UNNERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA

/ DIVISION: Ciencias Biológicas y de la Salud.

'CARRERA: Biología Experimental.

SERVICIO SOCtAL

'TITULO: ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE LA 2-

IIETILTIO-7-@-CLOROFENlL) 8-FEMOXI4,5-BENZO-3-AZA

SONEM (1,5-BDZ-CI) SOBRE EL MÚSCULO LISO UTERINO

)E LA RATA.

Fecha de entrega: 04/ 05/ 99

/Alumna: Peiáez Garcia Luz Elena

Matricula: 903365555

fÁsesor: Prof. A. Efraín Campos Sepú

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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLE'Z'ANA

ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE LA

2-NIETILTIO-7-( p-CLOROFENIL)

8-FENOXt4,5-BENZ0-3-AZA NONEM

(1 ,o-BDZ-CI) SOBRE

EL MÚSCULO LISO UTERINO

DE LA RATA.

INDICE

Pag.

I. lNTRODUCCl6N .................................................................................... 1

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I . .

It. OBJETIVOS ......................................................................................... 8

1 _- Objetivo generat 2.- Objetivos particulares

111. METODOLOGíA. ................................................................................. .9

1 .- Preparación del &oüs vaginal 2.- Aislamiento y montaje de la preparación

IV. RESULTADOS Y DiSCUSi6N ........................................................... 12

V. CONCLUSIÓN .................................................................................... 18

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS .................................................. 19

I. INTRODUCCI~N Desde la antigüedad el hombre ha usado numerosos productos naturales para

modifcar el pensamiento, los sentimientos y la conducta; así como para provocar un

estado de sedación y promover el sueño (16). Los primeros elementos que se

introdujeron como sedantes y después como hipnóticos, tales como: hidrato de cloral,

paraldehído, uretano y sulfonal; posteriormente, a principios de este siglo surgieron los

barbitúricos (16, 36, 37).

En 1903 se introdujo el barbital y en 1912 el fenobarbital, fármaco que por sus

efectos sedante, hipnótico, anestésico y anticonvulsivo motivó la búsqueda de agentes

más selectivos para modificar las funciones del Sistema Nervioso Central (SNC).

Posteriormente se descubrió que este grupo de fármacos inducen tolerancia y

dependencia física. Por lo anterior, se hizo necesario el desarrollo de dierentes

sedantes-hipnóticos, a pesar de los ya disponibles, con el propósito de evitar algunos

de los efectos indeseables de los barbitúricos (15,22).

Un avance muy importante en el área de la neuropsicofarmacología fue el

descubrimiento de las benzodiazepinas, las cuales presentaban efectos ansiolíticos y

tranquilizantes, la primera benzodiazepina clínicamente útil se originó en los

laboratorios Roche por el grupo Stembach asignándosele el nombre genérico de

clordiazepóxido, este compuesto indujo un efecto tranquilizante en modelos

experimentales animales; en 1961 se introdujo a la práctica clínica (16,36, 37).

Desde entonces se han sintetizado mas de 3000 compuestos de estructura

benzodiazepinica y se han sometido a pruebas de actividad biológica más de 120 de

ellos, y cerca de 35 se encuentran ya disponible para su aplicación clínica en diversas

partes del mundo. La mayoría de las 1,4 benzodizepinas (1,4 BDZ) que han logrado

entrar al mercado tales como el: Triazolam, Diazepam, Flurazepam, Midazolam entre

otras, se seleccionaron por su alta potencia ansiolítica en relación con su efecto

depresor del SNC; sin embargo todas poseen propiedades sedantes hipnóticas en

grado variable, estas propiedades se aprovechan ampliamente en clínica sobre todo

para inducir el sueño (15, 16, 36,37).

1

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En relación a su estructura química, el término benzodiazepina se refiere a la

parte de la estructura compuesta por un anillo de benceno (A) fusionado a un anillo de

diazepina de siete miembros (6) y un sustituyente 5 arilo (C), (Fig 1 ) (15).

9

6

/ C N

Fig I. Estructura general de las 1,4-benzodiazepinas

2

La mayor parte de las 1,4-BD2 comparten el mismo perfil de actividad biológica,

tanto a nivel de SNC como a nivel periférico; y en la mayoría de los casos solo difieren

en sus características farmamineticas, así podemos identificar a las benzodiazepinas

de vida media corta, intermedia o larga; lo que hace preciso tomar en cuenta este

aspecto en la elección de una benzodiazepina para una determinada aplicación

clínica. Posteriormente se demostró que el Diazepam actúa en áreas del sistema

Iímbico (hipocampo, amígdala, tálamo, fornix y cuerpo estriado), zonas que se sabe

participan en la modulación de las emociones. De esta manera se explican sus

propiedades farmacológicas como son: ansiolitico, tranquilizante menor, sedante,

hipnótico, anticonvulsivante, relajante muscular y efecto amnésico (1 1,13, 16).

Más recientemente se sintetizo una nueva generación de 1, 5 benzodiazepina

cuyo prototipo esta representada por el Clobazam (Fig 2), única 1,5-benzodiazepina

(1,5-BDZ) que difiere de la estructura de las l,4-BDZ clásicas utilizadas en el

tratamiento de la ansiedad, y cuadros convulsivos . Este compuesto ha sido estudiado

ampliamente en diversos modelos experimentales como: ansiolítico, anticonvulsivante,

en modelos de estudio electroencefalográficos y en estudios psicométricos. Se ha

demostrado que el Clobazam presenta una actividad ansiolítica eficaz, sin interferir

con la función psicomotora que normalmente se produce con la administracich de las 1,rl-BDZ ansiolíticas. Con base en estos estudios, el Clobazam se util i actualmente

en algunas patologías del SNC como la ansiedad y la epilepsia. (17, 19, 23, 24).

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CH2

Fig 2. Estructura del Clobazam.

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El mecanismo de acción de las benzodiazepinas fue propuesto en 1974 por

Haefely y Costa (16), dichos autores informaron que las benzodiazepinas facilitan la

acción de una molécula clave de la comunicación química del cerebro, el ácido gamma

aminobutírico (GABA); Krnjevic y Schratz demostraron en 1967 que el GABA es un

neurotransmisor inhibidor cuyo mecanismo de acción depende se su unión a

receptores específicos de la membrana, en la superficie de las neuronas. Se han

caracterizado tres subtipos de receptores distintos llamados A, 6 y C; el receptor de

las benzodiazepinas esta situado en la membrana neuronal, inmerso en el mismo

complejo macromolecular que el receptor al GAM,, acoplado a el canal de cloro que

se abre al activar el dicho receptor. La estructura de este complejo se caracteriza por

tener dos subunidades alfa y dos subunidades beta, estando el canal de cloro rodeado

por las subunidades. El canal de cloro se abre cuando el receptor GABA, es activado

por sus agonistas, lo cual permite la entrada de iones cloro. En reposo, en ausencia de

GABA el canal esta cerrado. Cuando el GABA se fija al receptor, el complejo cambia

de conformación: el canal se abre y aumenta la permeabilidad al cloro, quedando el

estado eléctrico de la neurona modificado, se vuelve menos excitable y por

consiguiente menos sensible a estímulos de los demás neurotransmisores (2, 3, 4, 16,

17, 21, 26).

Por otra parte, recientemente en el Instituto de Química de la UNAM, se

sintetizaron una serie de rnolbculas de estructura 1,5-benzodiazepínica diferentes al

clobazam (Fig 3.) (9) y que requieren ser sometidas a estudios sistematizados para

determinar su perfil de actividad biológica y poder caracterizar algún efecto que

pudiera tener importancia para su aplicación terapéutica. En este sentido la 1,5

benzodiazepina clorada fue estudiada en íleon aislado de cobayo y se observo que

este compuesto aumento notablemente la intensidad y frecuencia de las contracciones

del músculo liso intestinal lo que indica que la actividad biológica de la 1,5 BDZ-CI es

claramente diferente a la reportada para las 1,4 BDZ como el Diazepam.

Por lo anterior el presente trabajo pretende caracterizar la actividad biológica de

la 1 5 BDZ-CI sobre otro músculo liso: el uterino (8, 9, 28).

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Fig 3. Estructura de la 1,5-Benzodiazepina Clorada

(2-Tiometil-7-[p-Ci-fenil]4,5-üenzo-3 am-2-nonem).

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Serotonina (5-Hidroxitriptamina)

La serotonina, químicamente conocida como 5hidroxitriptamina (SHT), es una

monoamina biogénica, con un peso molecular de 176. Esta ampliamente distribuida en

el reino animal y vegetal. En los mamíferos, la 5HT se encuentra principalmente en

las plaquetas, en las &Mas enterocmmafines del tram gastrointestinal y en el

sistema nervioso central (SNC), donde desempeña un papel importante como

neurotransmisor. En el cuerpo humano el 90% esta localizado en las &ulas

cromoafines del tracto gastrointestinal, el resto se encuentra en plaquetas y en el SNC

(40). La 5-HT esta involucrada en numerows eventos fisiok5gicos como son, a nivel

periférico: interviene en fibras musculares lisas causando constricción o relajación y

así ejerce un mayor efecto sobre la capa vascular y el tracto digestivo (31). La 5-HT

también participa en varias funciones del SNC como es: sueno (m), termoregulación

(30), aprendizaje y memoria (1, 27), el dolor (25) en el comportamiento como la

agresividad, la ingesta de alimento (5, 6, IO), actividad sexual (29, 14). Reguiación

neuroendocrina (12), actividad motora (38) y ritmos biológicos. Así mismo la 5-HT e$ta

involucrada en distintos tipos de condiciones patoldgicas como en: desordenes

psiquiátricos similares a la ansiedad, depresión, agresividad, pánico, desorden

obsesiva, compulsiva, esquizofrenia, comportamiento suicida y autismo; desordenes

neurodegenerativos como enfermedades de Alzheimer, Parkinson y Huntington,

migraña y alcoholismo (18).

Una variedad de observaciones moleculares, bioquímicas y fisiológicas sugieren

la presencia de múltiples receptores específicos para la 5-HT. Los receptores se han

clasificado en siete clases: 5-HT1, 5-HTZ, 5-HT3, 5-HT4, 5-HT5. 5- i iT~ y 5-HT7 y diversos

isomoríos (8, 32, 42)

7

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11. OBJETNOS

1.- OBJETIVO GENERAL.

Estudiar el perfil de actividad biológica de una nueva molécula de estructura 1,5

benzodiazepínica clorada sobre el músculo liso uterino in vitro.

2.- OBJETIVOS PARTICULARES.

1 .- Realizar Curvas Dosis-Respuesta a la serotonina en el útero aislado de rata.

2.- Establecer el efecto de la 13 benzodiazepina clorada sobre la actividad del

músculo liso uterino in vifro.

3.- Determinar la interacción farmacología entre la 1,5 benzodiazepina clorada y

la serotonina en esta preparación.

8

1 .- PREPARACI6N E L FROTIS VAGINAL

Se utilizaron ratas hembra de la cepa Wistar con un peso corporal de 250 a 300

g, a las cuales se les realizó un frotis vaginal para determinar en qué estadio del ciclo

estral se encontraba el animal (metaestro, diestro, proestro, estro). Con una pipeta

Pasteur se introduce en la vagina 0.1 ml de solución fisiológica salina al 0.9% y se

succiona de inmediato, se colocan unas gotas en el portaabjetas y se agrega una

gota de lugol, enseguida se coloca el cubreobjetos para después ser observado al

microscopio. El estadio se determina de acuerdo a las caracteristicas morfolágicas

que presentan las dlulas epiteliales (Fig 4). Para el presente estudio se utilizaron las

ratas que se encontraban en estro.

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Fig 4. Características citológicas de los diferentes estadíos del ciclo estral en roedores.

9

2.- AISLAMIENTO Y MONTAJE DE LA PREPARACION

Los animates se pesaron y se sacrificaron por dislocación cervical, se extrajo el

Útero e inmediatamente se colocó en una caja de Petri, que contenía soluacKI De

Jalon (composkión ImM] NaCl 153, KCI 5.6, Glucosa 2.7, NaHC4 5.9, CaCh loo), el

útero se limpio de tejido adiposo y conectivo, se dividió en tres segmentos de 1.5 a 2.0

cm de longitud, los segmentos de útero fueron colocados en cámaras para órgano

aislado de 30 ml que contenían sdución De Jalon, burbujeada con carbógeno (5% de

COZ y 95% de Oz), manteniéndolo a una temperatura constante de 32OC y un pH de 7.4

(Fig 5). Cada segpento se sometió a una tensi6n inicial de 1 g (10, 17), la actividad

basal y la respuesta del músculo liso a los fármacos de prueba, se registro a &ads de

un transductor FTO3, conectado a un polígrafo Grass 79D. Después de un período de

15 minutos de estabilización, bajo perfusión continua con sdución De Jalon

(10mm/min) se realizaron curvas dosis-respuesta (CDR) a la serotonina soia (IxlOB a lxlOsM), a la BDE-CI sola suspendida en dimetilsulfoxido ai 1 % ( I x ~ O - ~ a l x l O d M) y a la serotonina en presencia de difefentes concent~aciones de la 1 3 BDZ-CI.

Los registros obtenidos en las diferentes condiciones experimeníales, se

midieron con un planimetro (Burreti Co~p.) y se expreswón como el promedio dd &ea

bajo la curva (ABC) de la actividad del músculo liso. Los resuliadas se sometieron al análisis estadístik ' de la prueba de t-student y se consideró estadísticamente

significativos los valores de ~$0.05.

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TRANSDUCTOR

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Fig 5. Montaje de la prepsación de útero in vitro, perfundido con sokición

de 32' C con un pH 7 4. nutriiente De Jalon burbujeada con carbwno y manteMdo ' a una temperdurn

11

IV. RESULTADOS Y DtSCUSlON

De acueFd0 a la informacron ’I disponible, la serotonina modifica la actividad

espontanea del Útero aislado de la rata, en la Fig 6. se muestran los trazos

representativos de la actividad contradi ‘I, inducida por la serotmii a las diferentes Wncentraci ‘ones ensayadas ( 1 x I O a a 1 x IOd M ), se aprecja que la respuesta contradjl

es dependiente de la concentración, 8s decira mayorconcentraci ’ónmayorlarespuesta

(A). En el panel €3, se muestra que la actividad uteiMaeqxnhwaen presencia de ias

diferentes concentraciones de la 1,5 BDZ-CI (1 a 300 x 10 -7M) induce una inhibición de la

actividad uterina, fenómeno Claramente opuesto al inducido por la SerOtoMna . sobreesia

preparación. Se puede apreciar que a las concentras ‘ones inhibe totalmente la actividad espontanea

( 1 0 0 ~ 3 0 0 ~ 1u7 M), se

La curva dosis respuesta de la adividad con!Wil indmida por la SeFOtonina

demuestra que es dependiente de la concentración molar (Fig 7) Se observa que la

respuesta del tejido control se mantiene constante.

En relación a la capacidad inhibitMia del compuesto en la Fig 8. obse~amos que la 1,5

BDZ-CI inhibe significativamente las contFacciones espontaneas del rmiscUlo liso uterino,

fendmeno dependiente de la concentma ‘ón del fármaco. invariabiemente la actividad

espontanea del músculo liso se mantiene por arriba de la respuesta inducida por la 1,5

BDZ-CI.

Cuando se realizo la CDR a la serotonina en presencia de las diferentes

concentraciones de la 1,5 BDZ-CI (Fig 9), se observó que la 1,5 BDZCI antagonlza

parcialmente la actividad contractil inducida por la monoamina, fenómeno que fue

depandiente de la concentración de la 1,5 BDZ-CI, sin embargo no ocurrió un

desplazamiento paralelo a la derecha de la CDR a la serotonina, lo que sugiere que el

antagonismo presentado por la interacción farmacológica no es de tipo competitivo

12

Por otra parte amrde a lo planteado en el proyedo, el prapósito del presente

trabajo fue estudiar la infkiencia de la 1,5 BDZ-CI .sobe la actividad inducida por de la

setutonina en el músculo liso uterino, ya que existe infomiacibn . que señala que la 1,5

BDZ-CI, en el músculo liso intestinal, produce un aumento en la -cia e intensidad de

las contracciones (28). Sin embargo en el músculo liso uterino se observó una respuesta

contraria a la obtenida en el músculo liso intestinal, ya que al adicionar las diferentes

concentraciones de la 1,5 BDZ-CI, se induce una disminución de Las cantracciories uterinas, lo que indica un perti1 de actividad simiiar a la que presentan las 1,4 BDZ como el

diazepam el que indw un efecto relajante en músculo liso intestinal (28).

Lo anter.Nx no es soqxendenk, si consideramos que el útero aun cuando también es músculo liso, tiene funciones fisiológicas diferentes y la densidad de receptores BS

diferente para los distintos newotransmisores, en relación a otros músados lisos; lo

antetior hace suponer que la 1,5 BDZ-CI esta interactwdo diredamente sotre el

receptor especifico del GABA tipo A, io que da lugar a un poknctal postsinaptico

inhibitorio (PPSI) que determina una rela@aón muscular; en el caso de íleon se collsidera que posiblemente este involucrado otro mecanismo de acción, postblemante un efecto

probablemente mediado por la aCetilcolina a traves de receptores muscarinicos,

interacción que da lugar a la contracción muscular, propiciada por una alta concentración

de calcio intracelular (28).

Finahnente, con el propósito de estaMecer si el mecanismo de acción de la 1,5

BDZ-CI que da lugar a la inhibición de la actividad motora uterina espantanea y deJ

antagonismo de la actividad uterine inducida por la serotonina, esta mediada’por

receptores específicos, es necesario la realización de estudios de radioreceptores

(binding) y de estudios bioquímicos para la determinación de los mecanismos de

tranducción de &lales (proteína G), y de segundos mensajeros involucrados en tales

efectos no obstante la propuesta del mecanismo de acción a través de receptor espeafica

no excluye otras posibilidades. Lo anterior implica el someier a estudios formales la

actividad bidógca de esta m o k u i a sobre otros modelos experimentales..

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V. CONCLUWN

La 1,5 BDZ-CI inhibe de manera dependiente de la concentración, las contracciones

del músculo liso uterino.

La I ,5 BDZ-CI antagonim parcialmente la action de la semtonina en esta preparación.

La actividad biológica de la 1 3 BDZ-CI en el músculo liso uterino aislado de la rata, fue

contraria a la adwidad observada en el músculo liso intestinal.

18

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