UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Sanja B. Stojanov

PoreĎenje antimikrobne aktivnosti biljnih ekstrakata vrste Micromeria

pulegium gajene in vitro i iz prirode

MASTER RAD

Niš, 2014.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

PoreĎenje antimikrobne aktivnosti biljnih ekstrakata vrste Micromeria

pulegium gajene in vitro i iz prirode

MASTER RAD

Student: Mentor:

Sanja Stojanov 39 Dr Tatjana Mihajilov-Krstev

Niš, 2014.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

The comparative analisis of antimicrobial activity of Micromeria pulegium

extracts grown in vitro and in nature

MASTER THESIS

Candidate: Menthor:

Sanja B. Stojanov 39 Dr. Tatjana Mihajilov-Krstev

Niš, February 2014.

ZAHVALA

Zahvaljujem se svom mentoru, prof. dr Tatjani Mihajilov-Krstev na izboru teme,

nesebičnoj pomoći i sugestijama tokom izrade ovog master rada.

Zahvaljujem se i profesorki Svetlani Tošić na ukazanom poverenju i mogućnosti da

učestvujem u jednom eksperimentalnom delu izrade njenog doktorata. Takođe, zahvaljujem se i

na pomoći asistentkinji Jovani Jović tokom izvođenja eksperimentalnog dela rada.

Posebnu zahvalnost iskazala bih svojoj porodici na neizmernoj podršci i razumevanju

koje su mi pružili tokom studiranja.

SAŢETAK

Cilj ovog rada je poreĎenje antimikrobne aktivnosti biljnih ekstrakata vrste Micromeria

pulegium prikupljene iz prirode i gajene u in vitro kulturi. Vrsta M. pulegium je uspešno uvedena

u kulturu in vitro od strane Svetlane Tošić u laboratoriji za fiziologiju biljaka PMF-a u Nišu. Za

ispitivanje antimikrobne aktivnosti korišćena je mikrodiluciona metoda. Ispitivanjem delovanja

metanolnog ekstrakta, dobijenog iz biljnog materijala prikupljenog iz prirode i gajenog in vitro,

protiv odabranih sojeva bakterija (Gram (+) bakterije: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus i

Listeria monocytogenes; Gram (-) bakterije: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli i

Salmonella enteritidis) došlo se do rezultata koji pokazuju da ne postoji značajna razlika u

antimikrobnom delovanju ova dva ekstrakta, koje je u poreĎenju sa tri referentna antibiotika

(streptomicin, hloramfenikol i tetraciklin) znatno niže. Najotporniji bakterijski soj je bio

Pseudomonas aeruginosa, dok je najosetljiviji soj bio Staphylococcus aureus.

Ključne reči: Micromeria pulegium, mikropropagacija, antimikrobna aktivnost

ABSTRAKT

The aim of study was to compare the antimicrobial activity of plant extracts Micromeria

pulegium collected from the nature and cultivated in vitro. Species M. pulegium was successfuly

introduced into culture in vitro by Svetlana Tosic in the laboratory of Plant Physiology, Faculty

of Science in Nis. Method of microdilution was used in analysis of antimicrobila activity.

Examining the effects of the methanol extract obtained from plant material collected from the

nature and cultivated in vitro, against selected strains of bacteria (Gram (+) bacteria: Bacillus

cereus, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes; Gram (-) bacteria: Pseudomonas

aeruginosa, Escherichia coli and Salmonella enteritidis), it was found that there was no

significant difference in antimicrobial activityof these extracts, which compared to three

references of antibiotics (streptomycin, chloramphenicol and tetracycline) were significantly

lower. The most resisant bacterial strain was Pseudomonas aeruginosa, and the most sensitive

strain was Staphylococcus aureus.

Keywords: Micromeria pulegium, micropropagation, antimicrobial activity

SADRŢAJ

1. UVOD .................................................................................................................................... 1

2. OPŠTI DEO ....................................................................................................................... 2

2.1. Opšte karakteristike familije Lamiaceae ........................................................................ 2

2.1.1. Rod Micromeria ....................................................................................................... 2

2.1.2. Biljna vrsta Micromeria pulegium ........................................................................... 3

2.2. In vitro kultura i mikropropagacija ................................................................................. 4

2.3. Biljni ekstrakti ................................................................................................................. 5

2.4. Mikroorganizmi .............................................................................................................. 5

2.4.1. Bakterije ................................................................................................................... 5

2.4.2. Patogenost bakterija ................................................................................................. 6

2.4.3. Glavne osobine nekih patogenih bakterija ............................................................... 6

3. CILJ RADA ....................................................................................................................... 9

4. MATERIJAL I METODE ................................................................................................... 10

4.1. Biljni materijal .............................................................................................................. 10

4.2. Dobijanje biljnog ekstrakta ....................................................................................... 11

4.3. Testiranje antimikrobne aktivnosti biljnih ekstrakata vrste Micromeria pulegium gajene in

vitro i iz prirode ................................................................................................................... 11

4.3.1. Bakterijske kulture ................................................................................................. 11

4.3.2. Mikrodiluciona metoda .......................................................................................... 11

4.3.3. Statistička obrada podataka........................................................................................ 12

5. REZULTATI I DISKUSIJA ................................................................................................ 13

6. ZAKLJUČAK ...................................................................................................................... 16

7. LITERATURA .................................................................................................................... 17

BIOGRAFIJA .......................................................................................................................... 20

1

1. UVOD

Lekovito bilje se vekovima koristi u tradicionalnoj medicini. Danas ono služi kao izvor

aktivnih supstanci za proizvodnju mnogih lekova, a nauka je omogućila da te supstance postanu

mnogo jače i delotvornije na zdravlje.

Sve do kraja XVIII i početka XIX veka gotovo se ništa nije znalo o hemijskom sastavu

lekovitog bilja. Biljke su upotrebljavane širom sveta na osnovu iskustva stečenog kroz vekove.

Tada počinje eksperimentalna farmakognozija, tj. nauka o lekovitom bilju.

Biljke su vrlo složenog hemijskog sastava. Istraživački metodi u hemiji lekovitog bilja iz

godine u godinu se sve brže usavršavaju, tako da se stalno otkrivaju nove materije, medju njima i

takve koje predstavljaju pravu prekretnicu u medicini i farmaciji (vitamini, hormoni, fitonicidi,

antibiotici i dr.) (Tucakov, 1990).

Od oko 250 000 biljaka na Zemlji, mali procenat je hemijski, biološki i fiziološki ispitan.

Do danas se kao lekovi koriste 119 jedinjenja izolovanih iz samo 90 biljnih vrsta (Chadwick and

March, 1990).

2

2. OPŠTI DEO

2.1. Opšte karakteristike familije Lamiaceae

Familija usnatice - Lamiaceae, Labiateae predstavlja veoma važnu i brojnu grupu biljaka.

Ovoj grupi pripada 200 rodova i 3200 vrsta, rasprostranjenih u čitavoj zemlji. Najveće bogatstvo

je zastupljeno u Mediteranu, Maloj i Centralnoj Aziji. Flora Balkanskog poluostrva broji 371

vrstu, od kojih su 84 vrste Balkanski endemiti.

Familija Lamiaceae je kosmopolitskog rasprostranjenja, naseljavaju suva i dobro

osunčana staništa - livade, pašnjake, kamenjare.

Većina usnatica spada u kategoriju dobrih medonosnih biljaka. Ove biljke se intezivno

istražuju u cilju korišćenja njihovih antimikrobnih aktivnosti.

To su zeljaste ili drvenaste biljke, vrlo retko šiblje, drveće ili lijane. Listovi su dekusirani,

bez zalizaka, prosti, na različite načine deljeni. Cvetovi su grupisani u cimozne cvasti koje su

ujedinjene u kombinovane cvasti, vrlo retko pojedinačni cvetovi. Cvetovi su zigomorfni, retko

aktinomorfni, dvopolni, petočlani ili četvoročlani. Čašica je petočlana ili petoperna ili dvousnata.

Krunica cevasta, petoperna, uvek više-manje dvousnata, retko jednousnata. Andreceum je graĎen

od 4 prašnika, ili od 2 prašnika i 2 staminodije. Tučak je sinkarpan, graĎen od dva oplodna

listića, plodnik nadcvetan, dvook ili četvorook zbog sekundarno razvijene pregrade. Plod se

sastoji od 4 oraščića ili usled zakržljalog samo 3 ili 1 oraščića.

Kod ovih biljaka dobro su razvijene žlezde na epidermisu koje sadrže etarska ulja

(mešavinu terpenoida) i ugljene hidrate (Tatić, Blečić, 1984).

2.1.1. Rod Micromeria

Rod Micromeria pripada familiji Lamiaceae. Obuhvata oko 130 vrsta rasprostranjenih u

Mediteranu (Josifović, 1974). U flori Srbije i Crne Gore ovaj rod je predstavljen sa 10 vrsta od

kojih su 7 endemske (Šilić, 1979). Na osnovu morfoloških karakteristika i filogenetskih odnosa

vrste roda Micromeria su grupisane u tri sekcije: Pseudomelissa, Eumicromeria i Cymularia

(Boisser, 1789). Vrste koje naseljavaju teritoriju Srbije i Crne Gore pripadaju sekciji

Pseudomelissa i Eumicromeria. Prema rezultatima vrste iz sekcije Pseudomelisa (M. pulegium

3

M. thymifolia, M .albanica, M. dalmatica) sadrže veliku količinu etarskog ulja (> 0,5%) gde su

dominantni monoterpenski oksidi mentanske klase, dok vrste Eumicromeria (M. croatica, M.

juliana, M. cristata, M. paruiflora) imaju malu količinu ulja (< 0,5 %) (Slavkovska et al., 2004).

2.1.2. Biljna vrsta Micromeria pulegium

Vrsta Micromeria pulegium rasprostranjena je u Rumuniji, Srbiji i Bosni. Na prostoru

Srbije raste na Tari (Zaovine), a noviji podaci ukazuju

na to da se nalazi i u Istočnoj Srbiji (Knjaževac)

(Bogosavljević et al., 2007). Na preliminarnoj Crvenoj

listi vaskularne flore Srbije i Crne Gore na području

klisure Svrljiškog Timoka u okolini Knjaževca nalazi

se i vrsta Micromeria pulegium (Stevanović i sar.,

2003).

Karta 1. Distribucija vrste Micromeria pulegium (Rochel) Bentham u Srbiji (prema:

Bogosavljević S., Zlatković B., RanĎelović V. 2007)

Carstvo: Plantae Razdeo: Magnoliophyta Klasa: Magnoliopsida Red: Lamiales Fam: Lamiaceae (Labiatae) Rod: Micromeria Vrsta: Micromeria pulegium (Rochel) Bentham

4

Vrsta Micromeria pulegium je višegodišnja biljka. Donji delovi stable su odrveneli.

Izdanci su brojni, visoki od 30-50 cm. Stabiljke su razgranate ili nerazgranate, pokrivene

kratkim, jednostavnim dlakama koje su savijene naniže. Listovi koji se nalaze na donjem i

srednjem delu stabiljke su većinom jajasti, reĎe okruglasti, gornji listovi su manji, lancetasti, svi

na oba kraja klinasti. Naličje listova je pepeljasto-zeleno sa brojnim tačkastim žlezdama,

pokriveno kratkim, oštrim dlakama. Lice lista je tamnozeleno, takoĎe obraslo dlakama, ali u

manjoj meri u odnosu na naličje. Lisna drška gusto-dlakava, 2-3 puta kraća od liske. Prisutne su i

brakteje, ušiljene linearno i dlakave. Cvetovi su sakupljeni u zbijene višecvetne račvice. Čašica

je većinom uspravna. Krunica je bela, svetloljubičasta sa ljubičastim pegama, spolja je gusto

pokrivena priljubljenim dlakama; gornja usna je ravna ili malo konkavna, kraća od donje,

purpurno istačkana. Oraščići su bubrežasti, svetlomrki, na vrhu tupo-kljunasti, pri osnovi

zaobljeni (Josifović et al., 1974).

2.2. In vitro kultura i mikropropagacija In vitro kultura biljnih ćelija, tkiva i organa predstavlja skup tehnika za aseptično

(sterilno) gajenje i vegetativno razmnožavanje biljaka, biljnih organa, tkiva i ćelija na sterilnoj

hranljivoj podlozi u kontrolisanim uslovima (Nešković et al., 2003).

Sam termin ―kultura in vitro‖ označava gajenje kultura u staklu, odnosno u prozirnim

posudama. Ovaj način razmnožavanja biljaka se naziva još i mikrorazmnožavanje ili

mikropropagacija, jer su biljni organi ili cele biljke u odnosu na generativnu proizvodnju jako

sitne, minijaturnih dimenzija (MeĎedović, 2003).

Za mikropropagaciju koriste se isključivo izdanci stabla osovinskog porekla: vršni i

pazušni pupoljci (Vinterhalter, 1996).

Biljne ćelije i tkiva imaju sposobnost da rastu i da se razvijaju kada se izoluju iz

organizma i gaje na sintetičkoj podlozi.

Jako bitna karakteristika mikropropagacije je velika brzina razmnožavanja, tokom cele

godine, pod kontrolisanim, laboratorijskim uslovima. MeĎutim postoji i nedostatak ove metode:

postupak je jako složen, potrebna su velika ulaganja i zahteva visokvalifikovanu radnu snagu

(Vinterhalter, 1996).

5

2.3. Biljni ekstrakti Koncentrovani pripravci koji mogu imati tečnu, polučvrstu i čvrstu konzistenciju, a

dobijaju se iz biljnih droga. Pre procesa ekstrakcije droga mora biti usitnjena do konzistencije

grubog praška, stabilizovana (enzimi moraju biti inaktivirani i obezmašćeni). Koristeći različite

rastvarače (voda, alkoholi različitih koncentracija, masno ili mineralno ulje...) iz droge se

ekstrahuju aktivni sastojci sa većom ili manjom količinom balasnih materija. Odnos droga /

solvent je specifičan za svaku sirovinu i definisano je farmakopejom.

Tečni ekstrakti se izraĎuju tako da jedan deo ekstrakta sadrži lekovite sastojke jednog

dela suve droge. Polutečni ekstrakti sadrže više aktivnih sastojaka, a suvi najviše (Tucakov,

1990).

2.4. Mikroorganizmi Organizmi sitnih veličina, ne mogu se videti golim okom jer su sitniji od 0,1 mm.

MeĎutim, pored najsitnijih oblika obuhvata i organizme koji su vidljivi golim okom, odnosno

dostižu makroskopske razmere, ponekad dužine i veličine do 1 ili nekoliko metara (neke

višećelijske alge, neke gljive). Ova heterogena grupa mikroorganizama obuhvata: viruse,

bakterije, alge, gljive, lišajeve i protozoe. Značajna osobina svih mikroorganizama zasnovana je

pre svega na njihovim mikroskopskim razmerama, brzom metabolizmu, brzom razmnožavanju i

raznolikosti enzima i biohemijskih procesa, kao i to da su rašireni svuda i na svakom mestu

zemljine kugle (Petrović et al., 2007).

2.4.1. Bakterije

Bakterije su prokariotski mikroorganizmi, koji spadaju u najsitnije organizme celularne

graĎe. I pored jako jednostavne graĎe sposobni su da obavljaju sve funkcije neophodne za život:

disanje, ishranu, rast, razmnožavanj i dr. Mogu imati loptast, štapićast, končast i spiralan oblik,

ali pored ova četiri osnovna oblika javljaju se i mnogi izvedeni oblici. Izvedeni oblici su rezultat

specifičnog rasporeda bakterijskih ćelija nakon deobe. Najveći broj bakterija obrazuje jedna

ćelija, meĎutim ima i bakterija koje predstavljaju končaste ili grozdaste skupine velikog broja

ćelija-kolonije.

6

Za bakterije se sa pravom može reći da su to organizmi koji naseljavaju sva raspoloživa

staništa na našoj planeti. Njihova sposobnost opstanka u najrazličitijim, pa i ekstremnim

uslovima zasnovana je, izmeĎu ostalog, i na ogromnoj metaboličkoj aktivnosti (Petrović et al.,

2007).

2.4.2. Patogenost bakterija Svaki mikroorganizam koji moze da uzrokuje oboljenje naziva se patogen, a sama

sposobnost da uzrokuje oboljenje naziva se patogenost. Stepen patogenosti mikroorganizama

naziva se virulencija. Virulencija je sposobnost mikroorganizma da uzrokuje oboljenje.

Virulentnost bakterija se izražava kao broj bakterijskih ćelija potreban da usmrti 50 % populacije

osetljivih laboratorijskih životinja. Većina bakterijskih vrsta je apatogena, odnosno ne može da

uzrokuje patološke procese. Mnogi od tih mikroorganizama normalno naseljavaju organizam

ljudi i životinja i predstavljaju simbionte, a samo mali broj njih može pod odreĎenim

okolnostima da uzrokuje oboljenje i oni se nazivaju oportunistički patogeni.

Svako oboljenje čiji je etiološki faktor mikroorganizam započinje infekcijom koja je

veoma složen proces i podrazumeva adheziju za tkivo, invaziju i kolonizaciju. Kada se uspostavi

infekcija dolazi do pojave oboljenja (Petrović et al., 2007).

2.4.3. Glavne osobine nekih patogenih bakterija Prema sastavu ćelijskog zida i bojenju postupkom po Gramu (metoda koju je predložio

naučnik Hans Christian Gram 1884. g.) bakterije se dele na: Gram-pozitivne i Gram-negativne.

Gram-negativne bakterije imaju jedan sloj lipopolisaharida koji pokriva njihov ćelijski zid, dok

Gram-pozitivne nemaju taj sloj, usled čega se prve boje crveno, a druge ljubičasto. Osim razlike

u graĎi ćelijskog zida ove dve grupe bakterija se razlikuju i po mnogim drugim osobinama, a

najvažnija je njihova različita osetljivost na antibiotike.

7

U ovom radu su testirane sledeće Gram-negativne bakterije:

Escherichia coli

Escherichia coli je Gram-negativna bakterija, štapićastog oblika,u paru ili nepravilnim

grupama, asporogena, fakultativni anaerobni bacil, prilično otporna bakterija. Mesecima može

živeti u vodi i zemlji, a na različitim namirnicama se vrlo brzo razmnožava. Otporna je na

temperature ispod nule, a toplota od 60°C je ubija za 15 – 20 minuta. Naseljava digestivni trakt

čoveka i životinja. Iako pripada normalnoj crevnoj flori, veliki broj infekcija je izazvan upravo

ovom bakterijom. Predstavlja deo crevne flore i neophodna je za procese varenja i sinteze nekih

supstanci (vitamini B12 i K). Glavni je uzročnik infekcija crevnog trakta, septikemije i

meningitisa (Jovanović et al., 1999).

Pseudomonas aeruginosa

Gram-negativni štapići, sa jednom ili više polarnih flagela. Nema kapsulu i ne stvaraju

spore. Raste u aerobnim uslovima, na temperaturi od 35-37 0C. P. aeruginosa je raširen u prirodi

i zemlji, vodi i biljkama, voću i namirnicama i predstavlja deo fiziološke mikroflore creva kod

oko 10 % ljudi. Luči endotoksine, egzotoksine, enzime i druge biološki aktivne materije koje

povećavaju njenu toksičnost. Uzročnik je brojnih oboljenja. Izaziva meningitis, infekcije pluća,

urinarnog i gastrointestinalnog trakta, kože (dermatitis), oka i infekcije rana (Jovanović et al.,

1999). Salmonella enteritidis

Rod Salmonella obuhvata Gram-negativne, pokretne, fakultativno anaerobne bacile,

najčešće ne stvaraju kapsulu i spore. Salmonella enteritidis ne spada u otporne bakterije. U

spoljnoj sredini, na predmetima, mogu da prežive svega nekoliko sati, ali se u vodama i

namirnicama mogu održati znatno duže, naročito na niskim temperaturama. Salmonele su

primarni crevni patogeni čoveka i mnogih životinja. Sa njihovim izlučevinama ove bakterije

dospevaju u spoljnu sredinu gde mogu da prežive različito vreme, ali ne mogu da se

razmnožavaju (Jovanović et al., 1999).

8

U ovom radu su testirane sledeće Gram-pozitivne bakterije:

Staphylococcus aureus (zlatni stafilokok)

Rod Staphylococuus su Gram-pozitivne bakterije, skupljene u nepravilne grupe-

grozdove, nepokretne, ne formiraju spore, fakultativni anaerobi (Petrović et al., 2007).

Staphylococcus aureus je široko rasprostranjena bakterija i može biti prisutna kod zdravih osoba.

Obzirom da S. aureus ispoljava veliku tolerantnost prema visokim koncentracijama kuhinjske

soli i šećera, često se javlja kao kontaminent slanih i slatkih namirnica. S. aureus je producent

ekstracelularnih, termostabilnih enterotoksina (Samardžija et al., 2007). Često naseljava kožu,

naročito kod bolničkih pacijenata. Bolesti koje izaziva ovaj stafilokok mogu biti invazivne

(prodorom bakterije u organizam), intoksikacije (izlučuje toksine koji su odgovorni za

poremećaje, npr. konzumiranje pokvarenih namirnica), i kombinacijom ove dve grupe

(Jovanović et al., 1999).

Bacillus cereus

Rod Bacillus čine Gram-pozitivne, štapićaste, sporogene bakterije. Aerobi ili fakultativni

anaerobi. Bakterije ovog roda su široko rasprostranjene u zemlji i vodi. Bacillus cereus je jedna

od dve vrste ovog roda koja je opisana kao patogena. Proizvodi termostabilan toksin koji

uzrokuje dijareju i termostabilan toksin koji izaziva povraćanje (Jovanović et al., 1999).

Listeria monocytogenes

U rodu Listeria se nalazi više bakterijskih vrsta, ali samo Listeria monocytogenes ima

značaja u medicini. Gram pozitivna, loptasta bakterija, nema kapsulu niti stvara spore. Ima flage

i na sobnoj temperaturi je pokretna, ali ne i na 37˚C. Dobro raste u aerobnim ili mikroaerofilnim

uslovima. Rasprostranjena je u prirodi. Izaziva epizotijska ili sporadična oboljenja domaćih i

divljih životinja, reĎe ljudi. Čovek se najčešće inficira zaraženom ili komtaminiranom hranom ili

direktnim kontaktom sa zaraženom životinjom (Jovanović et al., 1999).

9

3. CILJ RADA

Ciljevi ovoga rada su definisani u sledećem:

Prikupljanje nadzemnog dela biljne vrste Micromeria pulegium na lokalitetu opisanom

literaturi;

Determinacija biljnog materijala klasičnim metodama za determinaciju;

Mikropropagacija vrste Micromeria pulegium u kulturi in vitro;

Pripremanje ekstrakata uz pomoć metanola kao rastvarača;

Ispitivanje antimikrobne aktivnosti metanolnih ekstrakata vrste Micromeria pulegium,

prikupljene iz prirode i gajene u in vitro kulturi, uz pomoć mikrodilucione metode;

Statistička obrada dobijenih rezultata i poreĎenje dobijenih aktivnosti;

IzvoĎenje zaključaka i tumačenje rezultata u skladu sa postojećom literaturom u cilju

pronalaženja novih izvora antimikrobnih supstanci.

10

4. MATERIJAL I METODE

4.1. Biljni materijal Nadzemni deo biljne vrste Micromeria pulegium je prikupljan u vegetativnoj fazi u

klisuri Svrljiškog Timoka. Herbarski primerak je deponovan u herbarijumu na Prirodno-

matematičkom fakultetu u Nišu (broj vaučera 6912). Za mikropropagaciju su korišćeni nodalni

segmenti kao eksplanti a ostatak biljnog materijala je sušen u periodu od deset dana na sobnoj

temperaturi do konstantne mase.

Postupak mikropropagacije prikupljenih nodalnih segmenata biljne vrste Micromeria

pulegium je izvršen od strane Svetlane Tošić u laboratoriji za fiziologiju biljaka Prirodno-

matematičkog fakulteta u Nišu. Tako dobijeni biljni materijal je takoĎe sušen u periodu od deset

dana na sobnoj temperaturi do konstantne mase.

Slika 1. M. pulegium na podlozi Murashige and Skoog (MS) bez regulatora rastenja

11

4.2. Dobijanje biljnog ekstrakta Za pripremu biljnog ekstrakta uzet je po 1 g osušenog i usitnjenog biljnog materijala (iz

prirode i iz kulture) i pomešan sa 10 ml metanola. Nakon 1h stajanja uzorci su filtrirani, rastvarač

je uklonjen na vakum uparivaču i dobijeni ekstrakti su čuvani zamrznuti (255 K) do analize.

4.3. Testiranje antimikrobne aktivnosti biljnih ekstrakata vrste Micromeria

pulegium gajene in vitro i iz prirode

4.3.1. Bakterijske kulture Za ispitivanje antimikrobne aktivnosti korišćeni su sledeći sojevi bakterija: Gram

pozitivne bakterije (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus i Listeria monocytogenes) i Gram

negativne bakterije (Escherichia coli, Pseudomonas aeruiginosa i Salmonella enteritidis).

Tabela 1. Testirane bakterijske kulture

Bakterijski sojevi Izvor

Bacillus cereus Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes Escerichia coli Pseudomonas aeuriginosa Salmonella enteritidis

ATCC 11778 ATCC 25923 ATCC 15313 ATCC 25922 ATCC 9027 ATCC 13067

4.3.2. Mikrodiluciona metoda Za odreĎivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) i minimalne baktericidne

koncentracije (MBC) biljnog ekstrakta M. pulegium korišćena je mikrodiluciona metoda. Od

prekonoćnih kultura ispitivanih sojeva bakterija uzgajanih na hranljivoj podlozi, napravljene su

bakterijske suspenzije u sterilnom fiziološkom ratstvoru i turbidimetrijskom metodom je broj

mikroorganizama standardizovan na 0,5 McFarlanda. Nakon toga je napravljena serija duplih

razreĎenja uzoraka (u 30% metanolu) u mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarčića u kojima su dodati

inokulisani nutrijenti za rast (u svakom bunariću je bio finalni volumen – 100 µl i finalna

12

koncentracija bakterija 106 CFU/ml). Mikrotitarske ploče su zatim inkubirane 24h na 37˚C. Svi

testovi su vršeni u triplikatu a korišćene su dve kontrole rasta koje sadrže inokulisanu hranljivu

podlogu kao i inokulisanu hranljivu podlogu sa serijom duplih razblaženja rastvarača metanola.

Kao pozitivna kontrola su korišćeni antibiotici: hloramfenikol, streptomicin i tetraciklin.

Mikrobni rast je odreĎivan dodavanjem po 20 µl 0,5% vodenog rasvora TTC (2,3,5-trifenil

tetrazolijum hlorida) u svakom bunariću. Minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) se definiše

kao koncentracija ekstrakta pri kojoj mikroorganizmi ne pokazuju vidljivi rast (nema crveno

obojenih bakterija). Dа bi se utvrdila minimalna baktericidna koncentracija (MBC), iz svakog

bunarića je sadržaj prenošen na Мueller Hinton agaru (MHA) u petri pločama koje su zatim

inkubirane 24h nа 37˚C. МBC se definiše kao najniža koncentracija еkstrakata u kojoj je ubijeno

99,9% inokulisanih mikroorganizama.

Slika 2. Mikrotitarska ploča sa inokulisanom hranljivom podlogom, tretirana serijom

razblaženja uzoraka

4.3.3. Statistička obrada podataka Svi rezultati obraĎeni su analizom varijanse (ANOVA) sa sigurnošću od 95 % (p≤0,05).

13

5. REZULTATI I DISKUSIJA

U ovom radu je ispitivana antimikrobna aktivnost metanolnih ekstrakata biljne vrste

Micromeria pulegium uz pomoć mikrodilucione metode protiv tri Gram-pozitivne i tri Gram-

negativne bakterije. Izvršeno je poreĎenje antimikrobnih aktivnosti metanolnih ekstrakata

dobijenih iz nadzemnih delova biljke koji su prikupljani u vegetativnoj fazi u klisuri Svrljiškog

Timoka i dobijenih postupkom mikropropagacije nodalnih segmenata koji je izvršen od strane

Svetlane Tošić u laboratoriji za fiziologiju biljaka Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu.

Dobijeni rezultati su statistički obraĎeni i prikazani u tabeli 2.

Tabela 2. Antimikrobna aktivnost metanolnih ekstrakata nadzemnog dela biljne vrste Micromeria pulegium L. (iz prirode i iz kulture) i referentnih antibiotika (izražena kao MIC/MBC u mg/mL)

Metanolni ekstrakti M. pulegium

Gram (-) bacterije Gram (+) bacterije

Escherichia

coli

Salmonella

enteritidis

Pseudomonas

aeruginosa

Bacillus

cereus

Staphylococcu

s aureus

Listeria

monocytogenes

M. pulegium

(priroda) 25.13/50.25 25.13/25.13 25.13/>50.25 50.25/>50.25 12.57/12.57 12.57/25.13

M. pulegium

(in vitro) 34.25/68.70 17.13/34.25 68.70/>68.70 17.13/34.25 17.13/17.13 17.13/68.70

Streptomicin 0.16/0.16 0.04/0.04 0.08/0.08 0.01/0.01 0.01/0.01 0.01.0/0.01

Hloramfenikol 0.08/0.16 0.04/0.08 0.16/0.04 0.01/0.04 0.01/0.08 0.08/0.08

Tetraciklin 0.01/0.02 0.01/0.08 0.04/0.32 0.01/0.01 0.01/0.01 0.01/0.02

Vrste roda Micromeria su aromatične biljke koje se tradicionalno koriste kao začini i u

lekovite svrhe, zbog čega je pažnja naučne javnosti bila fokusirana na ispitivanje hemijskog

sastava i antimikrobne aktivnosti njihovih etarskih ulja. Ispitivane su vrste M. cristata (Tabanca

et al., 2001; Stojanović et al., 2008), M. thymifolia, M. albanica i M. dalmatica (Marinković et

al., 2002), M. fruticulosa (Gulluce at al., 2004; Formisano et al., 2007), M. juliana (Stojanović et

al., 2006), M. biflora (Adnan and Al-Rehaily, 2006; Mishra et al., 2010) i M. barbata (Bakkour

et al., 2012). Na osnovu hemijskog sastava etarskih ulja vrsta roda Micromeria se može

14

zaključiti da se izdvaja grupa bogata pulegonom u koju spadaju M. cilicica (Duru et al., 2004),

M. thymifolia, M. albanica i M. dalmatica (Marinković et al., 2002), M. fruticulosa ssp

serpyllifolia (Gulluce at al., 2004) i M. barbata (Bakkour et al., 2012). Ulja ostalih vrsta sadrže

alkohole borneol i linalol, seskviterpene kariofilen i kariofilen-oksid, dok dve vrste sadrže u

većem procentu timol, M. juliana (Stojanović et al., 2006), a naročito M. bifloa čije ulje je veoma

dobro delovalo na patogene bakterije koje izazivaju stvaranje karijesa (Mishra et al., 2010).

U dostupnoj literaturi je pronaĎeno vrlo malo podataka o antimikronom delovanju

ekstrakata nadzemnog dela biljnih vrsta roda Micromeria. Za vrstu M. nervosa je uporeĎivana

aktivnost etanolnog i etil-acetatnog ekstrakta (koncentracije 200 mg/mL) sa aktivnošću timola i

karvakrola koji su prisutni u vrstama roda Micromeria i poznati antimikrobni agensi (Ali-

Shtayeh et al., 1997). TakoĎe, poreĎene su antimikrobne aktivnosti etarskog ulja (koje je bogato

piperitonenom i pulegonom) i metanolnog ekstrakta, dobijenih iz nadzemnih delova biljne vrste

M. fruticulosa ssp serpyllifolia, protiv patogenih bakterijskih i fungalnih sojeva, i ustanovljeno je

da 300μg/disku metanolnog ekstraka nije delovao ni na jedan testiran soj (Gulluce at al., 2004). S

druge strane, rezultati poreĎenja antimikrobnih aktivnosti ulja, heksanskog, etil-acetatnog

ekstrakta biljne vrste M. cilicica i pulegona su, za većinu bakterijskih patogenih sojeva, pokazali

iste zone inhibicije (Duru et al., 2004). Daleko slabije delovanje je izmereno kod etanolnog

ekstrakta biljne vrste M. juliana koji je od sedam ispitivanih sojeva delovao samo na S.

epidermidis – zona inhibicije je bila 12 mm (Sarac and Ugur, 2007). Osim za vrstu M. nervosa

(Ali-Shtayeh et al., 1997), za ostale vrste nisu navedene koncentracije testiranih ekstrakata, a u

svim radovima upotrebljavana je disk-difuziona metoda koja je neprecizna i nereproduktibilna i

može se koristiti samo za preliminarni antimikrobni skrining. Tokom pregleda dostupne

literature nije pronaĎen nijedan rad o antimikrobnoj aktivnosti etarskog ulja ili esktrakta vrste M.

pulegium.

Naši rezultati mikrodilucione metode s jedne strane pokazuju slično delovanje metanolnih

ekstrakata (dobijenih iz biljnog materijala iz prirode i iz kulture) protiv svih testiranih sojeva, a s

druge strane, nisku aktivnost u poreĎenju sa referentnim antibioticima (MIC/MBC=0.01-0.16

mg/mL) (tabela 2). Inhibitorne i baktericidne koncentracije ekstrakata su bile u rangu od 25.13 –

50.25 mg/mL; i 17.13 – 68.70 mg/mL (respektivno) protiv Gram (-) bakterije i od 12.57 – 50.25

mg/mL; 17.13 – 68.70 mg/mL (respektivno) za Gram (+) bakterije. S obzirom na podatak da se

15

biljni ekstrakti koji imaju MIC vrednosti manju od 100 μg/mL smatraju nedelotvornim (Cos et

al., 2006), dobijene vrednosti nisu značajne sa aspekta antimikrobnog delovanja. Najviše

testirane koncentracije ekstrakta nisu imale baktericidno delovanje protiv sojeva P. aeruginosa

(MBC>50.25 mg/mL i MBC>68.70 mg/mL, za ekstrakt dobijen iz prirode i iz in vitro kulture) i

B. cereus (MBC>50.25 mg/mL za ekstrakt dobijen iz in vitro kulture). Najrezistentniji je bio soj

P. aeruginosa (MIC/MBC=25,13/>50,25 mg/mL; 68,7/>68,7 mg/mL, respektivno), a

najosetljiviji je bio soj S. aureus na koga su oba ekstrakta delovala u najnižim koncentracijama

(MIC/MBC=12,57/12,57 mg/mL; 17,13/17,13 mg/mL respektivno). Nije zabeležena značajna

razlika u antimikrobnom delovanju metanolnog ekstrakta koji je dobijen iz biljke ubrane u

prirodi i iz biljke odgajene in vitro u kulturi.

16

6. ZAKLJUČAK

Nadzemni deo biljne vrste Micromeria pulegium je prikupljan u vegetativnoj fazi u

klisuri Svrljiškog Timoka, nakon čega je od strane dr Bojana Zlatkovića izvršena determinacija

biljnog materijala i deponovanje herbarskog primerka u Herbaru PMF-a u Nišu. Za

mikropropagaciju su korišćeni nodalni segmenti kao eksplanti.Vrsta M. pulegium je prvi put

uvedena u in vitro kulturu i njena mikropropagacija je uspešno izvršena od strane Svetlane Tošić

u laboratoriji za fiziologiju biljaka PMF-a u Nišu. Na taj način je dokazano da se ova vrsta može

uspešno gajiti i razmnožavati u laboratoriji.

Ostatak biljnog materijala iz prirode, kao i materijala dobijenog mikropropagacijom je

sušen i od njega su napravljeni metanolni ekstrakti. Antimikrobna aktivnost dobijenih ekstrakata

je ispitivana upotrebom mikro-dilucione metode. Kao test mikroorganizmi uzeti su najčešći

bakterijski patogeni sojevi, po tri iz grupe Gram (+) i Gram (-) bakterija. Analiza dobijenih

rezultata ukazuje na to da su oba metanolna ekstrakta biljaka prikupljenih iz prirode i odgajenih

u in vitro kulturi delovala na sve testirane sojeve. Inhibitorne i baktericidne koncentracije

ekstrakata su bile u rangu od 25.13 – 50.25 mg/mL; i 17.13 – 68.70 mg/mL (respektivno) protiv

Gram (-) bacterije i od 12.57 – 50.25 mg/mL; 17.13 – 68.70 mg/mL (respektivno) protiv Gram

(+) bacterije. Dobijene aktivnosti su znatno slabije u odnosu na tri referentna antibiotika.

PoreĎenjem dobijenih rezultata nije zabeležena značajna razlika u antimikrobnom

delovanju metanolnog ekstrakta koji je dobijen iz biljke ubrane u prirodi i iz biljke odgajene in

vitro u kulturi.

17

7. LITERATURA

1. Al-Rehaily, J.A. (2006): Composition of the Essential oil of M.biflora ssp. Arabica

K.Walsh Pakistan Journal of Biological Sciences, 9(14), 2726-2728.

2. Ali – Shtayeh, M. S., Al-Nuri, M. A., Yaghmour, R. M. R.,& Faidi, Y. R. (1997):

Antimicrobial activity of Micromeria nervosa from Palestinian area. Journal of

Ethnopharmacology, 58, 143-147.

3. Bakkour, Y., Alwan, S., Soufi, H., El-Ashi, N., Tabchei, M., El Omar, F.(2012):

Chemical composition of essential oil extracted from Micromeria Barbata growing

and their antimicrobial and antioxidant properties. Journal of Natural Products, 5,

116-120.

4. Bogosavljević S., Zlatković B., RanĎelović V. (2007): Flora klisure Svrljiškog

Timoka. 9th Symposium on Flora of Southeastern Serbia and Neighbouring Regions,

Niš, proceeding, 41-54.

5. Boissier E (1879): Flora Orientalis. vol. 4. Basel & Geneve, 568 – 575.

6. Chadwick, D. J., Marsh, J. (Eds). Bioactive compounds from plants (CIBA

foundation symposium 154), John Wiley & Sons Ltd., Chichester, 1990.

7. Cos, P., Vlietinck, A.J., Berghe, D.V., Maes, L. (2006): Anti-infective Potential of

Natural Products: How to Develop a Stronger in vitro ’Proof-of-Concept’. Journal of

Ethnopharmacology, 106, 290-302.

8. Duru, M.E., Öztürk, M., Uğur, A., Ceylan, Ö. (2004): The constituens of essential oil

and in vitro antimicrobial activity of Micromeria cilicica from Turkey. J.

Ethnopharmacol. 94, 43-48.

9. Formisano, C., Mignola, E., Rigano, D., Senatore, F., Bellone, G., Bruno M., rosella

S., (2007): Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil from

aerial parts of Micromeria fruticulosa (Bertol.) Grande (Lamiaceae) growing wild in

southern Italy. Flavour frag. J., 22 (4), 289-292.

10. Gulluce, M., Sokmen, M., Sahin, F., Sokmen, A., Adiguzel, A., Ozer, H. (2004):

Biological activites of the essential oil and methanolic extracts of Micromeria

18

fruticosa (L) Druce ssp serpyllifolia (Bieb) PH Davis plants from the eastern Anatolia

region of Turkey, Journal of the Science of Food and Argicultre 84 (7): 735-741.

11. Josifović, M. (ed.) (1974): Flora SR Srbije, VI, Srpska akademija nauka i umetnosti,

Beograd.

12. Jovanović, M., Berger-Jekić, O. (1997): Specijalna bakteriologija, udžbenik za

studente medicine. Savremena administracija, Beograd.

13. Marinković, B., Marin, P.D., Soković, M., Duletić-Lausević, S&Vukojević, J. (2003):

Antigungal effect of the essential oil of two Micromeria ( Lamiaceae) species.

Bocconea, 16 (2), 1113-1116.

14. MeĎedović, S., Ferhatović Dž., (2003). Klonska proizvodnja sadnica drveća i grmlja.

Bemust, Sarajevo.

15. Mishra, R. K., Kumar, A., Shukla, A. C., Tiwari, P., Dikshit, A. ( 2010): Quantitative

and Rapid Antibacterial Assay of Micromeria biflora Benth. Leaf Essential Oil

Against Dental Caries Causing Bacteria Using Phylogenetic Approach. Journal of

Ecobiotechnology, 2(4), 22-26.

16. NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standards (2003) Performance

standards for antimicrobial susceptibility testing: eleventh informational supplement.

Document M100-S11. National Committee for Clinical Laboratory Standard, Wayne,

PA, USA.

17. Petrović O., Knežević P., Simeunović J. (2007): Mikrobiologija, skripta za studente

biologije. Savremena administracija, Beograd.

18. Samardžija, D., Damjanović, S., Pogačić, T. (2007): Staphyloccocus aureus u siru.

Mljekarstvo/Dairy, 57: 31-48.

19. Sarac N. and Ugur A. (2007): Antimicrobial activites and usage in folkloric medicine

of some Lamiaceae species growing in Mugla, Turkey. Eurasian Juornal of

BioSciences 4,28—37.

20. Slavkovska V., Couladis M., Bojović S., Tzakou O., Pavlović M., Lakušić B., and

Jancić R. (2005): Essential oil and its systematic significance in species of

Micromeria Bentham from Serbia and Montenegro. Pl. Syst. Evol. 255, 1–15

19

21. Stevanović V. et al. (1999): Crvena knjiga flore Srbije. 1, Isčezli i krajnje ugroženi

taksoni Ministarstvo za životnu sredinu republike Srbije, Beograd; Biološki fakultet

Univerziteta u Beogradu, Beograd; Zavod za zaštitu prirode Republike Srbije,

Beograd, 380-382.

22. Stojanović, G.; Palić, I. 2008: Antimicrobial and antioxidant activity of Micromeria

Bentham species. Curr. Pharm. Des. 14, 3196-3202.

23. Šilić C. (1979): Monographie der Gattungen Satureja L., Calamintha Miller,

Micromeria Benth., Acinos Miller und Clinopodium L. in der Flora Jugoslawiens,

Zemaljski Muzej BiH, Sarajevo, pp. 172 – 262.

24. Tabanca, N., Kirimer, N., Demirci, F., Baser, KH. (2001): Composition and

antimicrobial activity of the essential oils of Micromeria cristatasubsp. Phygia and the

enantiomeric distribution of borneol. J. Agric Food Chem. 49 (9), 4300- 3.

25. Tatić B., Blečić V. (1984): Sistematika i filogenija viših biljaka.Univerzitetski

udžbenik, Zavod za udžbenike i nastavna sredstva, Beograd, 314 - 316

26. Tucakov, J., (1990): Lečenje biljem. Beograd, 24 - 72

27. Vinterhalter, D., Vinterhalter B., (1996): Kultura in vitro i mikropropagacija biljaka.

Axial, P.O., Beograd, 15-54.

20

BIOGRAFIJA

Sanja Stojanov, roĎena 08. maja 1989. godine u Pirotu, gde 2004. godine završava osnovnu

skolu ―Vuk Karadžić‖. Iste godine upisuje Gimnaziju u Pirotu, društveno-jezički smer i završava

sa odličnim uspehom. Prirodno matematički fakultet Univerziteta u Nišu, upisala je školske

2008/2009.godine na Departmanu za biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije završava

2011. godine sa zvanjem ―biolog‖. Iste godine upisuje master akademske studije, smer Ekologija

i zaštita prirode, na istom fakultetu.

21

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад Аутор, АУ: Сања Стојанов Ментор, МН: Татјана Михајилов- Крстев Наслов рада, НР:

Поређење антимикробне активности биљних екстраката врсте Мicromeria pulegium гајене in vitro и из природе

Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2014. Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

19 страна; 3 слике; 2 табеле Научна област, НО: биологија

Научна дисциплина, НД: микробиологија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Мicromeria pulegium, микропропагација, антимикробна активност

УДК 579.222:581.135+582.929.4

Чува се, ЧУ: библиотека Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: Циљ овог рада је поређење антимикробне активности биљних екстраката врсте

Micromeria pulegium прикупљене из природе и гајене у in vitro култури. Врста М. pulegium је успешно уведена у културу in vitro од стране Светлане Тошић у лабораторији за физиологију биљака ПМФ-а у Нишу. За испитивање антимикробне активности коришћена је микродилуциона метода. Испитивањем деловања метанолног екстракта, добијеног из биљног материјала прикупљеног из природе и гајеног in vitro, против сојева бактерија (Грам (+) бактерије: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus i Listeria monocytogenes; Грам (-) бактерије: Pseudomonas aeruginosa, Esherichia coli и Salmonella enteritidis) дошло се до резултата који показују да не постоји значајна разлика у антимикробном деловању ова два екстракта, које је у поређењу са три референтна антибиотика (стрептомицин, хлорамфеникол и тетрациклин) знатно ниже. Најотпорнији бактеријски сој је био Pseudomonas aeruginosa, док је најосетљивији сој био Staphylococcus aureus.

Датум прихватања теме, ДП: Датум одбране, ДО: Чланови комисије, КО: Председник: Др Драгана Стојичић

Члан: Др Бојан Златковић

Члан, ментор: Др Татјана Михајилов- Крстев

22

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO: Document type, DT: monograph Type of record, TR: textual / graphic master thesis

Author, AU: Sanja Stojanov Mentor, MN: Tatjana Mihajilov- Krstev Title, TI: The comparative analisis of antimicrobial activity of Micromeria pulegium extracts

grown in vitro and in nature

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Republic of Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2014.

Publisher, PB: author’s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

19 pages; 3 pictures; 2 tables Scientific field, SF: biology

Scientific discipline, SD: microbiology

Subject/Key words, S/KW: Micromeria pulegium, micropropacation, antimicrobial activity

UC 579.222:581.135+582.929.4 Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: The aim of study was to compare the antimicrobial activity of plant extracts Micromeria pulegium collected from the nature and cultivated in vitro. Species M. pulegium was successfuly introduced into culture in vitro by Svetlana Tosic in the laboratory of Plant Physiology, Faculty of Science in Nis. Method of microdilution was used in analysis of antimicrobila activity. Examining the effects of the methanol extract obtained from plant material collected from the nature and cultivated in vitro, against selected strains of bacteria (Gram (+) bacteria: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes; Gram (-) bacteria: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli and Salmonella enteritidis), it was found that there was no significant difference in antimicrobial activityof these extracts, which compared to three references of antibiotics (streptomycin, chloramphenicol and tetracycline) were significantly lower. The most resisant bacterial strain was Pseudomonas aeruginosa, and the most sensitive strain was Staphylococcus aureus.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: Defended on, DE:

Defended Board, DB: President: Dr Dragana Stojičić Member: Dr Bojan Zlatković

Member, Mentor: Dr Tatjana Mihajilov- Krstev