch Williamson et al. (1998)

verwendeten Zuckerlösung als Flotationsmedium (spez. Gewicht 1,28) und erreichten bessere

Ergebnisse als die in vorliegender Arbeit unter der Verwendung von Zinksulfatlösung gewonnenen.

Bei der hier zur Verwendung gekommenen Methode könnte möglicherweise ebenfalls mit

konzentrierter Zuckerlösung anstelle von Zinksulfatlösung eine bessere Sensitivität erreicht werden.

- 71 -

DISKUSSION

Keferböck (1982), Mayerhofer (1985) und Schragner (1986) verwendeten im Vergleich allerdings

eine Zinksulfatlösung mit einer Dichte von 1,24, die darin deutlich unter der Dichte der hier

verwendeten Lösung (spez. Gewicht 1,3) liegt und deshalb vorhandene Eier evtl. schlechter

flotieren ließ. Auch wird die Zuckerlösung nach ihrer Herstellung schnell mit Pilzen besiedelt,

weshalb eine Vorratshaltung ungünstig ist. Dies sowie die klebrige Verunreinigung des

Arbeitsplatzes durch Zuckerlösung stellen gegenüber Zinksulfat einen Nachteil dar. Zajac (2002)

verglich ebenfalls eine Zinksulfatlösung (spez. Gewicht 1,18) mit einer Zuckerlösung (spez.

Gewicht 1,25) und konnte mit der Zinksulfatlösung mehr positive Proben ermitteln. Inwiefern mit

den vorgeschlagenen Änderungen tatsächlich eine höhere Sensitivität der Methode erreicht werden

kann, müsste mit einer ausreichenden Probenzahl unterschiedlicher Parasiteneier und Wirtstierarten

experimentell ermittelt werden.

5.2 McMaster-Methode

Die McMaster-Methode wird in ihrer Eigenschaft als Verdünnungsmethode primär zu der

Erfassung hoher Eizahlen in Kotproben in der epidemiologischen und experimentellen Parasitologie

eingesetzt. Ihre Effektivität ist daher von maßgeblicher Bedeutung. Obwohl die McMaster-Methode

kaum in qualitativen Untersuchungen mit mäßigen Eizahlen Verwendung findet, wurde hier neben

ihrer Effektivität auch ihre Sensitivität untersucht, da diese in Abhängigkeit von der Eizahl pro

Gramm Kot auch bei quantitativen Untersuchungen eine Rolle spielen kann.

Die Verwendung der McMaster-Methode hinsichtlich der Sensitivität ist nach vorliegenden

Ergebnissen nur sinnvoll, wenn höhere Eizahlen als 500 EpG in einer Probe zu erwarten sind. Für

Eizahlen unter 500 EpG liefert sie keine zuverlässig positiven Ergebnisse. Als

Verdünnungsmethode ist die McMaster-Methode dafür entwickelt worden, sehr hohe Eizahlen zu

einer für den Untersucher quantitativ erfassbaren Menge aufzubereiten (Gibson 1965). In dieser

Eigenschaft ist ihre geringe Sensitivität in unteren Eizahlen pro Gramm Kot nicht relevant, da sie

bei sachgemäßer Anwendung erst ab hohen Eizahlen (über 1000 EpG) zum Einsatz kommt. Als

Methode zur Diagnostik ist sie aufgrund der geringen Sensitivität grundsätzlich nicht geeignet. Die

errechnete untere Nachweisgrenze der Methode liegt bei 33 EpG. In diesem Fall ist in einer der drei

- 72 -

DISKUSSION

Zählkammern ein Ei zu finden. Dass es sich hierbei um einen rein theoretischen Wert handelt,

zeigen die vorliegenden Ergebnisse. Die Effektivität der Methode für die untersuchten Eizahlen pro

Gramm Kot schwankt von Konzentration zu Konzentration (excl. 1 EpG, hier traten keine

Schwankungen auf) gering und beträgt im Mittel 49 %. Sie zeigt mit zunehmender Eizahl pro

Gramm Kot keine Tendenz zur Erhöhung. In Anbetracht der Tatsache, dass es sich bei der

McMaster-Methode um ein quantitatives Verfahren handelt, ist diese Effektivität als gering

einzustufen. Die untersuchten Eizahlen pro Gramm Kot sind allerdings niedrig gewählt (die

McMaster-Methode wurde zur Untersuchung hoher Eizahlen entwickelt und ist in ihrer Eigenschaft

als Verdünnungsmethode erst ab 1000 EpG sinnvoll einzusetzen), über eine Verbesserung der

Effektivität in höhern Eizahlbereichen kann deshalb nur spekuliert werden. Hunter und Quenouille

(1952) postulierten, dass bei der Verwendung einer Verdünnungstechnik wie der McMaster-

Methode die Genauigkeit der Zählung steigt, je mehr Eier gezählt werden. Deplazes und Eckert

(1988) (vgl. Kapitel 2.2.2) validierten die McMaster-Methode in deutlich höheren

Eikonzentrationen pro Gramm Kot (1716 EpG) und erreichten eine höhere Effektivität (im Mittel

70,4 %) als in den vorgestellten Ergebnissen und als Egwang und Slocombe (1981)(s.u.). In der

Literatur findet man häufig Angaben über niedrige gefundene Eizahlen pro Gramm Kot (unter 500

EpG), welche mit der McMaster-Methode oder einer modifizierten McMaster-Methode ermittelt

wurden (z.B. Borgsteede et al., 2000). Solche niedrigen mit der McMaster-Methode ermittelten

Eizahlen, die von den Autoren o.a. Studien als zuverlässig angesehen wurden, müssen nach

vorliegenden Ergebnissen wahrscheinlich als falsch niedrig interpretiert werden, da die

Wahrscheinlichkeit tatsächlich wesentlich höherer Eizahlen in der Ausgangskotprobe sehr groß ist.

Die Problematik bestünde dabei nicht in zu niedrigen bestimmten Eizahlen pro Gramm Kot, wenn

der vorhandene Fehler immer der gleiche wäre. Schwierigkeiten in der Beurteilung ergeben sich aus

den vorhandenen Schwankungen, so dass kein allgemein gültiger Fehler angegeben werden kann.

Peters und Leiper (1940) bestimmten mit einer Verdünnungsmethode für hohe Eizahlen einen

wesentlich geringeren Variationskoeffizienten als für niedrige. Aufbauend auf jene und die

vorliegende Arbeit sollten weitere Untersuchungen angestrebt werden, um die Effektivität und die

Varianz der Methode besser eingrenzen zu können und darauf beruhende Fehleinschätzungen zu

vermeiden.

Egwang und Slocombe (1981) konnten mit zwei modifizierten McMaster-Methoden eine höhere

Effektivität in niedrigen Eizahlbereichen (vgl. Kapitel 2.2.2) als in den hier vorliegenden

- 73 -

DISKUSSION

Ergebnissen erreichen, die sich auch in denen von ihnen beschriebenen höheren Sensitivitäten

wiederspiegelt. Sie verwendeten eine modifizierte McMaster-Methode und eine Modifizierung der

Cornell-McMaster-Methode und erreichten bei 60 EpG Sensitivitäten von 100 % bzw. 90 %,

während die Effektivität der Methode bei 80 % bzw. 121 % lag. Bei 30 EpG wurde mit der

modifizierten McMaster-Methode immer noch eine 100 %ige Sensitivität erreicht und eine

Effektivität von 63 %. Die Ergebnisse sind mit den hier vorliegenden Daten nicht direkt

vergleichbar, da die Autoren u.a. Eier eines anderen Parasiten, nämlich H. contortus, eine andere

Korrelation von Fäzes zu Wasser (z.B. 1:7,5 bei der Cornell-McMaster-Methode) und eine mit 5g

größere Probenmenge zur Validierung einsetzten. Auch die Ergebnisse von Deplazes und Eckert

(1988) sind in ihrer Vergleichbarkeit sehr eingeschränkt, da die Autoren Zinkchloridlösung als

Flotationsmedium (spez. Gewicht 1,4) und Eier von Taenia hydatigena verwendeten, weshalb die

Ergebnisse weder mit den in dieser Arbeit vorliegenden noch mit denen von Egwang und Slocombe

(1981) direkt verglichen werden können. Verschiedene Autoren untersuchten diverse Faktoren,

welche die Ergebnisse der McMaster-Methode beeinflussen. Cringoli et al. (2004) zeigten, dass die

verwendete Flotationslösung die Menge an gefundenen Eiern signifikant beeinflusst. Sie empfehlen

für Strongylideneier eine Zuckerlösung mit einer Dichte zwischen 1,2 und 1,35 als

Flotationsmedium. Auch in vorliegender Arbeit stellte die gesättigte NaCl-Lösung (spez. Gewicht

1,18-1,2) nicht das ideale Flotationsmedium für alle untersuchten Eier dar. So wurden die Eier von

T. vulpis mit ZnSO4-Lösung (spez. Gewicht 1,3) flotiert, da aufgrund ihres hohen spezifischen

Gewichtes eine Flotation mit NaCl nur unzureichend stattfindet. Die Zuckerlösung weist allerdings

die schon beschriebenen Nachteile in der Anwendung auf (s.o.).

Eine weitere Verbesserung der McMaster-Methode kann den Untersuchungen genannter Autoren

zufolge durch das Auszählen der gesamten McMaster-Kammer anstelle einer Beschränkung auf die

markierten Zählfelder erreicht werden. Das untersuchte Volumen einer Kammer wird somit auf 1,0

ml erhöht. Nach Dunn und Keymer (1986) könnten die Ergebnisse durch eine auf 30 min

verlängerte Flotationszeit verbessert werden, länger als 40 min dürfen sie jedoch nicht flotieren. Die

aufgeführten Möglichkeiten sind mit einem vergleichsweise hohen Zeitaufwand verbunden, ihre

Nachteile liegen daher in der Praktikabilität, besonders bei einer großen Anzahl zu untersuchender

Proben.

- 74 -

DISKUSSION

5.3 Unterschiede im Nachweis einzelner Parasiten und Parasitenordnungen

In den vorliegenden Untersuchungen lässt sich keine offensichtliche Gesetzmäßigkeit in der

Nachweisbarkeit von Eiern unterschiedlicher Parasiten erkennen. Die bestehenden signifikanten

Unterschiede im Nachweis zwischen einzelnen Parasiten und Parasitenordnungen sind daher z.T.

schwer zu interpretieren. In der kombinierten Sedimentations-Flotationsmethode ist die gute

Nachweisbarkeit (sowohl in der Sensitivität als auch in der Effektivität) der Strongyliden der

Pflanzenfresser (C. oncophora und den Cyathostominae, siehe Abb. 1und 7) am auffälligsten. Die

Strongylida unterscheiden sich hier in ihrer Nachweisbarkeit ebenso wie die Cyclophyllida

signifikant von den Ascaridida (vgl. Kapitel 4.1.1.2), für deren Nachweis die Methode

vergleichsweise schlechter abschnitt. Die Sensitivität der McMaster-Methode ist ab 500 EpG für

alle untersuchten Parasiten gleich (s.Abb. 13–16) , während in der Effektivität große Unterschiede,

vor allem innerhalb der Ascaridida, festgestellt wurden (s. Abb. 20).

Die signifikanten Unterschiede zwischen Eiern innerhalb einer Ordnung und zwischen den

Ordnungen hinsichtlich ihrer Sensitivität könnten in unterschiedlicher Kotbeschaffenheit der Proben

und Unterschieden in den Flotationseigenschaften der Eier, welche jede Methode, die sich das

Prinzip der Flotation zu Nutze macht, stark beeinflussen, bedingt sein. Diese können in

unterschiedlicher Oberflächenbeschaffenheit, Dichte (Sawitz, 1942; David und Lindquist 1982),

verschiedenen Reifezuständen (Sasaki 1927), unterschiedlicher elektrostatischer Oberfläche der

Eier (Bailenger 1979) und unterschiedlicher Interaktion des Flotationsmediums mit den Eiern

begründet liegen. So war das negative Kotausgangsmaterial der Hunde trotz gleicher Fütterungs-

und Haltungsbedingungen zum Teil von unterschiedlicher Konsistenz (weicher oder fester

geformter Kot), die Kotbeschaffenheit zwischen den Tierarten entsprach den natürlichen

Unterschieden. Es ist anzunehmen, dass sich Eier aus dem zum Teil sehr grobfaserigen Kot der

Pflanzenfresser besser auswaschen und damit nachweisen lassen als aus dem feinen Kot der

Fleischfresser. Dieses Phänomen kann aber auch im Versuchsaufbau begründet sein, der zwingend

erfordert, die Eier in den negativen Kot einzurühren: So lässt sich die Eisuspension in den feinen

Hundekot einfacher einrühren als in den groben Pferde- oder extrem klebrigen Katzenkot. Gerade

die beiden letztgenannten wiesen in den Versuchen eine vergleichsweise gute Sensitivität auf,

welches auf eine artifizelle ungenügende Haftung der Eier im Kot hinweisen könnte, die sich unter

natürlichen Bedingungen vor allem bei der Katze anders darstellt. Es ist anzunehmen, dass die

- 75 -

DISKUSSION

Kotbeschaffenheit (sowohl innerhalb einer Tierart als auch zwischen den Tierarten) in der

Routinediagnostik eine maßgebliche Rolle spielt, aber nicht berücksichtigt werden kann.

Verschiedene Autoren (Ewer und Sinclair, 1951; Southcott, 1955; Riek et al.,1958; Mettrick, 1961;

Scott, 1938) haben Versuche zur Anwendung von Korrekturfaktoren hinsichtlich unterschiedlichen

Kotkonsistenzen gemacht. Ewer und Sinclair (1951) z.B. schlagen verschiedene Korrekturfaktoren

für Schafkot mit normaler, weich geformter, weicher, sehr weicher und wässriger Konsistenz vor.

Scott (1938) untersuchte Korrekturfaktoren für die Konsistenz humaner Fäzes und zog den Schluss,

dass diese unnötig sind. Im Allgemeinen wird von solcherlei Korrekturfaktoren kaum Gebrauch

gemacht. In der Regel werden in der Literatur Resultate aus Kotuntersuchungen qualitativ,

semiquantitativ oder quantitativ angegeben, ohne Angabe der Kotkonsistenz oder anderer Faktoren

wie der Fütterung.

Die deutlichen Unterschiede der Eier innerhalb einer Parasitenordnung weisen zum Teil sehr große

Unterschiede in ihrer Oberflächenbeschaffenheit und Form auf. Besonders fällt dies am Beispiel der

Ascaridida auf, bei denen sich nur T. cati und T. canis ähneln. Die Oberfläche der Eier von T.

leonina ist glatt, die Eier von A. suum besonders rau und knotig, die Oberfläche von T. cati und T.

canis ist rau alveoliert. Die Dichte der Eier verschiedener Parasiten wurde von einigen Autoren

bestimmt. So stellte Sawitz (1942) mit Hilfe von Zinksulfatlösungen die Dichten von Eiern von

Enterobius vermicularis, Trichuris trichuria, T. vulpis, A. caninum und Ascaris lumbricoides fest

und David und Lindquist (1982) mit Hilfe von Zuckerlösung die Dichte von T. canis, T. leonina, A.

caninum, T. vulpis, Physaloptera sp., Taenia sp., T. cati (embryoniert), A. suum, Trichuris suis und

Parascaris equorum.

In den hier vorgenommenen Versuchen wurden ausschließlich unembryonierte, möglichst frisch

ausgeschiedene und gewonnene Eier genutzt. Die Eier wurden in Wasser bei 4° C aufbewahrt und

innerhalb weniger Tage verwendet. Trotzdem kann für den von Hunden gesammelten Kot nicht

ausgeschlossen werden, dass die Eier sich unter Umständen in unterschiedlichen Stadien der

Zellteilung befunden haben, da der Kot bis zu 24 h im Zwinger gelegen haben kann und sich die

Eier, insbesondere die der Strongyliden, bei günstigen Außentemperaturen schnell weiter

entwickeln. Sawitz (1942) zeigte für A. lumbricoides, dass die Dichte dieser Eier sich sowohl

innerhalb des Einzellstadiums als auch zwischen fruchtbaren und unfruchtbaren Eiern unterschied.

Sasaki (1926) untersuchte ebenfalls fruchtbare Eier von Ascaris und stellte fest, das weniger reife

Eier schwerer sind als reifere Eier. Überträgt man diese Erkenntnisse auch auf Eier anderer

- 76 -

DISKUSSION

Parasiten, kann dies ein Grund für das unterschiedliche Verhalten morphologisch gleicher oder

ähnlicher Eier in der Flotation sein. Bailenger (1979) zieht ein unterschiedliches Flotationsverhalten

verschiedener Eier infolge elektrostatischer Oberflächenunterschiede in Betracht. Sawitz et al.

(1939) stellten fest, dass Eier von Trichuris in unterschiedlichen Flotationsmedien gleichen spez.

Gewichtes unterschiedlich gut flotieren. Sie postulierten deshalb, dass die Dichte eines biologischen

Objektes bestimmt durch seinen Auftrieb in einer Flüssigkeit nicht in zwingender Weise identisch

mit seiner tatsächlichen Dichte sein muss. Sie führten die gefundenen Unterschiede auf

Interaktionen der Ionen des Flotationsmediums mit der Eioberfläche zurück. Diese These würde

auch begründen, warum David und Lindquist (1982) für die gleichen Parasiten, untersucht mit einer

anderen Flotationslösung, z.T andere Werte ermittelten als Sawitz (1942). Nicht zuletzt spielt in der

vorliegenden Arbeit der für diese spezielle statistische Auswertung noch immer geringe Umfang der

Probenzahlen (zwischen 105 und 155) pro Parasit eine Rolle in der Beurteilung von Unterschieden.

Hier wären weitere Untersuchungen mit den verwendeten Methoden sowohl zu den bereits

untersuchten als auch zu anderen Parasiten wünschenswert.

5.4 Sedimentationsmethode

Ab einem Eigehalt von 20 EpG können mit der hier untersuchten Sedimentationsmethode für

F. hepatica falsch negative Ergebnisse nahezu ausgeschlossen werden.

McCaughey und Hatch (1964), Nickel (1962), Döbel (1963), Six (1968) und Conceicao et al.

(2002) erreichten mit anderen Sedimentationsverfahren eine deutlich bessere Sensitivität (vgl.

Kapitel 2.2.3). Da die Methoden in ihrer Durchführung aber von der hier verwendeten Methode

differieren, ist kein direkter Vergleich möglich. So verwendeten die Autoren u.a. eine Probenmenge

von 10 g bzw. 30 g Kot, so dass die Eizahlen in der gesamten Probe über den hier untersuchten

Eizahlen der gesamten Probe lagen. Conceicao et al. (2002) zeigten, das die Sensitivität bei

geringen Eizahlen pro Gramm Kot mit Erhöhung der Probenmenge zu verbessern ist. Eine

Möglichkeit zur Verbesserung der Sensitivität der in vorliegender Arbeit verwendeten Methode

wäre daher, die Probenmenge von 5 g auf 10 g oder ggf. sogar auf 30 g zu erhöhen. Mit

zunehmendem Ausgangsmaterial steigt allerdings auch der Bestandteil an feinen Kottrümmern,

- 77 -

DISKUSSION

welche ebenfalls mitsedimentieren und das Auszählen sehr erschweren können. Häufigeres

Auffüllen des Sediments mit Wasser und erneutes Sedimentieren und Dekantieren kann den Anteil

an Kottrümmern reduzieren, bedeutet aber für den Untersuchenden gerade bei einer größeren

Probenzahl einen Mehraufwand. Eine weitere Möglichkeit zur Verbesserung der Werte wäre die

Verwendung von Glasgefäßen mit parallelen Wänden, welche nur am unteren Ende spitz

ausgezogen sind, anstelle von den hier verwendeten Spitztrichtern. Boray und Pearson (1960)

konnten zeigen, dass ein Großteil der Eier beim Sedimentationsvorgang an den schrägen Wänden

eines Spitztrichters haften blieben und nicht ins Sediment gelangten. Dieser Eiverlust lässt sich

ihren Untersuchungen nach durch die Verwendung eines Zylinders, der nur am Ende spitz

ausgezogen ist, minimieren. Wie auch durch andere Autoren wurden in vorliegenden

Untersuchungen Leberegeleier verwendet, die aus den Gallenblasen frisch geschlachteter Rinder

gewonnen wurden. Döbel (1963) gibt zu bedenken, dass die Trennung der Eier von der zähflüssigen

Galle mitunter schwierig ist und dass an den Eiern haftende Gallereste deren Eigenschaften und

Verhalten in einer Methode beeinflussen können, welches den Vergleich der gewonnenen

Ergebnisse mit denen aus natürlich infizierten Kotproben unmöglich macht. Die Effektivität der

Methode steigt mit zunehmender Eizahl pro Gramm Kot bis zu 20 EpG. Hier stagniert sie auf dem

Niveau, an dem die Sensitivität 100 % erreicht. Ob die Effektivität bei höheren Eizahlen pro

Gramm Kot dennoch weiter zu steigern ist, muss in weiteren Untersuchungen geklärt werden. Der

Variationskoeffizient zeigt für die untersuchten Konzentrationsstufen eine unstete, aber sinkende

Tendenz von 185 % auf 29 %. Wahrscheinlich werden bei noch höheren Eizahlen pro Gramm Kot

niedrigere Variationskoeffizienten erreicht. Döbel (1963) erreichte mit einer anderen

Sedimentationsmethode eine Effektivität von 98 %, die genaue ursprüngliche Eizahl in der Probe ist

aber nicht bekannt, da sie die Proben nur semiquantitativ nach hoher, mittlerer und geringer Eizahl

eingestuft hatte. Conceicao et al. (2002) erreichten mit ihrer Methode eine deutlich bessere

Effektivität bei einem niedrigeren Variationskoeffizient. Nickel (1962) stellte bei seinen

Untersuchungen mit einer Sedimentationsmethode fest, dass sich mit höherem Eigehalt die Funde

mehr und mehr den realen Werten nähern. Happich und Boray (1969) ermittelten mit einer

Sedimentationsmethode eine ähnliche Effektivität wie sie in vorliegender Arbeit festgestellt wurde.

Die Autoren verwendeten bei Schaffäzes Probenmengen von 3 g und bei Rinderfäzes von 6 g. Auch

in Hinblick auf die Effektivität wäre zu untersuchen, ob die Erhöhung der Probenmenge auf 10 g

oder mehr eine Verbesserung bringen würde. Auffällig ist, dass die Autoren, die mit größeren

- 78 -

DISKUSSION

Probenmengen arbeiteten, bessere Ergebnisse erzielten als die, welche kleinere Probenmengen

verwendeten wie Happich und Boray (1969) oder die vorliegender Arbeit. Des Weiteren könnte aus

dem Ersatz von Spitztrichtern durch Gefäße mit parallelen Wänden (s.o.) eine deutlich höhere

Effektivität resultieren.

5.5 Auswanderverfahren nach Baermann

Die gemischte Kotprobe erreichte eine 100 %ige Sensitivität bei niedrigeren Larvenzahlen pro

Gramm Kot als die ungemischte. Das Ergebnis weist auf eine ungleichmäßige Verteilung der

Larven in der Fäzesportion hin. Im Generellen kann ab 10 LpG mit einer 100 %igen Sensitivität

gerechnet werden, unabhängig davon, ob die zu beprobende Kotmenge vorher gemischt wurde oder

nicht. Andere Autoren untersuchten an wesentlich höheren Larvenzahlen pro Gramm Kot die

Effektivität der Methode. Zur Sensitivität im hier definierten Sinne liegen keine Untersuchungen

vor. Die Schwäche der hier vorliegenden Daten besteht darin, dass die in einer Probe vorhandene

Larvenzahl nur aus der Larvenzahl der ursprünglichen Kotprobe, ermittelt ebenfalls mit dem

Auswanderverfahren nach Baermann, unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors errechnet

werden konnte. Geht man davon aus, dass ein bestimmter Prozentsatz an Larven in der Methode

verloren geht, so bedeutet dies, dass die hier ermittelte Sensitivität zu hoch angesetzt ist und die

tatsächliche 100 %ige Sensitivität erst bei höheren Larvenzahlen pro Gramm Kot erreicht wird.

Nimmt man des Weiteren an, dass der Prozentsatz etwaig verlorener Larven einer gewissen Varianz

unterliegt, so bedeutet das für die vorliegenden Ergebnisse eine in Abhängigkeit von der Größe

dieser Varianz mehr oder weniger große Ungenauigkeit. Trotz dieser Ungenauigkeiten hat die

Feststellung Bestand, dass die Sensitivität der Methode durch gründliches Mischen der ganzen

Kotportion vor ihrer Untersuchung zunimmt. Die Effektivität der Methode steigt mit zunehmender

Larvenzahl pro Gramm Kot. Sie ist für die gemischte Probe deutlich niedriger als für die

ungemischte. Die Spannweite wird mit zunehmender Larvenzahl größer und ist für die ungemischte

Kotprobe deutlich größer als für die gemischte. Auch diese Daten deuten auf eine natürliche

ungleichmäßige Verteilung der Larven in einer Kotprobe hin, die durch gründliches Mischen

verbessert werden kann. Unterlässt man das Mischen und gewinnt aus einer Kotmenge nur eine

Probe, die zur Untersuchung gelangt, so erhält man unter Umständen ein falsch negatives Resultat

- 79 -

DISKUSSION

oder eines mit relativ zu wenig Larven oder aber eines, in dem die Larvenzahl falsch überhöht ist.

Auch im Variationskoeffizienten für die genannten Verdünnungsstufen zeigt sich der Effekt der

Mischung einer Kotmenge vor der Verarbeitung zu Proben. Er liegt bei der gemischten Probe

deutlich niedriger als bei der ungemischten Kotprobe. Andere Autoren wie Cort et al. (1922),

Parnell (1936) und Dinaburg (1942) (vgl. Kapitel 2.2.4) untersuchten ebenfalls die Effektivität der

Baermann-Methode, verwendeten aber die Larven anderer Parasiten und einen anderen

Versuchsaufbau, weshalb ein direkter Vergleich der Daten nicht möglich ist. Außerdem

untersuchten sie vor allem die Effektivität im Hinblick auf Modifikationen der Methode und setzten

die mit verschiedenen Modifikationen gefundene Larvenmenge gleicher Kotproben in Vergleich

und nicht, wie vorliegend, die Effektivität der Methode für verschiedene Larvenmengen pro Gramm

Kot. So konnte Dinaburg (1942) aus künstlich mit H. contortus infizierten Schafkotproben nur 11

% der Larven wiederfinden, obwohl er mit vergleichsweise hohen Dosen infiziert hatte (zwischen

600 und 95.400 Larven). Parnell (1936) erreichte mit künstlich infiziertem Kot ebenfalls

vergleichsweise schlechte Ergebnisse. Im Hinblick auf diese Untersuchungen sind die in

vorliegender Arbeit gewonnenen Daten, trotz eingeschränkter direkter Vergleichbarkeit, vorsichtig

zu bewerten.

5.6 Schlussfolgerungen

Die vorliegende Arbeit zeigt, dass durch die verwendete kombinierte Sedimentations-

Flotationsmethode positive Proben ab einem Eigehalt von 80 Eiern pro Gramm Kot eines der hier

verwendeten Parasiten zuverlässig detektiert werden, durch die McMaster-Methode ab 500 Eiern

pro Gramm Kot. Unterschiede in der Sensitivität der Methode zwischen einzelnen Parasiten

existieren nur unterhalb dieser Grenzen. Die Effektivität und damit quantifizierte Aussagen über

den Eigehalt einer Probe ist für die kombinierte Sedimentations-Flotationsmethode sehr gering, die

McMaster-Methode erreicht bei 1000 EpG eine Effektivität von 52 %, welche im Hinblick auf ihren

quantitativen Nutzen unzureichend ist. Mit der McMaster-Methode gewonnene Ergebnisse in

niedrigen Eizahlbereichen sind daher nicht als zuverlässig zu bewerten. Unterschiede zwischen den

Parasiten beeinflussen zusätzlich die Ergebnisse im Hinblick auf die Effektivität auch bei hohen

Eizahlen pro Gramm Kot. Für die Anwendung der Methoden bedeutet dies, dass die kombinierte

- 80 -

DISKUSSION

Sedimentations-Flotationsmethode für qualitative Untersuchungen, bei denen eine Eizahl von unter

500 EpG erwartet wird, sowohl in der Diagnostik als auch bei epidemiologischen Arbeiten die

Methode der Wahl ist. Für den diagnostischen Wert der Methode ist eine Erhöhung der Sensitivität

durch verschiedene Modifikationen (wie zusätzliche Zentrifugation der Kot-Wasser-Suspension,

Ausdrücken der Flüssigkeit aus der Kotmasse im Sieb oder Zuckerlösung als Flotationmittel , siehe

Kapitel 5.1.1) anzustreben und muss in weiteren Untersuchungen geprüft werden. Nach den

vorliegenden Ergebnissen zur Sensitivität der, vergleichsweise aufwändigen und genauen,

kombinierten Sedimentation-Flotation ist der diagnostische Wert z.T. in der Praxis gebräuchlicher

einfacher Tests wie der direkte Ausstrich einer Kotprobe, der Ovassay®- oder der Fecalyzer®-

Methode infolge ihrer noch geringeren Konzentrationkraft für Eier von Endoparasiten und kleineren

Probengröße als wesentlich geringer einzustufen. Zu ähnlichen Ergebnisse kamen auch Egwang und

Slocombe (1981). Für den Umgang mit quantitativen Erhebungen bei niedrigen Eizahlen pro

Gramm Kot, wie sie z.B. Wirksamkeits- oder Resistenzstudien erfordern, muss in Betracht gezogen

werden, die Methode durch Modifizierungen als im Vergleich zur McMaster-Methode sensitivere

quantitative Technik zu etablieren. Mes (2001) unternahm ein solche Etablierung für eine Salz-

Zucker-Flotationsmethode mit dem Hinweis auf die schwierige Überwachung von Tieren, welche

nur niedrige Eizahlen ausscheiden. Diese enthält ebenfalls mehrere Schritte zur Konzentration der

Eier und ihre Ergebnisse sind quantifiziert. Gutierres et al. (1979) stellten in ihren Untersuchungen

fest, dass Kühe, welche mit 200.000 infektiösen Larven infiziert wurden, nur eine sehr geringe

Eiausscheidung entwickelten. In anschließenden Sektionen beherbergten aber 83,3 % der infizierten

Tiere adulte Würmer. Da subklinische Parasitosen mit nur geringer Eiausscheidung bei einem

Großteil der Tiere, z.B. nach Anthelminthikagaben oder bei adulten Tieren mit gutem Immunstatus,

auftreten, muss in diesen Fällen eine Methode zur sicheren quantitativen und qualitativen Detektion

von niedrigen Eizahlen (im Vergleich zu McMaster unter 1000 EpG) etabliert und genutzt werden.

Die Sensitivität des Sedimentationsverfahrens für Eier von F. hepatica ist in der qualitativen

Diagnostik gut, in quantitativen Erhebungen als mäßig zu beurteilen. Wie weit sich die Methode mit

Maßnahmen wie in Kapitel 5.3.1 beschrieben besonders hinsichtlich ihrer Effektivität aber auch

hinsichtlich ihrer Sensitivität verbessern lässt, bleibt Gegenstand weitergehender Untersuchungen.

Das Auswanderverfahren nach Baermann bietet dem Untersucher eine gute Sensitivität, die sich

durch gutes Mischen der Ausgangskotmenge vor ihrer Beprobung noch verbessern lässt. Die

Effektivität ist besonders bei vorher nicht gemischten Kotproben sehr großen Schwankungen

- 81 -

DISKUSSION

unterworfen, die sowohl in falsch zu geringe als auch falsch stark überhöhte Larvenzahl pro Gramm

Kot resultieren können. Auch in dieser Hinsicht können die Ergebnisse durch gutes Mischen der

Ausgangsprobe deutlich verbessert werden. Die hier vorliegenden Ergebnisse lassen den Schluss

zu, dass die Larven in einer Kotportion sehr ungleichmäßig verteilt sind und ein gründliches

vorheriges Mischen der Ausgangsprobe unumgänglich ist, besonders in der qualitativen Diagnostik.

Dies wiederum erfordert in praxi die Entnahme einer genügend großen Kotmenge.

Im Allgemeinen können zu der Validierung von koproskopischen Methoden folgende Aussagen

getroffen werden: Eier endogener Parasiten verhalten sich innerhalb derselben Methode zu ihrem

Nachweis unter Umständen sehr unterschiedlich. Ergebnisse, die bei der Untersuchung eines

Parasiten gewonnen wurden, können nicht ohne weiteres und ohne detaillierte Quantifizierung auf

andere, auch nicht auf andere Parasiten der gleichen Ordnung, übertragen werden. Die Validierung

einer Methode kann also nicht an nur einem Parasiten erfolgen, wenn mit der Methode auch andere

untersucht werden sollen, da die Sensitivitätsgrenzen für niedrige Eizahlen pro Gramm Kot und die

Effektivität zwischen den Parasiten teilweise stark variieren. Faktoren wie Reifezustand der Eier,

Konsistenz und Textur der Kotprobe und unterschiedliche Flotationsmedien trotz gleichen spez.

Gewichtes haben unter Umständen Einfluss auf ein Ergebnis und sollten daher in den

Untersuchungen so homogen und ähnlich wie möglich sein.

- 82 -

ZUSAMMENFASSUNG

6 ZUSAMMENFASSUNG

Amelie Kraemer (2005)

Validierung ausgewählter koproskopischer Untersuchungsmethoden zum direkten Nachweis

parasitärer Stadien verschiedener Parasitenspezies der Haussäugetiere

Mit zunehmenden Anforderungen an parasitologische Labors durch Qualitätssicherungs- und

-managementsysteme ist die Validierung der dort verwendeten Methoden unabdingbar.

Ziel dieser Arbeit war es, mit der Gewinnung relevanter Daten einen Beitrag zur Validierung der in

der veterinärparasitologischen Diagnostik gebräuchlichen koproskopischen Methoden unter den

hier beschriebenen Bedingungen zum Nachweis parasitärer Stadien hinsichtlich ihrer Sensitivität,

Effektivität und des Variationskoeffizienten zu leisten. Die Validierung wurde für die kombinierte

Sedimentations-Flotations – und die McMaster-Methode anhand von Eiern von Ancylostoma

caninum, Uncinaria stenocephala, Cooperia oncophora, Anoplocephala perfoliata, Ascaris suum,

Toxascaris leonina, Toxocara canis, Toxocara cati, Trichuris vulpis, Moniezia expansa und

verschiedener Cyathostominae durchgeführt. Die Sedimentation und das Auswanderverfahren nach

Baermann wurden als spezielle Nachweisverfahren für Fasciola hepatica bzw. Dictyocaulus

viviparus mit Eiern bzw. Larven dieser Parasiten validiert.

Mit der hier beschriebenen kombinierten Sedimentations-Flotationsmethode unter der Verwendung

von ZnSO4-Lösung konnten die hier untersuchten Parasiten ab einer Eizahl von 80 Eiern pro

Gramm Kot sicher (Sensitivität 100 %) detektiert werden. In niedrigeren Eizahlen unterliegt die

Sensitivität der Methode zum Teil großen Schwankungen. Die Effektivität der Methode stieg mit

zunehmender Eizahl. Bei 80 Eiern pro Gramm Kot wurden 1,5 % der Eier wiedergefunden, die

Effektivität unterlag in allen Konzentrationsstufen starken Schwankungen. Da diese Methode aber

vorrangig zur qualitativen und semiquantitativen Diagnostik angewandt wird, ist diese

vergleichsweise geringe Effektivität von untergeordneter Bedeutung. Mit der McMaster-Methode

konnten von den hier untersuchten Parasiten ab einer Eizahl von 500 Eiern pro Gramm Kot keine

falsch negativen Proben mehr gefunden werden. Die Varianz in der Sensitivität der Methode nahm

mit zunehmender Eizahl pro Gramm Kot ab. Die Effektivität der Methode betrug im Mittel 49 %

und unterlag relativ hohen Schwankungen. Die Untersuchung der Unterschiede sowohl zwischen

- 83 -

ZUSAMMENFASSUNG

den Parasiten als auch zwischen den Parasitenordnungen ergab zum Teil sehr schwer zu

interpretierende Ergebnisse, so dass davon ausgegangen werden kann, dass verschiedene

Einflussfaktoren wie unterschiedliche Oberflächenbeschaffenheit, Dichte, Reifezustände,

elektrostatische Oberfläche der Eier und unterschiedliche Interaktion des Flotationsmediums mit

den Eiern sowie die für statistische Auswertungen immer noch geringe Probenzahl eine größere

Rolle spielen als bisher angenommen. Es konnte jedoch für die Sensitivität der untersuchten

Methoden gezeigt werden, dass sich die Parasiten nur im unteren Grenzbereich der Sensitivität

unterscheiden. Ab einer bestimmten Eizahl pro Gramm Kot ist die Sensitivität für alle Parasiten

immer 100 %. Mit der einfachen Sedimentationsmethode nach Benedek konnten Eier von F.

hepatica ab 20 Epg sicher nachgewiesen werden. Die Effektivität unterlag starken Schwankungen,

die maximale Wiederfindungsrate betrug 20 %. Mit dem Auswanderverfahren nach Baermann

wurde für D. viviparus ab einer Larvenzahl von 6,3 pro Gramm Kot aus einer vorher gründlich

vermengten Kotprobe eine 100 %ige Sensitivität ermittelt. Der höchste Prozentsatz an Larven

wurde in der ungerührten Kotprobe gefunden, er unterlag aber großen Schwankungen und war zum

Teil falsch überhöht, was auf die ungleichmäßige Verteilung der Larven in der Probe schließen

lässt.

Die Ergebnisse zeigen, dass von den hier untersuchten Methoden die beschriebene kombinierte

Sedimentations-Flotationsmethode für die qualitative Diagnostik der hier untersuchten Parasiten die

Methode der Wahl ist und für die Untersuchung niedriger Eizahlen in epidemiologischen Studien

quantifiziert werden sollte. Ob die Methode weiter verbessert werden kann und wie sich andere als

die hier untersuchten Parasiten in der Methode verhalten, sollte in weiteren Untersuchungen

ermittelt werden. Zur Bestimmung der in einer Probe enthaltenen Eizahl pro Gramm Kot eignet sich

die McMaster-Methode nicht für Eizahlbereiche bis 1000 EpG, da hier die Effektivität der Methode

für eine zuverlässige quantitative Bestimmung. nicht ausreichend ist. Ab welcher Eizahl pro Gramm

Kot sich die Ergebnisse den realen Werten annähern, sollte Gegenstand weiterer Untersuchungen

sein. Zur Verbesserung und Standardisierung der Effektivität der McMaster-Methode wurden von

verschiedenen Autoren Vorschläge gemacht. Sowohl die Sedimentationsmethode als auch das

Auswanderverfahren nach Baermann sind wie hier beschrieben für die mit diesen Methoden

untersuchten Parasiten von guter Sensitivität und daher Methoden der Wahl zur qualitativen

Diagnostik.

- 84 -

SUMMARY

7 SUMMARY

Amelie Kraemer (2005)

Investigations in the validation of selected coproscopic methods for the direct detection of

parasitic stages using different parasite species of domestic mammals.

Increasing demand on quality assurance and management systems in parasitological laboratories

makes new and standardised validation of the methods used in those laboratories necessary.

The goal of this project is to yield relevant data to contribute toward the validation of coproscopic

methods used in veterinary-parasitological diagnostics for detecting parasitic stages according to

their sensitivity, efficiency and variability. The validation of the combined Sedimentation-Flotation-

method using zinc sulfate as flotation medium and the modified McMaster-method was performed

by using eggs of A. caninum, U. stenocephala, C. oncophora, Cyathostominae, A. suum, T. leonina,

T. canis, T. cati, T. vulpis, M. expansa and A. perfoliata. For the validation of the sedimentation

method and the Baermann larval migration method eggs and larvae respectively of F. hepatica and

D. viviparus were used as those methods are the special analytical procedures for them.

With an egg count of 80 epg feces all parasites could be reproducibly detected, using the combined

sedimentation-flotation method. The method sensitivity lacks measurably in variances when

performed with lower numbers of eggs. The method efficiency improves with increasing egg

numbers. The efficiency showed significant deviation at all concentration levels, e.g. at 80 epg,

1.5 % of eggs were retrieved. Since this method is used primarily for qualitative and semi-

quantitative detection this comparatively low efficiency is of less importance. Using the McMaster-

method no false-negative samples were detected, in egg counts of 500 epg. The variance in

sensitivity of the method decreases with increasing egg count per gram feces. The method

efficiency resulted in a mean of 49 % and showed relatively large variances. It can be assumed from

the literature, that the method efficiency can be markedly improved with larger egg counts, such as

1000 epg, leading to a decrease in variance. Differences among parasites as well as parasitic groups

led to results that were in hard to interpret. Various complicating factors could have contributed to

this situation, such as variations in the characteristics of the eggs – surface conditions (e.g.

electrostatic charge), density, maturity, interaction with flotation media – as well as the small

- 85 -

SUMMARY

sample sizes of some subpopulations. Differences in the sensitivity of the different methods exist

between species at lower dilution levels near the detection limit. All parasites showed a 100 %

sensitivity at certain concentrations of epgs used in this investigation. Employing the sedimentation

method, eggs of F. hepatica, starting at 20 epg, could be reproducibly found. The efficiency was

highly variable, and the maximum re-collection rate increased to 19,7 %. According to the

Baermann migration method detecting D. viviparous, a 100 % detection rate was observed

beginning with 6,3 larvae per gram feces in a thoroughly mixed-feces sample. The examination of

unmixed fecal samples resulted in lower sensitivity, though sample sizes have been too low for

statistically proven statements (n=120). The highest larval count was found in the unmixed fecal

sample but showed large variation and (partly high inhomogeneous) readings, suggesting an uneven

distribution of larvae in the sample. The results show that the combined sedimentation-flotation

method is the method of choice for the qualitative diagnosis of the parasites investigated and also

should be used as a quantified modification for low concentration egg counts in epidemiological

studies. Whether or not this method can be improved and what properties other parasites may show

is substance for further study. The McMaster-method shows little validity for egg counts below

1000 epg due to the method´s low efficiency for a reliably quantitative determination in this range.

A number of authors have made suggestions for improving and standardizing the efficiency of the

McMaster-method. Both, sedimentation and Baermann migration are methods of choice with

sufficient sensitivity in qualitative diagnostics for the detection of trematode stages and nematode

larvae, respectively.

- 86 -

ANHANG

8 ANHANG

8.1 Sensitivität der kombinierten Sedimentations-Flotationsmethode für

einzelne Parasiten Art Eizahl /g Kot Probenzahl Anzahl positiver Proben

absolut prozentual

A. caninum 1 25 0 0

5 15 1 6,7

10 25 11 44

20 25 21 84

40 25 23 92

60 25 24 96

80 15 15 100

U. stenocephala 1 15 0 0

5 15 1 6,66

10 15 4 26,66

20 15 5 33,33

40 15 9 60

60 15 13 86,66

80 15 15 100

T. canis 1 15 0 0

5 15 4 26,7

10 25 3 12

20 25 16 64

40 15 10 66,7

60 15 14 93,3

80 15 15 100

T. vulpis 1 15 0 0

5 15 4 26,76

10 15 4 26,76

20 15 5 33,33

40 15 12 80

60 15 15 100

- 87 -

ANHANG

80 15 15 100

T. leonina 1 15 0 0

5 15 2 13,33

10 15 2 13,33

20 15 3 20

40 15 8 53,33

60 15 14 93,33

80 15 15 100

T. cati 1 15 0 0

5 15 4 26,67

10 15 5 33,33

20 15 11 73,33

40 15 10 66,6

60 15 14 93,3

80 15 15 100

A. suum 1 15 0 0

5 15 0 0

10 15 6 40

20 15 9 60

40 15 10 66,6

60 15 13 86,66

80 15 15 100

Cyathostominae 1 15 1 6,66

5 15 7 46,66

10 15 13 86,66

20 15 13 86,66

40 15 15 100

60 15 15 100

80 15 15 100

A. perfoliata 1 15 0 0

5 15 4 26,66

10 15 8 35,33

20 15 9 60

40 15 12 80

60 15 13 86,66

- 88 -

ANHANG

80 15 15 100

C. oncophora 1 15 0 0

5 15 1 6,66

10 15 8 35,33

20 15 12 80

40 15 14 93,3

60 15 15 100

80 15 15 100

M. expansa 1 15 0 0

5 15 2 13,33

10 15 7 46,66

20 15 9 60

40 15 14 93,3

60 15 14 93,3

80 15 15 100

8.2 Effektivität der kombinierten Sedimentations-Flotationsmethode für

einzelne Parasiten

Art Eizahl / Probe Probenzahl Mean SD ∅ gef. Eier in % Vk % Range

A. caninum 5 25 0 0 0 0

25 15 0,067 0,26 0,27 387 1

50 25 0,64 0,81 1,28 126 3

100 25 1,36 1,11 1,36 82 5

200 25 1,48 0,91 0,74 62 3

300 25 2,61 1,4 0,87 65 5

400 15 6,06 4,54 1,5 75 18

U. stenocephala 5 15 0 0 0 0

25 15 0,06 0,3 0,24 387 1

50 15 0,26 0,5 0,52 171 1

100 15 0,33 0,5 0,33 146 1

200 15 0,86 0,8 0,43 96 2

300 15 2,26 1,9 0,75 86 8

400 15 3,13 1,5 0,78 48 5

- 89 -

ANHANG

T. canis 5 15 0 0 0 0

25 15 0,33 0,62 1,32 185 1

50 25 0,16 0,58 0,32 288 2

100 25 0,84 0,69 0,84 82 2

200 15 1,66 1,83 0,83 110 6

300 15 3,13 2,3 1,04 73 8

400 15 4,66 3,5 1,17 75 13

T. vulpis 5 15 0 0 0 0

25 15 0,26 0,46 1,04 172 1

50 15 0,4 0,8 0,8 207 3

100 15 0,6 1,0 0,6 164 3

200 15 1,6 1,4 0,8 88 5

300 15 3,4 1,9 1,13 55 6

400 15 2,5 1,4 0,62 56 4

T. leonina 5 15 0 0 0 0

25 15 0,13 0,4 052 263 1

50 15 0,2 0,6 0,4 280 2

100 15 0,26 0,6 0,26 222 2

200 15 0,6 0,6 0,2 105 2

300 15 2,9 2,3 0,96 77 9

400 15 2,86 2,1 0,71 70 5

T. cati 5 15 0 0 0 0

25 15 0,33 0,6 1,32 185 2

50 15 0,4 0,63 0,8 158 2

100 15 1,66 1,8 1,66 107 6

200 15 1,8 1,6 0,9 90 5

300 15 3,66 2,3 1,22 62 9

400 15 6,33 3,6 1,58 59 15

A. suum 5 15 0 0 0 0

25 15 0 0 0 0

50 15 0,53 0,7 1,06 139 2

100 15 0,6 0,6 0,6 93 2

200 15 1,66 1,6 0,83 98 5

300 15 3,2 2,6 1,06 81 8

- 90 -

ANHANG

400 15 5,13 2,1 1,28 42 7

Cyathostominae 5 15 0,06 0,3 1,2 387 1

25 15 0,53 0,6 2,12 120 2

50 15 1,73 1,3 3,46 77 4

100 15 2,0 1,5 2,0 73 5

200 15 8,26 4,9 4,13 59 18

300 15 6,66 3,2 2,22 48 10

400 15 14,06 5,0 3,51 36 18

A. perfoliata 5 15 0 0 0 0

25 15 0,4 0,7 1,6 184 2

50 15 0,66 0,7 1,32 108 2

100 15 0,8 0,9 0,8 107 3

200 15 1,8 1,5 0,9 82 5

300 15 2,73 2,0 0,91 74 6

400 15 4 2,0 1 52 6

C. oncophora 5 15 0 0 0 0

25 15 0,13 0,5 0,52 387 2

50 15 0,8 0,9 1,6 117 3

100 15 1,73 1,5 1,73 86 5

200 15 5,4 4,0 2,7 74 17

300 15 8,26 5,9 2,75 71 17

400 15 12,13 6,7 3,0 55 22

M. expansa 5 15 0 0 0 0

25 15 0,13 0,4 0,52 264 1

50 15 0,8 0,9 1,6 117 2

100 15 0,87 1,0 0,87 122 4

200 15 2,86 1,3 1,43 49 5

300 15 4,13 2,2 1,37 54 8

400 15 5,6 2,7 1,4 48 10

- 91 -

ANHANG

8.3 Sensitivität der McMaster-Methode für einzelne Parasiten

Art Eizahl/ g Kot Probenzahl Anzahl positiver Proben

absolut prozentual

A. caninum 1 15 0 0

30 15 6 40

50 15 9 60

80 15 9 60

100 15 8 53,33

500 15 15 100

1000 15 15 100

U. stenocephala 1 15 0 0

30 15 7 46,66

50 15 8 53,33

80 15 7 46,66

100 15 14 93,33

500 15 15 100

1000 15 15 100

T. canis 1 15 0 0

30 15 0 0

50 15 4 26,66

80 15 8 53,33

100 15 8 53,33

500 15 15 100

1000 15 15 100

T. vulpis 1 15 0 0

ZnSO4 30 15 5 26,67

50 15 10 66,7

80 15 8 53,33

100 15 12 80

500 15 15 100

1000 15 15 100

T. leonina 1 15 0 0

30 15 6 40

50 15 7 46,66

- 92 -

ANHANG

80 15 11 73,33

100 15 12 80

500 15 15 100

1000 15 15 100

T. cati 1 15 0 0

30 15 6 40

50 15 10 66,66

80 15 14 93,33

100 15 14 93,33

500 15 15 100

1000 15 15 100

A. suum 1 15 0 0

30 15 5 26,67

50 15 8 53,33

80 15 8 53,33

100 15 8 53,33

500 15 15 100

1000 15 15 100

Cyathostominae 1 15 0 0

30 15 2 13,33

50 15 9 60

80 15 9 60

100 15 12 80

500 15 15 100

1000 15 15 100

A. perfoliata 1 15 0 0

30 15 2 13,33

50 15 4 26,66

80 15 9 60

100 15 12 80

500 15 15 100

C. oncophora 1 15 0 0

30 15 6 40

50 15 7 46,66

80 15 9 60

- 93 -

ANHANG

100 15 11 73,33

500 15 15 100

1000 15 15 100

M. expansa 1 15 0 0

30 15 3 12

50 15 5 33,33

80 15 7 46,66

100 15 9 60

500 15 15 100

1000 15 15 100

8.4 Effektivität der McMaster-Methode für einzelne Parasiten

Art Eizahl / g Kot Probenzahl Mean SD

∅

gef. Eier in % Vk % Range

A. caninum 1 15 0 0 0 0 0

30 15 17,8 27,8 59,2 156 100

50 15 28,9 27,7 57,7 96 66,6

80 15 31 32 38,9 103 100

100 15 57,8 82,1 39,9 142 133,3

500 15 226,6 72,6 45,3 32 266,7

1000 15 437,7 106,8 43,8 24 866,7

U. stenocephala 1 15 0 0 0 0 0

30 15 22,2 27,1 74 122 66,6

50 15 22,2 24,1 44,4 109 66,6

80 15 26,6 31,3 33,3 118 66,6

100 15 37,7 36,6 37,7 63 133,3

500 15 379,9 128,3 75,9 34 500

1000 15 406,6 140,9 40,7 35 433,3

T. canis 1 15 0 0 0 0 0

30 15 0 0 0 0 0

50 15 8,9 15,2 17,8 172 33,3

80 15 22,2 24,1 27,7 109 66,6

100 15 35,5 42,6 35,35 120 133,3

- 94 -

ANHANG

500 15 184,4 69,9 36,9 38 200

1000 15 331,0 154,5 33,1 47 500

T. vulpis 1 15 0 0 0 0 0

mit ZnSO4 30 15 8,8 15,2 37 171 66,6

50 15 31 29,4 62,2 95 100

80 15 28,8 37,4 36 130 133,3

100 15 82,2 60,2 79,9 73 233,3

500 15 245,1 94,5 43,3 39 233,4

1000 15 766,6 209,3 76,7 27 700

T. leonina 1 15 0 0 0 0 0

30 15 22,2 32,5 74 146 100

50 15 24,4 29,4 48,8 121 66,6

80 15 39,9 33,7 52,7 85 133,3

100 15 59,6 43,9 59,9 73 133,3

500 15 246,5 85,2 49,3 35 266,6

1000 15 906,6 161,4 90,7 18 566,7

T. cati 1 15 0 0 0 0 0

30 15 17,7 24,7 59,2 139 66,6

50 15 31 26,6 62,2 86 66,6

80 15 133,3 71,2 166,2 53 233,3

100 15 133,3 67,8 137,7 51 266,6

500 15 379,9 117,3 75,9 31 400

1000 15 602,1 207,1 60,9 34 833,3

A. suum 1 15 0 0 0 0 0

30 15 13,3 21 44,4 158 66,6

50 15 24,4 26,6 48,8 109 66,6

80 15 39,9 55,1 41,6 138 100

100 15 22,2 27,2 22,2 122 100

500 15 191 84,9 38,2 44 266,7

1000 15 355,5 108,8 34,4 31 333,3

Cyathostominae 1 15 0 0 0 0 0

30 15 6,6 18,6 22,2 280 66,6

50 15 22,2 20,5 44,4 93 66,6

80 15 48,8 46,9 61 96 133,3

100 15 37,7 24,7 37,7 65 66,6

- 95 -

ANHANG

500 15 215,5 78,5 43,1 36 233,3

1000 15 511 217,7 51,1 43 900

A. perfoliata 1 15 0 0 0 0 0

30 15 6,6 18,6 22,2 280 66,6

50 15 13,3 24,4 26,6 184 66,6

80 15 24,4 23,4 30,5 96 66,6

100 15 39,9 25,7 39,9 65 66,6

500 15 148,8 46,9 14,9 32 133,3

C. oncophora 1 15 0 0 0 0 0

30 15 17,7 24,7 59,2 139 66,6

50 15 19,9 24,5 39,9 123 66,6

80 15 48,8 45,1 61 92 100

100 15 48,8 41,5 48,9 85 133,3

500 15 288,8 115,9 57,8 40 366,7

1000 15 531,0 230,4 53,1 43 766,7

M. expansa 1 15 0 0 0 0 0

30 15 13,3 27,5 44,4 207 66,6

50 15 17,7 27,7 35,5 156 66,6

80 15 26,6 33,7 33,3 127 100

100 15 39,7 42,1 35,7 105 133,3

500 15 182,1 90,7 29,7 50 333,4

1000 15 397,7 101 39,8 25 366,7

- 96 -

LITERATURVERZEICHNIS

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- 120 -

TABELLEN- UND ABBILDUNGSVERZEICHNIS

10 TABELLEN- UND ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Kapitel

3.1.1 Tabelle 1: Übersicht über die Zugehörigkeit der untersuchten Parasiten

zu Klassen, Ordnungen und Familien (modifizierter Auszug aus Eckert.

Friedhoff, Zahner, Deplazes 2005)

4.1.1.1 Abbildung 1: Sensitivität der kombinierten Sedimentations-

Flotationsmethode für A. caninum, U. stenocephala, Cyathostominae und

C. oncophora in verschiedenen Eikonzentrationen/g Kot

Abbildung 2: Sensitivität der kombinierten Sedimentations-

Flotationsmethode für T. cati, T. canis, T. leonina und A. suum in

verschiedenen Eikonzentrationen/g Kot


Flotationsmethode für M. expansa und A. perfoliata in verschiedenen



Flotationsmethode für T. vulpis in verschiedenen Eikonzentrationen/g

Kot

4.1.1.1 Tabelle 2: Signifikante Unterschiede in der Sensitivität zwischen den

Parasiten aus zusammengefassten Konzentrationsstufen (5, 10, 20, 40,

60 Eier/g Kot) in der kombinierten Sedimentatios-Flotationsmethode

4.1.1.2 Abbildung 5: Sensitivität der kombinierten Sedimentations-

Flotationsmethode für verschiedenen Parasiten mit arithmetischem


- 121 -


4.1.1.3 Abbildung 6: Durchschnittliche Sensitivität der kombinierten

Sedimentations- Flotationsmethode für alle, in Konzentrationsstufen

zusammengefasste, Parasiten und deren Spannweite

Tabelle 3: Standardabweichungen (SD) und Variationskoeffizienten

(Vk) der einzelnen Konzentrationsstufen für die durchschnittliche

Sensitivität der kombinierten Sedimentations-Flotationsmethode

4.1.2.1 Abbildung 7: Effektivität der kombinierten Sedimentations-

Flotationsmethode für A. caninum, U. stenocephala, Cyathostominae und C.

oncophora in verschiedenen Eikonzentrationen/g Kot

Abbildung 8: Effektivität der kombinierten Sedimentations-

Flotationsmethode für T. cati. T. canis, T. leonina und A. suum in



Flotationsmethode für M. expansa und A. perfoliata in verschiedenen



Flotationsmethode für T.vulpis in verschiedenen Eikonzentrationen/g

Kot

4.1.2.2 Abbildung 11: Effektivität der kombinierten Sedimentations-

Flotationsmethode für verschiedene Parasiten mit arithmetischem


- 122 -


4.1.2.3 Abbildung 12: Durchschnittliche Effektivität der kombinierten

Sedimentations- Flotationsmethode für alle, in Konzentrationsstufen

zusammengefasste, Parasiten und deren Spannweite

4.1.2.3 Tabelle 4: Standardabweichungen (SD) und Variationskoeffizienten


Effektivität der kombinierten Sedimentation-Flotation

4.2.1.1 Abbildung 13: Sensitivität der McMaster-Methode für A. caninum, U.

stenocephala, Cyathostominae und C. oncophora in verschiedenen


Abbildung 14: Sensitivität der McMaster-Methode für T. cati, T.

canis, T. leonina und A. suum in verschiedenen Eikonzentrationen/g

Kot

Abbildung 15: Sensitivität der McMaster-Methode für M. expansa und

A. perfoliatain verschiedenen Eikonzentrationen/g Kot

Abbildung 16: Sensitivität der McMaster-Methode für T. vulpis in


4.2.1.1 Tabelle 4: Signifikante Unterschiede in der Sensitivität zwischen den

Parasiten aus zusammengefassten Konzentrationsstufen (30, 50, 80,100,

500 EpG) in der McMaster-Methode

4.2.1.2 Abbildung 17: Sensitivität der McMaster-Methode für verschiedene

Parasiten mit arithmetischem Mittel der Parasitenordnungen

- 123 -


4.2.1.3 Abbildung 18: Durchschnittliche Sensitivität der McMaster-Methode

für alle, in Konzentrationsstufen zusammengefasste, Parasiten und

deren Spannweite



Sensitivität der McMaster-Methode

4.2.2.1 Abbildung 19: Effektivität der McMaster-Methode für A. caninum, U.

stenocephala, Cyathostominae und C. oncophora in verschiedenen


Abbildung 20: Effektivität der McMaster-Methode für T. cati, T. canis,

T. leonina und A. suum in verschiedenen Eikonzentrationen/g Kot

Abbildung 21: Effektivität der McMaster-Methode für M. expansa und

A. perfoliata in verschiedenen Eikonzentrationen/g Kot

Abbildung 22: Effektivität der McMaster-Methode für T. vulpis in


4.2.2.2 Abbildung 23: Effektivität der McMaster-Methode für verschiedene

Parasiten mit arithmetischem Mittel der Parasitenordnungen

4.2.2.3 Abbildung 24: Durchschnittliche Effektivität der McMaster-Methode

für alle, in Konzentrationsstufen zusammengefasste Parasiten und deren

Spannweite



Effektivität der McMaster-Methode

- 124 -


4.3.1 Abbildung 25: Sensitivität der Sedimentationsmethode für F. hepatica

4.3.2 Abbildung 26: Effektivität der Sedimentationsmethode für F. hepatica

Tabelle 7: Standardabweichungen (SD) und Variationskoeffizienten

(Vk) der einzelnen Konzentrationsstufen für die Effektivität der

Sedimentationsmethode für F. hepatica

4.4.1 Abbildung 27: Sensitivität des Auswanderverfahrens nach Baermann

für D. viviparus in einer ungerührten Kotprobe

4.4.1 Abbildung 28: Sensitivität des Auswanderverfahrens nach Baermann

für D. viviparus in einer 3 Minuten gerührten Kotprobe

4.4.2 Abbildung 29: Effektivität des Auswanderverfahrens nach Baermann

für D. viviparus aus einer ungerührten Kotprobe

4.4.2 Tabelle 8: Standardabweichungen (SD) und Variationskoeffizienten

(Vk) der einzelnen Konzentrationsstufen für die Effektivität des

Auswanderverfahrens nach Baermann für D. viviparus aus einer

ungerührten Kotprobe

4.4.2 Abbildung 30: Effektivität des Auswanderverfahrens nach Baermann

für D. viviparus aus einer 3 Minuten gerührten Kotprobe

4.4.2 Tabelle 9: Standardabweichungen (SD) und Variationskoeffizienten

(Vk) der einzelnen Konzentrationsstufen für die Effektivität des

Auswanderverfahrens nach Baermann für D. viviparus aus einer 3

Minuten gerührten Kotprobe

- 125 -

ERKLÄRUNG

Danksagung

Herrn Professor Dr. Thomas Schnieder danke ich herzlich für die Überlassung des Themas und die

Bereitstellung eines Arbeitsplatzes sowie die unkomplizierte und zügige Mitarbeit bei der

Fertigstellung dieser Arbeit.

Herrn Dr. Christian Epe danke ich sehr für die jeder Zeit gewährte Gesprächsbereitschaft und

motivierende Unterstützung in immer humorvoller Art und Weise.

Allen Mitarbeitern und Doktoranden des Institutes möchte ich herzlich für ihre ausgesprochene

Hilfsbereitschaft und die freundliche Aufnahme danken. Im Labor bewiesen Petra Thomas und

Anne Ohrdorf besonders gute Nerven und waren mir durch ihre immer gewährten Unterstützung

eine große Hilfe. Marion Czapp danke ich besonders für die kritische Durchsicht dieser Arbeit sehr.

Frau Jessica Wisniewski möchte ich für ihre unkomplizierte, freundschaftliche Unterstützung bei

den Berechnungen zur Statistik danken.

Meinem Bruder Friedrich – Wilhelm Reese danke ich sehr für die immer schnelle und wirksame

Hilfe bei allen Kämpfen mit dem Computer.

Inniger Dank gilt meiner Mutter, meiner Großmutter, meiner Tante Hilla Wirtz und meinem Onkel

Heinrich Schoeller, die immer regen Anteil an meinem Leben und meiner beruflichen Zukunft

genommen haben und ohne deren Rückhalt und Unterstützung mir das Studium und die Promotion

nur unter sehr schweren Bedingungen möglich gewesen wäre.

Ganz besonders möchte ich meinem Mann Dr. Christian Kraemer danken, der mich während der

gesamten Zeit immer liebevoll unterstützte und mir durch angeregte Diskussionen das

zielorientierte Arbeiten und Schreiben sehr erleichtert hat.

- 126 -

ERKLÄRUNG

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel „Validierung ausgewählter

koproskopischer Untersuchungsmethoden zum direkten Nachweis parasitärer Stadien verschiedener

Parasitenspezies der Haussäugetiere“ selbstständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden

folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:

- Materialien und Geräte wurden vom Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule

Hannover bereitgestellt.

- Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe von Herrn Dr. Beyerbach, Institut für

Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Tierärztlichen Hochschule

Hannover

Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater

oder andere Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar

entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der

vorgelegten Dissertation stehen.

Ich habe die Dissertation an folgender Institution angefertigt:

Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen

Zweck zur Beurteilung eingereicht.

Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der

Wahrheit entsprechend gemacht habe.

_____________________________

(Amelie Kraemer)

Wedemark, 22.07.2005

- 127 -

validierung ausgewählter koproskopischer

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