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VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS

Dra. Adriane Medeiros Nunes

Laboratório de Metrologia QuímicaDepartamento de Química Analítica e Inorgânica - UFPel

Pelotas, 26 de Outubro 2010

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IntroduçãoA necessidade de se mostrar a qualidade de medições químicas

está sendo cada vez mais exigida e reconhecida. Através da sua:

Comparabilidade

Rastreabilidade

Confiabilidade

Resultados Analíticos não confiáveis podem conduzir:

Decisões desastrosas

Prejuízos financeiros irreparáveis

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IntroduçãoPara garantir que um novo método analítico gere

informações

Confiáveis Interpretáveis

Sobre a amostra

Ele deve sofrer uma avaliação denominada validação

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Conceitos do processo de validação

Vários autores definem validação de métodos conceitos estão em continua evolução

Algumas definições podem ser transcritas:

-“A validação deve garantir, através de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados” (ANVISA).

- “Validação é o processo de definir uma exigência analítica e confirmar que o método sob investigação tem capacidade de desempenho consistente com o que a aplicação requer” (ISO/IEC 17025).

- “A validação de métodos assegura a credibilidade destes durante o uso rotineiro, sendo algumas vezes mencionado como o “processo que fornece uma evidência documentada de que o método realiza aquilo para o qual é indicado para fazer” (USP).

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Validação de métodos

Dentro do âmbito geral do termo validação de métodos é possível distinguir dois tipos:

- Validação no laboratório (“in house validation”)

Consiste das etapas de validação dentro de um único laboratório, seja para

validar um método novo que tenha sido desenvolvido ou para verificar

que um método adotado está bem aplicado.

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Validação de métodos

- Validação completa

Envolve todas as características de desempenho e um ESTUDO

INTERLABORATORIAL.

Utilizado para verificar como a metodologia se

comporta com uma determinada matriz em

vários laboratórios

-Estabelecendo a reprodutibilidade da metodologia

- Incerteza expandida associada à metodologia como um todo

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Legislação

No Brasil, existem duas agências credenciadoras para verificar a

competência de laboratórios de ensaios:

ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária

INMETRO: Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial.

Disponibilizam guias para o procedimento de validação de métodos analíticos

Resoluções: são documentos com poder de lei, que devem ser obedecidos.

Guias: são documentos que sugerem uma linha a ser seguida e são, portanto, abertos para interpretação: “recomendações”.

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Parâmetros analíticos para validação de métodos

- Parâmetros de desempenho analítico- Características de desempenho

- Parâmetros de mérito

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1- Seletividade ou Especificidade

Amostra

Uma amostra, de maneira geral, consiste:

- Analitos a serem medidos;- Matriz;- Outros componentes. (que podem ter algum efeito na medição)

Um método que produz resposta para apenas um analito é chamado de

específico.

Um método que produz resposta para vários analitos, mas que pode

distinguir a resposta do analito da de outros, é chamado seletivo.

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HG AASConsiste na formação de hidretos voláteis a partir do elemento em

solução ácida na presença de um agente redutor adequado

Hidreto Ponto de Fusão Ponto de Ebulição Solubilidade em H2O

(°C) (°C) (µg.ml-1)

AsH3 - 116,3 - 62,4 696

GeH4 - 164,8 - 88,1 insolúvel

SbH3 - 88 - 18,4 4100

SeH2 - 65,7 - 41,3 37700-68000

Tabela 1- Propriedades de alguns Hidretos empregados para AAS

Dependendo da técnica analítica utilizada, a quantidade relativa de matriz pode diminuir

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Dependendo da técnica analítica utilizada, a quantidade relativa de matriz pode diminuir

1- Seletividade ou Especificidade

Hidreto + Ar + H2 + traços de O2

Fig. 1- Sistema de Geração de Hidretos em batelada (adaptado de Welz & Melcher,1983)

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2- Linearidade e Faixa de aplicação

A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados

diretamente proporcionais à concentração do analito em amostras, dentro de

uma determinada faixa de concentração.

A quantificação requer que se conheça a dependência entre a resposta

medida e a concentração do analito;

A linearidade é obtida por padronização interna ou externa e formulada como

expressão matemática usada para o cálculo da concentração do analito a ser

determinado na amostra real.

Curva de Calibração

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y = ax + b

y = resposta medida (absorvância, altura ou área do pico, etc.);x = concentração;a = inclinação da curva de calibração = sensibilidade;b = interseção com o eixo y, quando x=0.

Regressão linear

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Coeficiente de correlação linear (r):

-indica o quanto pode ser considerada adequada a reta como modelo matemático. -> 0,90 é ideal.-Qualidade da curva obtida: quanto mais próximo de 1, menor a dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados.

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3- Limite de Detecção (LD)

O LD representa a menor concentração de analito que pode ser detectada,

mas não necessariamente quantificada, utilizando um determinado

procedimento experimental.

a3sLOD B=

menor concentração de analito na amostra que produz um sinal que pode

ser distinguido do sinal do branco, dentro de certo critério estatístico.

sendo “a” a inclinação da curva de calibração e “s” o desvio-padrão de 10 medidas do branco.

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4 - Limite de Quantificação

É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas.

sendo “a” a inclinação da curva analítica “s” o desvio-padrão de 10 medidas do branco.

a10sLOD B=

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5- Precisão e Exatidão

São dois termos muito importante em química analítica.

Precisão é uma medida da reprodutibilidade de um resultado.

Ex. se uma grandeza for medida várias vezes e os valores forem muito próximos uns

dos outros, a medida é precisa.

Exatidão se refere a quão próximo um valor de uma medida está do “valor real”.

Ex. se um padrão conhecido estiver disponível (Material de referência), a exatidão é

o quão próximo o valor determinado está do valor padrão.

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Precisão e Exatidão

Um dado constituinte em um mesmo material é determinado por três

métodos diferentes, (a), (b), e (c), onde foram feitas 5 medidas em cada

método.

(a)

(b)

(c)

Xv(valor verdadeiro)

16 17 18 19 20 21 22

Medidas precisas e exatas

Medidas precisas, mas inexatas

Medidas imprecisas e inexatas

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É a proximidade dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação

ao valor de referência aceito como convencionalmente verdadeiro.

Checagem da Exatidão (“Validação”)

- Materiais certificados de referência (CRMs)

- Técnicas alternativas

- Teste da recuperação

Exatidão

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Testes de recuperação

A recuperação do analito pode ser estimada pela análise de amostras adicionadas com quantidades conhecidas do mesmo (spike).

As amostras podem ser adicionadas com o analito em pelo menos três diferentes concentrações:

próximo ao limite de detecção; próximo à concentração máxima permissível;

concentração próxima à média da faixa de uso do método.

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Limitação do procedimento:

-O analito adicionado não está necessariamente na mesma forma que a presente na amostra. A presença de analitos adicionados em uma forma mais facilmente detectável pode ocasionar avaliações excessivamente otimistas da recuperação.

onde:C1 = concentração determinada na amostra adicionada.C2 = concentração determinada na amostra não adicionada.C3 = concentração adicionada.

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Metas - LABmequi

Desenvolvimento e validação de metodologias analíticas para a determinação de

metais em produtos alimentícios de carne por Espectrometria de Absorção

Atômica (AAS).

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Determinação de Na e K em carnes Determinação de Na e K em carnes processadas após tratamento com TMAH processadas após tratamento com TMAH

por FAESpor FAES

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Atualmente....

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Introdução

5% Comida Caseira

12% Ocorrência Natural

6% Adição na Ingestão

77% Comida Processada

- Principal aditivo para a conservação da carne- Controla o crescimento microbiológico- Intensifica o paladar do alimento

NaCl

Pesquisas indicam a carne como sendo a segunda maior fonte de sal na dieta, sendo que os cereais são os principais.

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Main Product Category Sub Categories (where relevant)

Current 2010 Targets

(g salt or mg sodium per 100g)*

Revised 2010 Targets (g salt or mg sodium per

100g)*

Targets for 2012 (g salt or mg

sodium per 100g)*

1. Meat Products 1.1 Bacon Includes all types of injection cured bacon, e.g. sliced back, streaky, smoked and unsmoked bacon, bacon joints etc. Excludes all dry and immersion cured bacon.

1.2 Ham/other cured meatsIncludes hams, cured pork loin and shoulder etc. Excludes ‘Protected Designation of Origin’ and traditional speciality guaranteed products,.

1.3 Sausages1.3.1 Sausages Includes all fresh, chilled and frozen meat sausages, e.g. pork, beef, chicken, turkey, etc.

1.3.2 Cooked sausages and sausage meat products Includes all cooked sausages and sausage meat products e.g. stuffing, turkey roll with stuffing etc. Excludes Scotch eggs (see category 22.1).

3.5g salt or 1400mg sodium (average)


2.88g salt or 1150mg sodium (average p)



1.63g salt or 650mg sodium (average p)

1.4g salt or 550mg sodium (maximum)





1.4 Meat Pies1.4.1 Delicatessen, pork pies and sausage rolls Includes all delicatessen pies, pork pies and sausage rolls e.g. game pie, cranberry topped pork pie, Melton Mowbray pork pie etc.




≈20%

≈35%

≈20%

≈20%

≈25%

≈11%

≈20%

≈10%

≈8%

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Atualmente, industrias alimentícias (que pertencem a Comunidade Européia)

têm respondido de forma positiva a redução do nível de sal em seus produtos

alimentícios.

Fabricantes de produtos cárneos vêm investindo no desenvolvimento de metodologias alternativas para a redução da concentração de sal (NaCl)

nas comidas processadas

Vários trabalhos estão sendo desenvolvidos com este objetivo

Substituindo o máximo possível de Na+ por K+, bem como por outros antioxidantes naturais

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Segundo Romans et al. (2001)

Para carnes curadas a concentração de Na+ pode ser reduzida por uma mistura de

até 50:50 de NaCl com KCl, por possuir sabor aceitável.

> 50% de substituição – resulta em sabores indesejáveis resultantes do k+

Cheng et al. (2007)Investigaram a interação da oxidação lipídica e a oxidação do pigmentos causados pela substituição do NaCl por KCl em amostras de carnes suínas

-Foi verificado que a redução do nível de NaCl não alterou significativamente a pigmentação durante o período de refrigeração.

-Com 50% de substituição – não houve diferenças significativas nos valores de pH, pigmentos totais e ferro heme.

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Avaliar o uso de TMAH no preparo das amostras de carnes processadas para a

determinação de Na e K por Espectrometria de Emissão Atômica com Chama

(FAES) / Propor uma metodologia simples e barata para o controle desses

elementos em amostras de carnes destinadas a exportação.

Objetivo

Os resultados serão comparados através de diferentes procedimentos de preparo de amostras;

Através do uso de diferentes técnicas analíticas;

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Espectrômetro 1 (FAES1/FAAS)

Espectrômetro de Absorção Atômica (Shimadzu) - modelo AA-6300

Corretor de Fundo de Deutério;

Chama ar-aceliteno foi utilizada para todas as determinações;

Lâmpada de Cátodo Oco de Na (589.0 nm) e K (766.5 nm);

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Espectrômetro 2 (FAES 2)

Fotômetro de Chama (Micronal) – modelo B462;

Chama – Gás butano;

Volume de amostra – 5 mL mim-1;

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Amostras

Amostras comerciais (Diferentes fabricantes): Almôndega;

Carne Bovina Fatiada;

Salsicha.

Tratamento das Amostras

Inicialmente lavadas com Água Milli-Q;

Cortadas;

Homogeneizadas – microprocessador;

Mantidas sob refrigeração à -16 °C em frascos de PEAD;

Antes da análise as amostras foram descongeladas e homogeneizadas.

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Digestão Ácida

2,5 mL HNO3

2,0 mL H2O2

Tº ≈ 90 ºC

t = 2 h

Solubilização com TMAH

400 µL de TMAH (25,0 % m/v)

Concentração final – 0,2% m/v TMAH

Solubilização T° ambiente

Simples Seguro Reprodutível

10,0 mL

Tº ≈ 50 ºC no US

t = 2 h

Solubilização com CH2O2

Metodologia

Almôndega Carne fatiada Salsicha

≈ 250,0 mg de amostra moída e úmida foram tratadas e aferidas a 50 mL

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DIGESTÃO ÁCIDA

HCl, HNOHCl, HNO33, H, H22SOSO44, HF e H, HF e H33POPO44; H; H22OO22

PONTO DE EBULIÇÃO À PRESSÃO ATMOSFÉRICAPONTO DE EBULIÇÃO À PRESSÃO ATMOSFÉRICA

Ácido Concentração P.E. (°C)

HCl 37% (m/v) 110

HF 49% (m/v) 108

HNO3 70% (m/v) 120

Água-régia (HCl:HNO3 3:1) v/v 112

H2SO4 98,3% (m/v) 338

H3PO4 85% (m/v) 150

Força do ácido

Ponto de ebulição

Poder oxidante

Poder complexante

Segurança na manipulação

Pureza

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DIGESTÃO ÁCIDA

Temperaturas desejáveis para a digestão de amostras biológicas

Decomposição com HNO3 (apresenta o menor Ponto de Ebulição)

Altos teores de GORDURAS (queijo, manteiga, óleo vegetal) 170 °C Altos teores de PROTEÍNAS (carne bovina, soro, albumina) 150 °C Altos teores de CARBOHIDRATOS (trigo, milho, áçúcar, etc.) 140 °C

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DIGESTÃO ÁCIDA

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SOLUBILIZAÇÃO ALCALINASOLUBILIZAÇÃO ALCALINA

TMAHTMAH

Amostras biológicas em geral podem ser facilmente solubilizadas com

TMAH em temperatura ambiente, sem a necessidade de aplicação de

energias para o aquecimento, como as microondas ou ultra-sônicas.

~ 250 mg de amostra seca

500 µL de TMAH (25% m/v)

Solução resultante: Apresentam características de suspensão;

Baixo fator de solubilização;

Permanecendo estável durante meses

Estocadas a temperatura ambiente

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TMAHTMAH

INCONVENIENTES:

Odor de amina;

Alta viscosidade da solução;

Otimização do procedimento de análise;

Possíveis interferências não-espectrais

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Resultados e Discussão

mg/g (média ± SD) (RSD)

Amostras Secas Amostras Úmidas

Carne Bovina

K 3,25 ± 0,06 (1,8) 3,18 ± 0,06 (1,9)

Na 12,69 ± 0,04 (0,3) 13,67 ± 0,05 (0,4)

Salsicha

K 3,23 ± 0,11 (3,4) 3,33 ± 0,04 (1,2)

Na 29,34 ± 0,12 (0,4) 30,53 ± 0,20 (0,6)

Almôndega

K 4,86 ± 0,05 (1,0) 5,02 ± 0,10 (2,0)

Na 10,90 ± 0,13 (1,2) 10,52 ± 0,04 (0,4)

O emprego das amostras úmidas

ou secas apresentaram resultados

de concentrações similares.

250 mg da amostra moída

foram suficiente para obter

resultados exatos e precisos

Amostras tratadas com TMAHTMAH

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AnalitoFaixa de

Calibração (mg L-1)

TMAH CH2O2 HNO3

a (mg L 1‑ )

LD (µg L-1) R

a (mg L 1‑ )

LD (µg L-1) R

a (mg L 1‑ )

LD (µg L-1) R

K 0,2 – 0,8 0,5922 4,6 0,9986 0,5697 5,7 0,9986 0,6048 2,8 0,9989

Na 0,1 – 0,6 0,8679 1,4 0,9992 0,8004 3,6 0,9977 0,8275 1,0 0,9942

Parâmetros de mérito para as três metodologias de preparo de amostra:

Boa Linearidade das curvas de calibração;

Sensibilidades semelhantes.

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Analito AmostraTMAH CH2O2 HNO3

Ve(mg g-1)

RSD(%)

LOD(µg g-1)

Ve(mg g-1)

RSD(%)

LOD(µg g-1)

Ve(mg g-1)

RSD(%)

LOD(µg g-1)

A 3,18±0,05 1,6 2,0 3,39±0,04 1,2 3,0 3,11±0,04 1,3 1,5

K B 3,33±0,03 0,9 3,59±0,08 2,2 3,22±0,01 0,3C 5,02±0,10 2,0 5,70±0,03 0,5 5,21±0,03 0,6

A 13,67±0,05 0,4 0,8 14,18±0,20 1,4 2,0 13,85±0,08 0,6 0,6

Na B 30,53±0,20 0,6 31,56±0,30 0,9 30,92±0,19 0,6C 10,52±0,04 0,4 9,98±0,10 1,0 9,68±0,16 1,6A: Carne fatiada; B: Salsicha; C: Almôndega; Ve: Valor encontrado.

Resultados analíticos, em mg/g, para amostras de carne processadas após tratamento com diferentes procedimentos de preparo de amostras por FAES.

Das amostras de carne analisadas a salsicha foi que apresentou maior conc. de Na;

Comparado com as metas atuais exigidas pela EU a concentração de Na nas amostras de Salsicha é 6X maior;

As amostras analisadas apresentaram concentrações de Na muito maior que as informadas no rótulo;

Exemplo: 0,68 m/g de Na (Rótulo) – 10 mg/g (Valor Encontrado).

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Analito AmostraFAES FAAS

Ve(mg g-1)

RSD(%)

R Ve(mg g-1)

RSD(%)

R

KA 3,52±0,26 7,4 0,9966 3,21±0,17 5,3 0,9988B 3,47±0,02 0,6 3,27±0,05 1,5

C 5,37±0,48 8,9 5,45±0,20 3,7

NaA 13,63±0,54 4,0 0,9980 13,32±0,18 1,3 0,9954B 31,93±0,58 1,8 29,60±0,50 1,7

C 9,82±0,16 1,6 10,69±0,05 0,5

As soluções foram preparadas em meio de

CsCl2 (0,09% m/v)

A: Carne fatiada; B: Salsicha; C: Almôndega; Ve: Valor encontrado.

Resultados analíticos, em mg/g, para amostras de carne processadas por FAAS e FAES 2, após tratamento com TMAH.

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ConclusãoConclusão

As altas concentrações de Na encontradas nas amostras analisadas e a grande discrepância nos níveis desse elemento informado em seus rótulos, enfatizam a importância do Brasil em reduzir o teor de sal nos alimentos processados e implementar um controle de qualidade.

O método de preparação das amostras com TMAH mostrou-se:

Ser uma metodologia simples que fornece resultados exatos e precisos para a determinação de Na e K por FAES;

Empregando poucas quantidades de amostras e reagentes;

Sendo eficiente na solubilização das amostras estudadas mesmo com um elevado teor de gordura, o mesmo comportamento não foi observado com a digestão ácida em copo aberto.

Em conclusão, o procedimento desenvolvido pode substituir com sucesso os procedimentos convencionais, pois não foram observadas diferenças significativas com um nível de confiança de 95%.

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AGRADECIMENTOS

Pelo apoio financeiro e bolsas concedidas:

AGRADECIMENTOS

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TMAHTMAH

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