validation of lc-ms/ms method for determination of
TRANSCRIPT
โ 19 โ
ANALYTICAL SCIENCE
& TECHNOLOGY
Vol. 25, No. 1, 19-24, 2012
Printed in the Republic of Korea
http://dx.doi.org/10.5806/AST.2012.25.1.019
์ธ์ฒด ํ์ฅ ๋ฐ ์๋ณ ์ค ์๋ฅดํํ๋ด์ ์ ๋์ ์ํ
LC-MS/MS ๋ถ์๋ฒ ๊ฒ์ฆ
๊น์ค์ 1ยทํ์กํฌ1ยท์ ์ง์1ยทํฉ๋ฏผํธ1ยท์์ฉ์ง1ยท์ฑ์์1,2ยท๊น๋ฏผ๊ฑธ1,2, โ
1์ ๋ถ๋ํ๊ต๋ณ์ ์์์ํ์ผํฐ,
2์ ๋ถ๋ํ๊ต ์ํ์ ๋ฌธ๋ํ์ ์ฝ๋ฆฌํ๊ต์ค
(2011. 11. 9. ์ ์, 2011. 12. 19. ์์ , 2011. 12. 27. ์น์ธ)
Validation of LC-MS/MS method for determination of ertapenem in human plasma and urine
Yun-Jeong Kim1, Song-Hee Han1, Ji-Young Jeon1, Min-Ho Hwang1, Yong-Jin Im1,
Soo-Wan Chae1,2 and Min-Gul Kim1,2, โ
1Clinical Trial Center, Chonbuk National University Hospital2Department of Pharmacology, College of Medicine, Chonbuk National University, 20,
Geonji-ro, Deokjin-Gu, Jeonju-si, Jeollabuk-do 561-712, Korea
(Received November 9, 2011; Revised December 19, 2011; Accepted December 27, 2011)
์ ์ฝ: LC-MS/MS๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ํ์ฅ๊ณผ ์๋ณ ์ค ์๋ฅดํํ๋ด์ ์ ์ํ๊ณ ์ ํํ ๋ถ์๋ฒ์ ๊ฐ๋ฐํ๊ณ ์ด
๋ถ์๋ฒ์ ๋ํ ๊ฒ์ฆ์ ์ํํ์๋ค. ํ์ฅ๊ณผ ์๋ณ ๋ถ์์ ์ํ์ฌ ๋ด๋ถ ํ์ค ๋ฌผ์ง์ธ ์ธํํ์ง๋ค์ ์ฒจ๊ฐ
ํ ํ ๋ฉํ์ฌ๋ก ๋จ๋ฐฑ์ง์ ์นจ์ ์ํค๊ณ , ๊ทธ ์์ธต์ก์ ์ทจํ์ฌ ๋ฉํ์ฌ๋ก ํฌ์ํ์ฌ LC-MS/MS๋ก ๋ถ์ํ์
๋ค. MS/MS์ MRM (multiple reaction monitoring) ๋ฐฉ๋ฒ์ ์ด์ฉํ์ฌ ํ์ฅ๊ณผ ์๋ณ ์ค์ ์๋ฅดํํ๋ด์
์ด๋ ํ ๋ถ์์ ๋ฐฉํด๋ฌผ ์์ด ์ ํ์ ์ผ๋ก ๊ฒ์ถํ ์ ์์๋ค. ํ์ฅ ์ค ์๋ฅดํํ๋ด์ ํ์ค ๊ฒ๋์ ์ 1~100
ยตg/mL์ ๋๋ ๋ฒ์์์ ์ฐ์ํ ์ง์ ์ฑ(r2 = 0.9996)์ ๋ณด์์ผ๋ฉฐ, ์ผ๋ด, ์ผ๊ฐ ์ฌํ์ฑ์ ๋ณ๋๊ณ์ 8.9%
์ดํ, ์ ํ์ฑ์ 97.2~106.2% ์ด์๋ค. ๋ํ ์๋ณ ์ค ์๋ฅดํํ๋ด์ ๋ถ์ ๊ฒฐ๊ณผ๋ ์ข์ ์๊ด๊ด๊ณ(r2 = 0.9992)
๋ฅผ ๋ณด์๊ณ , ์ผ๋ด, ์ผ๊ฐ ์ฌํ์ฑ์ด ๋ณ๋๊ณ์ 7.2% ์ดํ, ์ ํ์ฑ์ด 97.9~111.6% ์ด์๋ค. ๊ฒฐ๊ณผ์ ์ผ๋ก ์
๋ฅดํํ๋ด์ ์ฝ๋ํ ์ฐ๊ตฌ์ ์ ์ฉ๋๊ธฐ์ ์ถฉ๋ถํ ๊ฐ๋์ ํน์ด์ฑ, ์ง์ ์ฑ, ์ ๋ฐ์ฑ ๋ฐ ์ ํ์ฑ์ ๊ฐ์ง๊ณ ์
์์ ํ์ธํ์๋ค.
Abstract: Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method has been developed and
validated for the quantitative determination of ertapenem in human plasma and urine. After addition of internal
standard (ceftazidime), plasma and urine was diluted with methanol and analyzed by LC-MS/MS. Using MS/
MS with multiple reaction monitoring (MRM) mode, ertapenem were selectively detected without severe
interference from human plasma and urine. The standard calibration curve for ertapenem was linear (r2= 0.9996)
over the concentration range 1~100 ยตg/mL in human plasma. The intra- and inter-day precision over the
concentration range of ertapenem was lower than 8.9% (correlation of variance, CV), and accuracy was between
97.2~106.2%. On the other hand, it was showed good relationship (r2= 0.9992) and the precision (intra- and
โ Corresponding author
Phone : +82-(0)63-250-2532 Fax : +82-(0)63-250-2349
E-mail : [email protected]
20 ๊น์ค์ ยทํ์กํฌยท์ ์ง์ยทํฉ๋ฏผํธยท์์ฉ์งยท์ฑ์์ยท๊น๋ฏผ๊ฑธ
Analytical Science & Technology
inter-day) over the concentration range of ertapenem was lower than CV 7.2%, and accuracy was between
97.9~111.6% for urine. This method has been successfully applied to the pharmacokinetic study of ertapenem
in human plasma and urine.
Key words: ertapenem, LC-MS/MS, validation, human plasma, human urine
1. ์ ๋ก
์๋ฅดํํ๋ด์ ๋ฒ ํ-๋ฝํ ํ์ ์ ๊ด๋ฒ์ ํ์ฑ์ ๋
ํ๋ด๋ ํญ์์ ์ธ ์นด๋ฐํ๋ด ๊ณ์ด์ ์ฝ๋ฌผ๋ก์ ๋ฉ๋กํ๋ด
๊ณผ ๋งค์ฐ ์ ์ฌํ ๊ตฌ์กฐ์ 1ฮฒ-๋ฉํธ ์นด๋ฐํ๋ด์ด๋ค.1,2 ์๋ฅด
ํํ๋ด์ ๋น๊ฒฝ๊ตฌ์ฉ ์นด๋ฐํ๋ด๊ณ๋ก ๋ณต์ก์ฑ ๋ณต๋ถ ๋ด ๊ฐ
์ผ๊ณผ ๋ณต์ก์ฑ ํผ๋ถ ๋ฐ ํผ๋ถ์กฐ์ง ๊ฐ์ผ์ ์น๋ฃํ๋ ์๋ก
์ด ์ฃผ์ฌ์ ๋ก ๊ฐ๋ฐ๋์๋ค.3 ์ด๋ฌํ ์๋ฅดํํ๋ด ์ฃผ์ฌ์
๋ ์ธํฌ๋ฒฝ ๊ตฌ์ฑ์ฑ๋ถ์ธ ํฉํฐ๋๊ธ๋ฆฌ์นธ์ ํ์ฑ์ ์ต์ ,
์ธํฌ๋ฒฝ ํฉ์ฑ์ ์ ํดํจ์ผ๋ก์จ ์ด๊ท ํจ๊ณผ๋ฅผ ๋ํ๋ด๋ ๋ฒ
ํ-๋ฝํ๊ณ ํญ์์ ๋ก, ๊ธฐ์กด ์นด๋ฐํ๋ด๊ณ ํญ์์ ๊ฐ ์๋ด
๊ฐ์ผ ๋ฑ ์ค์ฆ์ ๊ฐ์ผ์น๋ฃ์ ์ฌ์ฉ๋ ๊ฒ๊ณผ๋ ๋ฌ๋ฆฌ ์ค๋ฑ
๋ ๋ฐ ์ค์ฆ์ ์ง์ญ์ฌํ ํ๋์ฑ ๊ฐ์ผ ์น๋ฃ์ ์ฐ์ธ๋ค.4
๋ํ ์ผ๋ฐ์ ์ธ ๊ทธ๋ ์์ฑ๊ณผ ์์ฑ, ํธ๊ธฐ์ฑ ๋ฐ ํ๊ธฐ์ฑ๊ท
์ ๋ํ ๋ฐ์ด๋ ํญ๊ท ๋ ฅ์ ๊ฐ์ง๊ณ ์๋ ๊ฒ์ผ๋ก ์๋ ค์ ธ
์์ผ๋ฉฐ, 1์ผ 1ํ 1 g ๋จ๋ ์๋ฒ์ผ๋ก ๊ฐํธํ ํฌ์ฌ๊ฐ ์ฅ์
์ด๋ค.5 ๋ํ ์ ๋งฅ์ฃผ์ฌ๋ฟ๋ง ์๋๋ผ ๊ทผ์ก์ฃผ์ฌ๋ ๊ฐ๋ฅํ๋ค
๋ ์ฅ์ ์ ๊ฐ์ง๊ณ ์๋ค.6 ์ด๋ ๋์ฅ๊ท ๋ฑ์ผ๋ก ์ธํ ๋ณต
์ก์ฑ ๋ณต๋ถ ๋ด ๊ฐ์ผ ์ธ์ ๋ณต์ก์ฑ ํผ๋ถ ๋ฐ ํผ๋ถ์กฐ์ง๊ฐ์ผ,
์ง์ญ์ฌํ ํ๋์ฑ ํ๋ ด, ๋ณต์ก์ฑ ์๋ก๊ฐ์ผ, ๊ธ์ฑ๊ณจ๋ฐ๊ฐ์ผ
์ ์ ์์ฆ์ด ์๋ค. ์๋ฅดํํ๋ด์ ์นด๋ฐํ๋ด ๊ณ์ด์ ํ
์ฝ๋ฌผ๊ณผ๋ ๋ฌ๋ฆฌ 84-96%์ ๋์ ๋จ๋ฐฑ ๊ฒฐํฉ๋ ฅ์ ๊ฐ์ง๋ฉฐ
1ฮฒ-๋ฉํธ๊ธฐ์ ๋์ ์ผ๋ก ๋ค๋ฅธ ์นด๋ฐํ๋ด์ ๋นํด ๋น๊ต์ ์
์ฅ์ ๊ฐ์๋ถํด์ ์์ ํ์ฌ ์๋ฅดํํ๋ด ๋ํธ๋ฅจ ๋จ๋ ์
์ ๋ก์ ์ฌ์ฉ์ด ๊ฐ๋ฅํ๋ค.6 ์๋ฅดํํ๋ด์ ์ ๋งฅ์ฃผ์ฌ ํ์
์ ๋, ๊ฑฐ์ 80%๋ ๊ณ ๋ฆฌ๊ฐ ์ด๋ฆฐ ํํ์ ๋์ฌ์ฒด์ ๋ฏธ๋ณ
ํ์ฒด ํํ๋ก์ ์๋ณ์ผ๋ก ๋ฐฐ์ถ๋๋ค.7,8 ๊ทธ๋ฌ๋ฏ๋ก ์๋ฅดํ
ํ๋ด์ ์ฝ๋ํ ์ฐ๊ตฌ๋ฅผ ์ํด์๋ ํ์ก๋ฟ ์๋๋ผ ์๋ณ์
์กด์ฌํ๋ ์ฝ๋ฌผ์ ์์ ์ธก์ ํ๋ ๊ฒ์ด ์ค์ํ๋ค.
์ง๊ธ๊น์ง ๋ณด๊ณ ๋ ์์ฒด์๋ฃ ์ค์ ์๋ฅดํํ๋ด์ ๋ถ์
๋ฐฉ๋ฒ์ ์ฃผ๋ก ๊ณ ์ฑ๋ฅ ์ก์ฒด ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ(HPLC)๋ฅผ
์ด์ฉํ ๊ฒ์ผ๋ก UV ๊ฒ์ถ๊ธฐ๋ฅผ ์ด์ฉํ ๋ถ์๋ฒ์ด ๋ง์ด
์๊ณ , ์ก์ฒด ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋ํผ-์ง๋๋ถ์๊ธฐ(LC-MS)๋ฅผ ์ฌ
์ฉํ๋ ๋ฐฉ๋ฒ์ด ์๋ ค์ ธ ์๋ค.6,8 ๊ทธ๋ฌ๋ UV ๊ฒ์ถ๊ธฐ(300
nm) ์ฌ์ฉ์ ๊ฒฝ์ฐ๋ ์ ํํ ์ฝ๋ฌผ์ ์์ ์ธก์ ํ๊ธฐ ์ด
๋ ต๊ณ , HPLC ๋ถ์์ ๊ฒฝ์ฐ๋ ์ง์ ์ฑ ์๊ด๊ณ์๊ฐ ๋ฎ๊ณ ,
Musson ๋ฑ, Soltani ๋ฑ์ ๋ณด๊ณ ์ ๊ฐ์ด ์ต์ ์ ๋ํ๊ณ
(limit of quantitation, LOQ)๊ฐ 1.25 ยตg/mL๋ก ๋์ ์
๋ณ์ ์๋ ์ฝ๋ฌผ์ ์ ๋๋๋ฅผ ์ธก์ ํ๊ธฐ์๋ ํ๊ณ๊ฐ ์
๋ค.9,10 10 ng/mL๋ก ๋ฎ์ ์ ๋ํ๊ณ์์ LC-MS/MS์
์ํ ๋ถ์๋ฒ๋ ๋ณด๊ณ ๋ ๋ฐ๊ฐ ์์ผ๋ ๋ด๋ถํ์ค๋ฌผ์ ์ฒจ
๊ฐ ์์ด ๋ถ์ํ์๋ค.11,12 ์ ์ฒ๋ฆฌ ๋ฐฉ๋ฒ์ผ๋ก๋ ๋จ๋ฐฑ์ง ์นจ
์ ๋ฒ ํน์ ์ก์ฒด-์ก์ฒด ์ถ์ถ๋ฒ์ ์ด์ฉํ๋ ๋ฐฉ๋ฒ๋ค์ด ์
๋ค. ์ก์ฒด-์ก์ฒด ์ถ์ถ๋ฒ์ ์ฌ์ฉํ์ฌ ํ์ฅ๋ด ๋งคํธ๋ฆญ์ค ์ฑ
๋ถ๋ค์ ํจ๊ณผ์ ์ผ๋ก ์ ๊ฑฐํ์์ผ๋, ์ ์ฒ๋ฆฌ ๊ณผ์ ์ด ๋๋ฌด
๋ณต์กํ์ฌ ์๋ฐฑ-์์ฒ ๊ฐ์ ์์ฒด์๋ฃ ๋ถ์์ ์ํํด์ผ
ํ๋ ์ฝ๋ํ ์ฐ๊ตฌ์ ๊ณ ํจ์จ ๋ถ์๋ฒ์ผ๋ก๋ ์ ํฉํ์ง
์์๋ค. ์ต๊ทผ ๋ค์ด ๊ณ ์ฒด์ ์ถ์ถ๋ฒ(solid phase extraction,
SPE)์ ์ด์ฉํ ๋ฐฉ๋ฒ์ด ์ฌ์ฉ๋์์ผ๋ ์ด๋ ์๋ จ๋ ์
๋ฌธ๊ฐ์ ์ํด ์ฌํ์ฑ ์๋ ๊ฒฐ๊ณผ๋ฅผ ์ป์ ์ ์์ผ๋ฉฐ, ๋ค
๋์ SPE ์ปฌ๋ผ์ ๊ณ ๋น์ฉ์ผ๋ก ๊ตฌ์ ํด์ผ ํ๋ ๋จ์ ์ด
์๋ค. UPLC-MS/MS์ ๊ฒฝ์ฐ, ์งง์ ๋ถ์ ์๊ฐ๊ณผ ๋์
๋ถ๋ฆฌ๋ฅ์ผ๋ก ์ต๊ทผ ์์ฒด์๋ฃ ์ค์ ์ฝ๋ฌผ ๋ถ์์ ๋ง์ด ์
์ฉ๋๊ณ ์์ผ๋, ์์ง๊น์ง๋ ์ผ๋ฐ HPLC๋ณด๋ค ๋ณด๊ธ๋ฅ ์ด
๋ฎ๊ณ ๊ณ ๋น์ฉ์ด ์๊ตฌ๋๋ฉฐ ์ฌ์ฉํ ์ ์๋ ์ปฌ๋ผ์ ์ ํ
์ฑ์ด ์์ด, ๋ง์ ์คํ์ค์์ ์ผ์์ ์ธ ๋ถ์๋ฒ์ผ๋ก ์ด
์ฉํ๊ธฐ์๋ ํ๊ณ๊ฐ ์๋ค.
๋ฐ๋ผ์, ๋ณธ ์ฐ๊ตฌ์์๋ ๊ธฐ์กด ๋ถ์๋ฒ์ ๋จ์ ์ ๊ฐ์
ํ๊ณ , ๋ง์ ์คํ์ค์์ ์ผ๋ฐ์ ์ผ๋ก ์ฌ์ฉํ ์ ์๋ ์ธ
์ฒด์ ํ์ฅ ๋ฐ ์๋ณ ๋ด์ ์๋ฅดํํ๋ด ์์ฒด์๋ฃ ๋ถ์๋ฒ
์ ๊ฐ๋ฐํ์๋ค.
2. ์คํ๋ฐฉ๋ฒ
2.1. ์์ฝ ๋ฐ ๊ธฐ๊ธฐ
๋ณธ ์ฐ๊ตฌ์์ ์ฌ์ฉํ ํ์ค๋ฌผ์ง์ธ ์๋ฅดํํ๋ด ๋ํธ๋ฅจ์
ํ๊ตญ์ ์์ค๋(์ฃผ)์์ ์ ๊ณต๋ฐ์๊ณ , ๋ด๋ถํ์ค๋ฌผ์ง๋ก ์ฌ์ฉ
ํ ์ธํํ์ง๋ค ํ์คํ์ Sigma Chemical Co. (St. Louis,
Mo, USA) ๋ก๋ถํฐ ๊ตฌ์ ํ์๋ค(Fig. 1). ์ด๋์์ผ๋ก ์ฌ์ฉ
ํ ammonium acetate๋ Sigma Chemical Co. (St. Louis,
Mo, USA), ์์ธํธ์ฐ์ JUNSEI Chemical (Japan)์์ ๊ตฌ
์ ํ์๋ค. HPLC ๋ฑ๊ธ์ water์ acetonitrile, ๋ฉํ์ฌ์
Fisher Scientific (USA)์์ ๊ตฌ์ ํ์์ผ๋ฉฐ ์ ์ฒ๋ฆฌ ๊ณผ์
์ ์ฌ์ฉ๋ MES ์์ถฉ์ก์ Sigma Chemical Co. (St.
์ธ์ฒด ํ์ฅ ๋ฐ ์๋ณ ์ค ์๋ฅดํํ๋ด์ ์ ๋์ ์ํ LC-MS/MS ๋ถ์๋ฒ ๊ฒ์ฆ 21
Vol. 25, No. 1, 2012
Louis, Mo, USA)์์ ๊ตฌ์ ํ์๋ค. ์ฝ๋ฌผ๋ถ์ ๊ธฐ๊ธฐ๋ก๋
Agilent HPLC 1100 series (Agilent Technologies, Palo
Alto, CA, USA), 4000QTRAP LC-MS/MS (AB SCIEX,
Foster City, CA, USA)์ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌ๊ธฐ(MICRO 17TR,
Hanil Science Industrial Co, Korea) ๋ฑ์ ์ฌ์ฉํ์๋ค.
2.2. LC-MS/MS ์กฐ๊ฑด ์ต์ ํ
ํ์ฅ ๋ฐ ์๋ณ ์ค ์๋ฅดํํ๋ด ์ ๋์ ์ํ ์ง๋๋ถ์
๊ธฐ์ ์ธ๋ถ์กฐ๊ฑด์ผ๋ก๋ ์ ๊ธฐ๋ถ๋ฌด์ด์จํ๋ฒ(electrospray
ionization (ESI) mode), curtain gas 20 psi, nebulizing
gas 50 psi, turbo gas 50 psi, source ์จ๋๋ 500 oC,
CAD gas๋ 5 psi, entrance potential -10 V, MRM ion
transfer (m/z) ๋ฐ collision energy (CE)๋ ๊ฐ๊ฐ -28 V,
-11 V์ด์๋ค. ์๋ฅดํํ๋ด์ precursor molecular ion๊ณผ
product ion์ m/z ๋ ๊ฐ๊ฐ 474.1๊ณผ 264.8๋ก ๋ชจ๋ํฐ๋ง
ํ์๊ณ , ์ธํํ์ง๋ค์ precursor ion์ m/z๋ pyridine
moiety๊ฐ ๋จ์ด์ ธ๋๊ฐ ํํ์ธ 466.0๋ก, product ion์
m/z๋ 422.0๋ก ๋ชจ๋ํฐ๋ง ํ์๋ค. ๋ํ, ์ด๋์์ 2
mM ammonium acetate 0.1% acetic acid, pH 3.8 (A)
๊ณผ acetonitrile (B)๋ก 0 ๋ถ: 100% (A) 0% (B), 6 ๋ถ: 0%
(A) 100% (B), 8 ๋ถ: 100% (A) 0% (B), 2 ๋ถ๊ฐ 100% (A)
๊ธฐ์ธ๊ธฐ ์ฉ๋ฆฌ ์กฐ๊ฑด์ผ๋ก ์ค์ ํ์ฌ ๋ถ์ํ์๋ค. ์ปฌ๋ผ์
Betabasic-8 ์ปฌ๋ผ(C8, 4.6 ร 100 mm, Thermo, USA),
์ ์์ 1 mL/min, ์ฃผ์ ๋์ 10 ยตL๋ก ํ์ฌ ๋ถ์ํ์๋ค.
2.3. ํ์ค๊ฒ๋์ ์์ฑ ๋ฐ ๋ถ์๋ฒ ๊ฒ์ฆ
์๋ฅดํํ๋ด ๋ฐ ์ธํํ์ง๋ค ํ์คํ์ 50% acetonitrile
์ ๋ น์ฌ ์๋ฅดํํ๋ด์ 10 mg/mL, ์ธํํ์ง๋ค์ 1
mg/mL๋ก ๋ง๋ค์๋ค. ์๋ฅดํํ๋ด์ 10, 20, 50, 100,
200, 400, 800, 1000 ยตg/mL์ ๋๋๋ก ๋ง๋ค์ด ๊ณตํ์ฅ
90 ยตL์ 100 mM MES ์์ถฉ์ก 90 ยตL๋ฅผ ๋ฃ๊ณ ๋ง๋ค์ด
๋์ ํ์ค์๋ฃ ๊ฐ 20 ยตL๋ฅผ ๋ฃ์ด ์ต์ข ๋๋ 1, 2, 5,
10, 20, 40, 80, 100 ยตg/mL๋ก ๋ง๋ ํ ์๋ก์ด ๋ฐ์ด์
์ 100 ยตL์ฉ ์ฎ๊ธด ํ ๋ด๋ถํ์ค๋ฌผ์ธ ์ธํํ์ง๋ค
1 mg/mL์ ์ฉ์ก์ 20 ยตL์ฉ ๋ํ์ฌ ๋ฃ์๋ค. ๊ทธ ํ ๋ฉ
ํ์ฌ์ 400 ยตL์ฉ ๋ํ์ฌ ๋ฃ์ ํ 20์ด ๋์ ํผํฉํ
ํ 4 oC๋ก ์ค์ ํด ๋ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌ๊ธฐ๋ฅผ ์ฌ์ฉํ์ฌ 20,800
g์์ 10๋ถ ๋์ ์์ฌ๋ถ๋ฆฌ ํ์๋ค. ์์ฌ๋ถ๋ฆฌ ํ ์๋ฑ
์ก 20 ยตL์ ๋ฉํ์ฌ 380 ยตL๋ฅผ ๋ฃ๊ณ 20๋ฐฐ ํฌ์ํ์ฌ
200 ยตL๋ฅผ ๋ฐ์ด์์ ์ฎ๊ฒจ ์ด ์ค 10 ยตL๋ฅผ LC-MS/MS
์ ์ฃผ์ ํ์๋ค. ์๋ณ ๋ถ์์ ์ํ ํ์ค๊ฒ๋์ ์๋ฃ๋
์์ ๋์ผํ ๋ฐฉ๋ฒ์ผ๋ก ์ ์กฐํ์์ผ๋ฉฐ 1, 2, 5, 10, 20,
40, 80, 100 ยตg/mL์ ๋๋๋ก ์กฐ์ ํ์ฌ LC-MS/MS๋ก
๋ถ์ํ์๋ค. ๋ถ์๋ฒ ๊ฒ์ฆ์ ์ํ ํน์ด์ฑ ์ํ์ผ๋ก์ 6
๊ฐ์ ๋ค๋ฅธ ๊ธฐ์์ ๊ณตํ์ฅ๊ณผ ๊ณต์๋ณ์ ์ค๋นํ์ฌ ๊ฐ ์
๋ฃ์ LOQ ๋๋์ ์๋ฅดํํ๋ด์ spikingํ์ฌ ๋ถ์ ์
๋ค๋ฅธ ๋ฌผ์ง๋ค์ ์ํ ๊ฐ์ญ์ด ์๋์ง ํ์ธํ์๋ค. ์ง์
์ฑ ์คํ์ ์ํด์๋ ์ป์ด์ง ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋จ์ผ๋ก๋ถํฐ ๋ด
๋ถํ์ค๋ฌผ์ง์ ํผํฌ ๋ฉด์ ์ ๋ํ ์๋ฅดํํ๋ด์ ํผํฌ
๋ฉด์ ๋น๋ฅผ ๊ตฌํ๊ณ , ๊ฒ๋์ ์ ์ ํํ๊ท ๋ฐฉ๋ฒ์ผ๋ก ๊ตฌํ์
์ผ๋ฉฐ ๊ฐ์ค์น๋ 1/x์ ์ด์ฉํ์๋ค. ์ฌ๊ธฐ์์ ์ป์ ๋ด๋ถ
ํ์ค๋ฌผ์ง์ ํผํฌ ๋ฉด์ ์ ๋ํ ์๋ฅดํํ๋ด ํผํฌ ๋ฉด์
์ ๊ฐ์ง๊ณ ๊ฒ๋์ ์ ์์ฑํ์์ผ๋ฉฐ quality control (QC)
์๋ฃ 1, 2, 40, 80 ยตg/mL ๋๋์ ํ์ฅ๊ณผ ์๋ณ ํ์ค์
๋ฃ๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ์๊ธฐ์ ๊ฒ์ฒด ์ฒ๋ฆฌ๋ฐฉ๋ฒ์ผ๋ก ์ฒ๋ฆฌํ์ฌ
๋ถ์ํ์๋ค(n=5). ๊ฐ ์ฑ๋ถ๊ณผ ๋ด๋ถํ์ค๋ฌผ์ง์ ์ธก์ ์น์
ํ์คํธ์ฐจ๋ฅผ ํ๊ท ๊ฐ์ผ๋ก ๋๋ ๋น์ ๋ฐฑ๋ถ์จ(%)๋ก์ ๊ตฌ
ํ์๋ค. ํ๋ฃจ์ 5๋ฒ ์ํํ์ฌ ์ผ๋ด ์ ๋ฐ์ฑ(%, CV๋ก
ํ์)์ ๊ตฌํ์๊ณ 5์ผ๊ฐ ์คํ์ ๋ฐ๋ณต ์ํํ์ฌ ์ผ๊ฐ
์ ๋ฐ์ฑ์ ๊ตฌํ์๋ค. ๊ฒ๋์ ์ ์ํ์ฌ ์ ๋ํ ๋๋์
ํ๊ท ๊ฐ์ ๊ธฐ์ง์ ๋๋๋ก ๋๋ ๋น์ ๋ฐฑ๋ถ์จ(%)๋ก์ ๊ตฌ
ํ์๋ค. ์ํ๋ฐฉ๋ฒ์ ํ์์จ์ ์กฐ์ฌํ๊ธฐ ์ํ์ฌ ์๋ฅดํ
ํ๋ด์ด ํฌํจ๋ ํ์ฅ์๋ฃ์ ์๋ณ์๋ฃ๋ฅผ ์ฐ์ ์ ์ฒ๋ฆฌ
ํ ํ, ๋ด๋ถํ์ค๋ฌผ์ง์ ๊ฐํ์ฌ ๊ฐ ์ฑ๋ถ์ ํ์์จ์ ๊ตฌ
ํ์๊ณ , ๋ด๋ถํ์ค๋ฌผ์ง๋ ๋์ผํ ๋ฐฉ๋ฒ์ผ๋ก ํ์ฅ์ ์ฒจ๊ฐ
ํ์ฌ ์ฐ์ ์ ์ฒ๋ฆฌ๋ฅผ ํ ๋ค์ ๋๋๋ฅผ ์๊ณ ์๋ ํ์ค
๋ฌผ์ง์ฉ์ก์ ๊ฐํ์ฌ ๋ถ์ํ๊ณ ์ป์ด์ง ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋จ์
ํผํฌ ๋ฉด์ ๋น๋ฅผ ์ด์ฉํ์ฌ ํ์์จ์ ๊ตฌํ์๋ค.
Fig. 1. Chemical structures of ertapenem and ceftazidime.
22 ๊น์ค์ ยทํ์กํฌยท์ ์ง์ยทํฉ๋ฏผํธยท์์ฉ์งยท์ฑ์์ยท๊น๋ฏผ๊ฑธ
Analytical Science & Technology
3. ๊ฒฐ๊ณผ ๋ฐ ๊ณ ์ฐฐ
3.1. ํน์ด์ฑ
๊ฑด๊ฐํ ์ฑ์ธ์ ๊ณตํ์ฅ๊ณผ ์๋ณ์ ๋ด๋ถํ์ค๋ฌผ์ง๋ง
spikingํ ๊ฒ๊ณผ ์๋ฅดํํ๋ด์ ํจ๊ป spikingํ ๊ฒ์ ๋
ํด ๋ณธ ์ํ ๋ฐฉ๋ฒ์ ๋ฐ๋ผ LC-MS/MS๋ก ๋ถ์ํ์๋ค
(Fig. 2). LC-MS/MS ๋ถ์๋ฒ์ ํตํ์ฌ ์ป์ด์ง ํฌ๋ก๋ง
ํ ๊ทธ๋จ์์ ์๋ฅดํํ๋ด๊ณผ ์ธํํ์ง๋ค์ ๊ฐ๊ฐ 4.07๋ถ
๊ณผ 3.90๋ถ์ ํผํฌ ์ ์ง์๊ฐ์ ๋ํ๋ด์๋ค. ๋ด๋ถํ์ค๋ฌผ
์ง์ ๊ฐํ์ง ์์ ๊ณตํ์ฅ๊ณผ ์๋ณ์์๋ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋จ
์์ peak๊ฐ ๊ฒ์ถ๋์ง ์์์ผ๋ฉฐ(A1๊ณผ B1), ๋ด๋ถํ์ค
๋ฌผ์ง์ ์ฒจ๊ฐํ ๊ณตํ์ฅ๊ณผ ์๋ณ์์๋ ๋ด๋ถํ์ค๋ฌผ์ง์
peak๋ง ๊ฒ์ถ๋์๊ณ (A3์ B3), ๋ด๋ถํ์ค๋ฌผ์ง์ด ์๋ฅดํ
ํ๋ด์ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋จ์ ์ํฅ์ ์ฃผ์ง ์์์ ํ์ธํ์
๋ค(A2, B2). ๋ณธ ์คํ์ ๋ถ์ ์กฐ๊ฑด์์ ์๋ฅดํํ๋ด ๋ฐ
๋ด๋ถํ์ค๋ฌผ์ง์ ๊ธฐํ ํ์ฅ ๋ฐ ์๋ณ์ ์กด์ฌํ๋ ๋ค๋ฅธ
์ฑ๋ถ๋ค๊ณผ ์ ๋ถ๋ฆฌ๋์๋ค. ์ฌ์ฏ ๊ฐ์ ๋ค๋ฅธ ๊ธฐ์์ ๊ฐ์ง
๊ณตํ์ฅ๊ณผ ์๋ณ์ ์ต์ ์ ๋ํ๊ณ ๋๋๋ฅผ spikingํ์ฌ ๋ถ
์ํ์์ ๋, ๊ฐ ์ฑ๋ถ์ ํผํฌ๊ฐ ๋ค๋ฅธ ๊ฐ์ญํจ๊ณผ ์์ด
์ ๋ถ์๋๋ ๊ฒ์ ํ์ธํ์๋ค.
3.2. ์ง์ ์ฑ
ํ์ค๋ฌผ์ง 1, 2, 5, 10, 20, 40, 80, 100 ยตg/mL์ ํ
์ฅ์๋ฃ์ ๋ด๋ถํ์ค๋ฌผ์ง์ spiking ํ ํ์ฅ์๋ฃ๋ฅผ ์ ์ฒ
๋ฆฌํ์ฌ LC-MS/MS๋ก ๋ถ์ํ์ฌ r2์ ๊ตฌํ ๊ฒฐ๊ณผ 0.9991
๋ก ์ํธํ ์ง์ ์ฑ์ ๋ํ๋ด์๊ณ , ์ต์ ๊ฒ์ถํ๊ณ(limit
of detection, LOD)๋ ์ ํธ ๋ ์ก์ ๋น๊ฐ 3๋ 1 ์ผ ๋
์ ๋๋, LOQ๋ ์ ํธ ๋ ์ก์ ๋น๊ฐ 10 ๋ 1 ์ผ ๋์
๋๋๋ก ๊ตฌํ ๊ฒฐ๊ณผ ๊ฐ๊ฐ 0.4, 1 ยตg/mL์ด์๋ค. ์๋ณ์๋ฃ
๋ 1, 2, 5, 10, 20, 40, 80, 100 ยตg/mL์ ๋๋๋ก ์กฐ์
ํ์ฌ LC-MS/MS ๋ถ์ํ ๊ฒฐ๊ณผ r2์ ๊ตฌํ์๊ณ , LOD์
LOQ๋ ๊ฐ๊ฐ 0.3, 1 ยตg/mL์ด์๋ค. ํ์ฅ ์๋ฃ๋ก๋ถํฐ
๊ตฌํ ์๋ฅดํํ๋ด์ ๊ณ์ฐ์์ y=0.0000341xโ0.000345
(r2 = 0.9996) [y=์๋ฅดํํ๋ด/๋ด๋ถํ์ค๋ฌผ์ง ํผํฌ ๋ฉด์ ์
Fig. 2. Extracted ion chromatograms (XIC) of plasma (A1, A2, A3 and A4) and urine (B1, B2, B3 and B4). The chromatogramsof double blank (DB) matrix without internal standard (A1 and B1), blank (B) matrix with internal standard (A2 andB2 for 474.1/264.8 Da, A3 and B3 for 466.0/422.0 Da) and LOQ sample spiking of ertapenem (1 ยตg/mL) to blankmatrix (A4 and B4), respectively.
์ธ์ฒด ํ์ฅ ๋ฐ ์๋ณ ์ค ์๋ฅดํํ๋ด์ ์ ๋์ ์ํ LC-MS/MS ๋ถ์๋ฒ ๊ฒ์ฆ 23
Vol. 25, No. 1, 2012
๋น์จ, x=์๋ฅดํํ๋ด์ ๋๋(ยตg/mL)]์์ผ๋ฉฐ 1~100 ยตg/
mL์ ๋ฒ์์์ ์ํธํ ์ง์ ์ฑ์ ๋ํ๋ด์๋ค. ์๋ณ์๋ฃ
์์์ ์๋ฅดํํ๋ด์ y = 0.000159xโ0.0175 (r2 = 0.9992)
์ผ๋ก ์ง์ ์ฑ์์ ์ํธํ ๊ฒฐ๊ณผ๋ฅผ ์ป์๋ค(Fig. 3).
3.3. ์ ํ์ฑ ๋ฐ ์ ๋ฐ์ฑ
์ ๋ฐ์ฑ์ ์๋ฅดํํ๋ด๊ณผ ๋ด๋ถํ์ค๋ฌผ์ง์ ํผํฌ ๋ฉด์
๋น์ ํ์คํธ์ฐจ๋ฅผ ์๋ฅดํํ๋ด๊ณผ ๋ด๋ถํ์ค๋ฌผ์ง์ ํผํฌ
๋ฉด์ ๋น์ ํ๊ท ๊ฐ์ผ๋ก ๋๋ ๋น์ ๋ฐฑ๋ถ์จ(%)๋ก์ ๊ตฌํ
์๋ค. ํ์ค์ฉ์ก์ ๋ํ์ฌ QC์๋ฃ๋ 1, 2, 40, 80 ยตg/
mL๋ก ํ๋ฃจ์ 5๋ฒ ์ํํ์ฌ ์ผ๋ด ์ ๋ฐ์ฑ์ ๊ตฌํ์๊ณ ,
5์ผ๊ฐ ์คํ์ ๋ฐ๋ณต ์ํํ์ฌ ์ผ๊ฐ ์ ๋ฐ์ฑ์ ๊ตฌํ์๋ค.
๋ํ, ์ ํ์ฑ์ ๊ฒ๋์ ์ ์ํ์ฌ ์ ๋ํ ๋๋์ ํ๊ท
๊ฐ์ ๊ธฐ์ง์ ๋๋๋ก ๋๋ ๋น์ ๋ฐฑ๋ถ์จ(%)๋ก์ ๊ตฌํ์
๋ค. ๊ฐ๋(์ ๋ ํ๊ณ)๋ ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋จ ์์์ ์ ํธ ๋
์ก์๋น(signal to noise ratio)๋ฅผ 10 ์ด์์ผ๋ก ํ์๋ค.
ํ์ ๊ธฐ์ค์ CV(%)๊ฐ 10%์ดํ๋ฅผ ๋ง์กฑํ๋ ์ง์ ์ ํ
์ฑ(Accuracy, %) 85~115% ์ผ ๋ ๋ง์กฑํ๋ ๊ฒ์ผ๋ก ํ
์ ํ์์ผ๋ฉฐ, ์คํ๊ฒฐ๊ณผ Table 1์ ๋ํ๋ ๊ฒ์ฒ๋ผ ์ผ๋ด
๋ถ์์์ CV(%)๋ 3.2~6.3%๋ก ๋ง์กฑํ๋ ๊ฒฐ๊ณผ๋ฅผ ๋ณด์
๊ณ , ์ผ๊ฐ ๋ถ์์์ CV(%) 6.3~8.9%์ ๊ฒฐ๊ณผ๋ฅผ ๋ํ๋ด
์๋ค. ๊ทธ๋ฆฌ๊ณ ์๋ณ์๋ฃ์ ์ผ๋ด 5ํ ๋ฐ๋ณต์ํ๊ณผ 5์ผ๊ฐ
๋ฐ๋ณต์ํ์ CV(%)๊ฐ ๊ฐ๊ฐ 3.2~7.2%์ 3.7~6.8%๋ก
๊ฒฐ๊ณผ๋ฅผ ๋ชจ๋ ๋ง์กฑํ์๋ค(Table 2). Accuracy๋ ํ์ฅ์
๋ฃ์ ์๋ณ์๋ฃ ๋ชจ๋ ๊ธฐ์ค์ ๋ง์กฑํ์๋ค. ์ถ์ถํจ์จ์
์คํ๊ฒฐ๊ณผ๋ ํ์์จ๋ก์ ํ๊ฐํ์์ผ๋ฉฐ, ๊ธฐ์ง ๋์ ๋ถ์
๋ฌผ์ง์ ๋ํด ๋ณธ ์ํ๋ฒ์ ์๋ฃ ์ถ์ถ๊ณผ ์ฒ๋ฆฌ๊ณผ์ ์ ๋ชจ
๋ ๊ฑฐ์น ํ ์ป์ ๋ถ์์น์ ๊ธฐ์ง ๋์ ๋ํ ํผ์ผํธ๋ก
๊ณ์ฐํ์ฌ 85~115% ์ผ ๊ฒฝ์ฐ ์ ํฉ์ผ๋ก ํ์ ํ์๊ณ ,
์ผ๋ด, ์ผ๊ฐ ์คํ๊ฒฐ๊ณผ ํ์ฅ์๋ฃ๋ 97.1~106.0%, ์๋ณ ์
๋ฃ๋ 97.0~111.2%๋ก ์ ํฉํ ๊ฒฐ๊ณผ๋ฅผ ๋ํ๋ด์๋ค(Table 3).
Fig. 3. Standard calibration curve of ertapenem in (A) plasmaand (B) urine.
Table 1. Intra-day and inter-day precision and accuracy forertapenem in human plasma
Statistical
variable
Concentration (ยตg/mL)
1 2 40 80
Intra-day (n=5)
Mean 1.1 2.0 39.4 77.9
CV (%) 3.2 4.0 6.3 4.4
Accuracy (%) 106.2 99.6 98.6 97.2
Inter-day (n=25)
Mean 1.1 2.0 39.1 80.3
CV (%) 8.9 7.7 8.4 6.3
Accuracy (%) 100.6 99.4 97.7 100.4
Table 2. Intra-day and inter-day precision and accuracy forertapenem in human urine
Statistical
variable
Concentration (ยตg/mL)
1 2 40 80
Intra-day (n=5)
Mean 1.1 2.0 39.3 80.2
CV (%) 7.2 5.6 4.8 3.2
Accuracy (%) 111.6 100.2 98.2 100.2
Inter-day (n=25)
Mean 1.0 2.0 41.5 83.7
CV (%) 6.8 3.7 4.8 6.4
Accuracy (%) 97.9 101.5 103.6 104.6
Table 3. Intra-day and inter-day recovery of ertapenem in human plasma and urine
Concentration
(ยตg/mL)
Plasma (%) Urine (%)
Intra-day (n=5) Inter-day (n=25) Intra-day (n=5) Inter-day (n=25)
1 106.0 ยฑ 0.03 100.6 ยฑ 0.03 111.2 ยฑ 0.07 97.0 ยฑ 0.06
2 99.5 ยฑ 0.08 99.45 ยฑ 0.08 100.4 ยฑ 0.11 101.5 ยฑ 0.07
40 98.4 ยฑ 2.46 97.7 ยฑ 2.46 98.2 ยฑ 1.89 103.6 ยฑ 1.97
80 97.1 ยฑ 3.42 100.3 ยฑ 3.42 100.2 ยฑ 2.55 104.6 ยฑ 5.35
Values are presented as Mean ยฑ SD
24 ๊น์ค์ ยทํ์กํฌยท์ ์ง์ยทํฉ๋ฏผํธยท์์ฉ์งยท์ฑ์์ยท๊น๋ฏผ๊ฑธ
Analytical Science & Technology
์ด๋ ๋ณธ ๋ถ์๋ฐฉ๋ฒ์ ์ ๋ฐ์ฑ์ ์ผ๋ด, ์ผ๊ฐ ๋ชจ๋ 10%
์ดํ, LOQ์์์ ์ ๋ฐ์ฑ์ 20% ์ดํ์๊ณ , LOQ๋
ํ์ฅ๊ณผ ์๋ณ์์ ๊ฐ๊ฐ 1 ยตg/mL์ด์๋ค. ์ด๋ก๋ถํฐ ํ์ค
์๋ฅดํํ๋ด์ ๋ํ ์๊ธฐ LC-MS/MS ๋ถ์๋ฒ์ ์ธ์ฒด์
๋ํ ์์ฒด์ด์ฉ๋ฅ ์ํ ๋ฐ ์ฝ๋ฌผ์ํธ์์ฉ ์ฐ๊ตฌ ๋ฑ ์ฝ๋
ํ์ ํน์ฑ์ ํ๊ฐํ๋ ์์์ฐ๊ตฌ์ ์ด์ฉ๋ ์ ์๋ ์ถฉ
๋ถํ ๊ฐ๋, ํน์ด์ฑ, ์ง์ ์ฑ, ์ ํ์ฑ ๋ฐ ์ ๋ฐ์ฑ์ ๊ฐ๊ณ
์์์ ์ ์ ์์๋ค.
4. ๊ฒฐ ๋ก
์๋ฅดํํ๋ด์ ์ธ์ฒด์ ํ์ฅ๊ณผ ์๋ณ ์ค์ LC-MS/MS
๋ถ์๋ฒ์ ์ค์ ํ๊ณ ์ด์ ์ ํจ์ฑ์ ๊ฒ์ฆํ๋ ์คํ์
ํตํ์ฌ ๋ค์๊ณผ ๊ฐ์ ๊ฒฐ๋ก ์ ์ป์๋ค.
1. ํ์ฅ์๋ฃ์ ์๋ณ ์๋ฃ๋ฅผ ๊ฐ๊ฐ ์ ๋จ๋ฐฑ์ผ๋ก ์ ์ฒ๋ฆฌ
ํ์ฌ LC-MS/MS ํฌ๋ก๋งํ ๊ทธ๋จ์ผ๋ก ๋ถ์ํ ๊ฒฐ๊ณผ ํ์ฅ
์ฑ๋ถ์ด๋ ์๋ณ ๋ด๋ถ์ ์๋ ์ฌ๋ฌ ๊ฐ์ง ๊ฐ์ญ๋ฌผ์ง์ ๋ฐฉ
ํด์์ด ์๋ฅดํํ๋ด ๋ฐ ๋ด๋ถํ์ค๋ฌผ์ง์ ๋ถ๋ฆฌํ์๋ค.
2. ํ์ฅ์๋ฃ์ ์๋ณ ์๋ฃ๋ก๋ถํฐ ๊ตฌํ ์๋ฅดํํ๋ด์
๊ฒ๋์ ์ r2โฅ 0.999๋ก 1~100 ยตg/mL ๋ฒ์์์ ์ํธํ
์ง์ ์ฑ์ ๋ํ๋ด์๊ณ LOQ๋ 1 ยตg/mL์ด์๋ค. ๋ถ์๋ฒ
์ ๊ฒ์ฆํ ๊ฒฐ๊ณผ ์ผ๋ด ์ฌํ์ฑ๊ณผ ์ผ๊ฐ ์ฌํ์ฑ์ ํ๊ท
์ ๋ฐ์ฑ๊ณผ ์ ํ์ฑ์ด ๋ชจ๋ ๊ธฐ์ค๊ฐ ์ด๋ด์ ๋ค์ด ์ด ๋ถ์
๋ฒ์ ์ถฉ๋ถํ ๊ฐ๋์ ์ ํ์ฑ ๋ฐ ์ ๋ฐ์ฑ์ด ์์๋ค.
์ด ๋ถ์๋ฒ์ ์ด๋ฏธ ๋ณด๊ณ ๋ ๋ถ์๋ฒ์ ๋น๊ตํ์ฌ ์๋ฃ
์ ์ฒ๋ฆฌ๊ฐ ๊ฐ๋จํ๊ณ , ๋ฎ์ ์ ๋ํ๊ณ๋ฅผ ๊ฐ์ง๋ฉฐ, ์์ฒด์
๋ฃ ๋ถ์๋ฒ์ผ๋ก์์ ์ํธํ ํน์ด์ฑ, ์ง์ ์ฑ, ์ ํ์ฑ ๋ฐ
์ ๋ฐ์ฑ์ ๋ํ๋ด์๋ค. ๋ฐ๋ผ์ LC-MS/MS ๋ถ์๋ฒ์
์ด์ฉํ ์ธ์ฒด ํ์ฅ๊ณผ ์๋ณ ๋ด์ ์๋ฅดํํ๋ด์ ์ ๋ํ
๋ณธ ์ํ๋ฒ์ ์ ํฉํ ์ํ๋ฒ์์ ๊ฒ์ฆํ์๋ค. ํฅํ ๋ณธ
์ฐ๊ตฌ์์ ์ ๋ฆฝํ ์๋ฅดํํ๋ด์ ์์ฒด์๋ฃ๋ถ์๋ฒ์ ์ฝ
๋ํ ์ฐ๊ตฌ์ ์ ์ฉํ ์ ์์ ๊ฒ์ผ๋ก ์์๋๊ณ , ์ฝ๋ฌผ์น
๋ฃ์ ์ ์ฉํ ์๋ฃ๋ก ํ์ฉ๋ ์ ์์ ๊ฒ์ผ๋ก ์ฌ๋ฃ๋์
๋ค.
์ฐธ๊ณ ๋ฌธํ
1. I. Odenholt, Expert. Opin. Investig. Drugs., 10(6),
1157-1166 (2001).
2. C. G. Zhanel, C. Johanson, J. M. Embil, A. Noreddin,
A. Gin, L. Vercaiqne and D. J. Hoban, Expert Rev Anti
Infect Ther., 3(1), 23-39 (2005).
3. J. B. Gordien, E. Boselli, C. Fleureau, B. Allaouch-
iche, G. Janvier, O. Lalaude, M. C. Saux and D. Breilh,
J. Chromatogr. B, 830(2), 218-223 (2006).
4. M. L. Hammond, J. Antimicrob. Chemother., 53,
Suppl. S2, ii7-ii9 (2004).
5. O. Burkhardt, H. Derendorf and T. Welte, Expert.
Opin. Pharmacother., 8(2), 237-256 (2007).
6. D. G. Musson, A. Majumdar, K. Birk, S. Holland, P.
Wickersham, S. X. Li, G. Mistry, A. Fisher, S. Wald-
man, H. Greenberg, P. Deutsch and J. D. Rogers. Anti-
microb Agents Chemother., 47(5), 1732-1735 (2003).
7. D. E. Nix, A. K. Majumdar and M. J. DiNubile, J.
Antimicrob. Chemother., 53, Suppl. S2, ii23-ii28 (2004).
8. O. Burkhardt, C. Hafer, A. Langhoff, V. Kaever, V.
Kumar, T. Welte, H. Haller, D. Fliser and J. T. Kiel-
stein, Nephrol. Dial. Transplant., 24, 267-271 (2009).
9. D. G. Musson, K. L. Birk, A. M. Cairns, A. K. Majum-
dar and J. D. Rogers, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci.
Appl., 720, 99-106 (1998).
10. D. G. Musson, A. Majumdar, S. Holland, K. Birk, L.
Xi, G. Mistry, D. Sciberras, J. Muckow, P. Deutsch, J.
D. Rogers, Antimicrob. Agents. Chemother., 48(2), 521-
524 (2004).
11. M. Soltani, A. P. MacGowan and A. M. Lovering, Int.
J. Antimicrob. Agents., 27(2), 165-167 (2006).
12. S. Lefeuvre, N. Venisse, S. Marchand, M. Bachelet and
W. Couet., J. Chromatogr. B, 862, 242-245 (2008).