METROSUL IV – IV Congresso Latino-Americano de Metrologia “A METROLOGIA E A COMPETITIVIDADE NO MERCADO GLOBALIZADO”

09 a 12 de Novembro, 2004, Foz do Iguaçu, Paraná – BRASIL Rede Paranaense de Metrologia e Ensaios

VALIDAÇÃO ANALÍTICA DO ENSAIO DE LAL PELO MÉTODO CINÉTICO

CROMOGÊNICO PARA DETERMINAÇÃO DE ENDOTOXINA EM DILUENTE DE VACINA CONTRA SARAMPO

Rosane Cuber Guimarães 1, Alaide Aline Xavier Leal1

1 Setor de Validação Analítica, Laboratório de Metrologia e Validação, Departamento da Garantia da Qualidade –

Bio-Manguinhos - FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brasil Resumo: Validar um método é o processo de demonstrar que a seqüência analítica adotada é capaz de produzir resultados confiáveis e reprodutíveis. Dessa forma, um método analítico deve ser submetido a estudos laboratoriais que demonstrem que o mesmo atenda às exigências requeridas pelo tipo de determinação a que se destina [1]. Assim o objetivo do presente trabalho foi demonstrar a validação do método e a avaliação quanto a sua adequação. Esta validação analítica foi realizada conforme descrito em protocolo, utilizando 3 lotes de diluente para vacina contra sarampo. Todos os parâmetros de validação estipulados: linearidade, repetibilidade, reprodutibilidade intralaboratorial e exatidão foram atendidos. Este estudo também demonstrou a adequação ao método para a determinação de endotoxina para diluente de vacina contra sarampo e sua extensão para amostras de água apirogênica.

Palavras chave: método bioanalítico, endotoxina, validação.

1. INTRODUÇÃO

O ensaio de LAL (Limulus amebocyte lysate) é usado para quantificar a endotoxina presente em uma amostra farmacêutica submetida à análise. Uma vez que a endotoxina bacteriana é um contaminante presente na maioria das amostras em um determinado nível, é essencial determinar se a quantidade de endotoxina presente nas amostras encontra-se dentro do limite estabelecido em farmacopéia.

O método LAL cinético cromogênico é realizado misturando-se LAL + cromóforo e a amostra a ser testada, monitorando-se a aparição de uma cor amarelada. Através de um equipamento leitor de microplacas e um software, o ensaio cinético cromogênico pode ser realizado onde o tempo inicial

da formação de cor será detectado e precisamente medido. O tempo inicial de formação de cor é inversamente proporcional à quantidade de endotoxina presente na amostra, assim os níveis de endotoxina são determinados pela comparação com uma curva padrão.

O presente método descrito na farmacopéia americana - USP[2] foi validado de acordo com os parâmetros estipulados pelo Food and Drug Administration - FDA [3] acrescidos dos parâmetros de precisão citados no Guia para Qualidade em Química Analítica – ANVISA [4].

2. MÉTODOS

O ensaio de LAL pelo método cinético cromogênico se realiza em condições pré-determinadas de temperatura de reação (37ºC+1ºC), volume final (200 µL) e pH da amostra (6-8). Os parâmetros de validação foram os seguintes:

• Linearidade é a habilidade de um método analítico em produzir resultados que sejam diretamente proporcionais a concentração do analito em amostras, na faixa linear de trabalho e, neste trabalho foi determinada construindo-se uma curva de calibração de tempo de reação contra concentração a partir de uma endotoxina padrão controle (CSE) de 50 EU/mL. A análise se realizou 3 vezes para cada diluição em um range de concentração de 5 x 10-3 a 0,5 EU/mL com os pontos em triplicata. Os resultados foram usados para se obter uma reta por regressão linear pelo método dos mínimos quadrados, com determinação dos parâmetros linear (b) e angular (a) e determinação do coeficiente de determinação e correlação (r e r2) e coeficiente de variação das replicatas (CV%).

• Precisão (Repetibilidade e Reprodutibilidade Intralaboratorial)

• Repetibilidade: Foram utilizados 3 lotes distintos de diluente de vacina contra Sarampo (Água apirogênica) e foram feitas três repetições, sob as mesmas condições de ensaio, por um mesmo analista em um mesmo dia e no mesmo equipamento. Também foi realizado um ensaio utilizando um lote de diluente de vacina contra Sarampo aditado de uma concentração de 0,05 EU de endotoxina padrão controle numa diluição 1:1 e foram feitas 10 repetições sob as mesmas condições de ensaio, por um mesmo analista em um mesmo dia e no mesmo equipamento.

• Reprodutibilidade Intralaboratorial (Precisão intermediária): foi realizada, utilizando um lote individual de diluente de vacina, aditado de uma concentração de 0,05 EU de endotoxina padrão controle numa diluição 1:1, três replicatas de cada amostra por três analistas diferentes em dias diferentes. Os valores reportados foram:

- resultados individuais;

- Média;

- Desvio padrão;

- Coeficiente de variação.

• Exatidão é o grau de concordância entre o valor médio obtido de uma série de resultados e o valor de referência aceito como convencionalmente verdadeiro, dentro de um intervalo de confiança. Para a quantificação de impurezas, a exatidão é determinada através da análise de amostras (fármacos ou produtos) contendo quantidades conhecidas de impurezas. Para este parâmetro foram utilizados 3 lotes distintos de diluente de vacina contra Sarampo (Água apirogênica) aditados de uma concentração de 0,05 EU de endotoxina padrão controle numa diluição 1:1. Foram feitas três repetições, sob as mesmas condições de ensaio, por um mesmo analista em um mesmo dia e no mesmo equipamento. Os valores reportados foram:

- resultados individuais;

- Média;

- Coeficiente de variação;

- Percentual de recuperação.

3. RESULTADOS

Na tabela 1 se observam os valores obtidos para o ensaio de LAL para determinação de endotoxina pelo método cinético cromogênico. Os parâmetros de linearidade, precisão e exatidão do método se

encontram dentro dos critérios de aceitação estabelecidos [2,3].

Tabela 1. Resultados da validação do método.

Parâmetro de Avaliação

Resultado Critério de Aceitação

r = - 0,9997 r = -1 a -0,98 R2 = 0,9995 R2 > 0,99 (a) = -0,2830 (a) = -0,3 a -0,1

Linearidade

(b) = +2,931 (b) = +2,5 a +3,5 Repetitividade

CVr = 1,48%

CVr < 2%

Reprodutibilidade Intralaboratorial

CVR = 1,39%

CVR < 4%

Exatidão (Recuperação)

83% CV replicatas = 2,5%

50% a 150%

Além da verificação dos parâmetros acima, tanto o FDA como a USP só consideram um laboratório apto a realizar o ensaio de LAL para determinação de endotoxina se todos os técnicos forem capazes de realizar curvas-padrão (Log da concentração de endotoxina em EU/mL x Log do tempo de reação) válidas de acordo com os critérios de linearidade e também demonstrar que não existem fatores de interferência na amostra (tanto fatores inibidores como fatores de potencialização). As curvas-padrão dos três analistas envolvidos na validação deste método, como também nas análises de rotina encontram-se demonstradas nas figuras 1, 2 e 3. Na tabela 2 encontra-se descrito, como a USP e o FDA sugerem, a demonstração de que não há presença de fatores de interferência na amostra a ser ensaiada. A quantidade de endotoxina a ser adicionada na amostra é calculada estabelecendo-se o valor de corte “Pass/Fail Cutoff” – PFC de acordo com a fórmula:

PFC = Limite de endotoxinaMVD (1)

Onde: MVD = Limite de endotoxina λ (2) λ = Menor concentração de endotoxina da curva padrão

• Se PFC < 1,0 EU/mL – Concentração do aditado = 0,1 a 0,5 EU/mL.

• Se PFC > 1,0 EU/mL – Concentração do aditado = 1,0 a 5,0 EU/mL.

Os resultados da série C da tabela 2 devem atender os requisitos de validação descritos no parâmentro de linearidade. Nesta validação atendemos a ambos os critérios, tanto os de linearidade como os da USP

através do preparo das curva-padrão por todos os analistas conforme descrito em Métodos – Linearidade. A recuperação da endotoxina, calculados da concentração encontrada na solução B após subtração da concentração de endotoxina encontrada na solução A deve estar entre 50 e 150%. Nesta validação atendemos a este critério no parâmetro exatidão. O resultado da série de controle negativo D não deve exceder o limite de endotoxina ditado pela curva (λ). Nesta validação nosso controle negativo para todos os ensaios foi água apirogênica (WFI) cujos resultados de endotoxina foram todos abaixo de 5 x 10-3 EU/mL.

Curva-padrão Analista 1

y = -0,2554x + 2,9539R2 = 0,9995

-2,500 -2,000 -1,500 -1,000 -0,500 0,000

Log da concentração

Log

do T

empo

de

Rea

ção

Fig. 1. Curva-padrão analista 1

Curva-padrão Analista 2

y = -0,2981x + 2,9117R2 = 0,999

3,000

3,100

3,200

3,300

3,400

3,500

3,600

3,700

-2,50 -2,00 -1,50 -1,00 -0,50 0,00

Log da concentração

Log

do T

empo

de

reaç

ão

Fig. 2. Curva-padrão analista 2

Curva-padrão Analista 3

y = -0,2954x + 2,9263R2 = 0,9999

2,900

3,000

3,100

3,200

3,300

3,400

3,500

3,600

3,700

-2,50 -2,00 -1,50 -1,00 -0,50 0,00

Log da concentração

Log

do te

mpo

de

reaç

ão

Fig. 3. Curva-padrão analista 3

Tabela 2. Preparação de soluções para o ensaio de inibição/potencialização para método cinético cromogênico.

Solução Concentração de Endotoxina Solução na qual a Endotoxina é adicionada

Número de Replicatas

Aa Nenhuma Amostra 3 Bb Concentração média da curva padrão Amostra 3 Cc No mínimo 3 concentrações (a menor

concentração é designada λ) Água apirogênica 3 de cada

Dd Nenhuma Água apirogênica 3 a Solução A: a amostra pode ser diluída até não exceder o MVD (máximo valor da diluição). b Solução B: a preparação a ser testada na mesma diluição que a Solução A, contendo endotoxina adicionada na mesma concentração ou próxima ao ponto médio da curva padrão. c Solução C: endotoxina padrão na mesma concentração usada para a construção da curva padrão(série de controles positivos). d Solução D: água apirogênica (controle negativo).

4. DISCUSSÃO

Conforme descrito no “Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos” – RE nº 899, de 29 de maio de 2003 emitido pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA, no caso de metodologia analítica descrita em farmacopéias ou formulários oficiais devidamente reconhecidos pela ANVISA, a metodologia será considerada validada [5]. Todavia, não só o FDA [1], como a própria USP [2] solicitam em suas publicações que antes da utilização do ensaio de LAL por qualquer método na rotina, o laboratório demonstre a qualificação de seus analistas e a ausência de fatores de interferência.

Isto se deve em grande parte, ao fato de existirem grandes fontes de variabilidade nos procedimentos entre os diversos laboratórios, nos equipamentos, diluentes e vidraria. Assim, torna-se imprescindível que um laboratório que tenha controle e garantia da qualidade confirme os parâmetros de validação antes de analisar rotineiramente suas amostras [6].

Neste estudo de validação, não só o equipamento – Leitor de Microplacas, como o software, se encontravam calibrados e qualificados e os parâmetros de validação foram todos atendidos.

Em todas as literaturas de validação citadas, o teste de repetitividade do método solicita que sejam utilizadas no mínimo três concentrações da amostra que esta sendo utilizada. Nesta validação, não foi

possível atender a esta recomendação, uma vez que as amostras de diluente de sarampo (água apirogênica) são processadas sem diluição e seus resultados já ficam no valor mínimo do limite de detecção do aparelho.

Para resolver este problema, as amostras de diluente foram aditadas de uma concentração de 0,05 EU de endotoxina padrão controle numa diluição 1:1 e a repetibilidade foi calculada.

O fato das amostras de diluente contra a vacina de sarampo serem água apirogênica (WFI) envasada, nos permite estender esta validação não só para as amostras de diluente como também para água apirogênica, não sendo necessária a execução de um novo protocolo de validação.

5. CONCLUSÃO

A validação analítica do teste de LAL pelo método cinético cromogênico, para determinação de endotoxina em diluente para vacina contra sarampo (água apirogênica), foi realizada conforme descrito em protocolo, utilizando 3 lotes de amostra. A faixa de concentração em EU/mL entre o maior e o menor ponto da curva padrão (range) foi de 2-log com 4 pontos (0,005; 0,05; 0,25 e 0,5). A densidade ótica (Onset OD) foi de 0,100 e a análise de regressão foi realizada por regressão linear, conforme requerido no Guideline do FDA. Os parâmetros de linearidade foram todos atendidos. O valor médio do coeficiente de correlação das curvas-padrão foi de 0,9997, os valores médios de coeficiente angular e coeficiente linear foram respectivamente -0,2830 e +2,931. O teste mostrou-se específico e exato, uma vez que as taxas de recuperação do spike ficaram entre 50% e 150%. Todos os coeficientes de variação das replicatas ficaram abaixo de 4%, atendendo aos requisitos de precisão e repetitividade do sistema. Esta validação também demonstrou a qualificação dos analistas, visto que todos foram capazes de produzir curvas-padrão válidas. Assim o presente trabalho é capaz de assegurar que o método analítico cinético cromogênico está desempenhando sua função adequadamente, ou seja, demonstra que controles de endotoxina são recuperados na amostra teste com especificidade / seletividade (sem interferências detectáveis), com linearidade, exatidão e precisão. Atualmente encontra-se em andamento o cálculo de incerteza deste método validado.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Laboratório de Controle Microbiológico (LACOM) do Departamento de Qualidade por ter realizado os ensaios referentes a validação do método.

REFERÊNCIAS [1] Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e

Qualidade Industrial, “Orientações sobre validação de métodos de ensaios químicos – DOQ-CGCRE-008”, 2003.

[2] United States Pharmacopeia 24 and National Formulary 19 Supplement - <85> Bacterial Endotoxins Test – pp. 2875-2879, July 2000.

[3] Food and Drug Administration, “Guideline on validation of the Limulus Amebocyte Lysate test as an end-product endotoxin test for human and animal parental drugs, biological products, and medical devices” – U.S. Department of Health and Human Services - 1987.

[4] Agência Nacional de Vigilância Sanitária, “Guia para Qualidade em Química Analítica: Uma Assistência a Acreditação”, vol.1, 2004.

[5] Agência Nacional de Vigilância Sanitária, RE nº 899 “Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos”, de 29 de maio de 2003.

[6] K. Z. McCullough, “Variability in the LAL Test” In: “LAL Panel Discussion” at the PDA Spring Meeting , New York, March 1989.

Autores: Validação analítica do ensaio de LAL pelo método cinético cromogênico para determinação de endotoxina em diluente de vacina contra sarampo, Rosane Cuber Guimarães, Setor de Validação Analítica, Laboratório de Metrologia e Validação, Bio-Manguinhos, FIOCRUZ, Endereço: Av. Brasil Nº 4365 – Manguinhos, CEP 21040-900, Rio de Janeiro, RJ, Brasil, Tel/Fax: (21) 3882-9386, e-mail: rosane@bio.fiocruz.br

Validação analítica do ensaio de LAL pelo método cinético cromogênico para determinação de endotoxina em diluente de vacina contra sarampo, Alaíde Aline Xavier Leal, Setor de Validação Analítica, Laboratório de Metrologia e Validação, Bio-Manguinhos, FIOCRUZ, Endereço: Av. Brasil Nº 4365 – Manguinhos, CEP 21040-900, Rio de Janeiro, RJ, Brasil, Tel/Fax: (21) 3882-9386, e-mail: alaíde@bio.fiocruz.br