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ANÁLISIS DE ALIMENTOS
VALIDACIÓN DE MÉTODOSANALÍTICOS
CALIDAD EN EL LABORATORIO DE
ANÁLISIS DE ALIMENTOS
Los laboratorios de análisis instrumental de
alimentos, propiedades físicas y microbiología
pueden prestar servicios a clientes internos y externos
de análisis fisicoquímico y microbiológico para muestras
de alimentos.
Acorde a la política de calidad, los laboratorios deyanálisis deben trabajar con el objetivo de generar
garantizar resultados confiables.
sistema trazabilidad de mediciones
de y Relacionados
CALIDAD EN EL LABORATORIO DE
ANÁLISIS DE ALIMENTOS
los laboratoriosEl trabajo realizado en bajo los
lineamientos17025:2005,
establecidos(NORMA
en la norma ISO/IEC
ARGENTINA IRAM 301*
ISO/IEC 17025) garantiza el mejoramiento continuo,
para el logro de la eficacia y eficiencia en los objetivos
del Sistema de Gestión de Calidad.
También EURACHEM que es una red de organizaciones
en Europa, que tiene el objetivo de establecer un
sistema de trazabilidad internacional de las mediciones
químicas y la promoción de buenas prácticas de calidad,
proporciona una Guía de Laboratorio para la
Validación de Métodos y Temas Relacionados.
EURACHEM
Proporciona un foro para la discusión de los problemascomunes y para el desarrollo de un enfoque informado y
considerado que considera cuestiones técnicas y
políticas de decisión.
Promueve las mejores prácticas en la medición analítica
mediante la producción de una guía autorizada dentro de
sus grupos de expertos, guías de publicación en la web y
el apoyo a talleres para comunicar las buenas prácticas.
acreditación otras co en calidad
EURACHEM
La orientación incluye cuestiones técnicas como la evaluación
de la incertidumbre de medición, validación de métodos y
ensayos de aptitud .
También trabaja a través del enlace con los organismos de
acreditación y otras organizaciones con intereses en la calidad
de la medición para ayudar a asegurar políticas prácticas de
acreditación y promoción de las provisiones técnicas sensibles
en la regulación.
tili
IRAM 301* ISO/IEC 17025
Esta norma establece los requisitos generales para la
competencia en la realización de ensayos o de
calibraciones, incluido
Cubre los ensayos y
utilizando:
el muestreo.
las calibraciones que se realizan
métodos
métodos
métodos
normalizados,no normalizados,
desarrollados por el propio laboratorio.
IRAM 301* ISO/IEC 17025
Organización
Sistema de gestión
Control de los documentos
Revisión de los pedidos, ofertas y contratos
Subcontratación de ensayos y de calibraciones
Compras de servicios y de suministros
Servicio al cliente
Control de trabajos de ensayos o de calibraciones no conformes
Mejora
Acciones correctivas
Acciones preventivas
Control de los registros
Auditorías internas
Revisiones por la dirección
ORGANIZACIÓN
Debe ser una entidad con responsabilidad legal y tener una dirección técnica con responsabilidad total ...
Debe realizar sus actividades de ensayo y de calibración de modo que se cumplan los requisitos de esta norma ...
Debe tener personal que tenga los recursos necesarios para desempeñar sus tareas ...
Debe tomar medidas para asegurarse de que su personal están libres de cualquier presión o influencia indebida ...
Debe tener políticas y procedimientos para asegurar la protección de la información confidencial y los derechos de propiedad de sus
clientes ...
Debe proveer adecuada supervisión al personal encargado de los ensayos y calibraciones ...
di i t i t i t t
SISTEMA DE GESTIÓN
Debe establecer, implementar y mantener unsistema de gestión apropiado al alcance de sus
actividades.
Debe documentar sus políticas, sistemas, programas, procedimientos e instrucciones tanto como sea necesario para asegurar la calidad de los resultados de los ensayos o calibraciones.
La documentación del sistema debe ser comunicada al personal pertinente, debe ser
comprendida por él, debe estar a su disposición y debe ser implementada por él.
SUBCONTRATACIÓN DE ENSAYOS Y DE
CALIBRACIONES
Cuando un laboratorio subcontrate un trabajo, se debe encargar este trabajo a un
subcontratista competente
Un subcontratista competente es el que, por ejemplo, cumple esta norma para el trabajo
en cuestión
no sean utilizados hasta que no hayan sido
COMPRAS DE SERVICIOS Y DE
SUMINISTROS
Deben existir procedimientos para la compra, la recepción y el almacenamiento de los reactivos y materiales consumibles de laboratorio que se necesiten para los
ensayos y las calibraciones
El laboratorio debe asegurarse de que los suministros, los reactivos y los materiales consumibles comprados, que afectan a la
calidad de los ensayos o de las calibraciones, no sean utilizados hasta que no hayan sido
inspeccionados…
técnico así como las opiniones e interpretaciones basadas en
SERVICIO AL CLIENTE
El laboratorio debe estar dispuesto a cooperar con los clientes o sus representantes para aclarar el pedido delcliente y para realizar el seguimiento del desempeño del
laboratorio en relación con el trabajo realizado siempre que el laboratorio garantice la confidencialidad hacia otros clientes
Los clientes valoran el mantenimiento de una buena comunicación, el asesoramiento y los consejos de orden
técnico, así como las opiniones e interpretaciones basadas en los resultados
El laboratorio debe procurar obtener información de retorno, tanto positiva como negativa, de sus clientes
La información de retorno debe utilizarse y analizarse para mejora rel sistema de gestión, las actividades de ensayo y
calibración y el servicio al cliente
QUEJAS
El laboratorio debe tener una política y un procedimiento para la resolución de las
quejas recibidas de los clientes o de otras partes.
Se deben mantener los registros de todas las quejas así como de las investigaciones y de las acciones correctivas llevadas a cabo por
el laboratorio
CONTROL DE TRABAJOS DE ENSAYOS
O DE CALIBRACIONES NOCONFORMES
El laboratorio debe tener una política y procedimientos que se deben implementar cuando cualquier aspecto de su trabajo de ensayo o de calibración, o el resultado de
dichos trabajos, no son conformes con sus propios procedimientos o con los requisitos
acordados con el cliente
Cuando la evaluación indique que el trabajo no conforme podría volver a ocurrir o existan
dudas sobre el cumplimiento de las operaciones del laboratorio con sus propias políticas y procedimientos, se deben seguir
rápidamente los procedimientos de acciones correctivas
la
las quejasdelosclientes
lasauditorías internasoexternas
eclontrodlela calidad
¿CÓMO IDENTIFICAR
TRABAJOS NO
CONFORMES O
PROBLEMAS?
lasrevisionespor ladirección
lacalibraciónde instrumentos
eclontrodlelos informesdeensayo
ycertificadosdecalibración
eclontrodlelos materiales consumibles
la observación o la supervisióndel
personal
l b t i d b id tifi l i ti
ACCIONES CORRECTIVAS
Cuando se necesite una acción correctiva, el laboratorio debe identificar las acciones correctivas
posibles
Debe seleccionar e implementar la o las acciones con mayor posibilidad de eliminar el problema y prevenir
su repetición
Las acciones correctivas deben corresponder en importancia a la magnitud del problema y sus riesgos
El laboratorio debe documentar e implementar cualquier cambio necesario que resulte de las investigaciones de las acciones correctivas.
AUDITORÍAS INTERNAS
El laboratorio debe efectuar, periódicamente,de acuerdo con un calendario y un
procedimiento predeterminados, auditorías internas de sus actividades para verificar
que sus operaciones continúan cumpliendo los requisitos del sistema de gestión y de
esta norma.
El programa de auditoría interna debe considerar todos los elementos del sistema
de gestión, incluidas las actividades de ensayo y calibración
EXACTITUD Y CONFIABILIDAD DE LOS
ENSAYOS O DE LAS CALIBRACIONES
Intervienen factores:
humanos,
instalaciones y condiciones ambientales.
El grado con el que losde
factoresla
contribuyenmedición
a la
incertidumbre total difiere
considerablemente según los ensayos y calibraciones.
El laboratorio debe tener en cuenta estos factores al
desarrollar los métodos y procedimientos de ensayo y de
calibración, en la capacitación y la calificación del
personal, así como en la selección y la calibración de losequipos utilizados.
PERSONAL
La dirección delde
laboratorio debe asegurar la
competencia todos los que operan equipos
específicos, realizan ensayos o calibraciones, evalúan
los resultados y firman los informes de ensayos y loscertificados de calibración.
Cuando emplea personal en formación, debe proveer
una supervisión apropiada.
El personal que realiza tareas específicas debe estar
calificado sobre la base de una educación, unadecapacitación, una experiencia apropiadas y
habilidades demostradas, según sea requerido.
en distintos la permanente
INSTALACIONES Y CONDICIONES
AMBIENTALES
Las instalaciones de ensayos o de calibraciones del
laboratorio, incluidas, pero no en forma excluyente, las
fuentes de energía, la iluminación y las condiciones
ambientales, deben facilitar la realización correcta de losensayos o de las calibraciones.
El laboratorio debe asegurarse de que las condiciones
ambientales no invaliden los resultados ni comprometan
la calidad requerida de las mediciones.
Se deben tomar precauciones especiales cuando el
muestreo y los ensayos o las calibraciones se realicen
en sitios distintos de la instalación permanente del
laboratorio.
AMBIENTALES
cruzada
función sus particulares
INSTALACIONES Y CONDICIONESAMBIENTALES
Debe haber una separación eficaz entre áreas vecinas
en las que se realicen actividades incompatibles.
Se deben tomar medidas para prevenir la contaminación
cruzada.
Se deben controlar el acceso y el uso de las áreas que
afectan a la calidad de los ensayos o de las
calibraciones.
El laboratorio debe determinar la extensión del control en
función de sus circunstancias particulares.
Se deben tomar medidas para asegurar el orden y la
limpieza del laboratorio.
Cuando sean necesarios se deben preparar
procedimientos especiales.
id
Se tili ar los
di
¿QUÉ MÉTODOS USAR?
El laboratorio debe utilizar los métodos de ensayo o
calibración, incluidos los de muestreo, que satisfagan
necesidades del cliente y que sean apropiados para
de
las
los
ensayos o las calibraciones que realiza.
Se deben utilizar preferentemente los métodos
publicados como normas internacionales, regionales onacionales.
El laboratorio debe asegurarse de que utiliza la última
versión vigente de la norma, a menos que no sea
apropiado o posible.
Cuando sea necesario, la norma debe ser
complementada con detalles adicionales para aseguraruna aplicación coherente.
El debe que aplicar
han validados
¿QUÉ MÉTODOS USAR?
El cliente debe ser informado del método elegido.
El laboratorio debe confirmar que puede aplicar
correctamenteutilizarlos para
los métodos normalizados antes de
los ensayos o las calibraciones.
Si el método normalizado cambia, se debe repetir la
confirmación.
También se pueden utilizar los métodos desarrollados
por el laboratorio si son apropiados para el uso previsto
y si han sido validados.
DESARROLADOS EN EL
una clara los del
Los desarrollados haber validados
¿SE PUEDEN APLICAR MÉTODOSDESARROLADOS EN EL
LABORATORIO?
La introducción de los métodos de ensayo y de
su
ser
calibración desarrollados por el laboratorio paradebepropio uso debe ser una actividad planificada y
asignada a personal calificado, provisto de los
adecuados
recursos
Cuando sea necesario utilizar métodos no normalizados,
éstos deben ser acordados con el cliente y deben incluir
una especificación clara de los requisitos del cliente y del
objetivo del ensayo o de la calibración.
Los métodos desarrollados debe haber sido validadosadecuadamente antes del uso.
L d i ió d l ti d ít lib
i
DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO
Una identificación apropiada
El alcance
La descripción del tipo de ítem a ensayar o a calibrar
Los parámetros o las magnitudes y los rangos a ser determinados
Los aparatos y equipos, incluidos los requisitos técnicos de funcionamiento
Los patrones de referencia y los materiales de referencia requeridos
Las condiciones ambientales requeridas y cualquier período de estabilización que sea necesario
La descripción del procedimiento
MEDICIONES ANALÍTICAS
La EURACHEM resume en seis principios la buena
práctica de laboratorio en las mediciones analíticas
Las mediciones analíticas deben realizarse para
satisfacer un requisito acordado (esun objetivo definido).
decir, con
Las mediciones analíticas deben realizarse
utilizando métodos y equipos que han sido
probados para asegurar que son adecuados asu propósito.
El personal que realiza las mediciones analíticas
debe ser calificado y competente para
emprender la tarea asignada” (y demostrar quepueden desempeñar el análisis apropiadamente).
MEDICIONES ANALÍTICAS
La EURACHEM resume en seis principios la buena
práctica de laboratorio en las mediciones analíticas
Deberá existir unadel
evaluacióndesempeño
periódica eunindependiente
laboratorio.técnico de
Las mediciones analíticas hechas en un
con
otro
laboratorio deben ser consistentes
aquéllas que se realicen en cualquier
laboratorio.
Las organizaciones que hacen mediciones
analíticas deben tener procedimientos bien
definidos de control y de aseguramiento decalidad.
El debe los no
ét
ió
VALIDACIÓN
La ISO define a la validación como la confirmación, a
través del examen y el aporte de evidencias objetivas, de
que se cumplen los requisitos particulares para un uso
específico previsto.
El laboratorio debe validar los métodos no normalizados,
los métodos que diseña o desarrolla, los métodos
normalizados empleados fuera del alcance previsto, así
como las ampliaciones y modificaciones de los métodos
normalizados, para confirmar que los métodos son aptos
para el fin previsto.
La validación debe ser tan amplia como sea necesario
para satisfacer las necesidades del tipo de aplicación o
del campo de aplicación dados.
ét
VALIDACIÓN
Es conveniente utilizar una o varias de las técnicas
siguientes para la determinación del desempeño de unmétodo:
calibración utilizando patrones de referencia o
materiales de referencia,
comparaciónmétodos,
con resultados obtenidos con otros
comparaciones interlaboratorios,
evaluación sistemática de los factores que influyen
en el resultado;
evaluación de la incertidumbre de los resultados
basada en el conocimiento científico de los principiosteóricos del método y en la experiencia práctica.
i tid b
VALIDACIÓN
La gama y
empleando
para el uso
la exactitud de los valores que se obtienenmétodos validados tal como fueron fijadas
previsto, deben responder a las necesidades
de los clientes.
incertidumbre de los resultados
límite de detección
selectividad del método
linealidad
repetibilidad o de reproducibilidad
robustez ante influencias externas
sensibilidad cruzada frente a las interferencias provenientes de la matriz de la muestra o del objeto de ensayo
H
VALIDACIÓN – Enfoque de la
EURACHEM
La existencia de métodos analíticos confiables para la
realización de ensayos de laboratorio es indispensable para elcontrol de calidad e inocuidad de los alimentos.
La confiabilidad de un método se determina mediante
procesos de validación.
La validación de un método es un requisito importante en lapráctica del análisis químico.
Hay varias preguntas:
porqué debe hacerse?
cuándo debe hacerse?
que necesita hacerse?
EURACHEM
P
precisión reproducibilidad) de
colaborativos
de laboratorios
VALIDACIÓN - Enfoque de laEURACHEM
Algunos analistas ven la validación de métodos como algo que
sólo puede hacerse en colaboración con otros laboratorios ypor consiguiente no la realizan.
Por ejemplo la comisión del Codex Alimentarius requiere
para que un método sea incluido ciertos datos sobre la
perfomance del mismo tales como: especificidad, exactitud,
precisión (repetitividad, reproducibilidad), límite de detección,
sensibilidad, aplicabilidad, practicidad, etc.
Este proceso de validación requiere extensos estudios
colaborativos.
Estos procesos de validación son muy complejos y pueden
requerir el análisis de 5 o más muestras y la participación
de 8 o más laboratorios.
Sin embargo no siempre los métodos incluidos en algunas
normas han sido sometidos a una validación tan compleja.
É
ió
VALIDACIÓN - Enfoque de la
EURACHEM
¿Qué es la validación?
Según ISO la validación es la confirmación mediante examen
y suministro de evidencia objetiva de que se cumplen los
requisitos particulares para un uso específico previsto (ISO8402:1994).
Ésta se puede interpretar para la validación de un método
como el proceso de definir una necesidad analítica y confirmar
que el método en cuestión tiene capacidades de desempeño
consistentes con las que requiere la aplicación.
Está implícita la necesidad de evaluar las capacidades dedesempeño del método.
El criterio de la “conveniencia” del método es importante.
El
VALIDACIÓN - Enfoque de la
EURACHEM
En el pasado la validación del método tendía a concentrarse
sobre el proceso de evaluación de los parámetros de
desempeño.
En el proceso de validación del método está implícito que:
Los estudios para determinar los parámetros dededesempeño se realizan usando equipos dentro
especificaciones, que están trabajando correctamente yque están calibrados adecuadamente.
El operador que realiza los estudios debe ser
técnicamente competente en el campo de trabajo bajo
estudio y debe poseer suficiente conocimiento sobre el
trabajo a realizar con el fin de que sea capaz de tomar
decisiones apropiadas a partir de las observaciones
hechas mientras avanza el estudio.
Ó
ét
VALIDACIÓN - Enfoque de la
EURACHEM
VALIDACIÓN Y DESARROLLO
Generalmente se considera que la validación del métodoligada estrechamente con el desarrollo del método.
está
No es fácil determinar exactamente donde termina el
desarrollo del método y donde empieza la validación.
Por lo general, muchos de los parámetros de desempeño del
método que están asociados a su validación son evaluados,
como parte del desarrollo del método.
¿POR QUÉ ES NECESARIA LA
VALIDACIÓN DE UN MÉTODO?
Importancia de las mediciones analíticas
Millones de mediciones analíticas se realizan diariamente en
miles de laboratorios alrededor del mundo con diversos fines:
evaluar bienes para propósitos de comercio,
como apoyo a la salud,
para verificar la calidad del agua para consumo
humano,
para el análisis de la composición elemental de una
aleación para confirmar su conveniencia en la
construcción de aeronaves,
en análisis forenses de fluidos corporales en
investigaciones criminales.
¿POR QUÉ ES NECESARIA LA
VALIDACIÓN DE UN MÉTODO?
Importancia de las mediciones analíticas
El costo de realizar estas mediciones es elevado y surgen
costos adicionales de las decisiones tomadas en base a los
resultados.
Por ejemplo, las pruebas que muestran que algún alimento no
es adecuado para su consumo pueden resultar en demandas
por compensación; pruebas que confirmen la presencia de
drogas prohibidas podrían ocasionar multas, encarcelamiento
o más aún, la ejecución en algunos países.
Claramente es importante determinar el resultado correcto yser capaz de demostrar que lo es.
De modo laboratorio su tienen clara
líti bl
EL DEBER PROFESIONAL DEL QUÍMICO
ANALÍTICO
El cliente espera poder confiar en los resultados reportados y
por lo general sólo los cuestiona cuando surge una
controversia.
De este modo, el laboratorio y su personal tienen una clara
responsabilidad de corresponder a la confianza del cliente
proporcionando la respuesta correcta a la parte analítica del
problema, en otras palabras, proporcionando resultados que
han demostrado ser “adecuados a su propósito”.
Esto lleva implícito que las pruebas realizadas son apropiadas
para la parte analítica del problema que el cliente desea
resolver y que el informe final presenta los datos analíticos de
tal manera que el cliente pueda entenderlos fácilmente y sacar
conclusiones apropiadas.
La validación del método permite a los químicos demostrar
que el método es “adecuado para su propósito”.
id
EL DEBER PROFESIONAL DEL QUÍMICO
ANALÍTICO
un resultado analítico concuerde con el propósitoPara que
requerido,
cualquier
confianza.
debe ser lo suficientemente confiable para quecondecisión basada en éste pueda tomarse
Así, el desempeño del método debe validarse y debe
estimarse la incertidumbre del resultado a un nivel deconfianza dado.
La incertidumbre deberá ser evaluada y establecida de una
forma que sea ampliamente reconocida, consistente de forma
interna y fácil de interpretar.
La mayor parte de la información requerida para evaluar la
incertidumbremétodo.
se puede obtener durante la validación del
efectos como aleatorios los
té
ALGUNAS DEFINICIONES
La exactitud expresa la cercanía de un resultado al
valor verdadero.
La validación de un método busca cuantificar la
los
los
exactitud probable de los resultados evaluando tanto
efectos sistemáticos como los aleatorios sobre
resultados. Normalmente la exactitud se estudia encomponentes: la veracidad y la precisión.
dos
La veracidad (de un método) es una expresión de que
tan cercana se encuentra la media de un conjunto de
resultados (producidos por el método) respecto del valor
real.
Normalmente, la veracidad se expresa en términos desesgo.
ALGUNAS DEFINICIONES
La precisión es una medida de que tan cercanos estánlos resultados unos con respecto a los otros y por lo
general se expresa mediante medidas tal como la
desviación estándar la cual describe la dispersión de losresultados.
ALGUNAS DEFINICIONES
Adicionalmente, una expresión cada ves más común de
exactitud es la incertidumbre de medición, la cual
proporcionaexactitud.
una figura única de expresión de la
La evaluación práctica de la veracidad se fundamenta en
un
la
la comparación de la media de los resultados de
método con relación a valores conocidos, es decir,
veracidad se determina contra un valor de referencia (o
sea, un valor verdadero o un valor verdadero
convencional).
ALGUNAS DEFINICIONES
Se dispone de dos técnicas básicas:
la verificación con respecto a los valores de
referencia de un material caracterizado,
la verificación con respecto de otro método
caracterizado.
ALGUNAS DEFINICIONES
Los valores de referencia son idealmente trazables apatrones internacionales.
Los materiales de referencia certificados por lo general
se aceptan como medio de proveer valores trazables y
por lo tanto, el valor de referencia es el valor certificado.
Para verificar la veracidad utilizando unla
material de
referencia, se determina la media y desviación
estándar de una serie de réplicas de una prueba y se
compara contra el valor caracterizado del material de
referencia.
materiales referencia pureza
ALGUNAS DEFINICIONES
El material de referencia ideal sería un material de
referencia certificado de matriz natural, muy semejante a
las muestras de interés.
Claramentelimitada.
la disponibilidad de estos materiales es
Los materiales de referencia para una validación puedenser por consiguiente:
preparados por adición de materiales típicos con
materialesmateriales
materiales
verificada
de referencia de pureza certificada u otrosde pureza y estabilidad adecuadas,
típicos bien caracterizados, de estabilidad
internamente y conservados para control
de calidad interno.
ALGUNAS DEFINICIONES
Normalmente,circunstancias
la precisión se determina para
específicas las cuales en la práctica
pueden ser muy variadas.
Las medidas de precisión más comunes son la
“repetibilidad” y la “reproducibilidad”.
La repetibilidad dará una idea de la clase deporvariabilidad esperada cuando un método se ejecuta
un solo analista, con un equipo en un período corto detiempo.
Si la muestra se analiza por varios laboratorios para
fines comparativos, entonces una medida de precisiónmás significativa a usarse es la reproducibilidad.
ALGUNAS DEFINICIONES
Tanto la reproducibilidad como la repetibilidad dependen
generalmente de la concentración del analito y deben
determinarse a varias concentraciones y de ser
pertinente, deberá establecerse la relación entre la
precisión y la concentración del analito.
La desviación estándar relativa puede ser más útil en
este caso puesto que la desviación estándar dividida por
la concentración es prácticamente constante dentro del
intervalo de interés, a condición de que éste no sea
demasiado grande
ALGUNAS DEFINICIONES
La sensibilidad es efectivamente la pendiente de la
curva de respuesta, es decir, el cambio en la respuesta
del instrumento que corresponde a un cambio en la
concentración del analito.
Cuando se ha establecido que la respuesta es lineal
con respecto a la concentración (o sea, dentro del
la
es
de
intervalo lineal del método) y se ha determinado
intercepción de la curva de respuesta, la sensibilidad
un parámetro útil para calcular y usar en fórmulas
cuantificación.
La robustez es una medida de la efectividad del método
analítico es qué tan buen desempeño se mantiene aun
sin una implementación perfecta.
preparación patrones
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
El análisis mediante recta de calibración puede hacersecuando sólo el analito de interés presenta señal analítica
o respuesta (absorbancia, fluorescencia, potencial
eléctrico, corriente, etc.), o cuando la señal del blanco esconstante.
Las etapas que deben seguirse en un análisis mediante
recta de calibración son:
determinación del
lineal
extremo superior del rango
preparación de patrones
medición de la respuesta de los patrones
estimación de los parámetros de la regresión
cálculo de las cifras de mérito del método
•predicción en muestras incógnita
está en suposición que datos
id lit
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Determinaciónrango lineal
del extremo superior del
Esta etapa es fundamental, ya que la regresión lineal
está basada en la suposición de que los datos de
respuesta analítica están linealmenteconcentración del analito.
relacionados con la
Si se sospecha que existen desvíos de la linealidad, se
recomienda realizar un análisis exploratorio previo cuyo
objeto es extender el rango de aplicabilidad de la técnica
analítica a la máxima concentración posible.
En dicho análisis, se incluyen patrones de concentración
conocida del analito desde cero hasta valores que se
desvíen visiblemente de la linealidad.
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Preparación de patrones
Una vez estimado el extremo superior del rango lineal de
la técnica, deben prepararse patrones de concentración
conocida dentro de dicho rango, e incluyendo el valor
cero de concentración del analito (blanco).
Usualmente,mínimocinco)
se preparan varios patrones (como
con concentraciones igualmente
espaciadas entre cerolineal, y cada patrón se
y el extremo superior del rangoanaliza por triplicado.
Debe ponerse especial cuidado en la preparación de los
patrones del analito para la calibración, de manera que
las concentraciones de calibrado se conozcan con la
máxima precisión posible.
tienen incertidumbre menor
Por si realizan de
id
nidad absorbancia implica ni el de
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
PreparaciónEste requisito
de patrones
se relaciona con el hecho de que la recta
de regresión se ajusta mediante ecuaciones que
suponen que los valores del eje x (concentraciones)
tienen una incertidumbre considerablemente menor quelos del eje y (respuestas).
Por ejemplo, si se realizan mediciones de absorbancia
como respuesta, podemos suponer que el nivel de
incertidumbre en la respuesta puede ser de0,005 unidades de absorbancia.
alrededor de
Si los valores de las respuestas son, en promedio, de 1unidad de absorbancia, esto implica un nivel relativo de
incertidumbrerespuesta.
de aproximadamente 0,5% en la
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Preparación de patrones
Por lo tanto, se deben preparar patrones de calibrado
cuyas concentraciones se conozcan con un error menor
al 0,5%.
Preparar soluciones de calibrado, por ejemplo, con
incertidumbres del orden del 0,1% en promedio, requierepesar más de 100 mg de reactivo, preparar soluciones
en matraces calibrados de al menos 100 mL, tomar
alícuotas con pipetas aforadas calibradas, etc.
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Medición de la respuesta de los patrones
Una vez preparados los patrones de concentración
conocida, se miden sus respuestas analíticas,
incluyendo réplicas de cada medición.
Usualmente cada patrón se mide por triplicado.
Es importante establecer la siguiente nomenclatura: si se
emplean 6 patrones, cada uno por triplicado, entonces el
número de niveles diferentes de concentración (p) es 6,
y el número total de puntos de la recta de calibrado (m)
es 18.
lineal el de pendiente al
Los estimados A B calculan las
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Estimaciónregresión
de los parámetros de la
El análisis de los datos de calibrado mediante regresión
lineal implica el cálculo de la pendiente (A) y ordenada al
origen (B) de la recta ajustada a la ecuación y = A x + B.
Los valores estimados de A y B se calculan mediante lassiguientes ecuaciones:.
lineal el de pendiente al
Los estimados A B calculan las
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Estimaciónregresión
de los parámetros de la
El análisis de los datos de calibrado mediante regresión
lineal implica el cálculo de la pendiente (A) y ordenada al
origen (B) de la recta ajustada a la ecuación y = A x + B.
Los valores estimados de A y B se calculan mediante lassiguientes ecuaciones:.
importante una de incertidumbre
cuadrados sólo estimaciones la
Los estándar los A B
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Estimaciónregresión
de los parámetros de la
Además de los valores individuales de A y B, es
importante tener una idea de su incertidumbre asociada,
ya que los datos instrumentales llevan asociados un
error que depende del ruido instrumental, y el ajuste por
cuadrados mínimos sólo provee estimaciones de la
pendiente y ordenada al origen.
Los desvíos estándar en los parámetros A y B se
calculan con las siguientes ecuaciones:
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Estimaciónregresión
de los parámetros de la
En las ecuaciones precedentes, el parámetro sy/x es el
desvío estándar de los residuos de la regresión y estádado por:
punto es A
datos parámetros en
Estos estadísticos también idea
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Estimaciónregresión
de los parámetros de la
donde yi es la respuesta experimental de cada patrón de
calibrado e yˆi representa la respuesta estimada en cadapunto, esto es, yˆi = A xi + B.
Se emplean m – 2 grados de libertad, ya que hay m
datos disponibles, y 2 parámetros estimados en la
regresión (A y B).
Estos parámetros estadísticos dan también una idea dela bondad de la regresión.
Es que /x lo pequeña ;
obstante valor limitado el instrumental
los de yi varían la cumple
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Estimaciónregresión
de los parámetros de la
Es deseable que sy/x sea lo más pequeña posible; noobstante su valor está limitado por el ruido instrumental.
La distribución de los residuos, es decir, el modo en quelos valores de (yi – yˆi ) varían con la respuesta, cumple
también un papel importante en el análisis de la
adecuación de los datos al modelo lineal.
rango
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Cifras de mérito del método
Las cifras de
regularmente
determinado
analíticas con
mérito de un método analítico se utilizan
conmétodo
el propósitocomparar
desus
calificar un
y propiedades
las provistas por otras técnicas.
Incluyen, entre otras, las siguientes:
sensibilidad de calibración
sensibilidad analítica
límite de detección
límite de cuantificación
rango dinámico
rango lineal
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Sensibilidad
La sensibilidad de calibración no es adecuada paraestán
(porcomparar dos métodos analíticos cuando estos
basados
ejemplo,
medidas
en respuestas de diferente naturaleza
absorbancia y fluorescencia, o absorbancia yelectroquímicas, etc.).
Para ello es preferible utilizar la llamada sensibilidad
analítica γ, definida por la relación entre la sensibilidad yel ruido instrumental:
donde sy es una medida conveniente del nivel de ruidoen la respuesta.
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Sensibilidad
Para estimar el nivel de ruido pueden usarse dos
procedimientos, que en teoría deberían coincidir.
En el primero, se estima el ruido instrumental (sy) a
través de los desvíos de las réplicas de las medicionesde calibrado respecto de sus promedios.
En el segundo método de estimación del nivel de ruido,
se lo estima como el desvío estándar de los residuos de
la regresión lineal, el parámetro ya definido sy/x
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Límite de detección (LOD)
Es la mínima concentración detectable de manera
confiable por la técnica.
En la definición moderna, el límite de detección (LOD) se
calcula en función del desvío estándar de la
concentración predicha para una muestra blanco (s0)
n
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Límite de detección (LOD)
De este modo, el LOD está dado por:
LOD = 2 × t0,05,m–2 × s0 (13)
definición que ha sido adoptada también por IUPACISO.
e
En la práctica, dado que m es un número relativamente
grande, el valor de (2×t0,05,m–2) tiende a 3,3, por lo que
una ecuación aproximada para el límite de detección es
LOD = 3,3 s0
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Límite de cuantificación (LOQ)
Es la mínima concentración cuantificable en forma
confiable.
Este parámetrocorrespondiente
(LOQ) se toma como la concentración
a 10 veces el desvío estándar (en
unidades de concentración) del blanco, con lo cual:
LOQ = 10 s0
De este modo, el desvío estándar relativo (DSR) parauna concentración igual al LOQ es del 10%, nivel que se
toma convencionalmente como el máximo DSR
aceptable para cuantificar el analito en una muestra.
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Rango dinámico
Se considera que va desde la menor concentración
detectable (el LOD) hasta la pérdida de relación entrerespuesta y concentración.
El rango dinámico es también el rango de aplicabilidadde la técnica.
En la zona de pérdida de la linealidad, podría aplicarse,en principio, un método de regresión polinómica para la
calibración (o algún otro de naturaleza no lineal), de
modo que nada impide que dicha zona sea utilizada conpropósitos predictivos.
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Rango dinámico
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Rango lineal
Se considera que el rango lineal comprende desde la
menor concentración que puede medirse (el LOQ) hasta
la pérdida de la linealidad.
La prueba estadística que se utiliza para determinar si
los datos se ajustan a la ley lineal es la F: en primer
lugar se calcula un valor "experimental" de F, dado por:
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Rango lineal
Luego se compara este valor con el crítico que se
encuentra en tablas de F (de una cola) para m – 2 y m –
p grados de libertad, y un determinado nivel de
confianza, por ejemplo 95%.
Si Fexp < F, se acepta que los datos se comportan
linealmente.
Alternativamente, se calcula la probabilidad pF asociada
a este valor de Fexp, y se considera que la prueba de
linealidad es aceptada si pF > 0,05.
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
LA CURVA DE CALIBRACIÓN
Otro parámetro obtenido en el análisis de regresión es elcoeficiente de determinación o de regresión, R2.
El coeficiente casi siempre tiene un valor cercano a launidad, que es el máximo valor que puede alcanzar.
Pero no debe mal interpretarse puesto que un
coeficiente de correlación de 1, no necesariamente
significa que la linealidad sea buena, sino que el
numerador y el denominador de la expresión anterior secancelan mutuamente.
El coeficiente de correlación sólo es otro indicio adicionalque debe sumarse al análisis de los residuos.
BIBLIOGRAFÍA.
NORMAARGENTINA IRAM 301* ISO/IEC 17025. Cuarta
edición. 2005-09-05.
Guía de Laboratorio para la Validación de Métodos y
Temas Relacionados. EURACHEM. 2005. Disponible en:
http://www.metroquimica.com.ar/descargas/Eurachem-
Guia-Validacion-CNM-MRD-030-2da-Ed.pdf
La Calibración en Química Analítica. Goicoechea, HC yOlivieri, AC. Editorial UNL, 2007.