Untersuchungen zur Rolle von Rac1 in der Organisation des Aktinzytoskeletts in U2OS-TumorzellenMaster-Arbeit von Kamilla Ripkens, Betreuerin: Fr. Prof. Perihan NalbantZentrum für medizinische Biotechnologie, Molekulare Zellbiologie, Universität Duisburg-Essen

Referenzen

EinleitungProteine der Rho-GTPasen-Familie übernehmen als molekulareSchalter eine zentrale Rolle in der intrazellulären Signaltransduktion.Sie haben Einfluss auf die Organisation des Aktinzytoskeletts, dieRegulation von Zellwachstum, -Differenzierung und -Migration unddie Genexpression. Die Regulation ihrer Aktivität erfolgt durch eineVielzahl von übergeordneten Regulatoren und Signale aktivierterRho-Proteine werden über Effektoren weitergeleitet (s.Abb.1)1.

10 µm

nt-siR

NA

Rac1-s

iRNA m

ix

-10

0

10

20

30

40

50

nt-siRNA ⇒ 10 ZellenRac1-siRNA mix ⇒ 12 Zellen

Imm

obile

Fra

ktio

n in

%

Zu den drei am besten charakterisierten Rho-GTPasen gehörenCdc42, Rac1 und RhoA. Untersuchungen an migrierenden Zellenhaben ergeben, dass Cdc42 zur Zellpolarität und Filopodienbildungbeiträgt, Rac1 die Generierung des Aktin-reichen Lamellipodiumsreguliert und RhoA maßgeblich für die Bildung von Stressfasern undderen Verankerungspunkte verantwortlich ist.Desweiteren wird eine reziproke Aktivierung von RhoA und Rac1benötigt, um die Bildung von dynamischen Fortsätzen undkontraktilen Fasern während der Zellmigration zu koordinieren.

Ziel der Arbeit

Zusammenfassung

Die Dynamik des Einbaus von Aktin-Molekülenist nach Rac1-Depletion verringert

ntsi Rac1si0.00.10.20.30.40.50.60.70.8

ntsi => 24 Zellen/5052 FA

Rac1si => 35 Zellen/6174 FA

FA -

Fläc

he (

µm2 )

A) Die genauere Untersuchung von Stressfasernergab eine deutliche Veränderung derZusammensetzung der Stressfaserpopulation inRac1-depletierten Zellen. Die unterschiedlichenArten der Stressfasern in U2OS-Zellen sind durchihre Verankerung an andere Stressfasern undassoziierte Adhäsionsplaques charakterisiert. DieÜberlagerung von gefärbten Aktinstrukturen undAdhäsionsplaques deutet darauf hin, dassRac1-depletierte Zellen überwiegendundynamische ventrale Stressfasern enthalten,die einen kontinuierlichen Fluss von dynamischenFasern verhindern und dadurch die Zellmigrationbeeinträchtigen. B) Vorherige Arbeiten habengezeigt, dass Rac1 eine Rolle in derAssemblierung von Adhäsionsplaques spielt. Umdiese Plaques zu charakterisieren wurden sie miteinem spezifischen Antikörper angefärbt undmithilfe einer Software ihre Fläche ermittelt. DieErgebnisse zeigen, dass diese inRac1- depletierten Zellen signifikant vergößertsind (p<0,0001). Die Vergößerung spricht für eineerhöhte Kontraktilität der verbundenenAktinfasern, und diese ist wiederum ein Maß fürdie Aktivität der GTPase RhoA. Diese Ergebnissesprechen für eine gegenseitige Beeinflussung derbeiden GTPasen Rac1 und RhoA.

Die Depletion von Rac1 führt

– zu einer verringerten Dynamik der Aktin-Moleküle– zum Verlust der leading edge und fehlenden Zellausstülpungen– zur Veränderung der Stressfaser-Population– zur Anhäufung von undynamischen Stressfasern und

Verringerung von dynamischen Stressfasern– zu vergrößerten Adhäsionspunkten

1 Schmidt A. & Hall A. (2002) Guanine nucleotide exchange factors for Rho GTPases: turning on the switch. Genes Dev. 16, 1587-1609.2 Pellegrin S. & Mellor H. (2007) Actin stress fibres. J. Cell. Sci. 120, 3491-3499.

A)

B)

Abb.2: Das Aktinzytoskelett der U2OS Tumorzelle

Für diese Arbeit wurde die Osteosarkom-Zelllinie U2OSgewählt. Diese Zellen zeigen ein strukturiertesAktinzytoskelett mit unterschiedlichen Arten vonAktinfasern (A)). Man unterscheidet drei Arten vonStressfasern(B))2, welche während des Migrations-prozesses dynamisch umorganisiert werden.Mit Hilfe von bildgebenden Verfahren wurden diemorphologischen Änderungen in U2OS-Zellen nachDepletion von Rac1 untersucht. Hierbei wurdebesonders die Organisation der Stressfaserncharakterisiert. Als kritische Komponente der Migrationwurde desweiteren die Dynamik dieser Strukturenmittels fluoreszenzmikroskopischen Lebendzell-analysen untersucht.

Der Verlust von Rac1 führt zur Verringerung von dynamischen und Anreicherung von

undynamischen Stressfasern

Die Depletion von Rac1 führt zum Verlust von dynamischen Fortsätzen in der leading edge

A)

B)

Abb.3: FRAP-Daten zeigen eine verringerte Dynamik von Aktin

A) Bei FRAP-Experimenten (fluorescencerecovery after photobleaching) werdenfluoreszierende Moleküle mit einem starkenLaserstrahl irreversibel ausgeblichen. Sind diefluoreszenzmarkierten Proteine in diesemBereich beweglich, wird die Fluoreszenz-intensität im Laufe der Zeit wieder zunehmen,da gebleichte Moleküle durch neuefluoreszierende Moleküle ersetzt werden. Überden Anstieg der Fluoreszenzintensität imgebleichten Feld kann indirekt eine Aussageüber die Dynamik der Moleküle gemachtwerden. Neben der Geschwindigkeit derFluoreszenzrückkehr ist die Fluoreszenz-intensität nach vollständiger Erholung (mobileFraktion) ein Maß für die Beweglichkeit derProteine. B) Mit Hilfe von Daten aus FRAP-Experimenten wurde die Dynamik des Einbausvon Aktin-Molekülen in die Stressfasernanalysiert. Die Wiederherstellungskurven derFluoreszenz-intensität von Kontroll- und Rac1-depletierten Zellen zeigen, dass die immobileFraktion nach Verlust von Rac1 signifikanterhöht ist (p=0,037). Die hieraus resultierendeverringerte Wiederherstellung der Fluoreszenzkann als Hinweis für eine Verringerung derAktin-Dynamik in den gemessenen Stress-fasern interpretiert werden.

60 m

in

A)

B)

C)

A) Um den Effekt der Rac1-Depletion im Hinblickauf die Organisation der Aktin-Strukturen zuuntersuchen, wurden Bildaufnahmen vonImmunfluoreszenzfärbungen angefertigt. DieAnalyse der Aufnahmen liefert Hinweise, dassdas Aktinzytoskelett nach Behandlung mitRac1- siRNA verändert wurde. Die behandeltenZellen zeigen eine wenig bis kaum deutlichausgebildete Zellfront. Häufig sind anstelle einerstrukturierten leading edge lediglich Anhäufungenvon Aktin-Molekülen am Zellrand zu erkennen,welche bei Kontrollzellen fehlen. DieRac1-depletierten Zellen zeigen insgesamt einedeorganisierte Struktur der Aktinfilamente. B) DieRac1-Depletion wurde mit Hilfe einesspezifischen Rac1-Antikörper in Western Blotsnachgewiesen. C) Eine wichtige Eigenschaftmigrierender Zellen ist die Ausbildung vonZellausstülpungen und dynamischen Vorwärts-bewegungen an der leading edge. Die überRac1-vermittelte Aktinpolymerisation spielt hierbeieine entscheidende Rolle. Mithilfe einesKymographen wurde gezeigt, dass diesesdynamische Verhalten in Rac1-depletierten Zellennicht vorhanden ist. Hierzu wurde eine Liniesenkrecht zum Zellrand durch den vorderen Teilder Zelle gezogen und der Kymograph mittelseiner Software erstellt. Der Kymographveranschaulicht die Bewegungsabläufe entlangdieser Linie über die Zeit (s. Pfeil). DieKontrollzellen zeigen sehr deutlicheVorwärtsbewegungen am Zellrand. DieRac1- depletierten Zellen hingegen lassen keineDynamik am Zellrand erkennen.

A)

B)

Ich bedanke mich bei Perihan Nalbant, Nina Schulze, Vera Schultz, Olga Müller und Diana Moser für die hervorragende Betreuung während der Anfertigung meiner Master-Arbeit.

Abb.4: Die Rac1-Depletion führt zu Aktin-Akkumulationen

Abb.1: Der GTPase Zyklus

Abb.5: Die Rac1-Depletion führt zu ventralen Stressfasern