UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y TECNOLOGÍA QUÍMICA LABORATORIO DE QUÍMICA DE ALIMENTOS Y MATERIAS GRASAS

VALIDACION DE LA METODOLOGÍA ANALÍTICA PARA LA DETERMINACIÓN DE ACIDOS GRASOS EN ACEITES DE OLIVA

EXTRA VIRGEN

MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE QUIMICO FARMACÉUTICO

VIVIANA ROSARIO JOFRE REBOLLEDO

Director: Q. Dr. Paz Robert

Co- Director: QF. Nalda Romero

SANTIAGO, CHILE ENERO DE 2009

ii

LA PRESENTE INVESTIGACIÓN SE LLEVÓ A CABO CON EL

FINANCIAMIENTO DEL PROYECTO INNOVA-CORFO FORTALECIMIENTO DE

LA INDUSTRIA OLIVINICOLA NACIONAL (07CN13IAM-10).

iii

DEDICATORIA

A herMario, mi padre Mario, mi Estrella del cielo y mi familia, los amo con todo mi

corazón…

iv

AGRADECIMIENTOS

Me gustaría agradecer:

A mi herMario por su apoyo, comprensión, amor y dedicación. A mi padre

Mario y mi madre Julia por incentivarme a estudiar y llegar más lejos siempre;

A todos los integrantes de mi familia, quienes me brindaron mucho amor,

amistad y apoyo durante todo el largo proceso de la universidad;

A la profesora Paz Robert, patrocinante y directora de la memoria, por

invitarme a trabajar junto a ella y estar dispuesta a ayudarme en cada momento que

lo necesité;

A los profesores del laboratorio, Sra. Lilia Masson, Sra. Nalda Romero y Sr.

Jaime Ortiz, por acompañarme durante este proceso con sus consejos;

A Juan Carlos Moreno y Javier Ubilla por brindarme su colaboración en cada

jornada de trabajo en el laboratorio de química de los alimentos;

A Arturo Fernández, por su gran ayuda, compañía y amistad durante este

año en el laboratorio;

A cada uno de los que de alguna forma se han hecho participes de mi vida

universitaria.

v

INDICE

DEDICATORIA ........................................................................................................... ii

AGRADECIMIENTOS ............................................................................................... iv

INDICE ....................................................................................................................... v

INDICE DE TABLAS ................................................................................................. ix

INDICE DE FIGURAS .............................................................................................. xv

RESUMEN .............................................................................................................. xvii

SUMMARY ............................................................................................................. xviii

I. INTRODUCCION .................................................................................................... 1

1.1. Antecedentes generales ...................................................................................... 1

1.2. Distribución de Olivos en Chile............................................................................ 2

1.2.2. Norte Chico ........................................................................................... 3

1.2.3. Zona Central ......................................................................................... 3

1.3. Variedades de Olivos en Chile ............................................................................ 4

1.4. Variedades de Aceite de Oliva ............................................................................ 6

1.4.1. Aceites de oliva vírgenes: ..................................................................... 7

1.4.2. Aceite de oliva refinado: ....................................................................... 8

1.4.3. Aceite de oliva – contiene exclusivamente aceites de oliva refinados y

aceites de oliva vírgenes: ............................................................................... 8

1.4.4. Aceite de orujo de oliva crudo: ............................................................. 8

1.4.5. Aceite de orujo de oliva refinado: ......................................................... 9

1.4.6. Aceite de orujo de oliva: ....................................................................... 9

1.5. Cualidades del aceite de oliva ............................................................................. 9

1.6. Legislación vigente para el aceite de oliva ........................................................ 11

vi

1.7. Validación de métodos analíticos ...................................................................... 13

II. OBJETIVOS ......................................................................................................... 15

2.1. Objetivo general ................................................................................................ 15

2.2. Objetivos especificos ......................................................................................... 15

III. MATERIALES Y METODOS ............................................................................... 16

3.1. Materiales .......................................................................................................... 16

3.1.1 Reactivos: .................................................................................................... 16

3.1.2 Equipo ......................................................................................................... 16

3.1.3 Material de Laboratorio ................................................................................ 17

3.2. Metodologia ....................................................................................................... 17

3.2.1 Implementación de la técnica analítica para la determinacion de la

composición en ácidos grasos de aceite de oliva extra virgen. ............................ 17

3.2.1.1. Preparación de la muestra ............................................................... 17

3.2.1.2. Análisis Cromatográfico ................................................................... 18

3.2.2. Aplicación de los parámetros de desempeño a las metodologías analíticas

de determinación de ácidos grasos. ..................................................................... 19

3.2.2.1 Intervalo de linealidad y sensibilidad del método. ............................ 19

3.2.2.2 Límite de detección y cuantificación del método .............................. 20

3.2.2.3 Medidas de precisión ........................................................................ 23

3.2.2.4.Medidas de exactitud: Recuperación. ............................................... 24

IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES ....................................................................... 26

4.1. Determinación de la linealidad y sensibilidad .................................................... 26

4.2 Limite de detección y de cuantificación .............................................................. 28

4.3 Medidas de Precisión ......................................................................................... 32

4.3.1 Repetibilidad ................................................................................................ 32

4.3.2 Replicabilidad .............................................................................................. 34

vii

4.4 Medidas de exactitud ......................................................................................... 35

4.4.1. Recuperación ............................................................................................. 35

4.4 Muestras analizadas .......................................................................................... 36

V. CONCLUSIONES ................................................................................................ 40

VI. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................... 41

VII. ANEXOS ............................................................................................................ 45

ANEXO 1 .............................................................................................................. 45

Determinación de la linealidad y sensibilidad ................................................... 45

1.1. Preparación de la solución madre de los principales ácidos grasos presentes en

el aceite de oliva extra virgen. .................................................................................. 45

1.2. Construcción de las curvas de calibración ........................................................ 46

ANEXO 2 .............................................................................................................. 48

Determinación del límite de detección y de cuantificación. .............................. 48

2.1. Preparación de la solución madre ..................................................................... 48

2.2. Construcción de las curvas de calibración ........................................................ 49

2.3. Cálculo de σy/x de la regresión para la determinación de los límites de detección

y cuantificación. ........................................................................................................ 51

2.4. Cálculo del límite de detección y de cuantificación ........................................... 53

ANEXO 3 .............................................................................................................. 55

Repetibilidad ..................................................................................................... 55

ANEXO 4 .............................................................................................................. 57

Replicabilidad ................................................................................................... 57

ANEXO 5 .............................................................................................................. 59

Recuperación ................................................................................................... 59

ANEXO 6 .............................................................................................................. 61

Muestras ........................................................................................................... 61

viii

6.1. Composición en porcentaje de los ácidos grasos de las muestras de aceite de

oliva analizadas ........................................................................................................ 61

6.2. Análisis estadístico ANOVA .............................................................................. 64

6.2.1. Análisis ANOVA para el ácido palmítico (C16:0) ................................ 64

6.2. 2. Análisis ANOVA para el ácido palmitoleico (C16:1 ) ........................ 65

6.2.3. Análisis ANOVA para el ácido heptadecanoico (C17:0) ..................... 66

6.2. 4. Análisis ANOVA para el ácido heptadecenoico (C17:1) .................... 67

6.2.5. Análisis ANOVA para el ácido esteárico (C18:0) ................................ 68

6.2.6. Análisis ANOVA para el ácido oleico (C18:1) ..................................... 69

6.2.7. Análisis ANOVA para el ácido linoleico (C18:2) ................................. 70

6.2.8. Análisis ANOVA para el ácido linolénico (C18:3) ............................... 71

6.2.9. Análisis ANOVA para el ácido araquídico (20:0) ................................ 72

6.2.10. Análisis ANOVA para el ácido eicosenoico (C20:1) ......................... 73

6.2.11. Análisis ANOVA para el ácido behénico (C22:0) .............................. 74

ix

INDICE DE TABLAS

Págs.

TABLA 1. Número de plantaciones por variedad de olivo. 4

TABLA 2. Composición de ácidos grasos, expresada en % de 9

ésteres metílicos según el CODEX STAN 33-1981,

COI y Reglamento Sanitario de los Alimentos Chile.

TABLA 3. Concentración (mg/mL) y porcentaje de los ácidos 16

palmítico, esteárico, oleico y linoleico, expresados

como porcentaje de ésteres metílicos.

TABLA 4. Intervalos de concentración de los principales ácidos 16

grasos ácido palmítico (C16:0), ácido esteárico

(C18:0), ácido oleico (C18:1), ácido linoleico (C18:2).

TABLA 5. Concentraciones de los ácidos grasos minoritarios

TABLA 6. Intervalos de concentración de ésteres metílicos de los 18

ácidos grasos minoritarios: palmitoleico (C16:1),

linoleico (C18:3), araquídico (C20:0), eicosenoico

(C20:1), behénico (C22:0).

TABLA 7. Intervalos de concentración (mg/mL), sensibilidad 21

(pendiente), intercepto, coeficiente de correlación y

error estándar de la sensibilidad y del intercepto, para

x

la determinación de la linealidad de los ácidos

palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), oleico (C18:1) y

linoleico (C18:2).

TABLA 8. Intervalos de concentración, sensibilidad (pendiente), 24

intercepto, coeficiente de correlación, error estándar de

la sensibilidad y del intercepto y desviación estándar

de la regresión para la determinación de la linealidad

de los ácidos palmitoleico (C16:1), linolénico (C18:3),

araquídico (C20:0), eicosenoico (C20:1) y behénico

(C22:0).

TABLA 9. Límites de detección y cuantificación del método 26

(mg/mL)

TABLA 10. Resultados de repetibilidad. Se presenta el promedio 27

(X) de los porcentajes de ésteres metílicos, la

desviación estándar (DE) y el coeficiente de variación

(CV) de cada ácido graso

TABLA 11. Resultados de replicabilidad. Se presenta el promedio 28

(X) de los porcentajes de ésteres metílicos, la

desviación estándar (DE) y el coeficiente de variación

(CV) de cada ácido graso

xi

TABLA 12. Porcentajes de recuperación (R) y desviación estandar 29

(DE) obtenido para los ácidos C16:0, C18:0, C18:1 y

C18:2.

TABLA 13. Perfil en ácidos grasos de aceites de oliva extra virgen, 30

variedades arbequina, picual y frantoio, expresado

como % de ésteres metílicos

TABLA 14. Preparación de solución madre, peso de cada 38

estándar (mg), concentración y composición en

porcentaje de los ésteres metílicos de los ácidos

palmítico, esteárico, oleico y linoleico.

TABLA 15. Concentración y área obtenida para la curva de 39

calibración del ácido palmítico C16:0

TABLA 16. Concentración y área obtenida para la curva de 39

calibración del ácido esteárico C18:0

TABLA 17. Concentración y área obtenida para la curva de 40

calibración del ácido oleico C18:1

TABLA 18. Concentración y área obtenida para la curva de 40

calibración del ácido linoleico C18:2

TABLA 19. Cantidades pesadas [mg] y concentración [mg/mL] de 41

cada ácido graso

xii

TABLA 20. Concentración y área obtenida para la curva de 42

calibración del ácido palmitoleico C16:1

TABLA 21. Concentración y área obtenida para la curva de 42

calibración del ácido linolénico C18:3

TABLA 22. Concentración y área obtenida para la curva de 42

calibración del ácido araquídico C20:0

TABLA 23. Concentración y área obtenida para la curva de 43

calibración del ácido eicosenoico C20:1

TABLA 24. Concentración y área obtenida para la curva de 43

calibración del ácido behénico C22:0

TABLA 25. Valores de yi e y’i obtenidos mediante la curva de 44

calibración del ácido palmitoleico.

TABLA 26. Valores de yi e y’i obtenidos mediante la curva de 44

calibración del ácido linolénico.

TABLA 27. Valores de yi e y’i obtenidos mediante la curva de 45

calibración del ácido araquídico.

xiii

TABLA 28. Valores de yi e y’i obtenidos mediante la curva de 45

calibración del ácido eicosenoico

TABLA 29. Valores de yi e y’i obtenidos mediante la curva de 45

calibración del ácido behénico.

TABLA 30. Valores de σy/x obtenido para cada ácido graso. 46

TABLA 31. Áreas de cada éster metílico de los ácidos grasos en 49

las 10 repeticiones de la muestra de aceite de oliva

variedad arbequina

TABLA 32. Composición en ácidos grasos expresada como 49

porcentaje de ésteres metílicos en las 10 muestras

analizadas, promedio, desviación estándar y

coeficiente de variación.

TABLA 33. Áreas de cada éster metílico de los ácidos grasos en 51

las 10 repeticiones de la muestra de aceite de oliva

variedad arbequina

TABLA 34. Composición en ácidos grasos expresada como 51

porcentaje de ésteres en las 10 muestras analizadas,

promedio, desviación estándar y coeficiente de

variación.

xiv

TABLA 35. Datos obtenidos para el cálculo de la recuperación del 52

ácido palmítico C16:0

TABLA 36. Datos obtenidos para el cálculo de la recuperación del 53

ácido esteárico C18:0

TABLA 37. Datos obtenidos para el cálculo de la recuperación del 53

ácido oleico C18:1

TABLA 38. Datos obtenidos para el cálculo de la recuperación del 54

ácido linoleico C18:2

TABLA 39. Composición de ácidos grasos expresado en 55

porcentaje de ésteres metílicos, promedio y desviación

estándar de 10 muestras analizadas de aceite de oliva

variedad picual

TABLA 40. Composición de ácidos grasos expresado en 55

porcentaje de ésteres metílicos, promedio y desviación

estándar de 10 muestras analizadas de aceite de oliva

variedad arbequina

TABLA 41. Composición de ácidos grasos expresado en 56

porcentaje de ésteres metílicos, promedio y desviación

estándar de 10 muestras analizadas de aceite de oliva

variedad frantoio

xv

INDICE DE FIGURAS

Págs.

FIGURA 1. Participación de las distintas regiones en el área 3

plantada con olivos

FIGURA 2. Variedades de olivos más plantadas expresadas 4

en porcentaje.

FIGURA 3. Curva de calibración para el ácido palmítico 22

(C16:0)

FIGURA 4. Curva de calibración para el ácido esteárico 22

(C18:0)

FIGURA 5. Curva de calibración para el ácido oleico (C18:1) 23

FIGURA 6. Curva de calibración para el ácido linoleico 23

(C18:2)

FIGURA 7. Curva de calibración para el ácido palmitoleico 24

(C16:1)

FIGURA 8. Curva de calibración para el ácido linolénico 25

(C18:3)

xvi

FIGURA 9. Curva de calibración para el ácido araquídico 25

(C20:0)

FIGURA 10. Curva de calibración para el ácido eicosenoico 25

(C20:1)

FIGURA 11. Curva de calibración para el ácido behénico 25

(C22:0)

FIGURA 12. Cromatograma aceite de oliva extra virgen, 33

variedad arbequina, (1) ác. Palmítico, (2) ác.

Palmitoleico, (3) ác. Heptadecanoico y

heptadecenoico, (4) ác. Esteárico, (5) ác. Oleico,

(6) ác. Linoleico, (7) ác. Araquídico, (8) ác.

Linolénico, (9) ác. Eicosenoico, (10) ác.

Behénico.

xvii

RESUMEN

El presente trabajo tuvo por objetivo validar e implementar una metodología analítica

por cromatografía de gases para la composición en ácidos grasos de un aceite de oliva extra

virgen, variedad arbequina.

Se determinó la linealidad del método de detección para los principales ácidos

grasos presentes en el aceite de oliva extra virgen, utilizando ésteres metílicos de los ácidos

palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), oleico (C18:1) y linoleico (C18:2) en contenidos similares

a los del aceite. Las curvas de calibración obtenidas presentaron un coeficiente de

correlación superior a 0,99.

Se determinó el límite de detección y de cuantificación para los ácidos grasos

minoritarios presentes en el aceite de oliva extra virgen, utilizando ésteres metílicos de los

ácidos palmitoleico (C16:1), linolénico (C18:3), araquídico (C20:0), eicosenoico (C20:1) y

behénico (C22:0) en contenidos similares a los del aceite. Las concentraciones del límite de

cuantificación (0,017-0,154 mg/ml) fueron superiores al límite de detección (0,005-0,046

mg/ml), cercanas al último punto de la curva de calibración.

La precisión se determinó por medio de la repetibilidad y la replicabilidad. La

repetibilidad se evaluó con 10 muestras de aceite de oliva extra virgen en un mismo día, por

un mismo analista y en el mismo instrumento. La replicabilidad se evaluó en 10 días

diferentes. Los coeficientes de variación obtenidos en repetibilidad y replicabilidad para los

ácidos grasos se ajustaron a la norma de la AOCS, excepto el ácido esteárico, que superó el

CV máximo permitido de 4%.

La exactitud se evaluó a través de la determinación de la recuperación en una

muestra de aceite sin y con (fortificación) la adición de los ésteres metílicos de los ácidos

palmítico, esteárico, oleico y linoleico. Se obtuvieron valores de recuperación entre 77 y

109%.

Se analizaron 26 muestras de aceites de oliva de las variedades arbequina, picual y

frantoio, encontrando diferencias significativas en el porcentaje de ésteres metílicos de

algunos ácidos grasos. La variedad arbequina presentó valores significativamente mayores

(p<0.05) en C16:0, C16:1, C17:0, C17:1 con respecto a las variedades picual y frantoio. La

variedad picual presento valores significativamente mayores (p<0,05) en C18:0 y C18:1 y

significativamente menores (p<0,05) de C18:2 y C18:3, con respecto a las variedades de

arbequina y frantoio. Para los ácidos 20:0, 20:1 y 22:0 no se encontraron diferencias

significativas.

xviii

SUMMARY

VALIDATION OF ANALYTICAL METHOD FOR THE DETERMINATION OF FATTY ACIDS IN EXTRA VIRGIN OLIVE OIL.

The objective of the present work was to validate and to implement the fatty acid

composition of a virgin extra olive oil, arbequina variety by gas chromatography.

The linearity of the detection method for the main fatty acids in the virgin extra olive oil was

determined using methyl esters of the palmitic (C16:0), stearic (C18:0), oleic (C18:1) and

linoleic (C18:2) acids with similar contents to those of the oil. The correlation coefficient of the

calibration curves obtained was above to 0.99.

The quantification and detection limit was determined for fatty acids minority in the virgin

extra olive oil, using methyl esters of the palmitoleic (C16:1), linolenic (C18:3), araquidic

(C20:0), eicosenoic (C20:1) and behenic (C22: 0) acids, in similar contents to those of the oil.

The concentration of the quantification limit (0,017-0,154 mg/ml) was higher than the detection

limit (0,005-0,046 mg/ml), near to the last point of the calibration curves.

Repeatability and replicability were used as the precision parameter. The repeatability was

evaluated with 10 virgin extra olive oil samples in a same day, by a same analyst and

instrument. The replicability was evaluated in 10 days different. The variation coefficients

obtained in repeatability and replicability for fatty acids were in according with the AOCS,

except for the stearic acid, with CV above 4%. The exactitude was evaluated through the determination of the recovery in an oil sample

without and with (fortification) the addition of methyl esters of palmitic, stearic, oleic and linoleic

acids. The recovery values were between 77 and 109%.

Twenty six olive oil samples of the arbequina, picual and frantoio varieties were analyzed,

significant differences in the percentage of methyl esters of fatty acids were found. The

arbequina variety showed values of C16:0, C16:1, C17:0, C17:1 significantly higher (p<0.05)

than picual and frantoio varieties. The picual variety showed values significantly higher

(p<0.05) for C18:0 and C18:1 and lower (p<0.05) for C18:2 and C18:3, respect to arbequina

and frantoio varieties. There were not significant differences for C20:0, C20:1 and C22:0

acids.

1

I. INTRODUCCION

1.1. Antecedentes generales

Desde su introducción en la Península Ibérica, probablemente por parte de

los romanos y árabes alrededor del siglo VI a.C., el olivo ha sido considerado como

símbolo de paz, felicidad y de la cultura mediterránea, además de producir aceite

de oliva. Del vocablo griego elaia deriva la palabra latina olea y olivum (olivo); de la

palabra hebrea zait viene la palabra árabe az-zait y zaitum que posteriormente han

dado lugar al nombre español de aceite y aceituna.

Grecia era una potencia en el cultivo de los olivos. Estos llevaron el olivo y

aceite de oliva por el Mediterráneo. Sin embargo, los romanos fueron los que se

encargaron de mejorar las técnicas de cultivo y de la elaboración de aceite de oliva,

el cual en la antigua Roma se utilizaba con fines terapéuticos, comestibles y

combustible. Durante la Edad Media la producción de aceite disminuyó

considerablemente ya que el mundo estaba dominado por las guerras, por lo cual el

aceite de oliva se consideraba un producto lujoso. Junto a la llegada de Cristóbal

Colón a América, a fines del siglo XV, llegaron olivos los cuales fueron distribuidos

principalmente en Perú, México, Argentina y Chile.

A pesar de que hoy en día los olivos se pueden encontrar en todos los

países del mundo, la zona Mediterránea sigue siendo el centro de mayor

producción, siendo España el país con más olivos y con mayor producción de

aceite de oliva. No obstante, existen países en donde la producción es más bien

pequeña pero creciente, Chile es un ejemplo.

2

El desarrollo de la producción del Aceite de Oliva ha venido evolucionando

de acuerdo al desempeño de la industria en los últimos años, dado el gran aumento

de la demanda tanto nacional como internacional, lo que incentiva a realizar

importantes inversiones en el nivel productivo, impulsándose así, a alcanzar

mayores volúmenes de producción.

Se estima que el 65% de las superficies plantadas están destinadas a la

producción de aceite de oliva y el resto a la elaboración de aceitunas de mesa.

Las exportaciones de aceite de oliva virgen chileno durante el año 2007

aumentaron un 58% y 70% en cantidad y valor respectivamente comparado con el

año 2006. Los principales países a los cuales Chile exporta son Estados Unidos

(42%), España (14%), Canadá, Venezuela y México con cifras cercanas al 5% cada

uno (Iglesias, 2008).

1.2. Distribución de Olivos en Chile

1.2.1. Norte Grande

I Región:

En esta zona la principal área productiva es el valle de Azapa, ya que las

condiciones agroclimáticas son excelentes, sin embargo el agua es escasa.

3

1.2.2. Norte Chico

III Región:

En la provincia de Huasco las plantaciones se encuentran distribuidas en

Freirina y Vallenar, pero la mayor superficie se encuentra en el valle de Huasco. En

esta zona el 80% de las plantaciones están destinadas a la producción de aceitunas

en salmuera, el restante 20% está dirigido a la producción de aceite de oliva,

encontrando variedades aceiteras tales como Empeltre y Liguria.

IV Región:

El 80% de la superficie plantada se encuentra en la comuna de Ovalle, la

cual se dedica principalmente a la producción de aceite. Las variedades aceiteras

que se pueden encontrar en esta zona son: Frantoio, Arbequina, Leccino, Empeltre

y Ascolano.

1.2.3. Zona Central

Región Metropolitana:

En la provincia de Melipilla se produce aceite principalmente con variedades

aceiteras tales como Frantoio, Leccino y Arbequina.

VII Región:

En la comuna de Sagrada Familia se localiza la mayoría de los olivos de la

región, ya que está la empresa olivícola, productora de aceite de oliva, más

4

importante de la región. Las variedades aceiteras que se encuentran en esta región

son Leccino, Frantoio, Empeltre y Liguria.

La distribución de la superficie nacional de acuerdo al número de

plantaciones de olivos en las distintas regiones del país se observa en la figura 1.

FIGURA 1. Participación de las distintas regiones en el área plantada con olivos.

1.3. Variedades de Olivos en Chile

La mayor parte de las variedades de olivos presentes en el mundo

provienen de la zona mediterránea de Europa, principalmente España e Italia.

Actualmente los cultivos chilenos más importantes son Arbequina, Frantoio,

Leccino, Picual y Coratina. En la tabla 1 se indica el número de plantaciones

correspondiente a cada variedad de olivos, los porcentajes correspondientes a las

variedades de los olivos se presentan en la figura 2. El cultivo de estos se

desarrolla principalmente entre las regiones de Tarapacá y de La Araucanía.

5

20%

17%

13%10%6%

34%

Variedades más Plantadas

Arbequina

Frantoio

Leccino

Picual

Coratina

Otros

TABLA 1. Número de plantaciones por variedad de olivo.

Fuente. Catastro asociación de olivicultores. Variedades desde 1940 hasta 2006, según datos encuesta.

Fuente. Catastro asociación de olivicultores. Variedades desde 1940 hasta 2006, según datos encuesta.

FIGURA 2. Variedades de olivos más plantadas expresadas en porcentaje.

Frantoio: Variedad italiana, muy común en la zona de La Toscana, y que se

ha propagado a numerosos países productores de aceite. Su fruto de tamaño

mediano, produce un aceite de mucha calidad organoléptica, muy frutal, de tonos

verdosos y muy estable, ya que es rico en polifenoles.

Variedad N° Plantaciones

Arbequina 36

Frantoio 30

Leccino 23

Picual 18

Coratina 10

Otros 60

6

Leccino: Se cultiva en toda la península italiana, ya que se utiliza como

agente polinizador. Es una variedad de fruto grande y de maduración muy pareja.

Su aceite es bastante amargo y tiene un sabor muy verde.

Coratina: Otra variedad italiana, que se cultiva principalmente en la región

de La Puglia (Bari). Gracias a su altísimo contenido de polifenoles generalmente se

utiliza para enriquecer mezclas y no como monovarietal. Su fruto es grande y

produce un aceite de color muy amarillento.

Arbequina: Esta variedad es originaria de España y entrega un fruto ovalado

y pequeño. Su aceite ha tenido muy buena aceptación en los mercados poco

habituados al consumo de aceite de oliva.

Picual: Proveniente de España, es la variedad más importante del mundo,

representa el 20% del total mundial y el 50% de las plantaciones ibéricas. Su fruto

es mediano muy estable, de color verde y con un sabor picante bien acentuado.

Otros tipos de olivos plantados corresponden a Nocellara del Belice,

Empeltre, Liguria, Barnea, Hojiblanca, Arbosana, Manzanilla, Bosana, Biancolilla,

Picholine, Suri, Cerasuola, Racimo (Racimo negra, racimo verde, racimo grando),

Santa Emiliana, Sevillana, Pendolino, Grappoic y Taggiasca

1.4. Variedades de Aceite de Oliva

7

El COI/T.15/NC nº 3/Rev. 1. 2003 denomina los diferentes tipos de aceites

de oliva según el modo de obtención y la acidez de éste. A continuación se

presentan los criterios de clasificación:

1.4.1. Aceites de oliva vírgenes:

Aceite obtenido del fruto del olivo únicamente por procedimientos mecánicos

u otros procedimientos físicos en condiciones, sobre todo térmicas, que no implique

la alteración del aceite y no hayan sufrido tratamiento alguno distinto del lavado,

decantación, el centrifugado y la filtración, se excluyen de los aceites obtenidos

mediante disolventes o por procedimientos de reesterificación, y toda mezcla con

aceites de otra naturaleza.

Dichos aceites son objeto de la clasificación y de las denominaciones

siguientes:

Aceite de Oliva Virgen Extra: aceite de oliva virgen con una acidez libre,

expresada en cantidad de ácido oleico, como máximo de 0,8g por 100g, siendo la

mediana de sus defectos 0, y la del atributo frutado superior a 0.

Aceite de Oliva Virgen: aceite de oliva virgen con una acidez libre máxima

de 2g por 100g, siendo la mediana de sus defectos inferior o igual a 2,5, y la del

atributo frutado superior a 0

8

Aceite de oliva Lampante: aceite de oliva virgen con una acidez libre,

superior a 2g por 100g siendo la mediana de sus defectos superior a 2,5, y la del

atributo frutado superior a 0.

1.4.2. Aceite de oliva refinado:

Aceite de oliva obtenido mediante el refinado de aceites de oliva vírgenes,

cuya acidez no podrá ser superior a 0,3 g por 100g, y cuyas otras características

son conformes a las establecidas por esta categoría.

1.4.3. Aceite de oliva – contiene exclusivamente aceites de oliva refinados y aceites

de oliva vírgenes:

Aceite de oliva constituido por una mezcla de aceite de oliva refinado y de

aceites de oliva vírgenes distintos del aceite lampante, cuya acidez libre no podrá

ser superior a 1g por 100g, y cuyas otras características son conformes a las

establecidas por esta categoría.

1.4.4. Aceite de orujo de oliva crudo:

Aceite obtenido a partir del orujo de oliva mediante tratamiento con

disolvente o por medios físicos, o que corresponda, con excepción de algunas

características determinadas, a un aceite de oliva lampante.

9

1.4.5. Aceite de orujo de oliva refinado:

Aceite obtenido mediante refino de aceite de oliva de orujo crudo, cuya

acidez libre, expresada en ácido oleico, no podrá ser superior a 0,3g por 100g y

cuyas otras características son conformes a esta categoría.

1.4.6. Aceite de orujo de oliva:

Aceite constituido por una mezcla de aceite de orujo de oliva refinado y de

aceites de oliva vírgenes distintos del lampante, cuya acidez libre, expresada en

ácido oleico, no podrá ser superior a 1g por 100g y cuyas otras características son

conformes a las establecidas para esta categoría.

De lo anterior se deduce que la Industria Olivícola Chilena posee un enorme

potencial de desarrollo, el cual requiere apoyo tecnológico de última generación

para mejorar la calidad de sus productos y defenderse de medidas para-

arancelarias que contribuyan en la penetración de los mercados internacionales.

1.5. Cualidades del aceite de oliva

El aceite de oliva es un alimento que posee grandes cualidades nutricionales

benéficas para la salud, que se basan en el contenido y composición de sus ácidos

grasos. Estos forman parte de los fosfolípidos de la membrana, siendo precursores

de sustancias de gran importancia y de diversas funciones fisiológicas, como las

prostaglandinas, prostaciclinas, tombroxanos y leucotrienos, sustancias a las que

10

se atribuyen funciones como las agregación y antiagregación plaquetaria, la

vasoconstricción o vasodilatación, respuestas de mayor o menor carácter

inflamatorio o antiinflamatorio.

Un aceite de oliva de excelente calidad (extra virgen) está compuesto

principalmente, por un ácido monoinsaturado, que es el ácido oleico (65-85%), de la

familia omega 9 y un ácido poliinsaturado, que es el linoleico (4-14%), el cual

pertenece al grupo de los omega 6, ambos con una marcada acción benéfica sobre

el sistema cardiovascular, además de que no contiene ácidos grasos trans. Se sabe

que una dieta rica en aceite de oliva, disminuye las concentraciones de colesterol

plasmático, tanto del total como del LDL, el cual es aterogénico, además mantiene y

eleva la concentración de colesterol HDL, el cual es antiaterogénico. Otro efecto de

una dieta rica en ácidos grasos monoinsaturados es que se favorece la formación

de compuestos con acción antiagregante y vasodilatadora, es decir, tiene un efecto

antitrombogénico. Así mismo, a nivel vascular el acido oleico disminuye la presión

sistólica y la diastólica. También muestra una influencia positiva en funciones

digestivas: gástricas, biliares, pancreáticas e intestinales (Serra, 2006).

Los ácidos grasos trans son ácidos grasos que contienen al menos un doble

enlace trans, a pesar de ser insaturados se comportan como ácidos grasos

saturados, aumentando el riesgo de enfermedades cardiovasculares, además la

incorporación de los ácidos grasos trans a los fosfolipidos de la membrana celular

provoca cambios en la permeabilidad y la hace más fácilmente oxidable, proceso

que acelera el envejecimiento celular (Hernández, 1999). Son producidos durante

los procesos de hidrogenación o de refinación de aceites y grasas. Sin embargo,

11

están presentes naturalmente en productos como la mantequilla y la carne de

rumiantes.

La presencia de isomeros trans de los ácidos oleico, linoleico y linolénico en

el aceite de oliva por sobre los niveles permitidos, podría indicar que existe alguna

adulteración con aceites vegetales hidrogenado ó aceites de oliva refinados, donde

se han aplicado altas temperaturas.

1.6. Legislación vigente para el aceite de oliva

En la tabla 2, se presenta la composición en ácidos grasos por

cromatografía de gases (% esteres metílicos), de acuerdo con el CODEX STAN 33-

1981 (Rev. 2-2003), COI/T.15/NC nº 3/Rev. 1 2003 y Reglamento Sanitario de los

Alimentos Decreto Supremo 977-96 Chile.

12

TABLA 2. Composición de ácidos grasos, expresada en % de ésteres metílicos según el CODEX STAN 33-1981, COI y Reglamento Sanitario de los Alimentos Chile. Acido Graso CODEX COI DS 977 96

C14:0 (Mirístico) 0 - 0,05 ≤0,05 < 0,1

C16:0 (Palmítico) 7,5 - 20,0 7,5 - 20,0 7 - 17

C16:1 (Palmitoleico) 0,3 - 3,5 0,3 - 3,5 0,3 - 4

C17:0 (Heptadecanoico) 0,0 - 0,3 ≤0,03 NE

C17:1 (Heptadecenoico) 0,0 - 0,3 ≤0,03 NE

C18:0 (Esteárico) 0,5 - 5,0 0,5 - 5,0 1 - 3

C18:1 (Oleico) 55,0 - 83,0 55,0 - 83,0 65 - 85

C18:2 (Linoleico) 3,5 - 21,0 3,5 - 21,0 4 - 14

C18:3 (Linolénico) NE ≤ 1,0 0,5 - 1,5

C20:0 (Araquídico) 0,0 - 0,6 ≤ 0,6 < 0,5

C20:1 (Eicosenoico) 0,0 - 0,4 ≤ 0,4 < 0,2

C22:0 (Behénico) 0,0 - 0,2 ≤ 0,2 < 0,2

C24:0 (Lignocérico) 0,0 - 0,2 ≤ 0,2 < 0,1

C18:1t 0,0 - 0,05 ≤0,05 NE

C18:2t + C18:3t 0,0 - 0,05 ≤0,05 NE

NE= no especificado

Para dar cumplimiento a estas especificaciones es que se hace importante

caracterizar los atributos de calidad de los aceites de esta industria como producto

de consumo nacional y de exportación. Para la caracterización es necesario llevar

a cabo procesos de análisis de los aceites en cuestión, a través de métodos

debidamente validados.

13

1.7. Validación de métodos analíticos

La validación según la FDA es el establecimiento de la evidencia

documental de que un procedimiento analítico conducirá, con un alto grado de

seguridad, a la obtención de resultados precisos y exactos, dentro de las

especificaciones y los atributos de calidad previamente establecidos. Otra definición

de una validación es “el procedimiento para demostrar que el método analítico es

aceptable para el fin que se pretende” (Harris, 2006).

La validación de los métodos analíticos es una actividad fundamental en los

sistemas de calidad de los laboratorios. El proceso de validación, guarda una

estrecha relación con la representatividad de los resultados, dependiendo del

objetivo de los análisis y del tipo de muestra (San Martín, 2000).

Existen dos tipos de validación: prospectiva y retrospectiva.

Una validación prospectiva es la que se realiza cuando la verificación del

cumplimiento de las condiciones establecidas para un proceso o método analítico,

se llevan a cabo antes de la comercialización del producto. Este tipo de validación

se aplica cuando se elabora un nuevo método analítico. Es típico en los

laboratorios de investigación y desarrollo, y se realiza de acuerdo con un protocolo

perfectamente planificado. Comprende el estudio de todos los criterios necesarios

para demostrar el buen funcionamiento del método.

Una validación retrospectiva es la que se realiza para verificar la idoneidad

del proceso analítico. La garantía de la calidad de un producto queda constatada a

14

través de los datos analíticos del producto ya comercializado. Se aplica a métodos

no validados previamente y de los que se tiene una amplia historia de resultados.

En una validación de métodos analíticos se miden los siguientes

parámetros: exactitud, precisión, selectividad, limite de detección y cuantificación.

La exactitud evalúa la cercanía existente entre el valor hallado en el analísis

respecto al valor verdadero o valor de referencia.

La precisión permite conocer la variabilidad del método determinando

replicabilidad y repetibilidad, en las que se evalúa la variabilidad del método

efectuando el analisis en las mismas condiciones (analista, instrumentos, reactivos,

dia) y la variabilidad del método sobre la misma muestra pero en diferentes

condiciones respectivamente.

Limite de detección determina la mínima cantidad del analito en la muestra

que puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada.

Límite de cuantificación determina la mínima cantidad del analito que puede

ser determinada con precisión y exactitud.

Selectividad determina si el método analítico en desarrollo entrega una

señal medible correspondiente sólo a la presencia de los analitos de la muestra sin

interferencias de impurezas, productos de degradación u otras sustancias

presentes en ella.

15

II. OBJETIVOS

2.1. Objetivo general

Validar e implementar una metodología por CG para Ácidos Grasos en

Aceite de Oliva extra virgen, variedad Arbequina.

2.2. Objetivos especificos

• Implementar la metodología analitica por CG para la determinación

de la composición en ácidos grasos en aceite de oliva extra virgen.

• Validar la metodología analítica mediante la aplicación de

parámetros de desempeño:

• Determinar el Intervalo de linealidad y sensibilidad del

método mediante una curva de calibración.

• Determinar el límite de detección y cuantificación del método.

• Determinar la precisión del método a partir de la replicabilidad

y la repetibilidad.

• Determinar la exactitud del método en términos de

recuperación.

16

III. MATERIALES Y METODOS

3.1. Materiales

- Aceite de Oliva extra virgen variedad Arbequina, cosecha 2007, obtenido de

Chile-Oliva, que se utilizó para la validación.

- 26 muestras de aceite de oliva extra-virgen, 10 muestras de variedad

arbequina, 10 muestras de variedad picual y 6 muestras de variedad frantoio,

obtenidas de Chile-Oliva.

3.1.1 Reactivos:

- Stándares de ésteres metílicos: ácido palmítico (C16:0), ácido

palmitoléico (C16:1), ácido esteárico (C18:0), ácido oleico (C18:1), ácido linoleico

(C18:2), ácido linolénico (C18:3), ácido araquídico (C 20:0), ácido eicosenoico

(C20:1), ácido behénico (C22:0) (Sigma).

- Hexano para análisis

- Metanol para análisis

- KOH para análisis

3.1.2 Equipo

Cromatografo: Hewlett Packard (HP) 5890 serie II con detector FID,

integrador HP 3395, con columna SP-2560 (100 m x 0,25 µm film x 0,20 d.i.;

SUPELCO, USA)

17

3.1.3 Material de Laboratorio

- Jeringa 1 µL para GC (SGE)

- Pipetas pasteur

- Micropipetas 200 y 1000 µL

- Tubos tapa rosca 5 mL

- Matraces aforados 5, 10 y 25 mL

3.2. Metodologia

3.2.1 Implementación de la técnica analítica para la determinacion de la

composición en ácidos grasos de aceite de oliva extra virgen.

Se implementó la metodología para la determinación de la composición en

ácidos grasos por cromatografía de gases considerando las recomendaciones del

Diario Oficial de las Comunidades Europeas REGLAMENTO (CE) Nº 796/2002 DE

LA COMISIÓN de 6 de mayo de 2002 por el que se modifica el Reglamento (CEE)

Nº 2568/91.

3.2.1.1. Preparación de la muestra

Los ésteres metílicos de los ácidos grasos se prepararon por

transesterificación en frio con una solución metanólica de hidróxido potásico, de

acuerdo al método, descrito en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas.

18

Procedimiento

En un tubo con tapa rosca de 5 ml se pesó aproximadamente 0,1g (7 gotas)

de la muestra de aceite. Se agregó 3 ml de hexano y se agitó. Luego, se añadió 0,5

ml de la solución metanólica 2 N de hidróxido potásico, se tapó, se cerró bien y se

agitó enérgicamente durante 30 segundos. Se dejó reposar hasta que la parte

superior de la solución quedó clara, aproximadamente 45 minutos. Luego, se

extrajo la fase de hexano que contenía los ésteres metílicos y se inyectó en el

cromatógrafo de gases. Es aconsejable mantener la solución en el frigorífico (<5ºC)

hasta el momento de realizar el análisis cromatográfico. No se recomienda guardar

la solución durante más de 12 horas.

3.2.1.2. Análisis Cromatográfico

Los ésteres metílicos se analizaron por cromatografía de gases de acuerdo

al siguiente programa:

Temperatura del inyector : 230ºC.

Temperatura del detector : 250ºC.

Programación de la temperatura del horno: temperatura inicial de 180ºC

durante 15 minutos y luego se aumentó a razón de 0,5ºC/min hasta 193ºC.

Gas portador: hidrógeno a una presión de 30 psi

Se inyectó un volumen de 1,0 µL de las soluciones Standard y de la

muestra. La identificación de los ésteres metílicos, se realizó con soluciones

patrones.

19

3.2.2. Aplicación de los parámetros de desempeño a las metodologías analíticas de

determinación de ácidos grasos.

3.2.2.1 Intervalo de linealidad y sensibilidad del método.

El intervalo de linealidad y sensibilidad del método se realizó para los

principales ácidos grasos presentes en el aceite de oliva extra-virgen,

correspondientes a los ácidos palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), oleico (C18:1) y

linoleico (C18:2), en porcentajes similares a los del aceite de oliva.

Para realizar la curva de calibración se preparó una solución estándar con

los ésteres metílicos de los ácidos grasos C16:0, C18:0, C18:1 y C18:2 en hexano.

La tabla 3 muestra la concentración y porcentaje de los ácidos grasos, expresados

como ésteres metílicos.

TABLA 3. Concentración (mg/mL) y porcentaje de los ácidos palmítico, esteárico, oleico y linoleico, expresados como porcentaje de ésteres metílicos.

Acido Graso mg/mL %

C16:0 (Ac. Palmítico) 8,28 12,4

C18:0 (Ac. Esteárico) 2,04 3,1

C18:1 (Ac. Oleico) 49,97 74,9

C18:2 (Ac. Linoleico) 6,44 9,6

Cada curva de calibración se construyó realizando 6 diluciones de la

solución estándar y se aforaron a 5 mL, de tal manera que el área de los ésteres

metílicos del aceite de oliva (muestra) pudiera ser interpolada en ella. En la tabla 4

se presenta el intervalo de concentración de cada éster metílico de ácido graso.

20

Cada dilución se inyectó en el CG, registrándose las áreas obtenidas, y

graficándolas frente a la concentración (mg/mL). De éstos gráficos se calculó la,

pendiente, intercepto y coeficiente de correlación (r).

TABLA 4. Intervalos de concentración de los principales ésteres metílicos de los ácidos palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), oleico (C18:1) y linoleico (C18:2).

Acido Graso Concentración

mínima (mg/mL) Concentración

máxima (mg/mL) C16:0 0,83 7,45

C18:0 0,20 1,84

C18:1 5,00 44,97

C18:2 0,64 5,80

El valor de la sensibilidad se obtuvo de la pendiente de la curva de

calibración de cada éster de ácido graso, de acuerdo a la ecuación.

Y = S* x + b (1)

Donde:

Y= Área

S= Sensibilidad (área*mL/mg)

X= Concentración (mg/mL)

b= Intercepto

3.2.2.2 Límite de detección y cuantificación del método

El límite de detección corresponde a la concentración mínima que puede

ser detectada por el instrumento usado en el análisis, y que arroja una señal

cualitativa. El límite de cuantificación corresponde a la concentración mínima en

que el instrumento puede producir una señal cuantificable.

21

El límite de detección y cuantificación del método para la determinación de

la composición en ésteres metílicos, en aceite de oliva extra virgen variedad

Arbequina, se calculó para las señales más pequeñas, correspondientes a los

ácidos palmitoleico (C16:1), linolénico (C18:3), araquídico (C20:0), eicosenoico

(C20:1) y behénico (C22:0). Se realizó el cálculo de los límites de detección y

cuantificación, a través de una curva de calibración de estos ácidos grasos, en

concentraciones cercanas a la real en Aceite de Oliva.

Para determinar el límite de detección y de cuantificación, se preparó una

solución estándar con los ésteres metílicos de los ácidos grasos C16:1, C18:3,

C20:0, C20:1, C22:0, en hexano. En la tabla 5 se presenta la concentración de los

ésteres metílicos de los ácidos grasos en mg/mL.

TABLA 5. Concentraciones de los ésteres metílicos de los ácidos grasos minoritarios.

Ácido graso Concentración [mg/mL]

C16:1 (Ac. Palmitoleico) 2,0

C18:3 (Ac. Linolénico) 4,9

C20:0 (Ac. Araquídico) 0,1

C20:1 (Ac. Eicosenoico) 1,0

C22:0 (Ac. Behénico) 2,1

La curva de calibración se preparó tomando 6 alícuotas de la solución

estándar, y se aforaron a 5 mL. En la tabla 6, se presentan los intervalos de

concentración utilizados en la curva de calibración. Cada dilución se inyectó en el

CG, registrándose las áreas obtenidas, y graficándolas frente a la concentración

(mg/mL). De éstos gráficos se calculó la pendiente, intercepto, coeficiente de

correlación (r) y desviación estándar.

22

TABLA 6. Intervalos de concentración de ésteres metílicos de los ácidos grasos minoritarios: palmitoleico (C16:1), linoleico (C18:3), araquídico (C20:0), eicosenoico (C20:1), behénico (C22:0).

Ácidos Grasos

Concentración mínima (mg/mL)

Concentración máxima (mg/mL)

C16:1 0,080 1,00

C18:3 0,020 0,69

C20:0 0, 016 0, 56

C20:1 0, 020 0, 40

C22:0 0, 009 0, 30

Se utilizó la desviación estándar de la regresión de las curvas de calibración

de cada ácido graso, la cual se calculó de acuerdo a la ecuación 2.

σy/x=√ Σ(yi - y’i)2 (2) (n-2)

Donde:

σ = Desviación estándar de la regresión

yi = Valor observado del punto en la ordenada

y’i= Valor teórico del punto obtenido por la predicción del modelo de

regresión

n = Número de puntos de la curva de calibración.

Los límites de detección y cuantificación se calcularon a través de las

ecuaciones 3 y 4.

Límite de detección (LD) es: CLD= 3σ (3) S

23

Límite de cuantificación (LC) es: CLC= 10σ (4) S

Donde:

CLD= Concentración del limite de detección (mg/mL)

CLC= Concentración del limite de cuantificación (mg/mL)

σ = Desviación estándar de la regresión (área).

b = intercepto de la curva de calibración (área)

S= pendiente de la curva de calibración (área* mL/mg)

3.2.2.3 Medidas de precisión

Precisión: es el parámetro que expresa la cercanía de coincidencia o grado

de dispersión, entre una serie de mediciones obtenidas de múltiples muestreos de

una misma muestra homogenea bajo condiciones establecidas. Se evalúa a través

de los parámetros de replicabilidad y repetibilidad.

Repetibilidad: Se determinó la repetibilidad de ésteres metílicos de una

misma muestra de aceite de oliva extra virgen, variedad arbequina. Se metilaron 10

muestras de aceite de oliva extra virgen, variedad arbequina, de acuerdo al método

de metilación detallado en 2.1.1 y se inyectaron en el cromatógrafo de gases, de

acuerdo al método detallado en 2.1.3, en el mismo día. Se calcularon, los valores

promedio, desviación estándar y porcentaje de coeficiente de variación.

Replicabilidad: Se determinó la replicabilidad de ésteres metílicos de una

misma muestra de aceite de oliva extra virgen variedad arbequina. Se metilaron 10

24

muestras de aceite de oliva extra virgen, variedad arbequina, de acuerdo al método

de metilación detallado en 2.1.1 y se inyectaron en el cromatógrafo de gases, de

acuerdo al método detallado en 2.1.3, en distintos días. Se calcularon los valores

promedio, desviación estándar y porcentaje de coeficiente de variación.

3.2.2.4.Medidas de exactitud: Recuperación.

Se metilaron dos muestras de aceite de oliva en paralelo, una real y una

fortificada con estándares dentro del intervalo de linealidad del método. Se

obtuvieron los datos de las áreas de ésteres metílicos de los ácidos grasos: ácido

palmítico (C16:0), ácido esteárico (C18:0), ácido oleico (C18:1), y ácido linoleico

(C18:2) y se calcularon los porcentajes (%) de recuperación.

Para el cálculo de los porcentajes de recuperación, se procedió de la

siguiente forma:

1º Se inyectó en el CG una muestra real y se obtuvo un área para cada

éster metílico del ácido graso a medir.

2º Se agregó una cantidad conocida de cada éster metílico de ácido graso a

la muestra (concentración fortificación agregada), se inyectó en el CG y se obtuvo

el área correspondiente a cada ácido graso con la respectiva fortificación.

3º Las áreas fueron restadas y con este resultado (área de la fortificación) se

calculó la concentración obtenida de cada ácido graso, utilizando las curvas de

calibración de ellos (concentración fortificación obtenida).

25

El porcentaje de recuperación se calculó de acuerdo con la ecuación 5

% Recuperación = Cfo * 100 (5) Cfa

Donde:

Cfo= Concentración fortificación obtenida

Cfa= Concentración fortificación agregada

26

IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

4.1. Determinación de la linealidad y sensibilidad

En la tabla 7 se muestra el intervalo de concentración (mg/mL) de los

estándares de los ésteres metílicos de los ácidos grasos, sensibilidad (pendiente),

intercepto, coeficiente de correlación y error estándar de la sensibilidad y del

intercepto, para la determinación de los ácidos palmítico, esteárico, oleico y

linoleico, los cuales corresponden a los principales ácidos grasos presentes en el

aceite de oliva. El intervalo de concentración estudiado correspondió al que

generalmente presentan los aceites de oliva extra virgen (variedad arbequina)

TABLA 7. Intervalos de concentración (mg/mL), sensibilidad (pendiente), intercepto, coeficiente de correlación y error estándar de la sensibilidad y del intercepto, para la determinación de la linealidad de los ácidos palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), oleico (C18:1) y linoleico (C18:2).

Acido graso

Intervalo de concentración

(mg/mL) S ES* N ES** r

C16:0 7,45 - 0,83 607561 7888 63450 37892 0,9996 C18:0 1,84 - 0,20 811465 49715 155547 58864 0,9923 C18:1 44,97 - 5,00 587630 12506 -100040 362599 0,9991C18:2 5,80 - 0,64 480022 4925 -27759 18282 0,9998 S= sensibilidad (pendiente de la curva), n= intercepto, ES= error estándar, ES* de la pendiente, ES** del intercepto

En las figuras 3, 4, 5 y 6, se muestran los gráficos de área versus

concentración (mg/mL) para los estándares de los ésteres metílicos de los ácidos

palmítico, esteárico, oleico y linoleico, respectivamente.

27

En la tabla 7 y las figuras 3-6, se observa una alta correlación, dada por el

coeficiente de correlación r para las curvas de calibración de cada uno de los ácidos

grasos e intervalo de concentración estudiados.

Curva Calibración C16:0

0500000

100000015000002000000250000030000003500000400000045000005000000

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00

Concentración [mg/mL]

área

FIGURA 3. Curva de calibración para el ácido palmítico (C16:0)

Curva Calibración C18:0

0200000400000600000800000

100000012000001400000160000018000002000000

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 2,00

Concentración [mg/mL]

área

s

FIGURA 4. Curva de calibración para el ácido esteárico (C18:0)

28

Curva Calibración C18:1

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

30000000

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00

Concentración [mg/mL]

área

s

FIGURA 5. Curva de calibración para el ácido oleico (C18:1)

Curva Calibración C18:2

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00

Concentración [mg/mL]

área

s

FIGURA 6. Curva de calibración para el ácido linoleico (C18:2)

4.2 Limite de detección y de cuantificación

En la tabla 8 se muestra el intervalo de concentración (mg/mL) de los

estándares de los ésteres metílicos de los ácidos grasos, sensibilidad (pendiente),

intercepto, coeficiente de correlación, error estándar de la sensibilidad y del

intercepto y desviación estándar de la regresión, para la determinación de los

29

ácidos palmitoleico, linolénico, araquídico, eicosenoico y behénico, los cuales

corresponden a los ácidos grasos presentes en menor concentración en aceites de

oliva. El intervalo de concentración estudiado correspondió al que generalmente

presentan los aceites de oliva extra-virgen (variedad arbequina).

TABLA 8. Intervalos de concentración, sensibilidad (pendiente), intercepto, coeficiente de correlación, error estándar de la sensibilidad y del intercepto y desviación estándar de la regresión para la determinación de la linealidad de los ácidos palmitoleico (C16:1), linolénico (C18:3), araquídico (C20:0), eicosenoico (C20:1) y behénico (C22:0).

Acido graso

Intervalo de concentración

(mg/mL) S ES* n ES** r σ

C16:1 1,00 - 0,20 324939 5466 1682 3314 0,9999 4989 C18:3 0,692 - 0,099 34484 673 14914 227 0,9998 188 C20:0 0,563 - 0,040 377935 15667 1622 5171 0,9974 1061 C20:1 0,200 - 0,020 576894 18522 -3581 4367 0,9987 983 C22:0 0,300 - 0,128 381434 14319 -1236 2809 0,9986 2174

S= sensibilidad (pendiente del gráfico área vs concentración), n= intercepto (del gráfico área vs concentración), ES= desviación estándar, ES* de la pendiente, ES** del intercepto, σ = desviación estándar de la regresión.

En las figuras 7, 8, 9, 10 y 11 se muestran los gráficos de área versus

concentración (mg/mL) para los ácidos palmitoleico, linolénico, araquídico,

eicosenoico y behénico, respectivamente.

En la tabla 8 y las figuras 7-11, se observa una alta correlación, dada por el

coeficiente de correlación (r) para las curvas de calibración de cada uno de los

ácidos grasos e intervalos de concentración estudiados.

30

Curva Calibración C16:1

050000

100000150000200000250000300000350000

0,150 0,250 0,350 0,450 0,550 0,650 0,750 0,850 0,950 1,050Concentración (mg/mL)

FIGURA 7. Curva de calibración para el ácido palmitoleico (C16:1)

Curva Calibración C18:3

15000

20000

25000

30000

35000

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600Concentración (mg/mL)

Are

a

FIGURA 8. Curva de calibración para el ácido linolénico (C18:3)

Curva Calibración C20:0

0

50000

100000

150000

200000

250000

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600Concentración (mg/mL)

Are

a

FIGURA 9. Curva de calibración para el ácido araquídico (C20:0)

Curva Calibración C20:1

-100001000030000500007000090000

110000130000150000

0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250Concentración (mg/mL)

Are

a

FIGURA 10. Curva de calibración para el ácido eicosenoico (C20:1)

31

Curva Calibración C22:0

020000

400006000080000

100000120000

0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350Concentración (mg/mL)

Are

a

FIGURA 11. Curva de calibración para el ácido behénico (C22:0)

En la tabla 9 se presenta el limite de detección y de cuantificación (mg/ mL)

determinado para los ácidos palmitoleico, linolénico, araquídico, eicosenoico y

behénico, calculado en relación a la desviación estándar de la regresión con la que

se obtuvo la curva de calibración de cada ácido graso.

TABLA 9.Límites de detección y cuantificación del método (mg/mL) Acido graso LD LC

C16:1 0,046 0,154

C18:3 0,016 0,055

C20:0 0,009 0,029

C20:1 0,005 0,017

C22:0 0,017 0,057 LD= límite de detección; LC= Límite de cuantificación

Los valores de limite de detección y cuantificación se encuentran debajo del

último punto de la curva de calibración de todos los ácidos grasos. Los ácidos

palmitoleico, linolénico, araquídico, eicosenoico y behénico tienen un limite de

detección de 0,046, 0,016, 0,009, 0,005, 0,017 mg/mL respectivamente, lo cual

quiere decir que si la concentración de estos ácidos grasos en un aceite de oliva

está por debajo de estos valores, no serán detectados, es decir, no arrojarán una

32

señal detectable. Si bién un valor mayor al límite de detección arroja una señal,

ésta es sólo una medida cualitativa, ya que los valores de límite de cuantificación

son mayores. Los valores de límite de cuantificación para los ácidos palmitoleico,

linolénico, araquídico, eicosenoico y behénico son 0,154, 0,055, 0,029, 0,017,

0,057 mg/mL, de tal forma que cuando la concentración de estos ácidos grasos en

el aceite de oliva se encuentra sobre estos valores se podrá asegurar que se está

cuantificando certeramente.

4.3 Medidas de Precisión

4.3.1 Replicabilidad

En la tabla 10 se presenta el promedio del porcentaje de ésteres metílicos,

la desviación estándar y el coeficiente de variación para los ácidos grasos mirístico,

palmítico, palmitoleico, heptadecanoico, heptadecenoico, esteárico, oleico,

linoleico, linolénico, araquídico, eicosenoico, behénico y lignocérico. Estos valores

fueron calculados para la determinación de la replicabilidad del método.

33

TABLA 10. Resultados de replicabilidad. Se presenta el promedio (X) de los porcentajes de ésteres metílicos, la desviación estándar (DE) y el coeficiente de variación (CV) de cada ácido graso

Ac.Graso X DE CV

C14:0 (ác. Mirístico) tz -- --

C16:0 (ác. Palmítico) 12,45 0,14 1,11

C16:1 (ác. Palmitoleico) 1,08 0,01 1,04

C17:0 (ác. Heptadecanoico) 0,10 0,00 1,94

C17:1 (ác. Heptadecenoico) 0,22 0,00 1,85

C18:0 (ác. Esteárico) 2,11 0,09 4,16

C18:1 (ác. Oleico) 73,15 0,12 0,17

C18:2 (ác. Linoleico) 8,97 0,16 1,74

C18:3 (ác. Linolénico) 0,31 0,00 0,88

C20:0 (ác. Araquídico) 0,40 0,00 0,83

C20:1 (ác. Eicosenoico) 0,47 0,01 2,86

C22:0 (ác. Behénico) 0,14 0,00 3,07

C24:0 (ác. Lignocérico) tz -- --

tz: trazas

La AOAC (Association of Official Analytical Chemists) indica que para los

analitos que se encuentran entre un 0,1 - 1,0%, 1,0 - 10,0% y sobre 10%, el CV

máximo permitido es de un 8%, 4% y 2%, respectivamente. En este contexto la

mayoría de los ácidos grasos que componen el aceite de oliva, C17:0, C17:1,

C18:3, C20:0, C20:1 y C22:0, se encuentran en el rango entre 0,1-1% y

presentaron CV menores a un 3%. Los ácidos C16:1 y C18:0, en un rango entre 1-

10% presentaron CV de 1 y 4,2%, respectivamente. Para el caso de los que se

encuentran sobre un 10%, como los ácidos C16:0 y C18:1, el CV fue de 1 y 0,17%,

respectivamente. Por lo tanto el ácido esteárico es el único que no cumple con

estos criterios.

34

4.3.2 Repetibilidad

En la tabla 11 se presenta el promedio del porcentaje de ésteres metílicos,

la desviación estándar, coeficiente de variación de los porcentajes de los ácidos

grasos mirístico, palmítico, palmitoleico, heptadecanoico, heptadecenoico,

esteárico, oleico, linoleico, linolénico, araquídico, eicosenoico, behénico,

lignocérico. Estos valores fueron calculados para la determinación de la

repetibilidad del método.

TABLA 11. Resultados de repetibilidad. Se presenta el promedio (X) de los porcentajes de ésteres metílicos, la desviación estándar (DE) y el coeficiente de variación (CV) de cada ácido graso

Ac. Graso X (%) DE CV

C14:0 (ác. mirístico) tz -- --

C16:0 (ác. palmítico) 12,56 0,21 1,70

C16:1 (ác. palmitoleico) 1,09 0,02 1,58

C17:0 (ác. heptadecanoico) 0,10 0,00 1,96

C17:1 (ác. heptadecenoico) 0,21 0,00 2,33

C18:0 (ác. esteárico) 2,33 0,33 14,10

C18:1 (ác. oleico) 72,73 0,48 0,66

C18:2 (ác. linoleico) 8,77 0,29 3,26

C18:3 (ác. linolénico) 0,31 0,02 6,14

C20:0 (ác. araquídico) 0,40 0,01 1,77

C20:1 (ác. eicosenoico) 0,45 0,03 6,30

C22:0 (ác. behénico) 0,13 0,01 5,98

C24:0 (ác. lignocérico) tz -- --

tz: trazas

Los ácidos C17:0, C17:1, C18:3, C20:0, C20:1 y C22:0, en un rango de 0,1-

1%, presentaron valores de CV menores a un 7%, respondiendo satisfactoriamente

al criterio del valor máximo del coeficiente de variación permitido (<8%) por la

35

AOAC para este rango de concentración del analito. Para los ácidos grasos en el

intervalo de concentración de 1-10%, el ácido C16:1, cumple con tener un CV< 4%,

en cambio, el ácido C18:0 presentó un valor muy superior (14%) al aceptado. Los

ácidos C16:0 y C18:1, con porcentajes sobre 10%, presentaron valores de CV

menores al 2%. Por lo tanto el ácido esteárico es el único que no cumple con estos

criterios.

Los valores obtenidos de CV para la repetibilidad fueron superiores a los de

replicabilidad, lo que se puede explicar por el cambio de día, ya que las otras

condiciones (analista e instrumento) no fueron variadas durante el estudio. De esta

forma se puede concluir que el cambio de día de análisis de una muestra de aceite

de oliva afecta los parámetros que se está midiendo, sin perjuicio de que los

resultados que se obtengan sean certeros.

4.4 Medidas de exactitud

4.4.1. Recuperación

En la tabla 12 se presentan los porcentajes de recuperación,

desviación estándar y coeficiente de variación de los ácidos palmítico, oleico,

linoleico y linolénico, los cuales se presentan en mayor porcentaje en el aceite de

oliva.

36

TABLA 12. Porcentajes de recuperación (R) y desviación estandar (DE) obtenido para los ácidos C16:0, C18:0, C18:1 y C18:2.

Acido Graso %R DE C16:0 109 9,6

C18:0 77 9,3

C18:1 101 14,9

C18:2 91 18,2

Los resultados de recuperación obtenidos (Tabla 12), alcanzaron valores

entre un 77 y 109%. El ácido esteárico presentó el menor valor de recuperación.

Los ácidos palmítico, oleico y linoleico presentan un alto valor de recuperación, lo

que se traduce en que el método es exacto para estos ácidos grasos, pero es

poco exacto para el ácido esteárico que presenta una recuperación más baja.

4.4 Muestras analizadas

Se analizó el perfil en ácidos grasos de un conjunto de muestras (n= 26) de

aceites de oliva extra virgen, de las variedades arbequina, frantoio y picual. La

distribución de los ácidos grasos y su desviación estándar se muestra en la tabla

13. La composición en ácidos grasos de cada muestra se detalla en anexo 6.1.

37

TABLA 13. Perfil en ácidos grasos de aceites de oliva extra virgen, variedades arbequina, picual y frantoio, expresado como % de ésteres metílicos

Variedad aceite / ácido graso

Arbequina (n=10)

Picual (n=10)

Frantoio (n=6)

C16:0 (Ác. Palmítico) 12,5 ± 1,10a 11,2 ± 0,83b 11,3 ± 0,56b

C16:1 (Ác. Palmitoleico) 1,0 ± 0,21a 0,9 ± 0,14b 0,9 ± 0,09b

C17:0 (Ác. Heptadecanoico) 0,1 ± 0,03a 0,04 ± 0,02b

0,06 ± 0,01b

C17:1 (Ác. Heptadecenoico) 0,2 ± 0,06a 0,09 ± 0,03b

0,09 ± 0,03b

C18:0 (Ác. Esteárico) 2,5 ± 0,27b 2,9 ± 0,30a

2,5 ± 0,35b

C18:1 (Ác. Oleico) 74,7 ± 2,50a 79,6 ± 0,88b

76,5 ± 1,04c

C18:2 (Ác. Linoleico) 6,8 ± 1,18b 3,4 ± 0,38a

6,5 ± 0,67b

C18:3 (Ác. Linolénico) 0,3 ± 0,05b 0,2 ± 0,04b

0,3 ± 0,04a

C20:0 (Ác. Araquídico) 0,4 ± 0,04a 0,4 ± 0,03a 0,4 ± 0,03a

C20:1 (Ác. Eicosenoico) 0,7 ± 0,17a 0,8 ± 0,12a 0,8 ± 0,10a

C22:0 (Ác. Behénico) 0,1 ± 0,05a 0,09 ± 0,05a 0,1 ± 0,06a

Letras distintas significa diferencia estadística significativa a un nivel de confianza de 95%

En la tabla 13 se observa que la variedad arbequina presentó un contenido

significativamente mayor (p<0,05) de ácidos palmítico, palmitoleico, heptadecanoico

y heptadecenoico con respecto a las variedades picual y frantoio. La variedad picual

presentó un contenido significativamente mayor (p<0,05) de ácido esteárico y un

contenido significativamente menor (p<0,05) de ácido linoleico, con respecto a las

variedades arbequina y frantoio. El ácido oleico presentó diferencias significativas

en las tres variedades. Los ácidos araquídico, eicosenoico y behénico no presentan

diferencias estadísticas significativas (Anexo 6.2). Uno de los factores que más

afecta a la distribución de ácidos grasos, es la variedad de la aceituna y su grado

de maduración (Pérez- Arquillué et al, 2003).

El CODEX STAN 33-19818(Rev. 2-2003) indica intervalos de concentración

para cada ácido graso. La media de concentración de los ácidos grasos de las

muestras de las variedades arbequina, picual y frantoio cumplen con estos

38

intervalos, con excepción del C20:1(0,7%; 0,8%; 0,8%, respectivamente) valores

superiores al rango establecido por esta norma para este ácido graso (0,0-0,4%).

La variedad picual presentó un contenido de ácido linoleico menor (3,4%) al

establecido por el reglamento (3,5- 21,0%). Un comportamiento similar para el

C20:1 (≤0,4%) y C18:2 (3,5-21,0%) se observó al comparar los valores de

composición en ácidos grasos con la norma COI/T.15/NC nº3/Rev.15 de diciembre

de 2003.

El DS 977-96 Reglamento Sanitario de los Alimentos, establece que los

aceites de oliva vírgenes deben cumplir con intervalos de concentración de los

ácidos grasos, expresados en % de ésteres metílicos. La media de las muestras

analizadas de las variedades arbequina, picual y frantoio cumplen estos

parámetros, con excepción del C20:1(0,7%; 0,8%; 0,8%) en cada una de ellas,

cuyos valores son superiores a los limites establecidos por esta norma (<0,2%), y

del C18:3 (0,3%; 0,2%; 0,3%), cuyos porcentajes son inferiores a los límites

establecidos por esta normativa para este ácido graso (0,5 - 1,5%). En esta

normativa no se consideran los ácidos C17:0 y C17:1, por lo que no se puede

establecer si los valores obtenidos están dentro o fuera del intervalo de aceptación.

El ácido palmítico, principal ácido graso saturado en los aceites de oliva,

presenta valores medios de 12,5, 11,2 y 11,3% para arbequina, picual y frantoio,

respectivamente. Se trata de valores medios que concuerdan a los descritos para

las variedades picual (11,9%) y frantoio (10,9%), pero no para arbequina (20,1%)

(Moyano et al., 2005; Sánchez Casas 2003, Aguilera 2003). Otro de los principales

ácidos grasos saturados es el ácido esteárico, cuyo rango varía entre 2,2 - 2,8 %;

2.6 - 3.2% y 2,2 - 2,9% para los aceites de las variedades arbequina, picual y

39

frantoio, respectivamente. Estos resultados son similares a los descritos para la

variedad picual (2,7%) y superiores a los descritos para arbequina (1,38%) y

frantoio (1,5%) (Moyano et al 2005, Sánchez Casas 2003, Aguilera 2003).

En cuanto a los ácidos insaturados destaca, por su importancia nutricional

(antes mencionada), el ácido oleico, el cual se encuentra por sobre un 70% en las

muestras de las tres variedades, de éstas, picual presenta el valor más elevado

(79,7%), le sigue frantoio (76,5%) y finalmente arbequina (74,7%). Estos resultados

concuerdan con diversos autores (INIA Uruguay 2007, Aguilera 2003, Sánchez

Casas 2003, Matías et al 2003) para la variedad picual (79,31%), pero no para las

variedades arbequina (66,96%) y frantoio (78,32%). El contenido de ácido linoleico

de la variedad picual (3,4%) está de acuerdo con el perfil descrito por Sánchez

Casas (2003) (3,48%) y el de la variedad frantoio (6,5%) con el de Aguilera (2003)

(6,79%). La variedad arbequina (6,8%) se aleja de los valores descritos como

aceptables para esta variedad (10,75%) (INIA Uruguay 2007).

El ácido linolénico, que presenta el mayor grado de insaturación del aceite

de oliva, muestra un contenido de 0,3% para la variedad arbequina, similar a los

valores reportados por Motilva (2001) de 0,34%. Sin embargo para las variedades

picual (0,2%) y frantoio (0,3%) se han encontrado valores mayores (0,73%) y

menores (0,48%), respectivamente.(INIA Uruguay, 2007).

En la figura 12, se muestra un cromatograma de aceite de oliva, en donde

se ve claramente el predominio de los ácidos grasos insaturados (C16:1, C17:1,

C18:1, C18:2, C18:3, C201) por sobre los saturados, (C16:0, C17:0, C18:0, C20:0,

40

C22:0), en especial del ácido monoinsaturado C18:1, que es el que caracteriza al

aceite de oliva, por su alto contenido.

FIGURA 12. Cromatograma aceite de oliva extra virgen, variedad arbequina, (1) ác. Palmítico, (2) ác. Palmitoleico, (3) ác. Heptadecanoico y heptadecenoico, (4) ác. Esteárico, (5) ác. Oleico, (6) ác. Linoleico, (7) ác. Araquídico, (8) ác. Linolénico, (9) ác. Eicosenoico, (10) ác. Behénico.

41

V. CONCLUSIONES

La metodología analítica implementada resultó ser adecuada para cumplir

con los objetivos propuestos en este estudio ya que permitió la determinación de los

ácidos grasos del aceite de oliva dentro del rango que pueden esperarse en un

aceite de oliva comercial, con excepción del ácido esteárico que no cumplió con los

valores normados de CV en repetibilidad y replicabilidad.

Las técnicas para la determinación de los ácidos grasos resultaron ser

lineales, entre 0,83 - 7,45 mg/mL; 0,20 - 1,84 mg/mL; 5,00 - 44,97 mg/mL y 0,64 -

5,80 mg/mL para los ácidos palmítico, esteárico, oleico y linoleico, respectivamente,

presentando en todos los casos un coeficiente de correlación superior a 0,99.

Los ácidos mirístico y lignocérico no arrojaron señal detectable por el

integrador, en ninguna de las muestras analizadas para la determinación de la

repetibilidad y reproducibilidad, por lo que se concluye que se encuentran en trazas.

Con los resultados obtenidos en la repetibilidad y replicabilidad se afirma

que la metodología cumple con la precisión por repetibilidad y replicabilidad para

todos los ácidos grasos, excepto para el ácido esteárico.

Los valores obtenidos para la recuperación de los ácidos palmítico (109%),

oleico (101%) y linoleico (91%) son aceptables, y se puede concluir que el método

es exacto para la determinación de estos ácidos grasos. El ácido esteárico

presentó una recuperación baja de (77%).

42

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45

VII. ANEXOS

ANEXO 1

Determinación de la linealidad y sensibilidad

La determinación de la linealidad y la sensibilidad se realizó a través de una

curva de calibración para cada éster metílico de ácido graso que se analizó. (ácidos

palmítico, esteárico, oleico y linoleico)

1.1. Preparación de la solución madre de los principales ácidos grasos presentes en

el aceite de oliva extra virgen.

Se preparó 25 mL de la solución de los ésteres metílicos de los ácidos

palmítico, esteárico, oleico y linoleico, los cuales se encontraban en una

composición porcentual similar a la del aceite de oliva. Las cantidades pesadas, la

concentración [mg/mL] y el porcentaje de cada éster de ácido graso en la solución

se presentan en la tabla 14.

TABLA 14. Preparación de solución madre, peso de cada estándar (mg), concentración y composición en porcentaje de los ésteres metílicos de los ácidos palmítico, esteárico, oleico y linoleico.

Ácido graso Peso (mg) mg/ mL % solución

C16:0 206,90 8,28 12,40

C18:0 51 2,04 3,06

C18:1 1249,30 49,97 74,89

C18:2 161 6,44 9,65

46

1.2. Construcción de las curvas de calibración

Se prepararon entre 4 y 7 diluciones de la solución madre y se inyectaron en

el CG. Con los datos de área obtenidos para cada concentración de cada éster de

ácido graso, se construyó una curva de calibración que se usó en la determinación

de la linealidad y la sensibilidad. Las tablas 15, 16, 17 y 18 muestran la

concentración del éster metílico del ácido graso en la solución y el área obtenida

para cada una de ellas, presentándose además la ecuación de la curva de

calibración obtenida y el coeficiente de correlación.

TABLA 15. Concentración y área obtenida para la curva de calibración del ácido palmítico C16:0

Y= 607561X + 63450 r= 0,9996

Conc[mg/mL] Área

7,45 4566179

6,62 4143296

4,97 3020626

3,31 2106970

1,66 1071276

0,83 564173

47

TABLA 16. Concentración y área obtenida para la curva de calibración del ácido esteárico C18:0

Y= 811465X + 155547 r= 0,9923

TABLA 17. Concentración y área obtenida para la curva de calibración del ácido oleico C18:1

Y= 587630X - 100040 r= 0,9991

TABLA 18. Concentración y área obtenida para la curva de calibración del ácido linoleico C18:2

Y= 480022X - 27759 r= 0,9998

Conc[mg/mL] Área

1,22 1261959

0,82 826872

0,41 488378

0,20 280290

Conc[mg/mL] Área

44,97 26393072

39,98 23796528

29,98 16750704

19,99 11816640

9,99 5730778

5,00 3003653

Conc[mg/mL] Área

5,80 2743378

5,15 2467896

2,58 1195356

1,29 577057

0,64 298660

48

ANEXO 2

Determinación del límite de detección y de cuantificación.

La determinación de los límites de detección y de cuantificación se realizó a

través de la construcción de curvas de calibración para los ácidos grasos en menor

porcentaje en el aceite de oliva(ácidos palmitoleico, linolénico, araquídico,

eicosenoico y behénico).

2.1. Preparación de la solución madre

Se preparó 5 mL de solución de los estándares de los ésteres metílicos de

los ácidos palmitoleico, linolénico, araquídico, eicosenoico y behénico, con una

concentración parecida al aceite de oliva. Las cantidades pesadas y la

concentración de cada éster metílico de ácido graso en la solución se presentan en

la tabla 19.

TABLA 19. Cantidades pesadas [mg] y concentración [mg/mL] de cada ácido graso Acido graso Peso (mg) mg/mL

C16:1 10,0 2,0

C18:3 24,7 4,94

C20:0 20,1 4,02

C20:1 5,0 1,0

C22:0 10,7 2,14

49

2.2. Construcción de las curvas de calibración

Se prepararon entre 3 y 5 diluciones de la solución madre y se inyectaron en

el CG. Con los datos de área obtenidos para cada concentración de los ésteres

metílicos de los ésteres metílicos de los ácidos grasos, se construyó una curva de

calibración que se usó en la determinación de la linealidad y la sensibilidad. Las

tablas 20, 21, 22, 23 y 24 muestran la concentración del éster metílico del ácido

graso en la solución y el área obtenida para cada una de ellas, presentándose

además la ecuación de la curva de calibración obtenida y el coeficiente de

correlación.

TABLA 20. Concentración y área obtenida para la curva de calibración del ácido palmitoleico C16:1

Y= 324939X + 1682

r= 0,9999

TABLA 21. Concentración y área obtenida para la curva de calibración del ácido linolénico C18:3

Y= 34484X + 14914 r= 0,9998

mg/ml área

1,000 321665

0,800 264676

0,600 201271

0,400 133115

0,200 62506

mg/ml Área

0,494 32026

0,296 24968

0,099 18405

50

TABLA 22. Concentración y área obtenida para la curva de calibración del ácido araquídico C20:0

Y= 377935X + 5171 r= 0,9974

TABLA 23. Concentración y área obtenida para la curva de calibración del ácido eicosenoico C20:1

Y= 576894X - 3581 r= 0,9987

TABLA 24. Concentración y área obtenida para la curva de calibración del ácido behénico C22:0

Y= 381434X – 1236 r= 0,9986

mg/ml área

0,563 208480

0,241 90230

0,080 31951

0,040 15124

mg/ml área

0,200 112243

0,120 64845

0,020 8313

mg/ml área

0,300 112043

0,214 82841

0,128 46136

51

2.3. Cálculo de σy/x de la regresión para la determinación de los límites de detección

y cuantificación.

Para calcular los límites de detección y cuantificación de los ácidos grasos

palmitoleico, linolénico, araquídico, eicosenoico y behénico se utilizó la siguiente

ecuación (2):

σy/x= √ Σ(yi - y’i)2 (n-2)

Donde:

σ = Desviación estándar de la regresión

yi = Valor observado del punto en la ordenada

y’i= Valor teórico del punto obtenido por la predicción del modelo de regresión

n = Número de puntos de la curva de calibración.

En las tablas 25, 26, 27, 28 y 29 se muestran los datos de yi e y’i para cada

concentración usada en la curva de calibración, además se muestra el valor del σy/x,

y un ejemplo de su cálculo con el ácido palmitoleico.

TABLA 25. Valores de yi e y’i obtenidos mediante la curva de calibración del ácido palmitoleico.

Conc.[mg/mL] yi y'i

1,0 321665 326621

0,8 264676 261633

0,6 201271 196645

0,4 133115 131657

0,2 62506 66669

52

n= 5

Ejemplo para el cálculo de σy/x

σy/x= √ ( ( (321665-326621)+ (264676- 261633)+ (201271- 196645)+ (133115- 131657)+ (62506- 66669))2/ 3)

σy/x = 4989

TABLA 26. Valores de yi e y’i obtenidos mediante la curva de calibración del ácido linolénico.

n=3 σy/x=188

TABLA 27. Valores de yi e y’i obtenidos mediante la curva de calibración del ácido araquídico.

n=4 σy/x= 1061

TABLA 28. Valores de yi e y’i obtenidos mediante la curva de calibración del ácido eicosenoico

n= 3 σy/x= 983

Conc.[mg/mL] yi y'i

0,494 32026 31949

0,296 24968 25121

0,099 18405 18327

Conc.[mg/mL] yi y'i

0,563 208480 208600

0,241 90230 90124

0,080 31951 30886

0,040 15124 16169

Conc.[mg/mL] yi y'i

0,20 112243 111634

0,12 64845 65941

0,02 8313 8826

53

TABLA 29. Valores de yi e y’i obtenidos mediante la curva de calibración del ácido behénico.

n= 3 σy/x= 2174

2.4. Cálculo del límite de detección y de cuantificación

Los límites de detección y de cuantificación se calcularon con las

ecuaciones 3 y 4. En la tabla 30 se presenta un resumen de los valores de σy/x de

cada ácido graso. Luego se presenta el cálculo del σy/x para ácido palmitoleico

como ejemplo, y los valores de los σy/x de los restantes ácidos grasos.

Limite de detección (LD) CLD= (b + 3σ)- b (3) S

Límite de cuantificación (LC) es: CLC= (b + 10σ)- b (4) S

En donde:

CLD= Concentración del limite de detección (mg/mL)

CLC= Concentración del limite de cuantificación (mg/mL)

σ = Desviación estándar de la regresión (área).

b = intercepto de la curva de calibración (área)

S= pendiente de la curva de calibración (área* mL/mg)

Conc.[mg/mL] yi y'i

0,300 112043 113194

0,214 82841 80390

0,128 46136 47587

54

TABLA 30. Valores de σy/x obtenido para cada ácido graso. Ácido graso σ

C16:0 4989

C18:3 188

C20:0 1061

C20:1 983

C22:0 2174

a) Cálculo de la concentración de los límites de detección y de cuantificación del

ácido palmitoleico

Ejemplo cálculo concentración del límite de detección.

CLD= 3σ S

CLD= (4989 *3)/324939

CLD= 0,046 mg/mL

Ejemplo cálculo concentración del límite de cuantificación.

CLC= 10σ S

CLC= (4989*10) /324939

CLC= 0,154 mg/mL

b) Concentración del límite de detección y cuantificación del ácido linolénico

CLD= 0,016 mg/mL

CLC= 0,055 mg/mL

55

c) Concentración del límite de detección y cuantificación del ácido araquídico

CLD= 0,009 mg/mL

CLC= 0,029 mg/mL

d) Concentración del límite de detección y cuantificación del ácido eicosenoico

CLD= 0,005 mg/mL

CLC= 0,017 mg/mL

e) Concentración del límite de detección y cuantificación del ácido behénico

CLD= 0,017 mg/mL

CLC= 0,057 mg/mL

ANEXO 3

Replicabilidad

En la tabla 31 se muestran los datos de área obtenidos en cada análisis de

las 10 muestras de aceite de oliva variedad arbequina, analizadas en el mismo

día, por el mismo analista y en el mismo equipo, con los cuales se elaboró la

tabla 32 que muestra el porcentaje, promedio, desviación estándar y coeficiente

de variación de cada ácido graso, parámetros con los cuales se evaluó la

replicabilidad para ellos.

56

TABLA 31. Áreas de cada éster metílico de los ácidos grasos en las 10 repeticiones de la muestra de aceite de oliva variedad arbequina

TABLA 32. Composición en ácidos grasos expresada como porcentaje de ésteres metílicos en las 10 muestras analizadas, promedio, desviación estándar y coeficiente de variación.

Ácido graso M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10C16:0 2012573 2667760 2034201 3057822 2020763 2801558 1906268 3534246 2543189 3393582C16:1 2012573 2667760 2034201 3057822 2020763 2801558 1906268 3534246 2543189 3393582C17:0 16126 21931 16198 24726 16237 22300 15303 27663 20432 25572C17:1 34808 46451 35338 53967 36130 48412 33544 61136 41525 58391C18:0 341843 446921 341973 520424 335901 472833 308427 572208 461367 595223C18:1 376651 493372 377311 574391 372031 521245 341971 633344 502892 465912C18:2 1454939 1966151 1419001 2192077 1495458 2033634 1409283 2579901 1759385 2395621C20:0 65806 87614 65468 101548 66035 91982 60790 112992 80712 107947C18:3 51288 68305 50002 77489 51193 71136 47106 87673 61874 82807C20:1 75431 103638 73178 113323 79054 107278 75602 137967 93202 127918C22:0 23617 30883 21527 34581 23034 31569 20272 38396 27959 35641

Ácido graso M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 X DE CV C16:0 12,34 12,29 12,60 12,32 12,32 12,37 12,49 12,47 12,66 12,61 12,45 0,14 1,11C16:1 1,08 1,07 1,09 1,06 1,07 1,07 1,10 1,08 1,09 1,08 1,08 0,01 1,04C17:0 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,00 1,94C17:1 0,21 0,21 0,22 0,22 0,22 0,21 0,22 0,22 0,21 0,22 0,22 0,00 1,85C18:0 2,10 2,06 2,12 2,10 2,05 2,09 2,02 2,02 2,30 2,21 2,11 0,09 4,16C18:1 73,14 73,31 72,93 73,22 73,26 73,19 73,15 73,25 72,98 73,09 73,15 0,12 0,17C18:2 8,92 9,06 8,79 8,83 9,12 8,98 9,23 9,10 8,76 8,90 8,97 0,16 1,74C20:0 0,40 0,40 0,41 0,41 0,40 0,41 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,00 0,83C18:3 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31 0,31 0,00 0,88C20:1 0,46 0,48 0,45 0,46 0,48 0,47 0,50 0,49 0,46 0,48 0,47 0,01 2,86C22:0 0,14 0,14 0,13 0,14 0,14 0,14 0,13 0,14 0,14 0,13 0,14 0,00 3,07

57

ANEXO 4

Repetibilidad

En la tabla 33 se muestran los datos de área obtenidos en cada análisis de

las 10 muestras de aceite de oliva variedad arbequina, analizadas en distintos días,

por el mismo analista y en el mismo equipo, con los cuales se elaboró la tabla 34

que muestra el porcentaje (éster metílico), promedio, desviación estándar y

coeficiente de variación de cada ácido graso, parámetros con los cuales se evaluó

la repetibilidad para ellos.

58

TABLA 33. Áreas de cada éster metílico de los ácidos grasos en las 10 repeticiones de la muestra de aceite de oliva variedad arbequina

TABLA 34. Composición en ácidos grasos expresada como porcentaje de ésteres en las 10 muestras analizadas, promedio, desviación estándar y coeficiente de variación.

Ácido Graso M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 C16:0 2012573 2593842 3030786 1498130 1899213 1327606 1374582 1963211 1642686 1443481C16:1 2012573 2593842 3030786 1498130 1899213 1327606 1374582 1963211 1642686 1443481C17:0 16126 21124 24456 12001 14633 10517 10976 16345 12997 11596C17:1 34808 46111 50732 25500 32709 21515 22807 33503 27678 24955C18:0 341843 448636 478784 296136 311246 322217 269376 348418 315122 265253C18:1 376651 494747 529516 321636 343955 343732 292183 381921 342800 290208C18:2 1454939 1914712 2233285 971796 1324896 881477 909267 1362056 1167796 1020766C18:3 51288 67076 75835 33634 45699 36898 31607 46988 40738 34378C20:0 65806 85457 96612 45518 58429 42542 42294 62404 54126 46468C20:1 75431 103832 121369 49762 68529 44744 44156 69520 60693 53104C22:0 23617 29440 32177 15165 19759 12482 13489 21053 19283 15184

Ácido Graso M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 X DE CVC16:0 12,34 12,34 12,48 12,93 12,77 12,80 12,66 12,45 12,36 12,51 12,56 0,21 1,70C16:1 1,08 1,07 1,09 1,11 1,13 1,09 1,08 1,08 1,07 1,09 1,09 0,02 1,58C17:0 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,00 1,96C17:1 0,21 0,22 0,21 0,22 0,22 0,21 0,21 0,21 0,21 0,22 0,21 0,00 2,33C18:0 2,10 2,13 1,97 2,56 2,09 3,11 2,48 2,21 2,37 2,30 2,33 0,33 14,10C18:1 73,14 73,11 73,39 72,00 73,12 72,66 72,02 72,81 72,51 72,54 72,73 0,48 0,66C18:2 8,92 9,11 9,20 8,39 8,91 8,50 8,38 8,64 8,79 8,85 8,77 0,29 3,26C18:3 0,31 0,32 0,31 0,29 0,31 0,36 0,29 0,30 0,31 0,30 0,31 0,02 6,14C20:0 0,40 0,41 0,40 0,39 0,39 0,41 0,39 0,40 0,41 0,40 0,40 0,01 1,77C20:1 0,46 0,49 0,50 0,43 0,46 0,43 0,41 0,44 0,46 0,46 0,45 0,03 6,30C22:0 0,14 0,14 0,13 0,13 0,13 0,12 0,12 0,13 0,15 0,13 0,13 0,01 5,98

59

ANEXO 5

Recuperación

Para la evaluación de la recuperación se inyectó una muestra de aceite de oliva

sin fortificar y una fortificada con una solución estándar de los ésteres metílicos de los

ácidos palmítico, esteárico, oleico y linoleico, de concentración conocida, cada una de

ellas se realizó en triplicado. En las tablas 35, 36, 37 y 38 se muestran los datos del

área del aceite de oliva natural y la muestra con estándar, el área correspondiente a la

fortificación, la concentración recuperada del estándar, el porcentaje de recuperación,

el promedio de la recuperación de las tres muestras analizadas, indicándose además la

concentración inicial del estándar.

TABLA 35. Datos obtenidos para el cálculo de la recuperación del ácido palmítico C16:0

Nº Muestra Área muestra

Área muestra fortificada - Área

muestra sin fortificar

Concentración recuperada

estándar % de

Recuperación

1 213288 1* 1449604 1236316 1,93 116,62 2 301332 2* 1353641 1052309 1,62 98,33 3 404755 3* 1596809 1192054 1,85 112,22

X= 109,06 DE= 9,55 * muestra fortificada con estándar Concentración verdadera estándar = 1,65 mg/mL

60

TABLA 36. Datos obtenidos para el cálculo de la recuperación del ácido esteárico C18:0

Nº Muestra Área muestra

Área muestra fortificada - Área

muestra sin fortificar

Concentración recuperada

estándar % de

Recuperación

1 54161 1* 392555 338394 0,32 79,20 2 64978 2* 342210 277232 0,27 66,17 3 84780 3* 412227 327447 0,34 84,30

X= 76,56 DE= 9,35 * muestra fortificada con estándar Concentración verdadera estándar = 0,41 mg/mL

TABLA 37. Datos obtenidos para el cálculo de la recuperación del ácido oleico C18:1

Nº Muestra Área muestra

Área muestra fortificada - Área

muestra sin fortificar

Concentración recuperada

estándar % de

Recuperación

1 11842616 1* 28812352 16969736 29,05 116,26 2 13645272 2* 28361232 14715960 25,21 100,91 3 14777456 3* 27347696 12570240 21,56 86,29

X= 101,15 DE= 14,99* muestra fortificada con estándar Concentración verdadera estándar = 24,99 mg/mL

61

TABLA 38. Datos obtenidos para el cálculo de la recuperación del ácido linoleico C18:2

Nº Muestra Área muestra

Área muestra fortificada - Área

muestra sin fortificar

Concentración recuperada

estándar % de

Recuperación

1 1568088 1* 3199901 1631813 3,46 107,68 2 1750203 2* 3147066 1396863 2,98 92,61 3 1936868 3* 3003093 1066225 2,29 71,40

X= 90,56 DE= 18,23 * muestra fortificada con estándar Concentración verdadera estándar = 3,22 mg/mL

ANEXO 6

Muestras

6.1. Composición en porcentaje de los ácidos grasos de las muestras de aceite de oliva

analizadas

Se analizaron 26 muestras de aceite de oliva de las variedades picual (n=10),

arbequina (n=10) y frantoio (n=6), el porcentaje, promedio y desviación estándar de los

ácidos grasos de cada una de las muestras de las variedades se presentan en las

tablas 38, 39 y 40.

62

TABLA 39. Composición de ácidos grasos expresado en porcentaje de ésteres metílicos, promedio y desviación estándar de 10 muestras analizadas de aceite de oliva variedad picual Ac. Graso MP1 MP2 MP3 MP4 MP5 MP6 MP7 MP8 MP9 MP10 PROM DE

C16:0 12,00 12,28 11,49 11,45 11,43 9,52 10,37 10,44 11,50 11,23 11,17 0,83C16:1 0,97 0,97 0,92 0,93 0,82 0,49 0,81 0,80 0,89 0,87 0,85 0,14 C17:0 0,05 0,05 0,05 0,04 0,03 0,00 0,05 0,04 0,06 0,05 0,04 0,02C17:1 0,11 0,11 0,08 0,09 0,08 0,00 0,08 0,09 0,10 0,10 0,09 0,03 C18:0 2,43 2,49 2,89 2,67 2,96 3,47 2,98 3,01 2,81 2,75 2,85 0,30C18:1 79,11 78,60 79,30 79,87 79,44 81,00 80,69 80,52 78,63 78,84 79,60 0,88 C18:2 3,17 3,09 3,23 3,29 3,42 3,63 3,14 3,09 4,12 4,02 3,42 0,38C18:3 0,25 0,00 0,17 0,19 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,20 0,04 C20:0 0,36 0,35 0,36 0,35 0,38 0,45 0,39 0,39 0,38 0,38 0,38 0,03C20:1 0,64 0,86 0,56 0,56 0,79 0,83 0,87 0,86 0,82 0,80 0,76 0,12 C22:0 0,12 0,11 0,10 0,10 0,11 0,00 0,12 0,11 0,00 0,13 0,09 0,05

TABLA 40. Composición de ácidos grasos expresado en porcentaje de ésteres metílicos, promedio y desviación estándar de 10 muestras analizadas de aceite de oliva variedad arbequina Ac. Graso MA1 MA2 MA3 MA4 MA5 MA6 MA7 MA8 MA9 MA10 PROM DE

C16:0 12,95 12,18 9,78 11,67 13,30 13,52 12,88 12,55 12,72 13,34 12,49 1,10 C16:1 1,12 0,89 0,58 0,95 1,00 1,37 0,96 1,11 1,12 1,10 1,02 0,21 C17:0 0,11 0,12 0,14 0,05 0,15 0,11 0,15 0,09 0,09 0,12 0,11 0,03 C17:1 0,18 0,28 0,21 0,09 0,29 0,25 0,27 0,20 0,19 0,25 0,22 0,06 C18:0 2,74 2,03 2,91 2,57 2,83 2,43 2,37 2,22 2,37 2,50 2,50 0,27 C18:1 73,43 75,35 78,81 79,04 72,35 71,50 73,46 74,41 73,76 74,42 74,65 2,50 C18:2 7,12 7,22 6,08 4,02 6,49 8,02 8,11 7,32 7,01 6,24 6,76 1,18 C18:3 0,27 0,34 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,31 0,05 C20:0 0,39 0,42 0,50 0,36 0,42 0,40 0,42 0,38 0,39 0,39 0,41 0,04 C20:1 0,57 0,60 0,27 0,77 0,66 0,82 0,86 0,78 0,75 0,67 0,67 0,17 C22:0 0,14 0,15 0,19 0,10 0,15 0,12 0,00 0,13 0,13 0,14 0,13 0,05

63

TABLA 41. Composición de ácidos grasos expresado en porcentaje de ésteres metílicos, promedio y desviación estándar de 10 muestras analizadas de aceite de oliva variedad frantoio

Ac. Graso MF1 MF2 MF3 MF4 MF5 MF6 PROM DE C16:0 11,30 12,09 11,09 10,90 11,90 10,70 11,33 0,56 C16:1 0,93 0,92 0,76 0,73 0,84 0,90 0,85 0,09 C17:0 0,08 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,06 0,01 C17:1 0,04 0,12 0,09 0,09 0,10 0,12 0,09 0,03 C18:0 2,53 1,92 2,94 2,76 2,51 2,39 2,51 0,35 C18:1 77,94 76,13 75,72 75,92 75,73 77,79 76,54 1,04 C18:2 5,18 6,71 6,94 6,87 6,72 6,26 6,45 0,67 C18:3 0,27 0,33 0,00 0,00 0,00 0,00 0,30 0,04 C20:0 0,41 0,36 0,41 0,00 0,41 0,34 0,39 0,03 C20:1 0,62 0,66 0,86 0,80 0,85 0,76 0,76 0,10 C22:0 0,14 0,12 0,15 0,15 0,14 0,00 0,12 0,06

64

6.2. Análisis estadístico ANOVA

6.2.1. Análisis ANOVA para el ácido palmítico (C16:0)

Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 9,83947 2 4,91973 6,05 0,0077 Within groups 18,6924 23 0,812712 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 28,5318 25 Multiple Range Tests for C16:0 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 2 10 11,171 X 3 6 11,33 X 1 10 12,489 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 *1,318 0,834013 1 - 3 *1,159 0,963035 2 - 3 -0,159 0,963035 --------------------------------------------------------------------------------

• denotes a statistically significant difference.

65

6.2. 2. Análisis ANOVA para el ácido palmitoleico (C16:1 )

Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0,184445 2 0,0922226 3,60 0,0437 Within groups 0,589343 23 0,0256236 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0,773788 25 Multiple Range Tests for C16:1 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 3 6 0,846667 X 2 10 0,847 X 1 10 1,02 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 *0,173 0,14809 1 - 3 *0,173333 0,170999 2 - 3 0,000333333 0,170999 --------------------------------------------------------------------------------

• denotes a statistically significant difference.

66

6.2.3. Análisis ANOVA para el ácido heptadecanoico (C17:0)

Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0,0275415 2 0,0137708 26,57 0,0000 Within groups 0,01192 23 0,000518261 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0,0394615 25 Multiple Range Tests for C17:0 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 2 10 0,042 X 3 6 0,055 X 1 10 0,113 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 *0,071 0,021061 1 - 3 *0,058 0,0243191 2 - 3 -0,013 0,0243191 --------------------------------------------------------------------------------

• denotes a statistically significant difference.

67

6.2. 4. Análisis ANOVA para el ácido heptadecenoico (C17:1)

Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0,110002 2 0,055001 27,46 0,0000 Within groups 0,0460633 23 0,00200275 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0,156065 25 Multiple Range Tests for C17:1 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 2 10 0,084 X 3 6 0,0933333 X 1 10 0,221 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 *0,137 0,0414017 1 - 3 *0,127667 0,0478066 2 - 3 -0,00933333 0,0478066 --------------------------------------------------------------------------------

• denotes a statistically significant difference.

68

6.2.5. Análisis ANOVA para el ácido esteárico (C18:0)

Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0,731882 2 0,365941 4,05 0,0311 Within groups 2,07813 23 0,0903536 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 2,81002 25 Multiple Range Tests for C18:0 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 10 2,497 X 3 6 2,50833 X 2 10 2,846 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 *-0,349 0,278085 1 - 3 -0,0113333 0,321105 2 - 3 *0,337667 0,321105 --------------------------------------------------------------------------------

• denotes a statistically significant difference.

69

6.2.6. Análisis ANOVA para el ácido oleico (C18:1)

Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 126,314 2 63,1569 22,52 0,0000 Within groups 64,5003 23 2,80436 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 190,814 25 Multiple Range Tests for C18:1 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 10 74,603 X 3 6 76,5383 X 2 10 79,6 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 *-4,997 1,54925 1 - 3 *-1,93533 1,78892 2 - 3 *3,06167 1,78892 --------------------------------------------------------------------------------

• denotes a statistically significant difference.

70

6.2.7. Análisis ANOVA para el ácido linoleico (C18:2)

Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 64,3543 2 32,1771 46,39 0,0000 Within groups 15,9523 23 0,69358 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 80,3066 25 Multiple Range Tests for C18:2 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 2 10 3,42 X 3 6 6,44667 X 1 10 6,763 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 *3,343 0,770465 1 - 3 0,316333 0,889656 2 - 3 *-3,02667 0,889656 --------------------------------------------------------------------------------

• denotes a statistically significant difference.

71

6.2.8. Análisis ANOVA para el ácido linolénico (C18:3)

Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0,459902 2 0,229951 5,56 0,0107 Within groups 0,951713 23 0,0413788 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 1,41162 25 Multiple Range Tests for C18:3 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 2 10 0,061 X 1 10 0,061 X 3 6 0,376667 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 0,0 0,188189 1 - 3 *-0,315667 0,217302 2 - 3 *-0,315667 0,217302 --------------------------------------------------------------------------------

• denotes a statistically significant difference.

72

6.2.9. Análisis ANOVA para el ácido araquídico (20:0)

Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0,00396154 2 0,00198077 1,77 0,1923 Within groups 0,0257 23 0,00111739 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0,0296615 25 Multiple Range Tests for C20:0 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 2 10 0,379 X 3 6 0,39 X 1 10 0,407 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 0,028 0,0309248 1 - 3 0,017 0,0357089 2 - 3 -0,011 0,0357089 --------------------------------------------------------------------------------

• denotes a statistically significant difference.

73

6.2.10. Análisis ANOVA para el ácido eicosenoico (C20:1)

Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0,288728 2 0,144364 2,35 0,1177 Within groups 1,41173 23 0,0613797 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 1,70046 25 Multiple Range Tests for C20:1 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 3 6 0,481667 X 1 10 0,648 XX 2 10 0,759 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 -0,111 0,229201 1 - 3 0,166333 0,264659 2 - 3 *0,277333 0,264659 --------------------------------------------------------------------------------

• denotes a statistically significant difference.

74

6.2.11. Análisis ANOVA para el ácido behénico (C22:0)

Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value --------------------------------------------------------------------------------------------------- Between groups 0,00651282 2 0,00325641 1,24 0,3068 Within groups 0,0601833 23 0,00261667 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0,0666962 25 Multiple Range Tests for C22:0 by Muestras -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD Muestras Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 2 10 0,09 X 3 6 0,116667 X 1 10 0,125 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 0,035 0,0473237 1 - 3 0,00833333 0,0546447 2 - 3 -0,0266667 0,0546447 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.