univerza v ljubljani -...

UNIVERZA V LJUBLJANI

PEDAGOŠKA FAKULTETA

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

Študijski program: Biologija in Kemija

TJAŠA BERGANT

Mentorica: doc. dr. Anita JEMEC

Somentorica: prof. dr. Kristina SEPČIĆ

ACETILHOLINESTERAZNA AKTIVNOST V VODNEM EKSTRAKTU GOBE

BUKOV OSTRIGAR (Pleurotus ostreatus)

DIPLOMSKO DELO

LJUBLJANA, 2016

Bergant T. Acetilholinesterazna aktivnost v vodnem ekstraktu gobe bukov ostrigar Pleurotus Ostreatus. Dipl. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Program biologija in kemija, 2016

ii

Diplomsko delo je zaključek dodiplomskega univerzitetnega študija biologije in kemije.

Opravljeno je bilo v laboratoriju Katedre za biokemijo na Oddelku za biologijo Biotehniške

fakultete v Ljubljani.

Študijska komisija Pedagoške fakultete je 10. maja 2016 odobrila predlagano temo

diplomske naloge z naslovom Acetilholinesterazna aktivnost v vodnem ekstraktu gobe

bukov ostrigar (Pleurotus ostreatus).

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: doc. dr. Iztok TOMAŽIČ

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Mentorica: doc. dr. Anita JEMEC


Somentorica: prof. dr. Kristina SEPČIĆ


Recenzentka: prof. dr. Damjana DROBNE


Podpisana se strinjam z objavo svoje naloge v polnem tekstu na spletni strani Digitalne

knjižnice Biotehniške fakultete. Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski

obliki, identična tiskani verziji.

Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela.


iii

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Dn

DK UDK 577:582.284.99(043.2)

KG bukov ostrigar/Pleurotus ostreatus/acetilholinesteraza/inhibicija

AV BERGANT, Tjaša

SA JEMEC, Anita (mentor)

KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16

ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Program Kemija in

Biologija

LI 2016

IN ACETILHOLINESTERAZNA AKTIVNOST V VODNEM EKSTRAKTU GOBE BUKOV

OSTRIGAR (Pleurotus ostreatus)

TD Diplomsko delo (univerzitetni študij)

OP VIII, 25 str., 11 sl., 32 vir.

IJ sl

JI sl/en

AI Zanimalo nas je, ali je v vodnem ekstraktu gobe bukovega ostrigarja (Pleurotus

ostreatus) mogoče zaznati aktivnost encima acetilholinesteraze (AChE), če kot

substrat uporabimo acetiltioholinklorid (AChCl). Z dodatkom različnih koncentracij

substrata in različnih inhibitorjev, smo želeli proučiti, v kolikšni meri ti vplivajo na

aktivnost encima. Uspeli smo dokazati aktivnost encima AChE v vzorcih bukovega

ostrigarja. Aktivnost je linearno naraščala s povečevanjem koncentracije substrata

AChCl. Pri koncentraciji 1 mM AChCl inhibitorji eserin, neostigmin bromid in poli

APS ne zavirajo aktivnosti encima. Predlagamo nadaljnje študije z drugimi

substrati, ki vsebujejo tioholin ter študije inhibicije encima pri višjih koncentracijah

substrata acetiltioholinklorida.


iv

KEY WORDS DOCUMENTATION

DN Dn

DC UDC 577:582.284.99(043.2)

CX oyster mushroom/Pleurotus ostreatus/acetylcholinesterase/inhibition

AU BERGANT, Tjaša

AA JEMEC, Anita (supervisor)

PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16

PB University of Ljubljana, Faculty of Education, Biotehnical Faculty, Academic Study

Programme Chemistry and Biology

PY 2016

TI ACETYLCHOLINESTERASE ACTIVITY IN WATER EXTRACT OF THE OYSTER

MUSHROOM (Pleurotus ostreatus)

DT Graduation thesis (University studies)

NO VIII, 25 p., 11 fig., 32 ref.

LA sl

AL sl/en

AB We were interested to see, if there is a possibility to detect any activity of the enzyme

acetylcholinesterase (AChE) in the water extract of the oyster mushroom (Pleurotus

ostreatus), if acetylthiocholine chloride (AChCl) is used as a substrate. We wished to study

at what rate the enzyme activity is affected, if we add different concentrates of the

substrate and different inhibitors. In samples of the oyster mushroom, activity of the

enzyme AChE was successfully proven. The activity linearly grew in correspondance with

increasing concentration of the AChCl substrate. Inhibitors eserine, neostigmine bromide,

and poly APS at 1 mM concentration of AChCl, do not block the enzyme activity. We

suggest further studies with other substrates, containing thiocholine. We also suggest

studies of the enzyme inhibition at higher concentrations of substrate acetylthiocholine

chloride.


v

KAZALO VSEBINE

1. UVOD .................................................................................................................................. - 1 -

1.1. Namen dela/raziskovalna vprašanja .......................................................................... - 1 -

2. PREGLED OBJAV ................................................................................................................. - 2 -

2.1. SPLOŠNE LASTNOSTI GOB .......................................................................................... - 2 -

2.1.1. Značilnosti bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus) ........................................... - 2 -

2.1.2. Interakcija rastline-glive ......................................................................................... - 3 -

2.2. ENCIM ACETILHOLINESTERAZA .................................................................................. - 3 -

2.2.1. Biološka vloga ......................................................................................................... - 3 -

2.2.2. Biokemijske značilnosti .......................................................................................... - 4 -

2.2.3. Substrati AChE ....................................................................................................... - 5 -

2.2.4. Inhibitorji AChE ....................................................................................................... - 6 -

2.2.5. Definicija in računanje encimske aktivnosti ........................................................... - 7 -

3. MATERIALI IN METODE ...................................................................................................... - 8 -

3.1. KEMIKALIJE ................................................................................................................. - 8 -

3.2. LABORATORIJSKA OPREMA ........................................................................................ - 8 -

3.3. PRIPRAVA VZORCEV GOBE (PLEUROTUS OSTREATUS) .............................................. - 8 -

3.4. MERJENJE ENCIMSKE AKTIVNOSTI ACETILHOLINESTERAZE ....................................... - 9 -

3.4.1. Vpliv različnih koncentracij substrata acetiltioholin klorida .................................. - 9 -

3.4.2. Test inhibicije aktivnosti encima .......................................................................... - 10 -

3.4.3. Določanje količine proteinov ................................................................................ - 11 -

4. REZULTATI ........................................................................................................................ - 13 -

4.1. AKTIVNOST ENCIMA ACETILHOLINESTERAZA V GOBAH .......................................... - 13 -

4.2. VPLIV RAZLIČNIH KONCENTRACIJ SUBSTRATA ......................................................... - 15 -

4.3. VPLIV INHIBITORJEV NA AKTIVNOST ........................................................................ - 17 -

5. RAZPRAVA ........................................................................................................................ - 19 -

5.1. AKTIVNOST ENCIMA ACETILHOLINESTERAZE V GOBAH .......................................... - 19 -

5.2. VPLIV RAZLIČNIH KONCENTRACIJ SUBSTRATA ......................................................... - 19 -

5.3. VPLIV INHIBITORJEV NA AKTIVNOST ........................................................................ - 19 -

6. SKLEPI ............................................................................................................................... - 21 -


vi

7. POVZETEK ......................................................................................................................... - 22 -

8. VIRI IN LITERATURA VSEBINE ........................................................................................... - 23 -

9. VIRI SLIK ............................................................................................................................ - 25 -


vii

KAZALO SLIK

Slika 1: 3D shematska predstavitev strukture encima AChE (Torpedo californica) ...................... - 5 -

Slika 2: Vrednosti absorbance v odvisnosti od časa pri endogeni reakciji .................................. - 13 -

Slika 3: Vrednosti absorbance v odvisnosti od časa ob dodatku 1mM AChCl ............................. - 14 -

Slika 4: Vrednosti absorbance za vodotopno AChE pri dodatku 0, 1, 3 in 5mM AChCl .............. - 15 -

Slika 5: Vrednosti absorbance za celokupno AChE pri dodatku 0, 1, 3 in 5 mM AChCl .............. - 15 -

Slika 6: Specifična aktivnost vodotopne AChE ob dodatku 0, 1, 3 in 5 mM AChCl. . .................. - 16 -

Slika 7: Specifična aktivnost celokupne AChE ob dodatku 0, 1, 3 in 5 mM AChCl. ...................... - 16 -

Slika 8: Vrednosti absorbance vodotopne AChE ob dodatku inhibitorjev eserina in ................. - 17 -

Slika 9: Vrednosti absorbance celokupne AChE ob dodatku inhibitorjev eserina in ................... - 17 -

Slika 10: Vrednosti absorbance vodotopne AChE ob dodatku inhibitorja poli APS .................... - 18 -

Slika 11: Vrednosti absorbance celokupne AChE ob dodatku inhibitorja poli APS ..................... - 18 -


viii

SEZNAM KRATIC

AChE Acetilholinesteraza

ACh Acetilholin

AChCl Acetiltioholin klorid

ChE Holinesteraza

BChE Butirilholinesteraza

DTNB Ditiobisnitrobenzoat

K-P pufer Kalij-fosfatni pufer

dH2O Destilirana voda


- 1 -

1. UVOD

Acetilholinesteraza (AChE) je encim, ki ne sodeluje le pri prenosu živčnih signalov, ampak

ima vlogo tudi pri drugih življenjsko pomembnih funkcijah (Karczmar, 2010), kot npr. pri

prenosu spermijev in razvoju motorične ploščice (Massoulié in sod., 1993). Gre za enega

izmed najhitrejših hidrolitičnih encimov, katerega aktivno mesto je posebej prilagojeno za

proces hidrolize substrata acetilholina (ACh) (Houghton in sod., 2006).

Acetilholin najdemo pri vretenčarjih in členonožcih kot glavni nevrotransmiter, s

pomočjo katerega se do živčnih celic prenašajo električni impulzi. Encim AChE se nahaja v

holinergičnih sinapsah. Če je živčni prenašalec ACh, se sinapse imenujejo acetilholinske

sinapse in prevladujejo pri večini živalskih skupin. Na postsinaptični membrani AChE

razgradi ACh in s tem prekine prenos živčnega signala med celicama (Karczmar, 2010).

Dokazali pa so tudi prisotnost ACh v tkivih, ki niso povezana z živčnim sistemom

(Karczmar, 2010). Šibka sinteza ACh je bila zaznana tudi v vzorcih gliv iz debla

Basidiomycota (Horiuchi in sod., 2003). Zaradi odsotnosti živčnih sinaps v gobah, se

pričakuje, da ti organizmi nimajo encima AChE, vendar pa obstajajo nekatere študije, ki

nakazujejo na njegovo morebitno prisotnost (Karczmar, 2010). Na primer, v ekstraktih gliv

rodu Aspergillus in Fusarium so zaznali aktivnost specifičnih esteraz, ki naj bi imele visoko

afiniteto na tioholin ester etanojske kisline. Na osnovi tega obstaja verjetnost, da se v njih

nahaja AChE (Mikhailova in sod., 1996).

1.1. Namen dela/raziskovalna vprašanja

Zanimalo nas je, ali je v vzorcu gobe bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus) mogoče

zaznati aktivnost encima AChE, če kot substrat uporabimo acetiltioholin klorid (AChCl).

Predvidevali smo, da bomo pomerili aktivnost encima ter da bo njegova aktivnost odvisna

od koncentracije substrata AChCl. Predvidevali smo tudi, da bodo različni inhibitorji

zavirali aktivnost encima z različno intenziteto.


- 2 -

2. PREGLED OBJAV

2.1. SPLOŠNE LASTNOSTI GOB

Po biološki klasifikaciji gobe uvrščamo v kraljestvo gliv (Fungi), ki se deli na 6 debel:

Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, Glomeromycota, Microsporidia in

Zygomycota. Glive so nižji evkariontski organizmi in vključujejo raznovrstne organizme,

(gobe, glive kvasovke, plesni, rje, tartufi…), ki naseljujejo tako zračni, vodni ali kopenski

habitat (Kirk in sod., 2010). Celično steno gliv gradijo hitin in -glukani, ki zagotavljajo

njeno trdnost, v notranjosti celice pa kot rezervne snovi skladiščijo olja in glikogen.

Bhadauria in sod. (2007), so razvili standardiziran protokol, po katerem je mogoče izolirati

vse vrste proteinov, ki se nahajajo v proteomu, z manjšo kontaminacijo drugih molekul.

Zaradi trdne celične stene je učinkovita ekstrakcija proteinov, ključna za vse proteomske

študije.

Telo glive predstavlja steljka, ki je lahko enocelična ali mnogocelična, grajena iz dolgih nitk

- hif. Preplet hif tvori micelij (podgobje), nad površjem pa se razvijejo trosovniki, v katerih

nastajajo trosi (spore), ki služijo nespolnemu razmnoževanju gliv. Razmnožujejo se sicer

tudi spolno. Glive so heterotrofni organizmi in jih lahko uvrščamo med saprofite, parazite,

simbionte ali patogene (Kirk in sod., 2010). Prehranjujejo se z direktno absorbcijo hranil,

ki jo omogočajo številni ekstracelularni hidrolitični encimi, s katerimi razgradijo organski

material (Burns in sod., 2013).

2.1.1. Značilnosti bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus)

Bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus) širše uvrščamo v deblo Basidiomycota, saj

njihove razmnoževalne strukture nastajajo na bazidiju - trosnem podstavku, kjer nastajajo

trosi, s katerimi se razmnožujejo (Kirk in sod., 2010). Običajno raste v skupinah na

bukovem lesu, prepoznamo pa ga po značilnem sivorjavem klobuku, v obliki školjke. Po

načinu prehranjevanja je saprofitni heterotrof, kar pomeni, da hranila absorbira iz odmrlih

ali razpadajočih organskih substratov, hkrati pa delujejo tudi kot razkrojevalci (Eger in

sod., 1976).

Spada med ostrigarje, ki so ene izmed najbolj iskanih užitnih gob z visoko hranilno

vrednostjo, krepijo imunski sistem in jih kot vir naravnih antimikrobnih snovi že vrsto let

uporabljajo za zdravljenje bakterijskih okužb (Tehrani in sod., 2012).


- 3 -

Ostrigarji so bogat vir proteinov (več kot 30% na suho maso), ne vsebujejo holesterola in

imajo znatne količine molekule lovastina, ki znižuje holesterol. Zaradi vsebnosti lovastina

so ostrigarje uporabili za študijo zniževanja ravni holesterola (Stamets, 2005). Bukov

ostrigar je zaradi enostavnega načina gojitve ter visoke vsebnosti raznovrstnih katalitičnih

encimov (Giardina in sod., 2000), uporaben model za raziskave, tako na področju

biokemije, biotehnologije in medicine (Rebolj in Sepčić, 2008).

2.1.2. Interakcija rastline-glive

Z ekološkega vidika rastline in mikorizne glive živijo v simbiontskem odnosu, saj glive

zagotavljajo vir mineralnih snovi rastlinam, te pa jim nudijo ogljikove hidrate, ki jih glive

same ne morejo sintetizirati. Zaradi odsotnosti živčnih sinaps v gobah, je komunikacija

med rastlinami in glivami preko nevrotransmiterjev, še vedno neraziskana, kljub temu, da

je bila prisotnost le-teh zaznana v nekaterih glivah in bakterijah rodu Rhizobium

(Roshchina, V.V., 2016).

Razumevanje ekspresije, funkcije in regulacije celotnega seta proteinov, ki jih kodira glivni

genom, bi tako predstavljalo nepogrešljive informacije pri razumevanju interakcij med

rastlinami in glivami (Bhadauria in sod., 2007).

2.2. ENCIM ACETILHOLINESTERAZA

2.2.1. Biološka vloga

Acetilholinesteraza je eden izmed najbolj učinkovitih in najhitreje delujočih encimov

živčnega sistema (Houghton in sod., 2006). Nahaja se tako na holinergičnih kot na živčno-

mišičnih sinapsah, kjer poteka razgradnja ACh in tako nosi pomembno vlogo pri prenosu

živčnih signalov, poleg tega pa opravlja vrsto drugih, življenjsko pomembnih funkcij

(Karczmar, 2010), kot npr. prenos spermijev in razvoj motorične ploščice (Massoulié,

1993). Mnoge študije so dokazale, da je AChE vključena v rast aksonov, po katerih se

prevajajo živčni signali (Downes in Granto, 2004). Čeprav je v času embrionalnega razvoja

srca pred oživčenjem vloga AChE nenavadna, je bila njena aktivnost zaznana v embrijih

podgan in piščancev (Nakamura in sod., 1994).


- 4 -

Iz večjega števila rodov kraljestva gliv so uspeli izolirati snovi z močno AChE inhibitorno

aktivnostjo (Houghton in sod., 2006), zato bi bila prisotnost AChE v glivah še toliko bolj

presenetljiva, kljub potrjeni prisotnosti ACh v glivah (Horiuchi in sod., 2003).

2.2.2. Biokemijske značilnosti

Acetilholinesteraza je hidrokatalitični encim, ki vpliva na razgradnjo nevrotransmiterja

ACh, zato ga uvrščamo med hidrolazne encime (Sussman in sod., 2010). V družino

holinesteraz (ChE) spadata dva tipa, AChE in pseudoholinesteraze (Silman in Futerman,

1987). Vretenčarji imajo dva encima: AChE najdemo v mnogih vrstah prevajalnih tkiv, kot

so mišična tkiva, centralno in periferno živčno tkivo ter v motoričnih in senzoričnih vlaknih

ter butirilholinesteraza (BChE), ki jo najdemo v serumu, jetrih, ledvicah, koži in prebavnem

traktu in je substratno dokaj nespecifičen encim (Silman in Futerman, 1987).

Nevretenčarji in žuželke imajo le eno vrsto ChE, ki je po katalitičnih lastnostih nekje med

AChE in BChE (Stojan in sod., 2008), kar pomeni, da v različnih taksonomskih skupinah

najdemo različne tipe ChE.

Acetilholinesteraza obstaja v raznovrstnih molekulskih oblikah, ki imajo podobne

katalitične lastnosti, a se razlikujejo v načinu vezave na celično površino (Silman, 1987).

Kot rezultat raznolikosti kemijskih struktur so nekatere oblike encima hidrofobne, spet

druge hidrofilne. Hidrofilne oblike se nahajajo znotraj celice, pritrjene na bazalno lamino,

kjer z razgradnjo uravnavajo presežne koncentracije znotrajceličnega ACh (Robaire in

Kato, 1973). Hidrofobni encimi, vezani v lipidni dvosloj plazemske membrane, pa biološko

aktivnost ACh preprečijo tako, da ga na sinaptični špranji razgradijo na acetat in holin. Za

hitro inaktivacijo ACh, so ti nameščeni v postsinaptične membrane, kjer so v neposredni

bližini receptorjev (Houghton in sod., 2006).

Sussman (1991) je s pomočjo AChE, izolirane iz tkiva električnega organa električnega

skata Torpedo californica, prvi določil tridimenzionalno strukturo AChE (slika 1), ki ustreza

tako mišji kot človeški AChE.


- 5 -

Slika 1: 3D shematska predstavitev strukture encima AChE (Torpedo californica) (vir: Annals of Neurosciences, 2008)

2.2.3. Substrati AChE

Na vezavo substrata z encimom vpliva tako specifičnost, kot tudi dostopnost substrata

(Berg in sod., 2002). Poleg substratov pa se na aktivno mesto encima AChE lahko vežejo

tudi inhibitorji, ki zavirajo delovanje tega encima (Houghton in sod., 2006). Vsak encim

ima aktivno mesto, ki predstavlja vezavno regijo za substrat, kjer poteka kataliza. Aktivno

mesto AChE se nahaja na dnu 2 nm globokega žepa in sestoji iz dveh podregij: esterazne

in anionske podregije (Sussman in sod., 2010).

Anionska podregija je večinoma sestavljena iz aromatskih in negativno nabitih

aminokislin, pomembnih za stabilizacijo in vezavo ACh, kamor pa se vežejo tudi številni

inhibitorji (Houghton in sod., 2006). Po vezavi ACh na anionsko regijo, se na esterazni

podregiji prične hidrolitični razpad, pri čemer se estrske vezi pretrgajo in povzročijo

razpad na acetat in holin. Po razpadu, molekula vode reagira z novonastalo acetilirano

obliko AChE, iz katere nastane ponovno aktiven encim (Sussman in sod., 2010). Na vhodu

v aktivni center (žep) se nahaja še periferno anionsko mesto, ki je odgovorno za inhibicijo

s substratom, in na katerega se ravno tako lahko vežejo različni inhibitorji.

Čeprav je AChE specifičen encim, je poleg hidrolize ACh, sposoben hidrolizirati številne

druge estre. Medtem ko hidroliza naravnih substratov poteka skozi vse stopnje z enako

hitrostjo, je pri določenih substratih ena stopnja ponavadi omejujoča, zato ti redko

dosežejo prehodno stanje. Ločimo dve vrsti substratov: tisti substrati, ki so preveliki in ne

dosežejo prehodnega stanja, in majhni substrati, ki se vežejo v aktivno mesto, kjer


- 6 -

acilirajo serin, a se potem ne odcepijo več (Stojan in sod., 2008). Predstavniki obeh so

inhibitorji AChE (Harel in sod., 1992).

Naravni substrat za vezavo na AChE je ACh, njegov analog pa je acetiltioholin (Ellman in

sod., 1961). Na AChE pa se vežejo tudi drugi substrati, kot so: acetiltioholin klorid,

acetiltioholin jodid, butiriltioholin, propioniltioholin in ostali (Stojan in sod., 2008).

2.2.4. Inhibitorji AChE

Inhibitorji AChE so lahko naravnega ali umetnega izvora. Glede na način delovanja ločimo

reverzibilne in ireverzibilne inhibitorje.

Ireverzibilni inhibitorji z vezavo na encim trajno ustavijo delovanje encima (Houghton in

sod., 2006). Sem spadajo insekticidi, pesticidi in živčni bojni strupi (Stojan in sod., 2008), ki

se kovalentno vežejo z esteraznim mestom. AChE tako deluje kot tarča za nekatere

najmočnejše toksine, vključno z insekticidi, kačjimi strupi in kemičnim orožjem (Soreq in

Seidman, 2001). Akutna zastrupitev z inhibitorji AChE v centralnih in perifernih

holinergičnih sinapsah lahko hitro pripelje do mišičnih krčev, v nadaljevanju tudi do

mišične ohromelosti (Rosenberry, 1975).

Reverzibilni inhibitorji pa delovanje encima zavirajo le, ko so vezani nanj, sicer se lahko od

encima odcepijo (Houghton in sod., 2006). Reverzibilni acetilholinesterazni inhibitorji

imajo širok spekter uporabe v medicini, saj naj bi njihovo delovanje vplivalo na zdravljenje

zelene mrene, mišične oslabelosti ter Alzheimerjeve bolezni (Houghton in sod., 2006).

Eserin (fizostigmin) je alkaloidna spojina iz skupine karbamatov in je značilen za kalabarski

bob (Physostigma venenosum). Že leta nazaj so razvili vodotopne spojine, analogne

fizostigminu z daljšo razpolovno dobo, ki so bile uporabljene za zdravljenje.

Čeprav so eserin včasih pogosteje uporabljali kot strup, je danes uporaben predvsem za

zdravljenje zelene mrene (Houghton in sod., 2006).

Neostigmin (prostigmin, vagostigmin) je reverzibilen inhibitor, ki stimulira nikotinske in

mukarinske receptorje, sam pa se veže na aktivna mesta encima. Izboljša mišični tonus pri

ljudeh z mišično oslabelostjo, uporablja pa se tudi po anesteziji za sprostitev mišic

(Houghton in sod., 2006).


- 7 -

Polimeri 3-alkilpiridinijevih soli, poznani pod kratico poli APS, so vodotopne spojine,

izolirane iz morske spužve Reniera sarai, s širokim spektrom bioloških aktivnosti. Imajo

antimikrobne učinke, delujejo citotoksično in so poznani kot acetilholinesterazni

inhibitorji (Turk in sod., 2008). Gre za specifične nekompetitivne inhibitorje AChE, ki se

vežejo na periferno aktivno mesto AChE (Sepčić in sod., 1998).

2.2.5. Definicija in računanje encimske aktivnosti

Encimi so biološki katalizatorji kemičnih reakcij v živih organizmih. Ti s svojim delovanjem

zvišujejo hitrost reakcije, a pri tem ne vplivajo na ravnotežje reakcije in se pri reakciji ne

porabljajo. Encim z vezavo substrata najprej tvori kompleks encim-substrat, šele nato

poteče reakcija pretvorbe substrata v produkt. S hitrostjo encimskih reakcij in aktivnostjo

encimov se ukvarja posebna veda - encimska kinetika (Berg in sod., 2002).

Aktivnost encima merimo s spektrofotometrično metodo po Ellmanu (Ellman in sod.,

1961). Iz izmerjene absorbance, lahko po Beer-Lambertovem zakonu, določimo

koncentracijo produkta, ki nastane pri encimsko katalizirani razgradnji substrata (Nelson

in sod., 2008).

[𝑷] = 𝑨

𝜺 𝒍

[P]= koncentracija produkta, A= absorbanca, 𝜀= ekstinkcijski koeficient, l= dolžina optične poti

Iz koncentracije nastalega produkta v časovni enoti, lahko določimo hitrost encimske

reakcije. Ta je podana s količino nastalega produkta ali s količino razgrajenega substrata,

na enoto časa (Nelson in sod., 2008). Pri merjenju je potrebno nadzirati številne

dejavnike, ki lahko vplivajo na hitrost encimske reakcije. To so: koncentracija substrata in

encima, pH, temperatura, aktivatorji in inhibitorji (Berg in sod., 2002). Encimsko aktivnost

dobimo, če hitrost encimske reakcije množimo z volumnom uporabljenega vzorca (Nelson

in sod., 2008).

Specifično aktivnost encima določimo tako, da količino nastalega produkta delimo z maso

proteinov v encimskem vzorcu.


- 8 -

3. MATERIALI IN METODE

3.1. KEMIKALIJE

Kalij-fosfatni (K-P) pufer (50 mM, pH 7.0)

10% Triton X-100,

Ellmanov reagent (DTNB)

1 M acetiltioholin klorid (AChCl)

Eserin (M= 275.35 g/mol)

Neostigmin bromid (M=303.20 g/mol)

Poli APS (M=14.7 kDa)

BSA Protein Assay (Pierce)

3.2. LABORATORIJSKA OPREMA

Warring blender homogenizer

Potter-Elvehjem homogenizer

centrifuga Eppendorf 5810 R (Nemčija)

centrifugirke

2 ml in 5ml epice

mikropipeta

čitalec mikrotitrskih plošč Anthos (Velika Britanija)

čitalec mikrotitrskih plošč BioTek CYTATION 3 (ZDA)

mikrotitrne plošče

3.3. PRIPRAVA VZORCEV GOBE (PLEUROTUS OSTREATUS)

Za laboratorijsko delo smo si izbrali vzorec gobe bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus),

seva Plo5. Najprej smo pripravili vzorce (homogenate) gobe v fosfatnem pufru. Gre za

mehanski postopek izolacije celičnih komponent, pri čemer razbijemo celične membrane,

da se celični organeli izločijo v okolje. Zatehtali smo 100 g vzorca gob, katerim smo

predhodno odstranili bete. S pomočjo Warring blenderja smo vzorec homogenizirali v 200

ml K-P pufra (50 mM, pH 7.0). Homogenat smo ves čas hranili na ledu, da smo s tem


- 9 -

preprečili proteolitsko razgradnjo. Nato smo v Potter-Elvehjem homogenizerju napravili

10 pasaž in dobljen homogenat enakomerno razdelili v dve čaši ter inkubirali na ledu.

V prvo čašo (označeno s črko V- ta predstavlja vodotopne encime, ki so se pri ekstrakciji

sprostili v medij) smo dali 25 ml homogenata in 75 ml K-P pufra (50 mM, pH 7.0). V drugo

čašo (označeno s črko T- ta predstavlja vse encime, ki so se pri ekstrakciji sprostili v medij,

tako vodotopne kot membranske) pa smo dali 25 ml vzorca in 75 ml K-P pufra (50 mM, pH

7.0) s Tritonom. Za pripravo 75 ml tega pufra z 0.5% Tritonom smo v 71.25 ml pufra dodali

3.75 ml 10% Tritona. Detergent Triton razbije celične membrane, pri čemer se

ekstrahirajo membranski proteini.

Homogenate smo dali na led za 30 minut ter jih nato enakomerno razdelili v centrifugirke,

ki smo jih označili enako kot homogenate. Centrifugirali smo 30 min na 15000 obratov pri

4°. V sedimentu tako ostanejo gostejše in težje molekule, lažje pa ostanejo v

supernatantu (Berg in sod., 2002). V supernatantu se nahaja veliko število vodotopnih

proteinov in smo ga zato uporabili kot vir AChE, katere aktivnost želimo pomeriti.

Supernatante smo prelili v 2 ml in 5 ml epice ter jih inkubirali na ledu do ponovne

uporabe.

3.4. MERJENJE ENCIMSKE AKTIVNOSTI ACETILHOLINESTERAZE

V supernatantih homogenatov smo pomerili aktivnost encima s pomočjo Ellmanove

metode (1961). Gre za posredno metodo, kjer se meri absorbanca rumeno obarvanega

produkta, kot posledica reakcije med tioholinom (produkt hidrolize AChCl) in Ellmanovim

reagentom (ditiobisnitrobenzoat, DTNB):

tioholin + ditiobisnitrobenzoat ---- tionitrobenzoat + ditioholinnitrobenzoat

(rumeno obarvanje)

Nastali reakcijski produkt absorbira pri 405 nm, zato absorbanco merimo pri tej valovni

dolžini.

3.4.1. Vpliv različnih koncentracij substrata acetiltioholin klorida

Najprej smo 40 minut merili absorbanco pri 405 nm za t.i. endogeno reakcijo, pri čemer

smo ugotavljali, ali sam vzorec reagira z Ellmanovim reagentom, brez dodatka substrata

AChCl.


- 10 -

Reakcijsko mešanico smo pripravili po spodnji shemi:

100 l Ellmanovega reagenta

50 l vzorca ali 50 l K-P pufra (50 mM, pH 7.0) v primeru slepega vzorca

30 l K-P pufra (50 mM, pH 7.0)

Za pripravo 1 L Ellmanovega reagenta smo odtehtali 91 mg DTNB (Sigma) in 37.5 mg

natrijevega hidrogenkarbonata (Sigma), dodali 100 ml 250 mM K-P pufra in dolili

destilirano vodo (dH20) do oznake 1 L ter raztopili kemikalije s stresanjem.

Po 40 minutah merjenja smo dodali AChCl, z različnimi končnimi koncentracijami: 1, 3 in 5

mM. Dodali smo torej 20 l 10, 30 in 50 mM raztopin AChCl. Merili smo absorbanco pri

405 nm, 15 minut. Za vsako posamezno reakcijsko mešanico nanešeno na plošče, smo

napravili po 3 paralelne meritve.

V vsaki meritvi smo izmerili tudi reakcijo brez vzorca, samo z dodatkom 0, 1, 3 in 5 mM

AChCl, t.i. slepi vzorec.

3.4.2. Test inhibicije aktivnosti encima

V nadaljnjih poskusih nas je zanimalo, ali različni inhibitorji zavirajo delovanje AChE.

Pripravili smo reakcijsko mešanico, tako kot v poskusih z različnimi koncentracijami AChCl,

le da smo tu uporabili le AChCl, s končno koncentracijo 1 mM.

Najprej smo izvedli t.i. endogeno reakcijo, z reakcijsko mešanico po spodnji shemi:

100 l Ellmanovega reagenta (enaka koncentracija DTNB kot v točki 3.4.1.)

50 l vzorca ali 50 l K-P pufra (50 mM, pH 7.0) v primeru slepega vzorca

10 l K-P pufra (50 mM, pH 7.0)

Po 40 minutah smo nato dodali še: 20 l inhibitorja, potem pa še 20 l 10 mM AChCl.

Uporabili smo inhibitorje eserin, neostigmin bromid in poli APS. Pripravili smo raztopine

inhibitorja eserina in neostigmin bromida s končnima koncentracijama 0.1 in 0.01 mM ter

raztopine poli APS s končnimi koncentracijami 10, 1 in 0.1 g/mL. Redčitve smo delali v

K-P pufru (50 mM, pH 7.0).

Za kontrolni vzorec smo uporabili substrat AChCl s končno koncentracijo 1 mM, brez

dodatka inhibitorja.


- 11 -

a) PRIPRAVA RAZTOPIN ESERINA:

Najprej pripravimo 100 mM raztopino eserina, tako da zatehtamo 1.9 mg eserina v

69 l etanola. Nato iz te raztopine pripravimo 1 mM ter 0.1 mM raztopino eserina

v K-P pufru (50 mM, pH 7.0). Pri reakcijah smo dodali 20 l teh raztopin s

koncentracijo 1 in 0.1 mM in dobili končni koncentraciji 0.1 in 0.01 mM.

b) PRIPRAVA RAZTOPIN NEOSTIGMIN BROMIDA:

Najprej pripravimo 100 mM raztopino neostigmin bromida, tako da zatehtamo 8.9

mg neostigmin bromida v 293.7 l vode. Nato iz te raztopine pripravimo 1 mM ter

0.1 mM raztopino eserina v K-P pufru (50 mM pH 7.0). Pri reakcijah smo dodali 20

l teh raztopin s koncentracijo 1 in 0.1 mM in dobili končni koncentraciji 0.1 in

0.01 mM.

c) PRIPRAVA RAZTOPIN POLI APS:

Najprej iz založne raztopine poli APS s koncentracijo 1000 g/ml pripravimo 100

mM raztopino v K-P pufru (50 mM pH 7.0). Nato iz te raztopine pripravimo

raztopini s koncentracijo 10 g/ml in 1 g/ml. Pri reakcijah smo dodali 20 l teh

raztopin s koncentracijo 100, 10 in 1 mM in dobili končne koncentracije 10, 1 in

0.1 g/ml.

Pripravljene raztopine premešamo z vrtičnikom in hranimo na ledu.

3.4.3. Določanje količine proteinov

Supernatant, ki smo ga uporabili za kvantifikacijo encimske aktivnosti, je bil uporabljen za

kvantifikacijo vsebnosti proteinov. Uporabili smo metodo z reagenti BSA Protein Assay

(Pierce). Količino proteinov v supernatantu smo določili z umeritveno krivuljo, ki smo jo

preračunali iz absorpcije standardov z znano koncentracijo proteinov.

Za pripravo standardov smo uporabili založno raztopino govejega serumskega albumina

(BSA, Sigma). Iz založne raztopine z 200 mg/ml BSA smo z redčenjem z dH2O pripravili

standarde z 2, 1.5, 1, 0.75, 0.5, 0.25, 0.125 in 0 mg/ml BSA. Absorbanco standardov smo,

enako kot tisto od vzorcev, izmerili v treh paralelkah.

V treh paralelkah smo 20 μl supernatanta nanesli na mikrotitrsko ploščo in dodali 200 μl

mešanice reagentov A in B BSA Protein Assay (Pierce). Reagenta A in B sta bila zmešana v


- 12 -

razmerju 50:1, glede na navodila proizvajalca. Mikrotitrska plošča z vzorci je bila

inkubirana 30 minut na 37°C. Za slepi poskus je bila uporabljena dH2O. Absorbanco smo

izmerili na 562 nm valovne dolžine na čitalcu mikrotitrskih plošč BioTek CYTATION 3.


- 13 -

4. REZULTATI

4.1. AKTIVNOST ENCIMA ACETILHOLINESTERAZA V GOBAH

a) Endogena reakcija

Najprej smo izvedli endogeno reakcijo slepega vzorca, vzorca z vodotopno AChE in vzorca

s celokupno AChE. Vrednosti izmerjene absorbance prikazuje slika 2.

Pri slepem vzorcu so vrednosti enake in se v času skorajda ne spreminjajo ter so nižje od

vrednosti pri dodanih vzorcih. Vrednosti pri celokupni in vodotopni AChE pa nekoliko

naraščajo. Tako začetne kot končne vrednosti so za vodotopno AChE višje od tistih za

celokupno AChE.

Slika 2: Vrednosti absorbance v odvisnosti od časa pri endogeni reakciji

0.0000

0.0500

0.1000

0.1500

0.2000

0.2500

0.3000

0.3500

0.4000

0.4500

0.5000

30 90 150 210 270 330 390 450 510 570 630 690 750 810 870

Ab

sorb

anca

(A

40

5n

m)

Čas [s]

Slepi vzorec

CelokupnaAChE

VodotopnaAChE


- 14 -

b) reakcija po dodatku 1 mM AChCl

Po dodatku 1mM substrata AChCl izmerjene vrednosti absorbance, v primerjavi z

vrednostmi pri endogeni reakciji za celokupno in vodotopno AChE, bolj strmo naraščajo.

Pri slepem vzorcu ob dodatku substrata ne opažamo večjih sprememb. (Slika 3)

Slika 3: Vrednosti absorbance v odvisnosti od časa ob dodatku 1mM AChCl

0.0000

0.0500

0.1000

0.1500

0.2000

0.2500

0.3000

0.3500

0.4000

0.4500

0.5000

30

12

0

21

0

30

0

39

0

48

0

57

0

66

0

75

0

84

0

93

0

10

20

11

10

12

00

12

90

13

80

14

70

15

60

16

50

17

40

Ab

sorb

anca

(A

40

5n

m)

Čas[s]

Slepi vzorec

CelokupnaAChE

VodotopnaAChE


- 15 -

4.2. VPLIV RAZLIČNIH KONCENTRACIJ SUBSTRATA

Meritve smo izvedli še z različnimi koncentracijami substrata: 0, 1, 3 in 5 mM. Tako pri

vzorcih z vodotopno AChE (slika 4) kot celokupno AChE (slika 5) smo opazili, da višje kot

so koncentracije dodanega substrata, višje so spremembe vrednosti absorbance (večji je

naklon krivulje).

Slika 4: Vrednosti absorbance za vodotopno AChE pri dodatku 0, 1, 3 in 5 mM AChCl

Slika 5: Vrednosti absorbance za celokupno AChE pri dodatku 0, 1, 3 in 5 mM AChCl

0.2000

0.2500

0.3000

0.3500

0.4000

0.4500

0.5000

30

15

0

27

0

39

0

51

0

63

0

75

0

87

0

99

0

11

10

12

30

13

50

14

70

15

90

17

10

18

30

19

50

20

70

21

90

23

10

Ab

sorb

anca

(A

405n

m)

Čas [s]

0mM

1mM

3mM

5mM

0.2000

0.2500

0.3000

0.3500

0.4000

0.4500

0.5000

30

15

0

27

0

39

0

51

0

63

0

75

0

87

0

99

0

11

10

12

30

13

50

14

70

15

90

17

10

18

30

19

50

20

70

21

90

23

10

Ab

sorb

anca

(A

405

nm

)

Čas [s]

0mM

1mM

3mM

5mM


- 16 -

Vrednosti absorbance ob dodatku 1, 3 in 5 mM AChCl linearno naraščajo; izjema so vzorci,

kjer substrata nismo dodali – tam se vrednosti ne spreminjajo oz. nekoliko padajo.

Specifična aktivnost vodotopne AChE (slika 6) se ob dodatku 1 mM AChCl ne razlikuje od

specifične aktivnosti encima, kjer substrata nismo dodali oz. se celo nekoliko zniža v

primeru celokupne AChE (slika 7). Specifična aktivnost vodotopne AChE narašča z

naraščajočo koncentracijo dodanega substrata (slika 6). Enako velja za vzorec celokupne

AChE (slika 7). Specifični aktivnosti vodotopne in celokupne AChE sta primerljivi.

Slika 6: Specifična aktivnost vodotopne AChE ob dodatku 0, 1, 3 in 5 mM AChCl. Prikazana je povprečna vrednost treh meritev in ustrezajoča standardna deviacija

Slika 7: Specifična aktivnost celokupne AChE ob dodatku 0, 1, 3 in 5 mM AChCl. Prikazana je povprečna vrednost treh meritev in ustrezajoča standardna deviacija

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

0 1 3 5

Spe

cifi

čna

akti

vno

st e

nci

ma

[nm

ol/

mg*

min

]

Koncentracija AChCl [mM]

Aktivnost encima

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

0 1 3 5

Spe

cfič

na

akti

vno

st e

nci

ma

[nm

ol/

mg*

min

]

Koncentracija AChCl [mM]

Aktivnost encima


- 17 -

4.3. VPLIV INHIBITORJEV NA AKTIVNOST

Meritve smo izvedli še z dodatkom inhibitorjev različnih koncentracij, z 1 mM AChCl, da bi

ugotovili, ali ti zavirajo delovanje encima. Izmerjene vrednosti absorbance za vodotopno

AChE (slika 8) in celokupno AChE (slika 9), ob dodatku eserina in neostigmin bromida

kažejo, da inhibitorja s koncentracijo 0.01 in 0.1 mM, ne zavirata njegovega delovanja.

Slika 8: Vrednosti absorbance vodotopne AChE ob dodatku inhibitorjev eserina in neostigmin bromida

Slika 9: Vrednosti absorbance celokupne AChE ob dodatku inhibitorjev eserina in neostigmin bromida

0.1500

0.2000

0.2500

0.3000

0.3500

0.4000

0.4500

0.5000

30

18

0

33

0

48

0

63

0

78

0

93

0

10

80

12

30

13

80

15

30

16

80

18

30

19

80

21

30

22

80

Ab

sorb

anca

[A

405n

m]

Čas [s]

0.1 mM eserin

0.01 mM eserin

0.1 mM neostigminbromid


Vzorec brezinhibitorjev

0.1500

0.2000

0.2500

0.3000

0.3500

0.4000

0.4500

0.5000

30

18

0

33

0

48

0

63

0

78

0

93

0

10

80

12

30

13

80

15

30

16

80

18

30

19

80

21

30

22

80

Ab

sorb

anca

[A

405n

m]

Čas [s]

0.1 mM eserin

0.01 mM eserin


0.01 mMneostigmin bromid

Vzorec brezinhibitorjev


- 18 -

Tudi ob dodatku inhibitorja poli APS vrednosti absorbance pri vodotopni AChE (slika 10) in

celokupni AChE (slika 11) kažejo na to, da poli APS pri nobeni izmed uporabljenih

koncentracij, ne inhibira delovanja encima.

Slika 10: Vrednosti absorbance vodotopne AChE ob dodatku inhibitorja poli APS

Slika 11: Vrednosti absorbance celokupne AChE ob dodatku inhibitorja poli APS

0.1500

0.2000

0.2500

0.3000

0.3500

0.4000

0.4500

0.5000

30

15

0

27

0

39

0

51

0

63

0

75

0

87

0

99

0

11

10

12

30

13

50

14

70

15

90

17

10

18

30

19

50

20

70

21

90

23

10

Ab

sorb

anca

[A

405n

m]

Čas [s]

10 ug/mL

1 ug/mL

0.1 ug/mL

0 ug/mL

0.1500

0.2000

0.2500

0.3000

0.3500

0.4000

0.4500

0.5000

30

15

0

27

0

39

0

51

0

63

0

75

0

87

0

99

0

11

10

12

30

13

50

14

70

15

90

17

10

18

30

19

50

20

70

21

90

23

10

Ab

sorb

anca

[A

405

nm

]

Čas [s]

10 ug/mL

1 ug/mL

0.1 ug/mL

0 ug/mL


- 19 -

5. RAZPRAVA

V diplomskem delu smo proučevali aktivnost encima AChE v vzorcu gobe bukovega

ostrigarja (Pleurotus ostreatus), ob dodatku različnih koncentracij substrata AChCl in

različnih inhibitorjev. Zanimalo nas je, kako na aktivnost encima vpliva koncentracija

uporabljenega substrata ter v kolikšni meri različni inhibitorji zavirajo delovanje encima.

V skladu s podatki iz literature in opravljenih meritev smo prišli do naslednjih ugotovitev.

5.1. AKTIVNOST ENCIMA ACETILHOLINESTERAZE V GOBAH

a) Endogena reakcija

Vrednosti absorbance v vzorcih so višje od tistih pri slepem vzorcu, saj endogena reakcija

nakazuje, da so v vzorcu prisotne SH skupine, ki jih ima veliko proteinov.

b) Reakcija po dodatku 1mM AChCl

Po dodatku 1 mM substrata AChCl so vrednosti absorbance v vzorcih bolj strmo naraščale,

kar pomeni, da se v vzorcu nahaja encim, ki je povzročil razgradnjo substrata. Sklepamo,

da smo pomerili encim AChE.

5.2. VPLIV RAZLIČNIH KONCENTRACIJ SUBSTRATA

Ob povišanih koncentracijah substrata, spremembe absorbance linearno naraščajo, kar

pomeni, da na aktivnost encima vpliva koncentracija dodanega substrata. Izmerjene

koncentracije so zelo nizke oziroma komaj zaznavne v primerjavi z drugimi organizmi, npr.

1000x manjše od AChE v glavah čebel (Boily in sod., 2013).

Predlagamo nadaljevanje študije z uporabo drugih analognih substratov, kot sta

propionilholin klorid in butirilholin klorid.

5.3. VPLIV INHIBITORJEV NA AKTIVNOST

Zanimalo nas je, ali se v našem vzorcu res nahaja encim AChE, zato smo vzorcem dodali

inhibitorje eserin, neostigmin bromid in poli APS, ki so specifični inhibitorji tega encima

(Houghton in sod., 2006). Za kontrolo smo vzeli vzorec brez dodanega inhibitorja, z 1 mM

koncentracijo substrata AChCl. Vrednosti kontrolnega vzorca in vzorcev AChE z dodanimi

inhibitorji, se ne razlikujejo, vrednosti absorbance pa se kljub dodatku inhibitorjev

povečujejo, kar pomeni, da se substrat porablja. Predvidevamo, da nobeden od

inhibitorjev ne zavira delovanja encima pri 1 mM koncentraciji AChCl. Predlagamo


- 20 -

nadaljnje študije z večjimi koncentracijami AChCl, kjer bo osnovna aktivnost AChE večja in

bo tako možno spremljati inhibicijo encima z dodanimi inhibitorji.

Delovanje ChE pri vretenčarjih je sicer zavrto pri koncentracijah 10 m fizostigmina (Usdin

in Karczmar, 1970), kar ustreza najnižji koncentraciji eserina, ki smo ga uporabili – 0.01

mM, a ta ne velja za inhibicijo AChE v glivah. Poskusili smo tudi z višjo koncentracijo, a ta

ni povzročila inhibicije encima. Encimu AChE, izoliranem iz govejih eritrocitov, se ob

dodatku različnih koncentracij eserina pri 1 mM koncentraciji substrata, aktivnost ravno

tako ni bistveno spremenila (Winteringham in Fowler, 1966), kar pomeni, da eserin na to

vrsto AChE ne deluje zaviralno.

Grandič in sod. (2012) navajajo, da pri nizkih koncentracijah neostigmina (1 m),

uporabljenega na vzorcu mladih miši, ta ni popolnoma inhibiral AChE aktivnosti. Čeprav

smo v našem vzorcu uporabili višje koncentracije neostigmina (0.01 ter 0.1 mM), ta ni

inhibiral aktivnosti AChE.

Inhibitor APS 12-2 je sintetičen polimer z molsko maso 14.7 kDa, ki je strukturno analogen

naravnemu polimeru poli APS in na aktivnost encima AChE vpliva že v nanomolarnih

koncentracijah preko delovanja na periferno anionsko mesto (Sepčič in sod., 1998). Tudi

ob uporabi tega inhibitorja nismo opazili inhibicije encimske aktivnosti v naših ekstraktih.


- 21 -

6. SKLEPI

V vzorcu bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus) je mogoče zaznati aktivnost encima

acetilholinesteraze, če kot substrat uporabimo acetiltioholin klorid.

Aktivnost encima je odvisna od koncentracije substrata acetiltioholin klorida. Pri višjih

koncentracijah je aktivnost encima višja.

Inhibitorji eserin, neostigmin bromid in poli APS pri 1 mM koncentraciji dodanega

substrata acetiltioholin klorida, ne zavirajo aktivnosti encima, ker je aktivnost pri tej

koncentraciji substrata že v osnovi zelo nizka.


- 22 -

7. POVZETEK

Acetilholinesteraza (AChE) je encim, ki na postsinaptični membrani razgradi acetilholin

(ACh) in s tem prekine prenos živčnega signala. Encim se nahaja v holinergičnih sinapsah,

prisotnost ACh pa so dokazali tudi v tkivih, ki niso povezana z živčnim sistemom. Šibka

sinteza ACh je bila zaznana tudi v vzorcih gliv iz debla Basidiomycota, a je zaradi

odsotnosti živčnih sinaps v gobah pričakovati, da ti organizmi nimajo encima AChE.

Zanimalo nas je, ali je v vodnem ekstraktu gobe bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus)

mogoče zaznati aktivnost AChE, če kot substrat uporabimo acetiltioholin klorid (AChCl). Z

dodatkom različnih koncentracij substrata in različnih inhibitorjev, smo želeli proučiti, v

kolikšni meri ti vplivajo na aktivnost encima.

Delo je potekalo v laboratoriju na Katedri za biokemijo na Oddelku za biologijo

Biotehniške fakultete v Ljubljani. S spektrofotometrično metodo po Ellmanu smo

proučevali aktivnost AChE, pri čemer smo opravili meritve absorbance pri 405 nm ter iz

dobljenih vrednosti izračunali aktivnost encima. Pomerili smo tudi koncentracijo

proteinov v vzorcih.

Uspeli smo dokazati aktivnost encima AChE v vzorcih bukovega ostrigarja. Aktivnost je

lineano naraščala s povečevanjem koncentracije substrata AChCl. Pri koncentraciji 1 mM

AChCl inhibitorji eserin, neostigmin bromid in poli APS ne zavirajo aktivnosti encima.

Predlagamo nadaljnje študije z drugimi substrati, ki vsebujejo tioholin ter študije inhibicije

encima pri višjih koncentracijah substrata acetiltioholin klorida.

Ključne besede: bukov ostrigar, Pleurotus ostreatus, acetilholinesteraza, inhibicija


- 23 -

8. VIRI IN LITERATURA VSEBINE

Berg, J.M., Tyzmoczko, J.L., &Stryer, L. (2002). Biochemistry. New York: W.H. Freeman.

Bhadauria V., Zhao W.S., Wang L.X., Zhang Y., Liu J.H., Yang J., Kong L.A., Peng Y.L. (2007).

Advances in fungal proteomics. Microbiological Research, 162, 93–200. doi:

10.1016/j.micres.2007.03.001

Boily, M., Sarrasin, B., Deblois, C., Aras, P., Chagnon, M. (2013). Acetycholinesterase in

honey bees (Apis mellifera) exposed to neonicotinoids, atrazine and glyphosate:

laboratoy and field experiments. Environ. Sci. Pollur. Res. Int. 20(8), 5603-5614.

doi: 10.1007/s11356-013-1568-2

Burns, Richard G., DeForest, Jared L., Marxsen, Jürgen, Sinsabaugh, Robert L.,

Stromberger, MaryE., Wallenstein, Matthew D., Weintraub, Michael N., Zoppini,

Annamaria (2013). Soil enzymes in a changing environment: Current knowledge

and future directions. Soil Biology and Biochemistry, 58, 216–234.

Downes, G.B, Granto, M. (2004). Acetylcholinesterase function is dispensable for sensary

neurite growth but is critical for neuromuscular synapse stability. Dev Bio. 270,

232 – 245.

Eger, G., Eden, G. & Wissig, E. (1976). Pleurotus ostreatus – breeding potential of a new

cultivated mushroom. Theoretical and Applied Genetics, 47, 155–163.

Ellman, L.G., Courtney, K.D., Andres Jr., V., Featherstone, R.M. (1961). A new and rapid

colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemical

Pharmacology, 7(2), 88–95.

Giardina, P., Fontanella, B., Rivieccio, V., Sannia, G. (2000). Manganase peroxidase

isoenzymes produced by Pleurotus ostreatus grown on wood sawdust. Archives of

Biochemistry and Biophyics, 376, 171-179.

Grandič, M., Araoz, R., Molgo, J., Turk, T., Sepčić, K., Benoit,. E, Frangež, R. (2013). Toxicity

of the synthetic polymeric 3- alkylpyridinium salt (APS3) is due to specific block of

nicotinic acetylcholine receptors. Toxicology. 303, 25-33.

Harel, M., Sussman, J.L., Krejci, E. (1992). Conversion of acetylcholinesterase to

butyrylcholinesterase: modeling and mutagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 89

(22), 10827–10831.

Horiuchi, Y., Kimura, R., Kato, N., Fujii, T., Seki, M., Endo, T.,Kato, T., Kawashima, K.

(2003). Evolutional study on acetylcholine expression. Life Sciences. 72, 1745–

1756.


- 24 -

Houghton, J. P., Ren, Y., Howes, J. M. (2006). Acetylcholinesterase inhibitors from plants

and fungi. Natural product reports, 23(2), 181-199.

Karczmar,G. A. (2010). Cholinesterases (ChEs) and the cholinergic system in ontogenesis

and phylogenesis, and non-classical roles of cholinesterases—A review. Chemico-

Biological Interactions, 187(1-3),34-43.

Kirk P., Cannon P., Minter D., Stalpers J. (2010). Dictionary of the fungi. 10. izdaja. Oxon.

CABI

Massoulié, J., Pezzementi, L., Bon, S., Krejci, E., Vallette, F.M. (1993). Molecular and

cellular biology of cholinesterase. Prog. Neurobiol. 41, 31–91.

Mikhailova, R.V., Lobanok, A.G., Zakharenko, I.N. (1996). Specific esterases of Aspergillus

and Fusarium Fungi. Applied Biochemistry and Microbiology, 33(5), 437-440.

Nakamura, T., Ikedia, T., Shimokaura, I. (1994). Distribution of acetylcholinesterase

actively in the rat embryonic heart with reference to HNK 1 immunoreactivity in

the conduction tissue. Anat Embryol. 190, 367 –373.

Nelson, D. L., Lehninger, A. L., & Cox, M. M. (2008). Lehninger principles of biochemistry.

New York: W. H. Freeman.

Rebolj, K., Sepčić, K. (2008). Ostreolysin, a Cytolytic Protein from Culinary-Medicinal

Oyster Mushroom Pleurotus ostreatus (Jacq.:Fr.) P.Kumm. (Agaricomycetideae),

and Its Potential Use in Medicine and Biotechnology. International Journal of

Medicinal Mushrooms, 4, 293-302.

Robaire, B., Kato, G. (1973). Some differences between soluble and membrane-bound

acetycholinesterase from Electrophorus electricus. Febs letters. 38(1), 1-4.

Rosenberry, T.L. (1975). Acetylcholinesterase. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 43, 103–

218.

Roshchina, V.V. (2016). New trends and perspectives in the evolution of

neurotransmitters in microbial, plant, and animal cells. Microbial Endocrinology:

Interkingdom Signaling in Infectious Disease and Health, Advances in Experimental

Medicine and Biology, 874, 25-77. doi: 10.1007/978-3-319-20215-0_2

Sepčić, K., Marcel, V., Klaebe, A., Turk, T., Šuput, D., Fournier, D. (1998). Inhibition of

acetylcholinesterase by an alkylpyridinium polymer from the marine

sponge, Reniera sarai. Biochim Biophys Acta. 1387, 217-225.

Silman, I., Futerman, A.H. (1987). Modes of attachment of acetylcholinesterase to the

surface membrane. Eur J Biochem. 170. 11–22.

Soreq, H., Seidman, S. (2001). Acetylcholinesterase – new roles for an old actor. Nat Rev

Neurosci. 2, 294 -302.


- 25 -

Stamets, E. P. (2005). Notes on nutritional properites of culinary - medicinal mushrooms.

International journal of medicinal mushrooms, 7(1-2), 103-110.

doi: 10.1615/IntJMedMushr.v7.i12.100

Stojan, J., Stojan, R., Stojan, Ž. (2008). Holin-esteraze:struktura, delovanje ter inhibicija z

naravnimi in sintetičnimi strupi. Med razgl. 47, 293-307.

Sussman, J.L. , Dvir, H., Silman, I., Harel, M., Rosenberry, L. T. (2010). Acetycholinesterase:

From 3D structure to function. Chem Biol Interact. 187(1-3), 10-22. doi:

10.1016/j.cbi.2010.01.042

Tehrani, M.H.H., Elham, F., Nejad, M.H.K., Mehregan, H., Hakemi-Valac, M. (2012).

Search for Proteins in the Liquid Extract of Edible Mushroom, Agaricus bisporus,

and Studying their Antibacterial Effects. Iranian Journal of Pharmaceutical

Research, 11 (1), 145-150.

Turk, T., Sepčić, K., Mancini, I., Guella, G. (2008). 3-Alkylpyridinium and 3-alkylpyridine

compounds from marine sponges, their synthesis, biological activites and potential

use. Atta-ur-Rahman, Studies in natural product Chemistry; Bioactive natural

products (Part O), Studies in natural products chemistry. 35, 355-397.

Usdin, E., Karczmar, A.G. (1970). Anticholinesterase Agents. Oxford: Pergamon Press. 61

Winteringham, F.P.W., Fowler, K.S. (1966). Substrate and dilution effects on the inhibition

of acetylcholinesterase by carbamates. Biochem. J. 101, 127-135.

9. VIRI SLIK

3D structure AChE. (n.d.). Retrieved August 18, 2016, from

http://annalsofneurosciences.org/journal/index.php/annal/article/viewArticle/95/

200#F1

http://dx.doi.org/10.1016%2Fj.cbi.2010.01.042

ZAHVALA

Najprej bi se rada zahvalila moji mentorici doc. dr. Aniti Jemec, ki me je usmerjala tako pri

laboratorijskem delu, kot pri pisanju diplomskega dela. Hvala za vso pomoč, napotke in

nasvete.

Zahvala gre tudi Alenki Malovrh, ki mi je bila v veliko pomoč pri laboratorijskem delu.

Posebna zahvala pa gre tudi mojemu fantu in domačim, ki so mi ves čas stali ob strani in

me spodbujali v času študija.

univerza v ljubljani -...

Documents