určení rodičů (analýza paternity)
DESCRIPTION
Určení rodičů (analýza paternity). Techniky. Dříve minisatelitový DNA fingerprinting alozymy, mtDNA Dnes převážně mikrosatelity Další možnosti: AFLP, SNPs, proteinový fingerprinting. mikrosatelity. Tandemová opakování krátkých motivů Např. (CTTT) n Někdy i složitější (CTTT) n (CA) n - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Určení rodičů(analýza paternity)
Techniky
• Dříve minisatelitový DNA fingerprinting alozymy, mtDNA
• Dnes převážně mikrosatelity
• Další možnosti:AFLP, SNPs, proteinový fingerprinting
mikrosatelity
• Tandemová opakování krátkých motivů
• Např. (CTTT)n
• Někdy i složitější (CTTT)n (CA)n
• Vysoce polymorfní
• Jednoduchá dědičnost
• Využití: analýza paternity, identity, populační struktury…
CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT
CTTTCTTTCTTTCTTTC
CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT
CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT
CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT
PCRPolymerase chain reaction
(jak z málo DNA udělat hodně)
PCR
• Z celkové DNA si namnožíme jen úsek, který nás zajímá.
• Co se bude množit? To určí primery.
• Primery – krátké oligonukleotidy komplementární k úsekům ohraničujícím místo našeho zájmu.
primer AGGGGACGTACACTCAGCTTTtemplát TCCCCTGCATGTGAGTCGAAA
primer
primer
DNAtemplátu
tento úsek se bude množit
Denaturace (obvykle 95°C)
při zvýšení teploty se oddělí komplementární vlákna DNA
Při ochlazení dojde k reasociaci
Primery přidané v nadbytku kmitají díky Brownově pohybu
Některé se dostanou do blízkosti komplementárních míst
Při ochlazení primery přisednou rychleji než dojde k vzájemné reasociaci dlouhých vláken DNA
(obvykle 50 - 65°C)
V úseku mezi primery zůstanou vlákna DNA oddělena
Primery jsou prodlužovány přidáváním nukleotidů podle sekvence templátu (obvykle 72°C – optimum pro Taq polymerázu)
Při dalším zahřátí dojde k oddělení templátu a nově vzniklých vláken
Po ochlazení primery přisednou na templát i nově vzniklé fragmenty
Při 72°C dojde opět k prodlužování primerů a vzniku nových kopií
Při dalším zahřátí…
Ochlazení – nasednutí primerů 72°C vznik nových fragmentů
95°C denaturace
Alely se liší délkou
CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT
CTTTCTTTCTTTCTTTC
CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT
CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT
+
Fragmentační analýza
Probíhá v sekvenátoru
Elektroforéza
gel
kapilára
Elektroforéza
gel
kapilára
detektorlaserovýpaprsek
CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT
CTTTCTTTCTTTCTTT
GAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAprimer primer
GAAAGAAAGAAAGAAAprimerprimer
Fluorescenční značení
Multiplex
Více dvojic primerů v jedné reakci
Různé značení
Analýza se standardem
standard
Určení paternityMatka Otec Mládě 1 Mládě 2
Určení paternity prostým vyloučením
(simple exclusion)
Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4
55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439
56 Matka 90 98 195 254 196 232 233 297
57 90 98 230 254 212 232 267 297
58 98 98 188 254 216 232 233 275
59 90 90 184 195 196 204 233 273
60 98 98 130 195 220 232 233 439
Možní otci
73 94 98 200 243 184 188 305 379
1004 90 90 256 264 212 224 228 256
1005 90 90 228 274 180 196 245 289
1006 90 98 176 234 216 220 347 410
1007 90 98 146 214 216 220 267 297
25 90 90 168 230 204 212 267 301
1003 90 98 184 217 204 204 212 273
genotypy
Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4
55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439
56 Matka 90 98 195 254 196 232 233 297
57 90 98 230 254 212 232 267 297
58 98 98 188 254 216 232 233 275
59 90 90 184 195 196 204 233 273
60 98 98 130 195 220 232 233 439
73 94 98 200 243 184 188 305 379
1004 90 90 256 264 212 224 228 256
1005 90 90 228 274 180 196 245 289
1006 90 98 176 234 216 220 347 410
1007 90 98 146 214 216 220 267 297
25 90 90 168 230 204 212 267 301
1003 90 98 184 217 204 204 212 273
Identifikace mateřských alel u mláďat(na prvním lokusu málo alel – nebudeme se jím zabývat)
Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4
55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439
56 Matka 90 98 195 254 196 232 233 297
57 90 98 230 254 212 232 267 297
58 98 98 188 254 216 232 233 275
59 90 90 184 195 196 204 233 273
60 98 98 130 195 220 232 233 439
73 94 98 200 243 184 188 305 379
1004 90 90 256 264 212 224 228 256
1005 90 90 228 274 180 196 245 289
1006 90 98 176 234 216 220 347 410
1007 90 98 146 214 216 220 267 297
25 90 90 168 230 204 212 267 301
1003 90 98 184 217 204 204 212 273
Zjištěni shody otcovských alel s alelami sociálního partnera→ nalezení mimopárových mláďat
Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4
55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439
56 Matka 90 98 195 254 196 232 233 297
57 90 98 230 254 212 232 267 297
58 98 98 188 254 216 232 233 275
59 90 90 184 195 196 204 233 273
60 98 98 130 195 220 232 233 439
73 94 98 200 243 184 188 305 379
1004 90 90 256 264 212 224 228 256
1005 90 90 228 274 180 196 245 289
1006 90 98 176 234 216 220 347 410
1007 90 98 146 214 216 220 267 297
25 90 90 168 230 204 212 267 301
1003 90 98 184 217 204 204 212 273
Dohledání genetických otců mimopárových mláďatmládě 57
Kód lokus 1 lokus 2 lokus 3 lokus 4
55 Soc. partner 90 98 130 188 216 220 275 439
56 Matka 90 98 195 254 196 232 233 297
57 90 98 230 254 212 232 267 297
58 98 98 188 254 216 232 233 275
59 90 90 184 195 196 204 233 273
60 98 98 130 195 220 232 233 439
73 94 98 200 243 184 188 305 379
1004 90 90 256 264 212 224 228 256
1005 90 90 228 274 180 196 245 289
1006 90 98 176 234 216 220 347 410
1007 90 98 146 214 216 220 267 297
25 90 90 168 230 204 212 267 301
1003 90 98 184 217 204 204 212 273
Dohledání genetických otců mimopárových mláďatmládě 59
Databáze na internetu
DATABÁZE
Primární databáze DNA sekvencí
GenBank (Amerika) EMBL (Evropa) DDBJ (Japonsko)
Databáze genů
Entrez GeneRefSeq
Databáze genových expresních dat
UniGeneGEO
Databáze genomů
NCBIEnsemblUCSC Genome Browser
Důležité odkazy
PROGRAMY
BLASTNa stránkách NCBI, Ensembl
BLATNa stránkách USCS
Primer3 – navrhování primerů
In Silico PCR
RepeatMasker
NCBI - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ tam najdu skoro vše: GenBank, Entrez Gene, UniGene, MapViewer, BLAST…
ENSEMBL - http://www.ensembl.org/Genome Browser, BLAST
USCS – http://genome.ucsc.edu/Genome Browser, BLAT, In Silico PCR
FASTA
>gi|gi-number|gb|accession|locus – description
GATCCTCCATATACAACGGTATCTCCACCTCAGGTTTAGATCTCAACAACGGAACCATTGCCGACATGAGACAGTTAGGTATCGTCGAGAGTTACAAGCTAAAACGAGCAGTAGTCAGCTCTGCATCTGAAGCCGCTGAAGTTCTACTAAGGGTGGATAACATCATCCGTGCAAGACCAAGAACCGCCAATAGACAACATATGTAACATATTTAGGATATACCTCGAAAATAATAAACCGCCACACTGTCATTATTATAATTAGAAACAGAACGCAAAAATTATCCACTATATAATTCAAAGACGCGAAAAAAAAAGAACAACGCGTCATAGAACTTTTGGCAATTCGCGTCACAAATAAATTTTGGCAACTTATGTTTCCTCTTCGAGCAGTACTCGAGCCCTGTCTCAAGAATGTAATAATACCCATCGTAGGTATGGTTAAAGATAGCATCTCCACAACCTCAAAGCTCCTTGCCGAGAGTCGCCCTCCTTTGTCGAGTAATTTTCACTTTTCATATGAGAACTTATTTTCTTATTCTTTACTCTCACATCCTGTAG
GenBank
• Obsahuje velmi podrobnou informaci o sekvenci:
Locus Základní vlastnosti sekvence (název, délka, typ)
Definition Výpis genů v sekvenci
Accession Databázové přístupové číslo
Version Verze dané sekvence
Keywords Pod kterými klíčovými slovy ji lze najít
Source organism Zařazení v systému
Reference Článek, kde byla daná sekvence publikována
Features Podrobný popis jednotlivých genů včetně jejich pozic
Origin Sekvence
Sekvence v genetické bance
• Jsou známy nějaké sekvence mamuta?• Z jakého druhu mamuta jsou známé sekvence?
(nejlépe cytochrom b)
NCBINational Centre for Biotechnology Information
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
• Chceme-li vyhledat sekvenci nejpodobnější k námi osekvenovanému neznámému vzorku, využijeme BLAST, opět na stránkách NCBI
• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Čemu je tato sekvence podobná?
BLASTBasic Local Alignment SearchTool
===========================================
• Hledá lokální (částečné) podobnosti
• Na rozdíl od klasického alignmentu umožňuje velmi rychle a efektivně prohledávat velké databáze
Úloha
• Ze zbytků potravy medvěda v Pyrenejích jsem získal dvě sekvence. Čemu jsou tyto sekvence podobné?
• >sekvence1 atgaccaatattcgaaaaactcacccactaataaaaattgtaaacaacgcattcattgacctcccagctccgtcaaacatctcatcatgatgaaactttggctccctcctaggcatctgc
• >sekvence2 ctagccatgcactactcaccagacgcctcaaccgccttttcatcaatcgcccacatcactcgagacgtaaattatggctgaatcatccgctaccttcacgccaatggcgcctcaatattctttatctgcctcttcctacacatcgggcgaggcctatattacggatcatttctctactcagaaacctgaaacatcggcattatcctcctgcttgcaactatagcaacagcctt cataggctatgtcctcccgtgaggacaaatatcattctga
• Postup: Na stránce NCBI zadám, že chci použít BLAST. Pod možnostmi Basic BLAST vyhledám nucleotide BLAST a zadám tuto možnost.Do okénka vložím sekvenci například ve FASTA formátu. V možnosti Database zadám Others. Spustím BLAST.