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UNIVERSIDAD TEacuteCNICA PARTICULAR DE LOJA La Universidad Catoacutelica de Loja
TITULACIOacuteN DE INGENIERO EN GESTIOacuteN AMBIENTAL
Determinacioacuten de patrones proteiacutecos durante el proceso de deshidratacioacuten en semillas de diferente comportamiento de
conservacioacuten
Trabajo de fin de Titulacioacuten
Autor
Loayza Jaramillo Freddy Javier
Director
Romero Saritama Joseacute Miguel Ing
Loja ndash Ecuador
2012
I
Certificacioacuten Ing Joseacute Miguel Romero Saritama DIRECTOR DEL TRABAJO DE FIN DE TITULACIOacuteN CERTIFICA Que el presente trabajo de investigacioacuten denominado ldquoDeterminacioacuten de patrones proteicos durante el proceso de deshidratacioacuten en semillas de diferente comportamiento de conservacioacutenrdquo realizado por el profesional en formacioacuten Freddy Javier Loayza Jaramillo cumple con los requisitos establecidos en las normas generales para la Graduacioacuten en la Universidad Teacutecnica Particular de Loja tanto en el aspecto de forma como de contenido por lo cual me permito autorizar su presentacioacuten para los fines pertinentes Loja 18 de Julio del 2012 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Ing Joseacute Miguel Romero Saritama CI
II
Cesioacuten de derechos Yo (Freddy Javier Loayza Jaramillo) declaro ser autor del presente trabajo y eximo expresamente a la Universidad Teacutecnica Particular de Loja y a sus representantes legales de posibles reclamos o acciones legales Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposicioacuten del Art 67 del Estatuto Orgaacutenico de la Universidad Teacutecnica Particular de Loja que en su parte pertinente textualmente dice ldquoForman parte del patrimonio de la Universidad la propiedad intelectual de investigaciones trabajos cientiacuteficos o teacutecnicos de tesis de grado que se realicen a traveacutes o con el apoyo financiero acadeacutemico o institucional (operativo) de la Universidadrdquo f Freddy Javier Loayza Jaramillo CI 0704368141
III
DECLARACIOacuteN DE AUTORIacuteA
ldquoLas ideas conceptos procedimientos y resultados vertidos en el presente trabajo son de exclusiva responsabilidad de su autorrdquo
Nombre del autor Firma
Freddy Javier Loayza Jaramillo ----------------------------------
IV
DEDICATORIA
Dedico este trabajo a Dios que siempre ha estado iluminando mi camino para poder ser un hombre de bien y poder terminar este difiacutecil proyecto A mi amada esposa Estefaniacutea Intildeiguez quien ha sido mi pilar para seguir adelante en los momentos maacutes difiacuteciles de este largo camino gracias por tu amor incondicional sin ti no lo habriacutea logrado A mi amado hijo Cristopher Matiacuteas Loayza quien es la razoacuten de mi existir y de mi superacioacuten Con profundo amor y agradecimiento a mis padres Vilma Jaramillo y Freddy Loayza por su amor y apoyo incondicional A mi hermana Andrea Loayza que siempre ha estado cuando maacutes la he necesitado A mis abuelitos Mariana Jaramillo y Rauacutel Jaramillo quienes han sido mas que unos padres para mi y gracias a ellos soy la persona que conocen ahora Y a todos mis tiacuteos y tiacuteas quienes me ayudaron a formarme Y una dedicatoria especial a mis queridos suegros Esmeralda Coacuterdova y Lauro Intildeiguez quienes me brindaron su apoyo incondicional en las buenas y malas les debo tanto y espero alguacuten diacutea poder retribuir a tanto iexclLos Amo
Freddy Javier Loayza Jaramillo Nombre del autor
V
AGRADECIMIENTOS A la Universidad Teacutecnica Particular de Loja al personal docente de la carrera de Gestioacuten Ambiental que con sus ensentildeanzas han contribuido a mi formacioacuten como profesional Al Banco de Germoplasma del Departamento de Ciencias Naturales por contribuir en mis conocimientos como estudiante y brindarme el apoyo en la realizacioacuten de mi proyecto de fin de carrera Al Ing Joseacute Miguel y las personas que forman el Instituto de Ecologiacutea por su constante apoyo y orientacioacuten en la realizacioacuten de mi trabajo Y un agradecimiento especial a mis Padres Suegros y Esposa por motivarme y apoyarme a seguir con mis estudios y ser mis pilares para cumplir con mis metas iexclGracias
Freddy Javier Loayza Jaramillo
VI
INDICE
Iacutendice de contenidos
CERTIFICACIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipI CESIOacuteN DE DERECHOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipII AUTORIAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIII DEDICATORhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIV AGRADECIMIENTOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipV INDICE DE CONTENIDOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipVI
RESUMENhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIX ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipX INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1 METODOLOGIacuteAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4 RESULTADOS Y DISCUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8 CONCLUCIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21 RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip22
BIBLIOGRAFIAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23 ANEXOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28
VII
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5
VIII
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Especies en estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4 Figura 2 Procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
IacuteNDICE DE GRAFICAS
Grafica 1 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8
Grafica 2 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip9
Grafica 3 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9
Grafica 4 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip10
Grafica 5 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Grafica 6 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip12
Grafica 7 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
Grafica 8 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
Grafica 9 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphellip15
Grafica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16
Grafica 11 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
Grafica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
Grafica 13 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18
Grafica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18
Grafica 15 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip19
Grafica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
IX
Grafica 17 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
Grafica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
Grafica 19 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
IX
RESUMEN
Las semillas como todo ser vivo tienen proteiacutenas las cuales son de gran
importancia para el normal funcionamiento de estas un procedimiento para
determinar la concentracioacuten de proteiacutenas en las semillas es el anaacutelisis
Bradford La peacuterdida neta de proteiacutenas en las semillas estaacute relacionado con
el envejecimiento por causa de la deshidratacioacuten El objetivo de este estudio
fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes niveles de humedad en
semillas con diferente comportamiento de conservacioacuten y determinar la
tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco especies
Los resultados mostraron que Lafoencia acuminata y Senna alata tienen una
tendencia de comportamiento ortodoxo mientras que Coccoloba ruiziana
presentoacute un comportamiento intermedio y en Myrtus communis y Capparis
flexuosa estas mostraron tendencia a un comportamiento recalcitrante
Cuatro especies presentaron concentraciones similares de proteiacutenas en las
semillas que van desde 0042 hasta las 6488 ugml excepto Myrtus
communis que presentoacute 177343 12919 y 16455 ugml proteiacutenas en los
niveles 25 20 y 10 de humedad respectivamente durante la deshidratacioacuten
no existiendo correlacioacuten entre cantidad de proteiacutenas y niveles de humedad
en las semillas
Palabras clave Proteiacutenas totales semillas ortodoxas semillas
recalcitrantes semillas intermedias Anaacutelisis bradford deshidratacioacuten
semillas
X
SUMMARY
The seeds are like all living proteins which are important for the normal
functioning of these a method for determining protein concentration in seed is
the Bradford analysis The net loss of the proteins in the seeds is related to
aging caused by dehydration The objective of this study was to quantify total
protein at various levels of moisture in different seed storage behavior and
determine the desiccation tolerance of the five species
The results showed that Senna alata Lafoencia acuminata and have a
tendency of orthodox behavior while Coccoloba ruiziana presented an
intermediate behavior and in the case of Myrtus communis and Capparis
flexuosa these tended to recalcitrant behavior Four species showed similar
concentrations of protein in seeds ranging from 0042 to the 6488 ug ml
except Myrtus communis presented 177343 12919 and 16455 ug ml
protein at levels 25 20 and 10 humidity respectively for the dehydration no
correlation exists between protein and moisture levels in the seeds
Keywords Total protein orthodox seeds recalcitrant seeds seeds
intermediate bradford Analysis dehydration seeds
1
INTRODUCCIOacuteN
En las semillas como en todo ser vivo existen proteiacutenas las cuales son de
gran importancia para el normal funcionamiento de estas en algunas
especies (Beevers amp Poulson 1992) Ellas constituyen maacutes del 50 del peso
seco de la ceacutelula las proteiacutenas maacutes comunes que encontramos en las
semillas son las globulinas albuminas prolaminas y proteiacutenas de
almacenamiento (Nielsen et al 1995) Ciertas cantidades de eacutestas se
acumulan en un corto periacuteodo de tiempo durante el desarrollo de la semilla
en muchas especies Las proteiacutenas de almacenamiento las prolaminas las
globulinas y las albuminas se acumulan poco en especies sin embargo
constituyen una alta proporcioacuten de la proteiacutena total de la semilla madura
(Laurie amp Robert 1990)
Estudios realizados con diferentes especies de semillas como por ejemplo
en el olivo y soja han demostrado que las proteiacutenas de reserva se
almacenan en el embrioacuten y el endospermo (Bawley amp Black 1994) Las
proteiacutenas de reserva en embriones y ceacutelulas vegetativas son sintetizadas
durante el desarrollo de la semilla e hidrolizadas durante la maduracioacuten
imbibicioacuten y germinacioacuten de estas proporcionando una de las principales
fuentes de carbono nitroacutegeno y azufre para el subsiguiente crecimiento y
desarrollo Estas proteiacutenas de reserva en ceacutelulas vegetativas proporcionan
una base para las semillas y frutos durante el crecimiento reproductivo y
para una raacutepida expansioacuten de las estructuras vegetativas despueacutes del
periodo de dormancia durante la germinacioacuten (Bawley amp Black 1994)
Un procedimiento para la determinacioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas en
las semillas es el anaacutelisis Bradford que consiste en la unioacuten de un colorante
Comassie Blue G-250 a las proteiacutenas Las proteiacutenas se unen a la forma azul
para formar un complejo proteiacutena-colorante con un coeficiente de extincioacuten
mayor que el colorante libre Este meacutetodo es sensible (1-15 μg) simple
raacutepido barato y pocas sustancias interfieren en su determinacioacuten como los
detergentes y las soluciones baacutesicas (Bradford 1976 Fernaacutendez 2007)
La peacuterdida neta de las proteiacutenas en las semillas es quizaacutes el deterioro maacutes
baacutesico de todos los eventos relacionados con el envejecimiento por causa de
la deshidratacioacuten ya que estos cambios podriacutean ser la base de todos los
demaacutes aspectos de la disminucioacuten del metabolismo La disminucioacuten en el
contenido de proteiacutenas por envejecimiento de las semillas puede ser debido
2
a 1) un dantildeo extenso en la siacutentesis de proteiacutenas reportado en diferentes
sistemas del cultivo (Hallman et al 1973) una germinacioacuten reducida o
semillas no viables en el aacuterbol (Espiacutendola et al 1994) oacute 2) la siacutentesis o la
activacioacuten de grandes cantidades de enzimas proteoliacuteticas durante el
deterioro de la semilla (Bewley amp Negro 1982)
La deshidratacioacuten es el procedimiento maacutes delicado en el tratamiento de las
semillas y uno de los problemas maacutes difiacuteciles de la conservacioacuten ex situ Es
necesario efectuar un seguimiento continuo de la deshidratacioacuten porque las
distintas etapas del desarrollo de las semillas estaacuten condicionadas por
factores mecaacutenicos quiacutemicos morfoloacutegicos y fisioloacutegicos que pueden
favorecer su germinacioacuten pero tambieacuten determinar la dormicioacuten Cada tipo
de semilla pasa por un proceso diferente de deshidratacioacuten que si se efectuacutea
mal puede comprometer la viabilidad de la misma (Genmedoc 2005)
La semilla es uno de los principales recursos para el manejo agriacutecola y
silviacutecola de las poblaciones vegetales para la reforestacioacuten para la
conservacioacuten del germoplasma vegetal y para la recuperacioacuten de especies
valiosas sobrexplotadas Eacutestas pueden almacenarse vivas por largos
periodos aseguraacutendose asiacute la preservacioacuten de especies y variedades de
plantas valiosas (Trujillo 1990) Para poder almacenar las semillas a largo
plazo es necesario que primero pasen por un proceso de deshidratacioacuten
pero lamentablemente todas las semillas difieren en su tolerancia a la
desecacioacuten Seguacuten este paraacutemetro las semillas se pueden clasificar en
ortodoxas recalcitrantes e intermedias (Farrant et al 1993) Las semillas
ortodoxas toleran una deshidratacioacuten hasta de 5 en el contenido de
humedad por su parte las semillas que toleran la deshidratacioacuten entre 10 y
125 de contenido de humedad se consideran intermedias y las que toleran
la deshidratacioacuten entre 15 y 50 de humedad se denominan recalcitrantes
(Farrant et al 1993 Gentil 2001)
En la mayoriacutea de especies recalcitrantes la reduccioacuten de humedad produce
una reduccioacuten de la germinacioacuten (Floriano 2004) un ejemplo claro es la
especie Quercus nigra que cuando su contenido de humedad baja al 30
la germinacioacuten se anula tal y como han puesto de manifiesto de Zulueta amp
Montoto (1992) Otro ejemplo que se da en las semillas recalcitrantes es la
familia del cafeacute el contenido de humedad miacutenimo que toleran las semillas de
C arabica C canephora y C liberica sin reducir su viabilidad es de
aproximadamente 9 11 y 24 respectivamente (Gentil 2001 amp Eira et al
2006) con reduccioacuten en la viabilidad a bajas temperaturas (Gentil 2001) a
diferencia de las semillas de C costatifructa C racemosa y C sessiliflora las
cuales mostraron un nivel criacutetico de humedad de semilla de 19 30 y 30
respectivamente (Dussert et al 1998)
3
Las semillas Ortodoxas sufren deterioro en su viabilidad pero a una tasa
inferior que las semillas recalcitrantes En estas los cambios en las reservas
de alimento almacenado parecen no afectar la viabilidad o vigor de la semilla
(Black M 1992) Un ejemplo claro de esto es la especie Cratylia argentea la
cual fue sometida a niveles de deshidratacioacuten del 10 8 y 6 siendo su
viabilidad del 95 86 y 76 respectivamente (Montoya amp Bonilla 2009)
El objetivo de este estudio fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes
niveles de humedad en semillas con diferente comportamiento de
conservacioacuten y determinar la tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco
especies
4
METODOLOGIA
COLECCIOacuteN DE MATERIAL
Se colectaron semillas maduras de las siguientes especies Lafoensia
acuminata (Ruiz y Pav) (Lythraceae) Senna alata (L) Roxb
(Cesalpinaceae) Coccoloba ruiziana (Lindau) (Polygonaceae) Myrtus
communis (Linneo) (Myrtaceae) y Capparis flexuosa (Linneo)
(Capparaceae) (figura 1) distribuidas en la provincia de Loja Las semillas
fueron transportadas al laboratorio del Banco de Germoplasma de la
Universidad Teacutecnica Particular de Loja en fundas de tela para evitar una
deshidratacioacuten previa
a b c
d e
Figura 1 Semillas de las cinco especies en estudio a) Lafoensia acuminata b) Senna alata c) Coccoloba ruiziana d) Myrtus communis e) Capparis flexuosa
CONTENIDO DE HUMEDAD
Colectadas la semillas se procedioacute a calcular en el laboratorio el porcentaje de humedad inicial de las mismas para ello se utilizaron dos reacuteplicas de 10 o 20 semillas (dependiendo del tamantildeo) el meacutetodo realizado fue de secado en estufa a temperatura baja y constante 103 degC por 17 horas (ISTA 2005) finalizado el procedimiento se utilizoacute la siguiente foacutermula para calcular el porcentaje de humedad
5
Formula (CH= pi-pfpi times 100) CH= Contenido de Humedad pi= peso inicial pf= peso final
DESHIDRATACIOacuteN DE SEMILLAS Determinado el contenido de humedad inicial de las semillas se determinoacute los diferentes porcentajes de humedad a deshidratar (tabla 1) en base al protocolo ldquoHANDLING OF DESICCATION AND TEMPERATURE SENSITIVE TREE SEEDSldquo establecido por ldquoThomsenrdquo (2000) Las semillas fueron colocadas en frascos de vidrio hermeacuteticos con gel de siacutelice como deshidratante Las semillas fueron pesadas cada 20 minutos durante el primer diacutea y en los posteriores diacuteas la toma de datos se realizoacute de una a dos veces durante el diacutea hasta que las semillas alcanzaron el peso y porcentaje de deshidratacioacuten deseado Tabla 1
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados para
las semillas de las especies en estudio
Especie CH inicial CH a deshidratar
Lafoensia acuminata 1237 129632
Senna alata 125 129632
Coccoloba ruiziana 2144 2015129632
Myrtus communis 35 3025201510532
Capparis flexuosa 45 4030201096532
VIABILIDAD DE SEMILLAS Para determinar la tolerancia a la desecacioacuten se evaluoacute la viabilidad de las semillas expresada en tiempo y porcentaje de germinacioacuten en cada nivel de deshidratacioacuten alcanzado para cada especie Para los ensayos de germinacioacuten se utilizo dos reacuteplicas de 25 semillas en cada nivel estas fueron sembradas en cajas petri sobre papel absorbente huacutemedo y colocadas en germinadores con periodos de 12 horas luz y 12 de oscuridad
EXTRACCIOacuteN Y CUANTIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
En todos los niveles deshidratados para cada una de las especies se realizoacute
la extraccioacuten de proteiacutenas de acuerdo al siguiente protocolo se trituroacute 05
6
gramos de semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido (figura 2 a) una vez
trituradas se maceroacute con el buffer de extraccioacuten de proteiacutenas (Tampoacuten Trisndash
HCl 001 M Mercaptoetanol 01 Aacutecido ascoacuterbico 005 M Tritoacuten Xndash100 al
01 Polivinilpolipirrolidona (PVP)) en tubos eppendorf y centrifugadas en
frio (4deg) a 12000-rpm por 45 minutos El sobrenadante obtenido se colocoacute
en tubos eppendorf (figura 2 b) en algunos casos fue necesario centrifugar
nuevamente por un minuto para eliminar completamente impurezas El
extracto final fue conservado en friacuteo a -20 degC hasta su posterior utilizacioacuten
a b c
Figura 2 Representacioacuten del procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenas a) trituracioacuten
de las semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido b) colocacioacuten del sobrenadante en
tubos eppendorf c) cuantificacioacuten de proteiacutenas en el Nanodrop 2000
La cuantificacioacuten de proteiacutenas totales se la realizoacute utilizando el meacutetodo
espectrofomeacutetrico de Bradford (1976) donde la curva de calibracioacuten se la
elaboro utilizando el reactivo de Bradford (Azuacutel de coomassie G-250 Pierce
Chem USA) y albuacutemina bovina fraccioacuten V (BSA Sigma) como estaacutendar La
cuantificacioacuten se la realizoacute en el equipo espectofotoacutemetro Nanodrop 2000
(figura 2 c)
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
I
Certificacioacuten Ing Joseacute Miguel Romero Saritama DIRECTOR DEL TRABAJO DE FIN DE TITULACIOacuteN CERTIFICA Que el presente trabajo de investigacioacuten denominado ldquoDeterminacioacuten de patrones proteicos durante el proceso de deshidratacioacuten en semillas de diferente comportamiento de conservacioacutenrdquo realizado por el profesional en formacioacuten Freddy Javier Loayza Jaramillo cumple con los requisitos establecidos en las normas generales para la Graduacioacuten en la Universidad Teacutecnica Particular de Loja tanto en el aspecto de forma como de contenido por lo cual me permito autorizar su presentacioacuten para los fines pertinentes Loja 18 de Julio del 2012 helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip Ing Joseacute Miguel Romero Saritama CI
II
Cesioacuten de derechos Yo (Freddy Javier Loayza Jaramillo) declaro ser autor del presente trabajo y eximo expresamente a la Universidad Teacutecnica Particular de Loja y a sus representantes legales de posibles reclamos o acciones legales Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposicioacuten del Art 67 del Estatuto Orgaacutenico de la Universidad Teacutecnica Particular de Loja que en su parte pertinente textualmente dice ldquoForman parte del patrimonio de la Universidad la propiedad intelectual de investigaciones trabajos cientiacuteficos o teacutecnicos de tesis de grado que se realicen a traveacutes o con el apoyo financiero acadeacutemico o institucional (operativo) de la Universidadrdquo f Freddy Javier Loayza Jaramillo CI 0704368141
III
DECLARACIOacuteN DE AUTORIacuteA
ldquoLas ideas conceptos procedimientos y resultados vertidos en el presente trabajo son de exclusiva responsabilidad de su autorrdquo
Nombre del autor Firma
Freddy Javier Loayza Jaramillo ----------------------------------
IV
DEDICATORIA
Dedico este trabajo a Dios que siempre ha estado iluminando mi camino para poder ser un hombre de bien y poder terminar este difiacutecil proyecto A mi amada esposa Estefaniacutea Intildeiguez quien ha sido mi pilar para seguir adelante en los momentos maacutes difiacuteciles de este largo camino gracias por tu amor incondicional sin ti no lo habriacutea logrado A mi amado hijo Cristopher Matiacuteas Loayza quien es la razoacuten de mi existir y de mi superacioacuten Con profundo amor y agradecimiento a mis padres Vilma Jaramillo y Freddy Loayza por su amor y apoyo incondicional A mi hermana Andrea Loayza que siempre ha estado cuando maacutes la he necesitado A mis abuelitos Mariana Jaramillo y Rauacutel Jaramillo quienes han sido mas que unos padres para mi y gracias a ellos soy la persona que conocen ahora Y a todos mis tiacuteos y tiacuteas quienes me ayudaron a formarme Y una dedicatoria especial a mis queridos suegros Esmeralda Coacuterdova y Lauro Intildeiguez quienes me brindaron su apoyo incondicional en las buenas y malas les debo tanto y espero alguacuten diacutea poder retribuir a tanto iexclLos Amo
Freddy Javier Loayza Jaramillo Nombre del autor
V
AGRADECIMIENTOS A la Universidad Teacutecnica Particular de Loja al personal docente de la carrera de Gestioacuten Ambiental que con sus ensentildeanzas han contribuido a mi formacioacuten como profesional Al Banco de Germoplasma del Departamento de Ciencias Naturales por contribuir en mis conocimientos como estudiante y brindarme el apoyo en la realizacioacuten de mi proyecto de fin de carrera Al Ing Joseacute Miguel y las personas que forman el Instituto de Ecologiacutea por su constante apoyo y orientacioacuten en la realizacioacuten de mi trabajo Y un agradecimiento especial a mis Padres Suegros y Esposa por motivarme y apoyarme a seguir con mis estudios y ser mis pilares para cumplir con mis metas iexclGracias
Freddy Javier Loayza Jaramillo
VI
INDICE
Iacutendice de contenidos
CERTIFICACIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipI CESIOacuteN DE DERECHOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipII AUTORIAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIII DEDICATORhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIV AGRADECIMIENTOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipV INDICE DE CONTENIDOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipVI
RESUMENhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIX ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipX INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1 METODOLOGIacuteAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4 RESULTADOS Y DISCUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8 CONCLUCIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21 RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip22
BIBLIOGRAFIAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23 ANEXOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28
VII
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5
VIII
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Especies en estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4 Figura 2 Procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
IacuteNDICE DE GRAFICAS
Grafica 1 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8
Grafica 2 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip9
Grafica 3 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9
Grafica 4 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip10
Grafica 5 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Grafica 6 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip12
Grafica 7 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
Grafica 8 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
Grafica 9 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphellip15
Grafica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16
Grafica 11 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
Grafica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
Grafica 13 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18
Grafica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18
Grafica 15 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip19
Grafica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
IX
Grafica 17 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
Grafica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
Grafica 19 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
IX
RESUMEN
Las semillas como todo ser vivo tienen proteiacutenas las cuales son de gran
importancia para el normal funcionamiento de estas un procedimiento para
determinar la concentracioacuten de proteiacutenas en las semillas es el anaacutelisis
Bradford La peacuterdida neta de proteiacutenas en las semillas estaacute relacionado con
el envejecimiento por causa de la deshidratacioacuten El objetivo de este estudio
fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes niveles de humedad en
semillas con diferente comportamiento de conservacioacuten y determinar la
tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco especies
Los resultados mostraron que Lafoencia acuminata y Senna alata tienen una
tendencia de comportamiento ortodoxo mientras que Coccoloba ruiziana
presentoacute un comportamiento intermedio y en Myrtus communis y Capparis
flexuosa estas mostraron tendencia a un comportamiento recalcitrante
Cuatro especies presentaron concentraciones similares de proteiacutenas en las
semillas que van desde 0042 hasta las 6488 ugml excepto Myrtus
communis que presentoacute 177343 12919 y 16455 ugml proteiacutenas en los
niveles 25 20 y 10 de humedad respectivamente durante la deshidratacioacuten
no existiendo correlacioacuten entre cantidad de proteiacutenas y niveles de humedad
en las semillas
Palabras clave Proteiacutenas totales semillas ortodoxas semillas
recalcitrantes semillas intermedias Anaacutelisis bradford deshidratacioacuten
semillas
X
SUMMARY
The seeds are like all living proteins which are important for the normal
functioning of these a method for determining protein concentration in seed is
the Bradford analysis The net loss of the proteins in the seeds is related to
aging caused by dehydration The objective of this study was to quantify total
protein at various levels of moisture in different seed storage behavior and
determine the desiccation tolerance of the five species
The results showed that Senna alata Lafoencia acuminata and have a
tendency of orthodox behavior while Coccoloba ruiziana presented an
intermediate behavior and in the case of Myrtus communis and Capparis
flexuosa these tended to recalcitrant behavior Four species showed similar
concentrations of protein in seeds ranging from 0042 to the 6488 ug ml
except Myrtus communis presented 177343 12919 and 16455 ug ml
protein at levels 25 20 and 10 humidity respectively for the dehydration no
correlation exists between protein and moisture levels in the seeds
Keywords Total protein orthodox seeds recalcitrant seeds seeds
intermediate bradford Analysis dehydration seeds
1
INTRODUCCIOacuteN
En las semillas como en todo ser vivo existen proteiacutenas las cuales son de
gran importancia para el normal funcionamiento de estas en algunas
especies (Beevers amp Poulson 1992) Ellas constituyen maacutes del 50 del peso
seco de la ceacutelula las proteiacutenas maacutes comunes que encontramos en las
semillas son las globulinas albuminas prolaminas y proteiacutenas de
almacenamiento (Nielsen et al 1995) Ciertas cantidades de eacutestas se
acumulan en un corto periacuteodo de tiempo durante el desarrollo de la semilla
en muchas especies Las proteiacutenas de almacenamiento las prolaminas las
globulinas y las albuminas se acumulan poco en especies sin embargo
constituyen una alta proporcioacuten de la proteiacutena total de la semilla madura
(Laurie amp Robert 1990)
Estudios realizados con diferentes especies de semillas como por ejemplo
en el olivo y soja han demostrado que las proteiacutenas de reserva se
almacenan en el embrioacuten y el endospermo (Bawley amp Black 1994) Las
proteiacutenas de reserva en embriones y ceacutelulas vegetativas son sintetizadas
durante el desarrollo de la semilla e hidrolizadas durante la maduracioacuten
imbibicioacuten y germinacioacuten de estas proporcionando una de las principales
fuentes de carbono nitroacutegeno y azufre para el subsiguiente crecimiento y
desarrollo Estas proteiacutenas de reserva en ceacutelulas vegetativas proporcionan
una base para las semillas y frutos durante el crecimiento reproductivo y
para una raacutepida expansioacuten de las estructuras vegetativas despueacutes del
periodo de dormancia durante la germinacioacuten (Bawley amp Black 1994)
Un procedimiento para la determinacioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas en
las semillas es el anaacutelisis Bradford que consiste en la unioacuten de un colorante
Comassie Blue G-250 a las proteiacutenas Las proteiacutenas se unen a la forma azul
para formar un complejo proteiacutena-colorante con un coeficiente de extincioacuten
mayor que el colorante libre Este meacutetodo es sensible (1-15 μg) simple
raacutepido barato y pocas sustancias interfieren en su determinacioacuten como los
detergentes y las soluciones baacutesicas (Bradford 1976 Fernaacutendez 2007)
La peacuterdida neta de las proteiacutenas en las semillas es quizaacutes el deterioro maacutes
baacutesico de todos los eventos relacionados con el envejecimiento por causa de
la deshidratacioacuten ya que estos cambios podriacutean ser la base de todos los
demaacutes aspectos de la disminucioacuten del metabolismo La disminucioacuten en el
contenido de proteiacutenas por envejecimiento de las semillas puede ser debido
2
a 1) un dantildeo extenso en la siacutentesis de proteiacutenas reportado en diferentes
sistemas del cultivo (Hallman et al 1973) una germinacioacuten reducida o
semillas no viables en el aacuterbol (Espiacutendola et al 1994) oacute 2) la siacutentesis o la
activacioacuten de grandes cantidades de enzimas proteoliacuteticas durante el
deterioro de la semilla (Bewley amp Negro 1982)
La deshidratacioacuten es el procedimiento maacutes delicado en el tratamiento de las
semillas y uno de los problemas maacutes difiacuteciles de la conservacioacuten ex situ Es
necesario efectuar un seguimiento continuo de la deshidratacioacuten porque las
distintas etapas del desarrollo de las semillas estaacuten condicionadas por
factores mecaacutenicos quiacutemicos morfoloacutegicos y fisioloacutegicos que pueden
favorecer su germinacioacuten pero tambieacuten determinar la dormicioacuten Cada tipo
de semilla pasa por un proceso diferente de deshidratacioacuten que si se efectuacutea
mal puede comprometer la viabilidad de la misma (Genmedoc 2005)
La semilla es uno de los principales recursos para el manejo agriacutecola y
silviacutecola de las poblaciones vegetales para la reforestacioacuten para la
conservacioacuten del germoplasma vegetal y para la recuperacioacuten de especies
valiosas sobrexplotadas Eacutestas pueden almacenarse vivas por largos
periodos aseguraacutendose asiacute la preservacioacuten de especies y variedades de
plantas valiosas (Trujillo 1990) Para poder almacenar las semillas a largo
plazo es necesario que primero pasen por un proceso de deshidratacioacuten
pero lamentablemente todas las semillas difieren en su tolerancia a la
desecacioacuten Seguacuten este paraacutemetro las semillas se pueden clasificar en
ortodoxas recalcitrantes e intermedias (Farrant et al 1993) Las semillas
ortodoxas toleran una deshidratacioacuten hasta de 5 en el contenido de
humedad por su parte las semillas que toleran la deshidratacioacuten entre 10 y
125 de contenido de humedad se consideran intermedias y las que toleran
la deshidratacioacuten entre 15 y 50 de humedad se denominan recalcitrantes
(Farrant et al 1993 Gentil 2001)
En la mayoriacutea de especies recalcitrantes la reduccioacuten de humedad produce
una reduccioacuten de la germinacioacuten (Floriano 2004) un ejemplo claro es la
especie Quercus nigra que cuando su contenido de humedad baja al 30
la germinacioacuten se anula tal y como han puesto de manifiesto de Zulueta amp
Montoto (1992) Otro ejemplo que se da en las semillas recalcitrantes es la
familia del cafeacute el contenido de humedad miacutenimo que toleran las semillas de
C arabica C canephora y C liberica sin reducir su viabilidad es de
aproximadamente 9 11 y 24 respectivamente (Gentil 2001 amp Eira et al
2006) con reduccioacuten en la viabilidad a bajas temperaturas (Gentil 2001) a
diferencia de las semillas de C costatifructa C racemosa y C sessiliflora las
cuales mostraron un nivel criacutetico de humedad de semilla de 19 30 y 30
respectivamente (Dussert et al 1998)
3
Las semillas Ortodoxas sufren deterioro en su viabilidad pero a una tasa
inferior que las semillas recalcitrantes En estas los cambios en las reservas
de alimento almacenado parecen no afectar la viabilidad o vigor de la semilla
(Black M 1992) Un ejemplo claro de esto es la especie Cratylia argentea la
cual fue sometida a niveles de deshidratacioacuten del 10 8 y 6 siendo su
viabilidad del 95 86 y 76 respectivamente (Montoya amp Bonilla 2009)
El objetivo de este estudio fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes
niveles de humedad en semillas con diferente comportamiento de
conservacioacuten y determinar la tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco
especies
4
METODOLOGIA
COLECCIOacuteN DE MATERIAL
Se colectaron semillas maduras de las siguientes especies Lafoensia
acuminata (Ruiz y Pav) (Lythraceae) Senna alata (L) Roxb
(Cesalpinaceae) Coccoloba ruiziana (Lindau) (Polygonaceae) Myrtus
communis (Linneo) (Myrtaceae) y Capparis flexuosa (Linneo)
(Capparaceae) (figura 1) distribuidas en la provincia de Loja Las semillas
fueron transportadas al laboratorio del Banco de Germoplasma de la
Universidad Teacutecnica Particular de Loja en fundas de tela para evitar una
deshidratacioacuten previa
a b c
d e
Figura 1 Semillas de las cinco especies en estudio a) Lafoensia acuminata b) Senna alata c) Coccoloba ruiziana d) Myrtus communis e) Capparis flexuosa
CONTENIDO DE HUMEDAD
Colectadas la semillas se procedioacute a calcular en el laboratorio el porcentaje de humedad inicial de las mismas para ello se utilizaron dos reacuteplicas de 10 o 20 semillas (dependiendo del tamantildeo) el meacutetodo realizado fue de secado en estufa a temperatura baja y constante 103 degC por 17 horas (ISTA 2005) finalizado el procedimiento se utilizoacute la siguiente foacutermula para calcular el porcentaje de humedad
5
Formula (CH= pi-pfpi times 100) CH= Contenido de Humedad pi= peso inicial pf= peso final
DESHIDRATACIOacuteN DE SEMILLAS Determinado el contenido de humedad inicial de las semillas se determinoacute los diferentes porcentajes de humedad a deshidratar (tabla 1) en base al protocolo ldquoHANDLING OF DESICCATION AND TEMPERATURE SENSITIVE TREE SEEDSldquo establecido por ldquoThomsenrdquo (2000) Las semillas fueron colocadas en frascos de vidrio hermeacuteticos con gel de siacutelice como deshidratante Las semillas fueron pesadas cada 20 minutos durante el primer diacutea y en los posteriores diacuteas la toma de datos se realizoacute de una a dos veces durante el diacutea hasta que las semillas alcanzaron el peso y porcentaje de deshidratacioacuten deseado Tabla 1
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados para
las semillas de las especies en estudio
Especie CH inicial CH a deshidratar
Lafoensia acuminata 1237 129632
Senna alata 125 129632
Coccoloba ruiziana 2144 2015129632
Myrtus communis 35 3025201510532
Capparis flexuosa 45 4030201096532
VIABILIDAD DE SEMILLAS Para determinar la tolerancia a la desecacioacuten se evaluoacute la viabilidad de las semillas expresada en tiempo y porcentaje de germinacioacuten en cada nivel de deshidratacioacuten alcanzado para cada especie Para los ensayos de germinacioacuten se utilizo dos reacuteplicas de 25 semillas en cada nivel estas fueron sembradas en cajas petri sobre papel absorbente huacutemedo y colocadas en germinadores con periodos de 12 horas luz y 12 de oscuridad
EXTRACCIOacuteN Y CUANTIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
En todos los niveles deshidratados para cada una de las especies se realizoacute
la extraccioacuten de proteiacutenas de acuerdo al siguiente protocolo se trituroacute 05
6
gramos de semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido (figura 2 a) una vez
trituradas se maceroacute con el buffer de extraccioacuten de proteiacutenas (Tampoacuten Trisndash
HCl 001 M Mercaptoetanol 01 Aacutecido ascoacuterbico 005 M Tritoacuten Xndash100 al
01 Polivinilpolipirrolidona (PVP)) en tubos eppendorf y centrifugadas en
frio (4deg) a 12000-rpm por 45 minutos El sobrenadante obtenido se colocoacute
en tubos eppendorf (figura 2 b) en algunos casos fue necesario centrifugar
nuevamente por un minuto para eliminar completamente impurezas El
extracto final fue conservado en friacuteo a -20 degC hasta su posterior utilizacioacuten
a b c
Figura 2 Representacioacuten del procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenas a) trituracioacuten
de las semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido b) colocacioacuten del sobrenadante en
tubos eppendorf c) cuantificacioacuten de proteiacutenas en el Nanodrop 2000
La cuantificacioacuten de proteiacutenas totales se la realizoacute utilizando el meacutetodo
espectrofomeacutetrico de Bradford (1976) donde la curva de calibracioacuten se la
elaboro utilizando el reactivo de Bradford (Azuacutel de coomassie G-250 Pierce
Chem USA) y albuacutemina bovina fraccioacuten V (BSA Sigma) como estaacutendar La
cuantificacioacuten se la realizoacute en el equipo espectofotoacutemetro Nanodrop 2000
(figura 2 c)
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
II
Cesioacuten de derechos Yo (Freddy Javier Loayza Jaramillo) declaro ser autor del presente trabajo y eximo expresamente a la Universidad Teacutecnica Particular de Loja y a sus representantes legales de posibles reclamos o acciones legales Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposicioacuten del Art 67 del Estatuto Orgaacutenico de la Universidad Teacutecnica Particular de Loja que en su parte pertinente textualmente dice ldquoForman parte del patrimonio de la Universidad la propiedad intelectual de investigaciones trabajos cientiacuteficos o teacutecnicos de tesis de grado que se realicen a traveacutes o con el apoyo financiero acadeacutemico o institucional (operativo) de la Universidadrdquo f Freddy Javier Loayza Jaramillo CI 0704368141
III
DECLARACIOacuteN DE AUTORIacuteA
ldquoLas ideas conceptos procedimientos y resultados vertidos en el presente trabajo son de exclusiva responsabilidad de su autorrdquo
Nombre del autor Firma
Freddy Javier Loayza Jaramillo ----------------------------------
IV
DEDICATORIA
Dedico este trabajo a Dios que siempre ha estado iluminando mi camino para poder ser un hombre de bien y poder terminar este difiacutecil proyecto A mi amada esposa Estefaniacutea Intildeiguez quien ha sido mi pilar para seguir adelante en los momentos maacutes difiacuteciles de este largo camino gracias por tu amor incondicional sin ti no lo habriacutea logrado A mi amado hijo Cristopher Matiacuteas Loayza quien es la razoacuten de mi existir y de mi superacioacuten Con profundo amor y agradecimiento a mis padres Vilma Jaramillo y Freddy Loayza por su amor y apoyo incondicional A mi hermana Andrea Loayza que siempre ha estado cuando maacutes la he necesitado A mis abuelitos Mariana Jaramillo y Rauacutel Jaramillo quienes han sido mas que unos padres para mi y gracias a ellos soy la persona que conocen ahora Y a todos mis tiacuteos y tiacuteas quienes me ayudaron a formarme Y una dedicatoria especial a mis queridos suegros Esmeralda Coacuterdova y Lauro Intildeiguez quienes me brindaron su apoyo incondicional en las buenas y malas les debo tanto y espero alguacuten diacutea poder retribuir a tanto iexclLos Amo
Freddy Javier Loayza Jaramillo Nombre del autor
V
AGRADECIMIENTOS A la Universidad Teacutecnica Particular de Loja al personal docente de la carrera de Gestioacuten Ambiental que con sus ensentildeanzas han contribuido a mi formacioacuten como profesional Al Banco de Germoplasma del Departamento de Ciencias Naturales por contribuir en mis conocimientos como estudiante y brindarme el apoyo en la realizacioacuten de mi proyecto de fin de carrera Al Ing Joseacute Miguel y las personas que forman el Instituto de Ecologiacutea por su constante apoyo y orientacioacuten en la realizacioacuten de mi trabajo Y un agradecimiento especial a mis Padres Suegros y Esposa por motivarme y apoyarme a seguir con mis estudios y ser mis pilares para cumplir con mis metas iexclGracias
Freddy Javier Loayza Jaramillo
VI
INDICE
Iacutendice de contenidos
CERTIFICACIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipI CESIOacuteN DE DERECHOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipII AUTORIAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIII DEDICATORhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIV AGRADECIMIENTOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipV INDICE DE CONTENIDOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipVI
RESUMENhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIX ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipX INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1 METODOLOGIacuteAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4 RESULTADOS Y DISCUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8 CONCLUCIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21 RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip22
BIBLIOGRAFIAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23 ANEXOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28
VII
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5
VIII
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Especies en estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4 Figura 2 Procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
IacuteNDICE DE GRAFICAS
Grafica 1 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8
Grafica 2 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip9
Grafica 3 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9
Grafica 4 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip10
Grafica 5 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Grafica 6 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip12
Grafica 7 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
Grafica 8 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
Grafica 9 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphellip15
Grafica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16
Grafica 11 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
Grafica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
Grafica 13 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18
Grafica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18
Grafica 15 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip19
Grafica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
IX
Grafica 17 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
Grafica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
Grafica 19 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
IX
RESUMEN
Las semillas como todo ser vivo tienen proteiacutenas las cuales son de gran
importancia para el normal funcionamiento de estas un procedimiento para
determinar la concentracioacuten de proteiacutenas en las semillas es el anaacutelisis
Bradford La peacuterdida neta de proteiacutenas en las semillas estaacute relacionado con
el envejecimiento por causa de la deshidratacioacuten El objetivo de este estudio
fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes niveles de humedad en
semillas con diferente comportamiento de conservacioacuten y determinar la
tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco especies
Los resultados mostraron que Lafoencia acuminata y Senna alata tienen una
tendencia de comportamiento ortodoxo mientras que Coccoloba ruiziana
presentoacute un comportamiento intermedio y en Myrtus communis y Capparis
flexuosa estas mostraron tendencia a un comportamiento recalcitrante
Cuatro especies presentaron concentraciones similares de proteiacutenas en las
semillas que van desde 0042 hasta las 6488 ugml excepto Myrtus
communis que presentoacute 177343 12919 y 16455 ugml proteiacutenas en los
niveles 25 20 y 10 de humedad respectivamente durante la deshidratacioacuten
no existiendo correlacioacuten entre cantidad de proteiacutenas y niveles de humedad
en las semillas
Palabras clave Proteiacutenas totales semillas ortodoxas semillas
recalcitrantes semillas intermedias Anaacutelisis bradford deshidratacioacuten
semillas
X
SUMMARY
The seeds are like all living proteins which are important for the normal
functioning of these a method for determining protein concentration in seed is
the Bradford analysis The net loss of the proteins in the seeds is related to
aging caused by dehydration The objective of this study was to quantify total
protein at various levels of moisture in different seed storage behavior and
determine the desiccation tolerance of the five species
The results showed that Senna alata Lafoencia acuminata and have a
tendency of orthodox behavior while Coccoloba ruiziana presented an
intermediate behavior and in the case of Myrtus communis and Capparis
flexuosa these tended to recalcitrant behavior Four species showed similar
concentrations of protein in seeds ranging from 0042 to the 6488 ug ml
except Myrtus communis presented 177343 12919 and 16455 ug ml
protein at levels 25 20 and 10 humidity respectively for the dehydration no
correlation exists between protein and moisture levels in the seeds
Keywords Total protein orthodox seeds recalcitrant seeds seeds
intermediate bradford Analysis dehydration seeds
1
INTRODUCCIOacuteN
En las semillas como en todo ser vivo existen proteiacutenas las cuales son de
gran importancia para el normal funcionamiento de estas en algunas
especies (Beevers amp Poulson 1992) Ellas constituyen maacutes del 50 del peso
seco de la ceacutelula las proteiacutenas maacutes comunes que encontramos en las
semillas son las globulinas albuminas prolaminas y proteiacutenas de
almacenamiento (Nielsen et al 1995) Ciertas cantidades de eacutestas se
acumulan en un corto periacuteodo de tiempo durante el desarrollo de la semilla
en muchas especies Las proteiacutenas de almacenamiento las prolaminas las
globulinas y las albuminas se acumulan poco en especies sin embargo
constituyen una alta proporcioacuten de la proteiacutena total de la semilla madura
(Laurie amp Robert 1990)
Estudios realizados con diferentes especies de semillas como por ejemplo
en el olivo y soja han demostrado que las proteiacutenas de reserva se
almacenan en el embrioacuten y el endospermo (Bawley amp Black 1994) Las
proteiacutenas de reserva en embriones y ceacutelulas vegetativas son sintetizadas
durante el desarrollo de la semilla e hidrolizadas durante la maduracioacuten
imbibicioacuten y germinacioacuten de estas proporcionando una de las principales
fuentes de carbono nitroacutegeno y azufre para el subsiguiente crecimiento y
desarrollo Estas proteiacutenas de reserva en ceacutelulas vegetativas proporcionan
una base para las semillas y frutos durante el crecimiento reproductivo y
para una raacutepida expansioacuten de las estructuras vegetativas despueacutes del
periodo de dormancia durante la germinacioacuten (Bawley amp Black 1994)
Un procedimiento para la determinacioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas en
las semillas es el anaacutelisis Bradford que consiste en la unioacuten de un colorante
Comassie Blue G-250 a las proteiacutenas Las proteiacutenas se unen a la forma azul
para formar un complejo proteiacutena-colorante con un coeficiente de extincioacuten
mayor que el colorante libre Este meacutetodo es sensible (1-15 μg) simple
raacutepido barato y pocas sustancias interfieren en su determinacioacuten como los
detergentes y las soluciones baacutesicas (Bradford 1976 Fernaacutendez 2007)
La peacuterdida neta de las proteiacutenas en las semillas es quizaacutes el deterioro maacutes
baacutesico de todos los eventos relacionados con el envejecimiento por causa de
la deshidratacioacuten ya que estos cambios podriacutean ser la base de todos los
demaacutes aspectos de la disminucioacuten del metabolismo La disminucioacuten en el
contenido de proteiacutenas por envejecimiento de las semillas puede ser debido
2
a 1) un dantildeo extenso en la siacutentesis de proteiacutenas reportado en diferentes
sistemas del cultivo (Hallman et al 1973) una germinacioacuten reducida o
semillas no viables en el aacuterbol (Espiacutendola et al 1994) oacute 2) la siacutentesis o la
activacioacuten de grandes cantidades de enzimas proteoliacuteticas durante el
deterioro de la semilla (Bewley amp Negro 1982)
La deshidratacioacuten es el procedimiento maacutes delicado en el tratamiento de las
semillas y uno de los problemas maacutes difiacuteciles de la conservacioacuten ex situ Es
necesario efectuar un seguimiento continuo de la deshidratacioacuten porque las
distintas etapas del desarrollo de las semillas estaacuten condicionadas por
factores mecaacutenicos quiacutemicos morfoloacutegicos y fisioloacutegicos que pueden
favorecer su germinacioacuten pero tambieacuten determinar la dormicioacuten Cada tipo
de semilla pasa por un proceso diferente de deshidratacioacuten que si se efectuacutea
mal puede comprometer la viabilidad de la misma (Genmedoc 2005)
La semilla es uno de los principales recursos para el manejo agriacutecola y
silviacutecola de las poblaciones vegetales para la reforestacioacuten para la
conservacioacuten del germoplasma vegetal y para la recuperacioacuten de especies
valiosas sobrexplotadas Eacutestas pueden almacenarse vivas por largos
periodos aseguraacutendose asiacute la preservacioacuten de especies y variedades de
plantas valiosas (Trujillo 1990) Para poder almacenar las semillas a largo
plazo es necesario que primero pasen por un proceso de deshidratacioacuten
pero lamentablemente todas las semillas difieren en su tolerancia a la
desecacioacuten Seguacuten este paraacutemetro las semillas se pueden clasificar en
ortodoxas recalcitrantes e intermedias (Farrant et al 1993) Las semillas
ortodoxas toleran una deshidratacioacuten hasta de 5 en el contenido de
humedad por su parte las semillas que toleran la deshidratacioacuten entre 10 y
125 de contenido de humedad se consideran intermedias y las que toleran
la deshidratacioacuten entre 15 y 50 de humedad se denominan recalcitrantes
(Farrant et al 1993 Gentil 2001)
En la mayoriacutea de especies recalcitrantes la reduccioacuten de humedad produce
una reduccioacuten de la germinacioacuten (Floriano 2004) un ejemplo claro es la
especie Quercus nigra que cuando su contenido de humedad baja al 30
la germinacioacuten se anula tal y como han puesto de manifiesto de Zulueta amp
Montoto (1992) Otro ejemplo que se da en las semillas recalcitrantes es la
familia del cafeacute el contenido de humedad miacutenimo que toleran las semillas de
C arabica C canephora y C liberica sin reducir su viabilidad es de
aproximadamente 9 11 y 24 respectivamente (Gentil 2001 amp Eira et al
2006) con reduccioacuten en la viabilidad a bajas temperaturas (Gentil 2001) a
diferencia de las semillas de C costatifructa C racemosa y C sessiliflora las
cuales mostraron un nivel criacutetico de humedad de semilla de 19 30 y 30
respectivamente (Dussert et al 1998)
3
Las semillas Ortodoxas sufren deterioro en su viabilidad pero a una tasa
inferior que las semillas recalcitrantes En estas los cambios en las reservas
de alimento almacenado parecen no afectar la viabilidad o vigor de la semilla
(Black M 1992) Un ejemplo claro de esto es la especie Cratylia argentea la
cual fue sometida a niveles de deshidratacioacuten del 10 8 y 6 siendo su
viabilidad del 95 86 y 76 respectivamente (Montoya amp Bonilla 2009)
El objetivo de este estudio fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes
niveles de humedad en semillas con diferente comportamiento de
conservacioacuten y determinar la tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco
especies
4
METODOLOGIA
COLECCIOacuteN DE MATERIAL
Se colectaron semillas maduras de las siguientes especies Lafoensia
acuminata (Ruiz y Pav) (Lythraceae) Senna alata (L) Roxb
(Cesalpinaceae) Coccoloba ruiziana (Lindau) (Polygonaceae) Myrtus
communis (Linneo) (Myrtaceae) y Capparis flexuosa (Linneo)
(Capparaceae) (figura 1) distribuidas en la provincia de Loja Las semillas
fueron transportadas al laboratorio del Banco de Germoplasma de la
Universidad Teacutecnica Particular de Loja en fundas de tela para evitar una
deshidratacioacuten previa
a b c
d e
Figura 1 Semillas de las cinco especies en estudio a) Lafoensia acuminata b) Senna alata c) Coccoloba ruiziana d) Myrtus communis e) Capparis flexuosa
CONTENIDO DE HUMEDAD
Colectadas la semillas se procedioacute a calcular en el laboratorio el porcentaje de humedad inicial de las mismas para ello se utilizaron dos reacuteplicas de 10 o 20 semillas (dependiendo del tamantildeo) el meacutetodo realizado fue de secado en estufa a temperatura baja y constante 103 degC por 17 horas (ISTA 2005) finalizado el procedimiento se utilizoacute la siguiente foacutermula para calcular el porcentaje de humedad
5
Formula (CH= pi-pfpi times 100) CH= Contenido de Humedad pi= peso inicial pf= peso final
DESHIDRATACIOacuteN DE SEMILLAS Determinado el contenido de humedad inicial de las semillas se determinoacute los diferentes porcentajes de humedad a deshidratar (tabla 1) en base al protocolo ldquoHANDLING OF DESICCATION AND TEMPERATURE SENSITIVE TREE SEEDSldquo establecido por ldquoThomsenrdquo (2000) Las semillas fueron colocadas en frascos de vidrio hermeacuteticos con gel de siacutelice como deshidratante Las semillas fueron pesadas cada 20 minutos durante el primer diacutea y en los posteriores diacuteas la toma de datos se realizoacute de una a dos veces durante el diacutea hasta que las semillas alcanzaron el peso y porcentaje de deshidratacioacuten deseado Tabla 1
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados para
las semillas de las especies en estudio
Especie CH inicial CH a deshidratar
Lafoensia acuminata 1237 129632
Senna alata 125 129632
Coccoloba ruiziana 2144 2015129632
Myrtus communis 35 3025201510532
Capparis flexuosa 45 4030201096532
VIABILIDAD DE SEMILLAS Para determinar la tolerancia a la desecacioacuten se evaluoacute la viabilidad de las semillas expresada en tiempo y porcentaje de germinacioacuten en cada nivel de deshidratacioacuten alcanzado para cada especie Para los ensayos de germinacioacuten se utilizo dos reacuteplicas de 25 semillas en cada nivel estas fueron sembradas en cajas petri sobre papel absorbente huacutemedo y colocadas en germinadores con periodos de 12 horas luz y 12 de oscuridad
EXTRACCIOacuteN Y CUANTIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
En todos los niveles deshidratados para cada una de las especies se realizoacute
la extraccioacuten de proteiacutenas de acuerdo al siguiente protocolo se trituroacute 05
6
gramos de semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido (figura 2 a) una vez
trituradas se maceroacute con el buffer de extraccioacuten de proteiacutenas (Tampoacuten Trisndash
HCl 001 M Mercaptoetanol 01 Aacutecido ascoacuterbico 005 M Tritoacuten Xndash100 al
01 Polivinilpolipirrolidona (PVP)) en tubos eppendorf y centrifugadas en
frio (4deg) a 12000-rpm por 45 minutos El sobrenadante obtenido se colocoacute
en tubos eppendorf (figura 2 b) en algunos casos fue necesario centrifugar
nuevamente por un minuto para eliminar completamente impurezas El
extracto final fue conservado en friacuteo a -20 degC hasta su posterior utilizacioacuten
a b c
Figura 2 Representacioacuten del procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenas a) trituracioacuten
de las semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido b) colocacioacuten del sobrenadante en
tubos eppendorf c) cuantificacioacuten de proteiacutenas en el Nanodrop 2000
La cuantificacioacuten de proteiacutenas totales se la realizoacute utilizando el meacutetodo
espectrofomeacutetrico de Bradford (1976) donde la curva de calibracioacuten se la
elaboro utilizando el reactivo de Bradford (Azuacutel de coomassie G-250 Pierce
Chem USA) y albuacutemina bovina fraccioacuten V (BSA Sigma) como estaacutendar La
cuantificacioacuten se la realizoacute en el equipo espectofotoacutemetro Nanodrop 2000
(figura 2 c)
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
III
DECLARACIOacuteN DE AUTORIacuteA
ldquoLas ideas conceptos procedimientos y resultados vertidos en el presente trabajo son de exclusiva responsabilidad de su autorrdquo
Nombre del autor Firma
Freddy Javier Loayza Jaramillo ----------------------------------
IV
DEDICATORIA
Dedico este trabajo a Dios que siempre ha estado iluminando mi camino para poder ser un hombre de bien y poder terminar este difiacutecil proyecto A mi amada esposa Estefaniacutea Intildeiguez quien ha sido mi pilar para seguir adelante en los momentos maacutes difiacuteciles de este largo camino gracias por tu amor incondicional sin ti no lo habriacutea logrado A mi amado hijo Cristopher Matiacuteas Loayza quien es la razoacuten de mi existir y de mi superacioacuten Con profundo amor y agradecimiento a mis padres Vilma Jaramillo y Freddy Loayza por su amor y apoyo incondicional A mi hermana Andrea Loayza que siempre ha estado cuando maacutes la he necesitado A mis abuelitos Mariana Jaramillo y Rauacutel Jaramillo quienes han sido mas que unos padres para mi y gracias a ellos soy la persona que conocen ahora Y a todos mis tiacuteos y tiacuteas quienes me ayudaron a formarme Y una dedicatoria especial a mis queridos suegros Esmeralda Coacuterdova y Lauro Intildeiguez quienes me brindaron su apoyo incondicional en las buenas y malas les debo tanto y espero alguacuten diacutea poder retribuir a tanto iexclLos Amo
Freddy Javier Loayza Jaramillo Nombre del autor
V
AGRADECIMIENTOS A la Universidad Teacutecnica Particular de Loja al personal docente de la carrera de Gestioacuten Ambiental que con sus ensentildeanzas han contribuido a mi formacioacuten como profesional Al Banco de Germoplasma del Departamento de Ciencias Naturales por contribuir en mis conocimientos como estudiante y brindarme el apoyo en la realizacioacuten de mi proyecto de fin de carrera Al Ing Joseacute Miguel y las personas que forman el Instituto de Ecologiacutea por su constante apoyo y orientacioacuten en la realizacioacuten de mi trabajo Y un agradecimiento especial a mis Padres Suegros y Esposa por motivarme y apoyarme a seguir con mis estudios y ser mis pilares para cumplir con mis metas iexclGracias
Freddy Javier Loayza Jaramillo
VI
INDICE
Iacutendice de contenidos
CERTIFICACIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipI CESIOacuteN DE DERECHOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipII AUTORIAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIII DEDICATORhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIV AGRADECIMIENTOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipV INDICE DE CONTENIDOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipVI
RESUMENhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIX ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipX INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1 METODOLOGIacuteAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4 RESULTADOS Y DISCUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8 CONCLUCIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21 RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip22
BIBLIOGRAFIAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23 ANEXOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28
VII
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5
VIII
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Especies en estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4 Figura 2 Procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
IacuteNDICE DE GRAFICAS
Grafica 1 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8
Grafica 2 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip9
Grafica 3 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9
Grafica 4 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip10
Grafica 5 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Grafica 6 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip12
Grafica 7 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
Grafica 8 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
Grafica 9 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphellip15
Grafica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16
Grafica 11 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
Grafica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
Grafica 13 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18
Grafica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18
Grafica 15 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip19
Grafica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
IX
Grafica 17 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
Grafica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
Grafica 19 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
IX
RESUMEN
Las semillas como todo ser vivo tienen proteiacutenas las cuales son de gran
importancia para el normal funcionamiento de estas un procedimiento para
determinar la concentracioacuten de proteiacutenas en las semillas es el anaacutelisis
Bradford La peacuterdida neta de proteiacutenas en las semillas estaacute relacionado con
el envejecimiento por causa de la deshidratacioacuten El objetivo de este estudio
fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes niveles de humedad en
semillas con diferente comportamiento de conservacioacuten y determinar la
tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco especies
Los resultados mostraron que Lafoencia acuminata y Senna alata tienen una
tendencia de comportamiento ortodoxo mientras que Coccoloba ruiziana
presentoacute un comportamiento intermedio y en Myrtus communis y Capparis
flexuosa estas mostraron tendencia a un comportamiento recalcitrante
Cuatro especies presentaron concentraciones similares de proteiacutenas en las
semillas que van desde 0042 hasta las 6488 ugml excepto Myrtus
communis que presentoacute 177343 12919 y 16455 ugml proteiacutenas en los
niveles 25 20 y 10 de humedad respectivamente durante la deshidratacioacuten
no existiendo correlacioacuten entre cantidad de proteiacutenas y niveles de humedad
en las semillas
Palabras clave Proteiacutenas totales semillas ortodoxas semillas
recalcitrantes semillas intermedias Anaacutelisis bradford deshidratacioacuten
semillas
X
SUMMARY
The seeds are like all living proteins which are important for the normal
functioning of these a method for determining protein concentration in seed is
the Bradford analysis The net loss of the proteins in the seeds is related to
aging caused by dehydration The objective of this study was to quantify total
protein at various levels of moisture in different seed storage behavior and
determine the desiccation tolerance of the five species
The results showed that Senna alata Lafoencia acuminata and have a
tendency of orthodox behavior while Coccoloba ruiziana presented an
intermediate behavior and in the case of Myrtus communis and Capparis
flexuosa these tended to recalcitrant behavior Four species showed similar
concentrations of protein in seeds ranging from 0042 to the 6488 ug ml
except Myrtus communis presented 177343 12919 and 16455 ug ml
protein at levels 25 20 and 10 humidity respectively for the dehydration no
correlation exists between protein and moisture levels in the seeds
Keywords Total protein orthodox seeds recalcitrant seeds seeds
intermediate bradford Analysis dehydration seeds
1
INTRODUCCIOacuteN
En las semillas como en todo ser vivo existen proteiacutenas las cuales son de
gran importancia para el normal funcionamiento de estas en algunas
especies (Beevers amp Poulson 1992) Ellas constituyen maacutes del 50 del peso
seco de la ceacutelula las proteiacutenas maacutes comunes que encontramos en las
semillas son las globulinas albuminas prolaminas y proteiacutenas de
almacenamiento (Nielsen et al 1995) Ciertas cantidades de eacutestas se
acumulan en un corto periacuteodo de tiempo durante el desarrollo de la semilla
en muchas especies Las proteiacutenas de almacenamiento las prolaminas las
globulinas y las albuminas se acumulan poco en especies sin embargo
constituyen una alta proporcioacuten de la proteiacutena total de la semilla madura
(Laurie amp Robert 1990)
Estudios realizados con diferentes especies de semillas como por ejemplo
en el olivo y soja han demostrado que las proteiacutenas de reserva se
almacenan en el embrioacuten y el endospermo (Bawley amp Black 1994) Las
proteiacutenas de reserva en embriones y ceacutelulas vegetativas son sintetizadas
durante el desarrollo de la semilla e hidrolizadas durante la maduracioacuten
imbibicioacuten y germinacioacuten de estas proporcionando una de las principales
fuentes de carbono nitroacutegeno y azufre para el subsiguiente crecimiento y
desarrollo Estas proteiacutenas de reserva en ceacutelulas vegetativas proporcionan
una base para las semillas y frutos durante el crecimiento reproductivo y
para una raacutepida expansioacuten de las estructuras vegetativas despueacutes del
periodo de dormancia durante la germinacioacuten (Bawley amp Black 1994)
Un procedimiento para la determinacioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas en
las semillas es el anaacutelisis Bradford que consiste en la unioacuten de un colorante
Comassie Blue G-250 a las proteiacutenas Las proteiacutenas se unen a la forma azul
para formar un complejo proteiacutena-colorante con un coeficiente de extincioacuten
mayor que el colorante libre Este meacutetodo es sensible (1-15 μg) simple
raacutepido barato y pocas sustancias interfieren en su determinacioacuten como los
detergentes y las soluciones baacutesicas (Bradford 1976 Fernaacutendez 2007)
La peacuterdida neta de las proteiacutenas en las semillas es quizaacutes el deterioro maacutes
baacutesico de todos los eventos relacionados con el envejecimiento por causa de
la deshidratacioacuten ya que estos cambios podriacutean ser la base de todos los
demaacutes aspectos de la disminucioacuten del metabolismo La disminucioacuten en el
contenido de proteiacutenas por envejecimiento de las semillas puede ser debido
2
a 1) un dantildeo extenso en la siacutentesis de proteiacutenas reportado en diferentes
sistemas del cultivo (Hallman et al 1973) una germinacioacuten reducida o
semillas no viables en el aacuterbol (Espiacutendola et al 1994) oacute 2) la siacutentesis o la
activacioacuten de grandes cantidades de enzimas proteoliacuteticas durante el
deterioro de la semilla (Bewley amp Negro 1982)
La deshidratacioacuten es el procedimiento maacutes delicado en el tratamiento de las
semillas y uno de los problemas maacutes difiacuteciles de la conservacioacuten ex situ Es
necesario efectuar un seguimiento continuo de la deshidratacioacuten porque las
distintas etapas del desarrollo de las semillas estaacuten condicionadas por
factores mecaacutenicos quiacutemicos morfoloacutegicos y fisioloacutegicos que pueden
favorecer su germinacioacuten pero tambieacuten determinar la dormicioacuten Cada tipo
de semilla pasa por un proceso diferente de deshidratacioacuten que si se efectuacutea
mal puede comprometer la viabilidad de la misma (Genmedoc 2005)
La semilla es uno de los principales recursos para el manejo agriacutecola y
silviacutecola de las poblaciones vegetales para la reforestacioacuten para la
conservacioacuten del germoplasma vegetal y para la recuperacioacuten de especies
valiosas sobrexplotadas Eacutestas pueden almacenarse vivas por largos
periodos aseguraacutendose asiacute la preservacioacuten de especies y variedades de
plantas valiosas (Trujillo 1990) Para poder almacenar las semillas a largo
plazo es necesario que primero pasen por un proceso de deshidratacioacuten
pero lamentablemente todas las semillas difieren en su tolerancia a la
desecacioacuten Seguacuten este paraacutemetro las semillas se pueden clasificar en
ortodoxas recalcitrantes e intermedias (Farrant et al 1993) Las semillas
ortodoxas toleran una deshidratacioacuten hasta de 5 en el contenido de
humedad por su parte las semillas que toleran la deshidratacioacuten entre 10 y
125 de contenido de humedad se consideran intermedias y las que toleran
la deshidratacioacuten entre 15 y 50 de humedad se denominan recalcitrantes
(Farrant et al 1993 Gentil 2001)
En la mayoriacutea de especies recalcitrantes la reduccioacuten de humedad produce
una reduccioacuten de la germinacioacuten (Floriano 2004) un ejemplo claro es la
especie Quercus nigra que cuando su contenido de humedad baja al 30
la germinacioacuten se anula tal y como han puesto de manifiesto de Zulueta amp
Montoto (1992) Otro ejemplo que se da en las semillas recalcitrantes es la
familia del cafeacute el contenido de humedad miacutenimo que toleran las semillas de
C arabica C canephora y C liberica sin reducir su viabilidad es de
aproximadamente 9 11 y 24 respectivamente (Gentil 2001 amp Eira et al
2006) con reduccioacuten en la viabilidad a bajas temperaturas (Gentil 2001) a
diferencia de las semillas de C costatifructa C racemosa y C sessiliflora las
cuales mostraron un nivel criacutetico de humedad de semilla de 19 30 y 30
respectivamente (Dussert et al 1998)
3
Las semillas Ortodoxas sufren deterioro en su viabilidad pero a una tasa
inferior que las semillas recalcitrantes En estas los cambios en las reservas
de alimento almacenado parecen no afectar la viabilidad o vigor de la semilla
(Black M 1992) Un ejemplo claro de esto es la especie Cratylia argentea la
cual fue sometida a niveles de deshidratacioacuten del 10 8 y 6 siendo su
viabilidad del 95 86 y 76 respectivamente (Montoya amp Bonilla 2009)
El objetivo de este estudio fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes
niveles de humedad en semillas con diferente comportamiento de
conservacioacuten y determinar la tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco
especies
4
METODOLOGIA
COLECCIOacuteN DE MATERIAL
Se colectaron semillas maduras de las siguientes especies Lafoensia
acuminata (Ruiz y Pav) (Lythraceae) Senna alata (L) Roxb
(Cesalpinaceae) Coccoloba ruiziana (Lindau) (Polygonaceae) Myrtus
communis (Linneo) (Myrtaceae) y Capparis flexuosa (Linneo)
(Capparaceae) (figura 1) distribuidas en la provincia de Loja Las semillas
fueron transportadas al laboratorio del Banco de Germoplasma de la
Universidad Teacutecnica Particular de Loja en fundas de tela para evitar una
deshidratacioacuten previa
a b c
d e
Figura 1 Semillas de las cinco especies en estudio a) Lafoensia acuminata b) Senna alata c) Coccoloba ruiziana d) Myrtus communis e) Capparis flexuosa
CONTENIDO DE HUMEDAD
Colectadas la semillas se procedioacute a calcular en el laboratorio el porcentaje de humedad inicial de las mismas para ello se utilizaron dos reacuteplicas de 10 o 20 semillas (dependiendo del tamantildeo) el meacutetodo realizado fue de secado en estufa a temperatura baja y constante 103 degC por 17 horas (ISTA 2005) finalizado el procedimiento se utilizoacute la siguiente foacutermula para calcular el porcentaje de humedad
5
Formula (CH= pi-pfpi times 100) CH= Contenido de Humedad pi= peso inicial pf= peso final
DESHIDRATACIOacuteN DE SEMILLAS Determinado el contenido de humedad inicial de las semillas se determinoacute los diferentes porcentajes de humedad a deshidratar (tabla 1) en base al protocolo ldquoHANDLING OF DESICCATION AND TEMPERATURE SENSITIVE TREE SEEDSldquo establecido por ldquoThomsenrdquo (2000) Las semillas fueron colocadas en frascos de vidrio hermeacuteticos con gel de siacutelice como deshidratante Las semillas fueron pesadas cada 20 minutos durante el primer diacutea y en los posteriores diacuteas la toma de datos se realizoacute de una a dos veces durante el diacutea hasta que las semillas alcanzaron el peso y porcentaje de deshidratacioacuten deseado Tabla 1
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados para
las semillas de las especies en estudio
Especie CH inicial CH a deshidratar
Lafoensia acuminata 1237 129632
Senna alata 125 129632
Coccoloba ruiziana 2144 2015129632
Myrtus communis 35 3025201510532
Capparis flexuosa 45 4030201096532
VIABILIDAD DE SEMILLAS Para determinar la tolerancia a la desecacioacuten se evaluoacute la viabilidad de las semillas expresada en tiempo y porcentaje de germinacioacuten en cada nivel de deshidratacioacuten alcanzado para cada especie Para los ensayos de germinacioacuten se utilizo dos reacuteplicas de 25 semillas en cada nivel estas fueron sembradas en cajas petri sobre papel absorbente huacutemedo y colocadas en germinadores con periodos de 12 horas luz y 12 de oscuridad
EXTRACCIOacuteN Y CUANTIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
En todos los niveles deshidratados para cada una de las especies se realizoacute
la extraccioacuten de proteiacutenas de acuerdo al siguiente protocolo se trituroacute 05
6
gramos de semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido (figura 2 a) una vez
trituradas se maceroacute con el buffer de extraccioacuten de proteiacutenas (Tampoacuten Trisndash
HCl 001 M Mercaptoetanol 01 Aacutecido ascoacuterbico 005 M Tritoacuten Xndash100 al
01 Polivinilpolipirrolidona (PVP)) en tubos eppendorf y centrifugadas en
frio (4deg) a 12000-rpm por 45 minutos El sobrenadante obtenido se colocoacute
en tubos eppendorf (figura 2 b) en algunos casos fue necesario centrifugar
nuevamente por un minuto para eliminar completamente impurezas El
extracto final fue conservado en friacuteo a -20 degC hasta su posterior utilizacioacuten
a b c
Figura 2 Representacioacuten del procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenas a) trituracioacuten
de las semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido b) colocacioacuten del sobrenadante en
tubos eppendorf c) cuantificacioacuten de proteiacutenas en el Nanodrop 2000
La cuantificacioacuten de proteiacutenas totales se la realizoacute utilizando el meacutetodo
espectrofomeacutetrico de Bradford (1976) donde la curva de calibracioacuten se la
elaboro utilizando el reactivo de Bradford (Azuacutel de coomassie G-250 Pierce
Chem USA) y albuacutemina bovina fraccioacuten V (BSA Sigma) como estaacutendar La
cuantificacioacuten se la realizoacute en el equipo espectofotoacutemetro Nanodrop 2000
(figura 2 c)
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
IV
DEDICATORIA
Dedico este trabajo a Dios que siempre ha estado iluminando mi camino para poder ser un hombre de bien y poder terminar este difiacutecil proyecto A mi amada esposa Estefaniacutea Intildeiguez quien ha sido mi pilar para seguir adelante en los momentos maacutes difiacuteciles de este largo camino gracias por tu amor incondicional sin ti no lo habriacutea logrado A mi amado hijo Cristopher Matiacuteas Loayza quien es la razoacuten de mi existir y de mi superacioacuten Con profundo amor y agradecimiento a mis padres Vilma Jaramillo y Freddy Loayza por su amor y apoyo incondicional A mi hermana Andrea Loayza que siempre ha estado cuando maacutes la he necesitado A mis abuelitos Mariana Jaramillo y Rauacutel Jaramillo quienes han sido mas que unos padres para mi y gracias a ellos soy la persona que conocen ahora Y a todos mis tiacuteos y tiacuteas quienes me ayudaron a formarme Y una dedicatoria especial a mis queridos suegros Esmeralda Coacuterdova y Lauro Intildeiguez quienes me brindaron su apoyo incondicional en las buenas y malas les debo tanto y espero alguacuten diacutea poder retribuir a tanto iexclLos Amo
Freddy Javier Loayza Jaramillo Nombre del autor
V
AGRADECIMIENTOS A la Universidad Teacutecnica Particular de Loja al personal docente de la carrera de Gestioacuten Ambiental que con sus ensentildeanzas han contribuido a mi formacioacuten como profesional Al Banco de Germoplasma del Departamento de Ciencias Naturales por contribuir en mis conocimientos como estudiante y brindarme el apoyo en la realizacioacuten de mi proyecto de fin de carrera Al Ing Joseacute Miguel y las personas que forman el Instituto de Ecologiacutea por su constante apoyo y orientacioacuten en la realizacioacuten de mi trabajo Y un agradecimiento especial a mis Padres Suegros y Esposa por motivarme y apoyarme a seguir con mis estudios y ser mis pilares para cumplir con mis metas iexclGracias
Freddy Javier Loayza Jaramillo
VI
INDICE
Iacutendice de contenidos
CERTIFICACIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipI CESIOacuteN DE DERECHOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipII AUTORIAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIII DEDICATORhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIV AGRADECIMIENTOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipV INDICE DE CONTENIDOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipVI
RESUMENhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIX ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipX INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1 METODOLOGIacuteAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4 RESULTADOS Y DISCUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8 CONCLUCIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21 RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip22
BIBLIOGRAFIAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23 ANEXOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28
VII
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5
VIII
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Especies en estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4 Figura 2 Procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
IacuteNDICE DE GRAFICAS
Grafica 1 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8
Grafica 2 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip9
Grafica 3 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9
Grafica 4 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip10
Grafica 5 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Grafica 6 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip12
Grafica 7 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
Grafica 8 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
Grafica 9 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphellip15
Grafica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16
Grafica 11 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
Grafica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
Grafica 13 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18
Grafica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18
Grafica 15 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip19
Grafica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
IX
Grafica 17 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
Grafica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
Grafica 19 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
IX
RESUMEN
Las semillas como todo ser vivo tienen proteiacutenas las cuales son de gran
importancia para el normal funcionamiento de estas un procedimiento para
determinar la concentracioacuten de proteiacutenas en las semillas es el anaacutelisis
Bradford La peacuterdida neta de proteiacutenas en las semillas estaacute relacionado con
el envejecimiento por causa de la deshidratacioacuten El objetivo de este estudio
fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes niveles de humedad en
semillas con diferente comportamiento de conservacioacuten y determinar la
tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco especies
Los resultados mostraron que Lafoencia acuminata y Senna alata tienen una
tendencia de comportamiento ortodoxo mientras que Coccoloba ruiziana
presentoacute un comportamiento intermedio y en Myrtus communis y Capparis
flexuosa estas mostraron tendencia a un comportamiento recalcitrante
Cuatro especies presentaron concentraciones similares de proteiacutenas en las
semillas que van desde 0042 hasta las 6488 ugml excepto Myrtus
communis que presentoacute 177343 12919 y 16455 ugml proteiacutenas en los
niveles 25 20 y 10 de humedad respectivamente durante la deshidratacioacuten
no existiendo correlacioacuten entre cantidad de proteiacutenas y niveles de humedad
en las semillas
Palabras clave Proteiacutenas totales semillas ortodoxas semillas
recalcitrantes semillas intermedias Anaacutelisis bradford deshidratacioacuten
semillas
X
SUMMARY
The seeds are like all living proteins which are important for the normal
functioning of these a method for determining protein concentration in seed is
the Bradford analysis The net loss of the proteins in the seeds is related to
aging caused by dehydration The objective of this study was to quantify total
protein at various levels of moisture in different seed storage behavior and
determine the desiccation tolerance of the five species
The results showed that Senna alata Lafoencia acuminata and have a
tendency of orthodox behavior while Coccoloba ruiziana presented an
intermediate behavior and in the case of Myrtus communis and Capparis
flexuosa these tended to recalcitrant behavior Four species showed similar
concentrations of protein in seeds ranging from 0042 to the 6488 ug ml
except Myrtus communis presented 177343 12919 and 16455 ug ml
protein at levels 25 20 and 10 humidity respectively for the dehydration no
correlation exists between protein and moisture levels in the seeds
Keywords Total protein orthodox seeds recalcitrant seeds seeds
intermediate bradford Analysis dehydration seeds
1
INTRODUCCIOacuteN
En las semillas como en todo ser vivo existen proteiacutenas las cuales son de
gran importancia para el normal funcionamiento de estas en algunas
especies (Beevers amp Poulson 1992) Ellas constituyen maacutes del 50 del peso
seco de la ceacutelula las proteiacutenas maacutes comunes que encontramos en las
semillas son las globulinas albuminas prolaminas y proteiacutenas de
almacenamiento (Nielsen et al 1995) Ciertas cantidades de eacutestas se
acumulan en un corto periacuteodo de tiempo durante el desarrollo de la semilla
en muchas especies Las proteiacutenas de almacenamiento las prolaminas las
globulinas y las albuminas se acumulan poco en especies sin embargo
constituyen una alta proporcioacuten de la proteiacutena total de la semilla madura
(Laurie amp Robert 1990)
Estudios realizados con diferentes especies de semillas como por ejemplo
en el olivo y soja han demostrado que las proteiacutenas de reserva se
almacenan en el embrioacuten y el endospermo (Bawley amp Black 1994) Las
proteiacutenas de reserva en embriones y ceacutelulas vegetativas son sintetizadas
durante el desarrollo de la semilla e hidrolizadas durante la maduracioacuten
imbibicioacuten y germinacioacuten de estas proporcionando una de las principales
fuentes de carbono nitroacutegeno y azufre para el subsiguiente crecimiento y
desarrollo Estas proteiacutenas de reserva en ceacutelulas vegetativas proporcionan
una base para las semillas y frutos durante el crecimiento reproductivo y
para una raacutepida expansioacuten de las estructuras vegetativas despueacutes del
periodo de dormancia durante la germinacioacuten (Bawley amp Black 1994)
Un procedimiento para la determinacioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas en
las semillas es el anaacutelisis Bradford que consiste en la unioacuten de un colorante
Comassie Blue G-250 a las proteiacutenas Las proteiacutenas se unen a la forma azul
para formar un complejo proteiacutena-colorante con un coeficiente de extincioacuten
mayor que el colorante libre Este meacutetodo es sensible (1-15 μg) simple
raacutepido barato y pocas sustancias interfieren en su determinacioacuten como los
detergentes y las soluciones baacutesicas (Bradford 1976 Fernaacutendez 2007)
La peacuterdida neta de las proteiacutenas en las semillas es quizaacutes el deterioro maacutes
baacutesico de todos los eventos relacionados con el envejecimiento por causa de
la deshidratacioacuten ya que estos cambios podriacutean ser la base de todos los
demaacutes aspectos de la disminucioacuten del metabolismo La disminucioacuten en el
contenido de proteiacutenas por envejecimiento de las semillas puede ser debido
2
a 1) un dantildeo extenso en la siacutentesis de proteiacutenas reportado en diferentes
sistemas del cultivo (Hallman et al 1973) una germinacioacuten reducida o
semillas no viables en el aacuterbol (Espiacutendola et al 1994) oacute 2) la siacutentesis o la
activacioacuten de grandes cantidades de enzimas proteoliacuteticas durante el
deterioro de la semilla (Bewley amp Negro 1982)
La deshidratacioacuten es el procedimiento maacutes delicado en el tratamiento de las
semillas y uno de los problemas maacutes difiacuteciles de la conservacioacuten ex situ Es
necesario efectuar un seguimiento continuo de la deshidratacioacuten porque las
distintas etapas del desarrollo de las semillas estaacuten condicionadas por
factores mecaacutenicos quiacutemicos morfoloacutegicos y fisioloacutegicos que pueden
favorecer su germinacioacuten pero tambieacuten determinar la dormicioacuten Cada tipo
de semilla pasa por un proceso diferente de deshidratacioacuten que si se efectuacutea
mal puede comprometer la viabilidad de la misma (Genmedoc 2005)
La semilla es uno de los principales recursos para el manejo agriacutecola y
silviacutecola de las poblaciones vegetales para la reforestacioacuten para la
conservacioacuten del germoplasma vegetal y para la recuperacioacuten de especies
valiosas sobrexplotadas Eacutestas pueden almacenarse vivas por largos
periodos aseguraacutendose asiacute la preservacioacuten de especies y variedades de
plantas valiosas (Trujillo 1990) Para poder almacenar las semillas a largo
plazo es necesario que primero pasen por un proceso de deshidratacioacuten
pero lamentablemente todas las semillas difieren en su tolerancia a la
desecacioacuten Seguacuten este paraacutemetro las semillas se pueden clasificar en
ortodoxas recalcitrantes e intermedias (Farrant et al 1993) Las semillas
ortodoxas toleran una deshidratacioacuten hasta de 5 en el contenido de
humedad por su parte las semillas que toleran la deshidratacioacuten entre 10 y
125 de contenido de humedad se consideran intermedias y las que toleran
la deshidratacioacuten entre 15 y 50 de humedad se denominan recalcitrantes
(Farrant et al 1993 Gentil 2001)
En la mayoriacutea de especies recalcitrantes la reduccioacuten de humedad produce
una reduccioacuten de la germinacioacuten (Floriano 2004) un ejemplo claro es la
especie Quercus nigra que cuando su contenido de humedad baja al 30
la germinacioacuten se anula tal y como han puesto de manifiesto de Zulueta amp
Montoto (1992) Otro ejemplo que se da en las semillas recalcitrantes es la
familia del cafeacute el contenido de humedad miacutenimo que toleran las semillas de
C arabica C canephora y C liberica sin reducir su viabilidad es de
aproximadamente 9 11 y 24 respectivamente (Gentil 2001 amp Eira et al
2006) con reduccioacuten en la viabilidad a bajas temperaturas (Gentil 2001) a
diferencia de las semillas de C costatifructa C racemosa y C sessiliflora las
cuales mostraron un nivel criacutetico de humedad de semilla de 19 30 y 30
respectivamente (Dussert et al 1998)
3
Las semillas Ortodoxas sufren deterioro en su viabilidad pero a una tasa
inferior que las semillas recalcitrantes En estas los cambios en las reservas
de alimento almacenado parecen no afectar la viabilidad o vigor de la semilla
(Black M 1992) Un ejemplo claro de esto es la especie Cratylia argentea la
cual fue sometida a niveles de deshidratacioacuten del 10 8 y 6 siendo su
viabilidad del 95 86 y 76 respectivamente (Montoya amp Bonilla 2009)
El objetivo de este estudio fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes
niveles de humedad en semillas con diferente comportamiento de
conservacioacuten y determinar la tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco
especies
4
METODOLOGIA
COLECCIOacuteN DE MATERIAL
Se colectaron semillas maduras de las siguientes especies Lafoensia
acuminata (Ruiz y Pav) (Lythraceae) Senna alata (L) Roxb
(Cesalpinaceae) Coccoloba ruiziana (Lindau) (Polygonaceae) Myrtus
communis (Linneo) (Myrtaceae) y Capparis flexuosa (Linneo)
(Capparaceae) (figura 1) distribuidas en la provincia de Loja Las semillas
fueron transportadas al laboratorio del Banco de Germoplasma de la
Universidad Teacutecnica Particular de Loja en fundas de tela para evitar una
deshidratacioacuten previa
a b c
d e
Figura 1 Semillas de las cinco especies en estudio a) Lafoensia acuminata b) Senna alata c) Coccoloba ruiziana d) Myrtus communis e) Capparis flexuosa
CONTENIDO DE HUMEDAD
Colectadas la semillas se procedioacute a calcular en el laboratorio el porcentaje de humedad inicial de las mismas para ello se utilizaron dos reacuteplicas de 10 o 20 semillas (dependiendo del tamantildeo) el meacutetodo realizado fue de secado en estufa a temperatura baja y constante 103 degC por 17 horas (ISTA 2005) finalizado el procedimiento se utilizoacute la siguiente foacutermula para calcular el porcentaje de humedad
5
Formula (CH= pi-pfpi times 100) CH= Contenido de Humedad pi= peso inicial pf= peso final
DESHIDRATACIOacuteN DE SEMILLAS Determinado el contenido de humedad inicial de las semillas se determinoacute los diferentes porcentajes de humedad a deshidratar (tabla 1) en base al protocolo ldquoHANDLING OF DESICCATION AND TEMPERATURE SENSITIVE TREE SEEDSldquo establecido por ldquoThomsenrdquo (2000) Las semillas fueron colocadas en frascos de vidrio hermeacuteticos con gel de siacutelice como deshidratante Las semillas fueron pesadas cada 20 minutos durante el primer diacutea y en los posteriores diacuteas la toma de datos se realizoacute de una a dos veces durante el diacutea hasta que las semillas alcanzaron el peso y porcentaje de deshidratacioacuten deseado Tabla 1
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados para
las semillas de las especies en estudio
Especie CH inicial CH a deshidratar
Lafoensia acuminata 1237 129632
Senna alata 125 129632
Coccoloba ruiziana 2144 2015129632
Myrtus communis 35 3025201510532
Capparis flexuosa 45 4030201096532
VIABILIDAD DE SEMILLAS Para determinar la tolerancia a la desecacioacuten se evaluoacute la viabilidad de las semillas expresada en tiempo y porcentaje de germinacioacuten en cada nivel de deshidratacioacuten alcanzado para cada especie Para los ensayos de germinacioacuten se utilizo dos reacuteplicas de 25 semillas en cada nivel estas fueron sembradas en cajas petri sobre papel absorbente huacutemedo y colocadas en germinadores con periodos de 12 horas luz y 12 de oscuridad
EXTRACCIOacuteN Y CUANTIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
En todos los niveles deshidratados para cada una de las especies se realizoacute
la extraccioacuten de proteiacutenas de acuerdo al siguiente protocolo se trituroacute 05
6
gramos de semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido (figura 2 a) una vez
trituradas se maceroacute con el buffer de extraccioacuten de proteiacutenas (Tampoacuten Trisndash
HCl 001 M Mercaptoetanol 01 Aacutecido ascoacuterbico 005 M Tritoacuten Xndash100 al
01 Polivinilpolipirrolidona (PVP)) en tubos eppendorf y centrifugadas en
frio (4deg) a 12000-rpm por 45 minutos El sobrenadante obtenido se colocoacute
en tubos eppendorf (figura 2 b) en algunos casos fue necesario centrifugar
nuevamente por un minuto para eliminar completamente impurezas El
extracto final fue conservado en friacuteo a -20 degC hasta su posterior utilizacioacuten
a b c
Figura 2 Representacioacuten del procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenas a) trituracioacuten
de las semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido b) colocacioacuten del sobrenadante en
tubos eppendorf c) cuantificacioacuten de proteiacutenas en el Nanodrop 2000
La cuantificacioacuten de proteiacutenas totales se la realizoacute utilizando el meacutetodo
espectrofomeacutetrico de Bradford (1976) donde la curva de calibracioacuten se la
elaboro utilizando el reactivo de Bradford (Azuacutel de coomassie G-250 Pierce
Chem USA) y albuacutemina bovina fraccioacuten V (BSA Sigma) como estaacutendar La
cuantificacioacuten se la realizoacute en el equipo espectofotoacutemetro Nanodrop 2000
(figura 2 c)
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
V
AGRADECIMIENTOS A la Universidad Teacutecnica Particular de Loja al personal docente de la carrera de Gestioacuten Ambiental que con sus ensentildeanzas han contribuido a mi formacioacuten como profesional Al Banco de Germoplasma del Departamento de Ciencias Naturales por contribuir en mis conocimientos como estudiante y brindarme el apoyo en la realizacioacuten de mi proyecto de fin de carrera Al Ing Joseacute Miguel y las personas que forman el Instituto de Ecologiacutea por su constante apoyo y orientacioacuten en la realizacioacuten de mi trabajo Y un agradecimiento especial a mis Padres Suegros y Esposa por motivarme y apoyarme a seguir con mis estudios y ser mis pilares para cumplir con mis metas iexclGracias
Freddy Javier Loayza Jaramillo
VI
INDICE
Iacutendice de contenidos
CERTIFICACIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipI CESIOacuteN DE DERECHOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipII AUTORIAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIII DEDICATORhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIV AGRADECIMIENTOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipV INDICE DE CONTENIDOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipVI
RESUMENhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIX ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipX INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1 METODOLOGIacuteAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4 RESULTADOS Y DISCUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8 CONCLUCIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21 RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip22
BIBLIOGRAFIAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23 ANEXOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28
VII
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5
VIII
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Especies en estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4 Figura 2 Procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
IacuteNDICE DE GRAFICAS
Grafica 1 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8
Grafica 2 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip9
Grafica 3 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9
Grafica 4 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip10
Grafica 5 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Grafica 6 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip12
Grafica 7 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
Grafica 8 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
Grafica 9 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphellip15
Grafica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16
Grafica 11 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
Grafica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
Grafica 13 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18
Grafica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18
Grafica 15 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip19
Grafica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
IX
Grafica 17 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
Grafica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
Grafica 19 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
IX
RESUMEN
Las semillas como todo ser vivo tienen proteiacutenas las cuales son de gran
importancia para el normal funcionamiento de estas un procedimiento para
determinar la concentracioacuten de proteiacutenas en las semillas es el anaacutelisis
Bradford La peacuterdida neta de proteiacutenas en las semillas estaacute relacionado con
el envejecimiento por causa de la deshidratacioacuten El objetivo de este estudio
fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes niveles de humedad en
semillas con diferente comportamiento de conservacioacuten y determinar la
tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco especies
Los resultados mostraron que Lafoencia acuminata y Senna alata tienen una
tendencia de comportamiento ortodoxo mientras que Coccoloba ruiziana
presentoacute un comportamiento intermedio y en Myrtus communis y Capparis
flexuosa estas mostraron tendencia a un comportamiento recalcitrante
Cuatro especies presentaron concentraciones similares de proteiacutenas en las
semillas que van desde 0042 hasta las 6488 ugml excepto Myrtus
communis que presentoacute 177343 12919 y 16455 ugml proteiacutenas en los
niveles 25 20 y 10 de humedad respectivamente durante la deshidratacioacuten
no existiendo correlacioacuten entre cantidad de proteiacutenas y niveles de humedad
en las semillas
Palabras clave Proteiacutenas totales semillas ortodoxas semillas
recalcitrantes semillas intermedias Anaacutelisis bradford deshidratacioacuten
semillas
X
SUMMARY
The seeds are like all living proteins which are important for the normal
functioning of these a method for determining protein concentration in seed is
the Bradford analysis The net loss of the proteins in the seeds is related to
aging caused by dehydration The objective of this study was to quantify total
protein at various levels of moisture in different seed storage behavior and
determine the desiccation tolerance of the five species
The results showed that Senna alata Lafoencia acuminata and have a
tendency of orthodox behavior while Coccoloba ruiziana presented an
intermediate behavior and in the case of Myrtus communis and Capparis
flexuosa these tended to recalcitrant behavior Four species showed similar
concentrations of protein in seeds ranging from 0042 to the 6488 ug ml
except Myrtus communis presented 177343 12919 and 16455 ug ml
protein at levels 25 20 and 10 humidity respectively for the dehydration no
correlation exists between protein and moisture levels in the seeds
Keywords Total protein orthodox seeds recalcitrant seeds seeds
intermediate bradford Analysis dehydration seeds
1
INTRODUCCIOacuteN
En las semillas como en todo ser vivo existen proteiacutenas las cuales son de
gran importancia para el normal funcionamiento de estas en algunas
especies (Beevers amp Poulson 1992) Ellas constituyen maacutes del 50 del peso
seco de la ceacutelula las proteiacutenas maacutes comunes que encontramos en las
semillas son las globulinas albuminas prolaminas y proteiacutenas de
almacenamiento (Nielsen et al 1995) Ciertas cantidades de eacutestas se
acumulan en un corto periacuteodo de tiempo durante el desarrollo de la semilla
en muchas especies Las proteiacutenas de almacenamiento las prolaminas las
globulinas y las albuminas se acumulan poco en especies sin embargo
constituyen una alta proporcioacuten de la proteiacutena total de la semilla madura
(Laurie amp Robert 1990)
Estudios realizados con diferentes especies de semillas como por ejemplo
en el olivo y soja han demostrado que las proteiacutenas de reserva se
almacenan en el embrioacuten y el endospermo (Bawley amp Black 1994) Las
proteiacutenas de reserva en embriones y ceacutelulas vegetativas son sintetizadas
durante el desarrollo de la semilla e hidrolizadas durante la maduracioacuten
imbibicioacuten y germinacioacuten de estas proporcionando una de las principales
fuentes de carbono nitroacutegeno y azufre para el subsiguiente crecimiento y
desarrollo Estas proteiacutenas de reserva en ceacutelulas vegetativas proporcionan
una base para las semillas y frutos durante el crecimiento reproductivo y
para una raacutepida expansioacuten de las estructuras vegetativas despueacutes del
periodo de dormancia durante la germinacioacuten (Bawley amp Black 1994)
Un procedimiento para la determinacioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas en
las semillas es el anaacutelisis Bradford que consiste en la unioacuten de un colorante
Comassie Blue G-250 a las proteiacutenas Las proteiacutenas se unen a la forma azul
para formar un complejo proteiacutena-colorante con un coeficiente de extincioacuten
mayor que el colorante libre Este meacutetodo es sensible (1-15 μg) simple
raacutepido barato y pocas sustancias interfieren en su determinacioacuten como los
detergentes y las soluciones baacutesicas (Bradford 1976 Fernaacutendez 2007)
La peacuterdida neta de las proteiacutenas en las semillas es quizaacutes el deterioro maacutes
baacutesico de todos los eventos relacionados con el envejecimiento por causa de
la deshidratacioacuten ya que estos cambios podriacutean ser la base de todos los
demaacutes aspectos de la disminucioacuten del metabolismo La disminucioacuten en el
contenido de proteiacutenas por envejecimiento de las semillas puede ser debido
2
a 1) un dantildeo extenso en la siacutentesis de proteiacutenas reportado en diferentes
sistemas del cultivo (Hallman et al 1973) una germinacioacuten reducida o
semillas no viables en el aacuterbol (Espiacutendola et al 1994) oacute 2) la siacutentesis o la
activacioacuten de grandes cantidades de enzimas proteoliacuteticas durante el
deterioro de la semilla (Bewley amp Negro 1982)
La deshidratacioacuten es el procedimiento maacutes delicado en el tratamiento de las
semillas y uno de los problemas maacutes difiacuteciles de la conservacioacuten ex situ Es
necesario efectuar un seguimiento continuo de la deshidratacioacuten porque las
distintas etapas del desarrollo de las semillas estaacuten condicionadas por
factores mecaacutenicos quiacutemicos morfoloacutegicos y fisioloacutegicos que pueden
favorecer su germinacioacuten pero tambieacuten determinar la dormicioacuten Cada tipo
de semilla pasa por un proceso diferente de deshidratacioacuten que si se efectuacutea
mal puede comprometer la viabilidad de la misma (Genmedoc 2005)
La semilla es uno de los principales recursos para el manejo agriacutecola y
silviacutecola de las poblaciones vegetales para la reforestacioacuten para la
conservacioacuten del germoplasma vegetal y para la recuperacioacuten de especies
valiosas sobrexplotadas Eacutestas pueden almacenarse vivas por largos
periodos aseguraacutendose asiacute la preservacioacuten de especies y variedades de
plantas valiosas (Trujillo 1990) Para poder almacenar las semillas a largo
plazo es necesario que primero pasen por un proceso de deshidratacioacuten
pero lamentablemente todas las semillas difieren en su tolerancia a la
desecacioacuten Seguacuten este paraacutemetro las semillas se pueden clasificar en
ortodoxas recalcitrantes e intermedias (Farrant et al 1993) Las semillas
ortodoxas toleran una deshidratacioacuten hasta de 5 en el contenido de
humedad por su parte las semillas que toleran la deshidratacioacuten entre 10 y
125 de contenido de humedad se consideran intermedias y las que toleran
la deshidratacioacuten entre 15 y 50 de humedad se denominan recalcitrantes
(Farrant et al 1993 Gentil 2001)
En la mayoriacutea de especies recalcitrantes la reduccioacuten de humedad produce
una reduccioacuten de la germinacioacuten (Floriano 2004) un ejemplo claro es la
especie Quercus nigra que cuando su contenido de humedad baja al 30
la germinacioacuten se anula tal y como han puesto de manifiesto de Zulueta amp
Montoto (1992) Otro ejemplo que se da en las semillas recalcitrantes es la
familia del cafeacute el contenido de humedad miacutenimo que toleran las semillas de
C arabica C canephora y C liberica sin reducir su viabilidad es de
aproximadamente 9 11 y 24 respectivamente (Gentil 2001 amp Eira et al
2006) con reduccioacuten en la viabilidad a bajas temperaturas (Gentil 2001) a
diferencia de las semillas de C costatifructa C racemosa y C sessiliflora las
cuales mostraron un nivel criacutetico de humedad de semilla de 19 30 y 30
respectivamente (Dussert et al 1998)
3
Las semillas Ortodoxas sufren deterioro en su viabilidad pero a una tasa
inferior que las semillas recalcitrantes En estas los cambios en las reservas
de alimento almacenado parecen no afectar la viabilidad o vigor de la semilla
(Black M 1992) Un ejemplo claro de esto es la especie Cratylia argentea la
cual fue sometida a niveles de deshidratacioacuten del 10 8 y 6 siendo su
viabilidad del 95 86 y 76 respectivamente (Montoya amp Bonilla 2009)
El objetivo de este estudio fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes
niveles de humedad en semillas con diferente comportamiento de
conservacioacuten y determinar la tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco
especies
4
METODOLOGIA
COLECCIOacuteN DE MATERIAL
Se colectaron semillas maduras de las siguientes especies Lafoensia
acuminata (Ruiz y Pav) (Lythraceae) Senna alata (L) Roxb
(Cesalpinaceae) Coccoloba ruiziana (Lindau) (Polygonaceae) Myrtus
communis (Linneo) (Myrtaceae) y Capparis flexuosa (Linneo)
(Capparaceae) (figura 1) distribuidas en la provincia de Loja Las semillas
fueron transportadas al laboratorio del Banco de Germoplasma de la
Universidad Teacutecnica Particular de Loja en fundas de tela para evitar una
deshidratacioacuten previa
a b c
d e
Figura 1 Semillas de las cinco especies en estudio a) Lafoensia acuminata b) Senna alata c) Coccoloba ruiziana d) Myrtus communis e) Capparis flexuosa
CONTENIDO DE HUMEDAD
Colectadas la semillas se procedioacute a calcular en el laboratorio el porcentaje de humedad inicial de las mismas para ello se utilizaron dos reacuteplicas de 10 o 20 semillas (dependiendo del tamantildeo) el meacutetodo realizado fue de secado en estufa a temperatura baja y constante 103 degC por 17 horas (ISTA 2005) finalizado el procedimiento se utilizoacute la siguiente foacutermula para calcular el porcentaje de humedad
5
Formula (CH= pi-pfpi times 100) CH= Contenido de Humedad pi= peso inicial pf= peso final
DESHIDRATACIOacuteN DE SEMILLAS Determinado el contenido de humedad inicial de las semillas se determinoacute los diferentes porcentajes de humedad a deshidratar (tabla 1) en base al protocolo ldquoHANDLING OF DESICCATION AND TEMPERATURE SENSITIVE TREE SEEDSldquo establecido por ldquoThomsenrdquo (2000) Las semillas fueron colocadas en frascos de vidrio hermeacuteticos con gel de siacutelice como deshidratante Las semillas fueron pesadas cada 20 minutos durante el primer diacutea y en los posteriores diacuteas la toma de datos se realizoacute de una a dos veces durante el diacutea hasta que las semillas alcanzaron el peso y porcentaje de deshidratacioacuten deseado Tabla 1
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados para
las semillas de las especies en estudio
Especie CH inicial CH a deshidratar
Lafoensia acuminata 1237 129632
Senna alata 125 129632
Coccoloba ruiziana 2144 2015129632
Myrtus communis 35 3025201510532
Capparis flexuosa 45 4030201096532
VIABILIDAD DE SEMILLAS Para determinar la tolerancia a la desecacioacuten se evaluoacute la viabilidad de las semillas expresada en tiempo y porcentaje de germinacioacuten en cada nivel de deshidratacioacuten alcanzado para cada especie Para los ensayos de germinacioacuten se utilizo dos reacuteplicas de 25 semillas en cada nivel estas fueron sembradas en cajas petri sobre papel absorbente huacutemedo y colocadas en germinadores con periodos de 12 horas luz y 12 de oscuridad
EXTRACCIOacuteN Y CUANTIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
En todos los niveles deshidratados para cada una de las especies se realizoacute
la extraccioacuten de proteiacutenas de acuerdo al siguiente protocolo se trituroacute 05
6
gramos de semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido (figura 2 a) una vez
trituradas se maceroacute con el buffer de extraccioacuten de proteiacutenas (Tampoacuten Trisndash
HCl 001 M Mercaptoetanol 01 Aacutecido ascoacuterbico 005 M Tritoacuten Xndash100 al
01 Polivinilpolipirrolidona (PVP)) en tubos eppendorf y centrifugadas en
frio (4deg) a 12000-rpm por 45 minutos El sobrenadante obtenido se colocoacute
en tubos eppendorf (figura 2 b) en algunos casos fue necesario centrifugar
nuevamente por un minuto para eliminar completamente impurezas El
extracto final fue conservado en friacuteo a -20 degC hasta su posterior utilizacioacuten
a b c
Figura 2 Representacioacuten del procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenas a) trituracioacuten
de las semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido b) colocacioacuten del sobrenadante en
tubos eppendorf c) cuantificacioacuten de proteiacutenas en el Nanodrop 2000
La cuantificacioacuten de proteiacutenas totales se la realizoacute utilizando el meacutetodo
espectrofomeacutetrico de Bradford (1976) donde la curva de calibracioacuten se la
elaboro utilizando el reactivo de Bradford (Azuacutel de coomassie G-250 Pierce
Chem USA) y albuacutemina bovina fraccioacuten V (BSA Sigma) como estaacutendar La
cuantificacioacuten se la realizoacute en el equipo espectofotoacutemetro Nanodrop 2000
(figura 2 c)
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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ENLACES WEB
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4041 Sudaacutefrica Consultado el 16 de Abril del 2012 Disponible en
wwwrngrnet
Fernaacutendez E amp Galvaacuten A ldquoMeacutetodos Para la Cuantificacioacuten de
Proteiacutenasrdquo Coacuterdoba Argentina Consultado el 12 de Diciembre del
2011 Disponible en httpwwwucoes
28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
VI
INDICE
Iacutendice de contenidos
CERTIFICACIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipI CESIOacuteN DE DERECHOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipII AUTORIAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIII DEDICATORhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIV AGRADECIMIENTOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipV INDICE DE CONTENIDOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipVI
RESUMENhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipIX ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellipX INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1 METODOLOGIacuteAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4 RESULTADOS Y DISCUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8 CONCLUCIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21 RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip22
BIBLIOGRAFIAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23 ANEXOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip28
VII
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5
VIII
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Especies en estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4 Figura 2 Procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
IacuteNDICE DE GRAFICAS
Grafica 1 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8
Grafica 2 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip9
Grafica 3 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9
Grafica 4 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip10
Grafica 5 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Grafica 6 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip12
Grafica 7 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
Grafica 8 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
Grafica 9 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphellip15
Grafica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16
Grafica 11 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
Grafica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
Grafica 13 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18
Grafica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18
Grafica 15 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip19
Grafica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
IX
Grafica 17 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
Grafica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
Grafica 19 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
IX
RESUMEN
Las semillas como todo ser vivo tienen proteiacutenas las cuales son de gran
importancia para el normal funcionamiento de estas un procedimiento para
determinar la concentracioacuten de proteiacutenas en las semillas es el anaacutelisis
Bradford La peacuterdida neta de proteiacutenas en las semillas estaacute relacionado con
el envejecimiento por causa de la deshidratacioacuten El objetivo de este estudio
fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes niveles de humedad en
semillas con diferente comportamiento de conservacioacuten y determinar la
tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco especies
Los resultados mostraron que Lafoencia acuminata y Senna alata tienen una
tendencia de comportamiento ortodoxo mientras que Coccoloba ruiziana
presentoacute un comportamiento intermedio y en Myrtus communis y Capparis
flexuosa estas mostraron tendencia a un comportamiento recalcitrante
Cuatro especies presentaron concentraciones similares de proteiacutenas en las
semillas que van desde 0042 hasta las 6488 ugml excepto Myrtus
communis que presentoacute 177343 12919 y 16455 ugml proteiacutenas en los
niveles 25 20 y 10 de humedad respectivamente durante la deshidratacioacuten
no existiendo correlacioacuten entre cantidad de proteiacutenas y niveles de humedad
en las semillas
Palabras clave Proteiacutenas totales semillas ortodoxas semillas
recalcitrantes semillas intermedias Anaacutelisis bradford deshidratacioacuten
semillas
X
SUMMARY
The seeds are like all living proteins which are important for the normal
functioning of these a method for determining protein concentration in seed is
the Bradford analysis The net loss of the proteins in the seeds is related to
aging caused by dehydration The objective of this study was to quantify total
protein at various levels of moisture in different seed storage behavior and
determine the desiccation tolerance of the five species
The results showed that Senna alata Lafoencia acuminata and have a
tendency of orthodox behavior while Coccoloba ruiziana presented an
intermediate behavior and in the case of Myrtus communis and Capparis
flexuosa these tended to recalcitrant behavior Four species showed similar
concentrations of protein in seeds ranging from 0042 to the 6488 ug ml
except Myrtus communis presented 177343 12919 and 16455 ug ml
protein at levels 25 20 and 10 humidity respectively for the dehydration no
correlation exists between protein and moisture levels in the seeds
Keywords Total protein orthodox seeds recalcitrant seeds seeds
intermediate bradford Analysis dehydration seeds
1
INTRODUCCIOacuteN
En las semillas como en todo ser vivo existen proteiacutenas las cuales son de
gran importancia para el normal funcionamiento de estas en algunas
especies (Beevers amp Poulson 1992) Ellas constituyen maacutes del 50 del peso
seco de la ceacutelula las proteiacutenas maacutes comunes que encontramos en las
semillas son las globulinas albuminas prolaminas y proteiacutenas de
almacenamiento (Nielsen et al 1995) Ciertas cantidades de eacutestas se
acumulan en un corto periacuteodo de tiempo durante el desarrollo de la semilla
en muchas especies Las proteiacutenas de almacenamiento las prolaminas las
globulinas y las albuminas se acumulan poco en especies sin embargo
constituyen una alta proporcioacuten de la proteiacutena total de la semilla madura
(Laurie amp Robert 1990)
Estudios realizados con diferentes especies de semillas como por ejemplo
en el olivo y soja han demostrado que las proteiacutenas de reserva se
almacenan en el embrioacuten y el endospermo (Bawley amp Black 1994) Las
proteiacutenas de reserva en embriones y ceacutelulas vegetativas son sintetizadas
durante el desarrollo de la semilla e hidrolizadas durante la maduracioacuten
imbibicioacuten y germinacioacuten de estas proporcionando una de las principales
fuentes de carbono nitroacutegeno y azufre para el subsiguiente crecimiento y
desarrollo Estas proteiacutenas de reserva en ceacutelulas vegetativas proporcionan
una base para las semillas y frutos durante el crecimiento reproductivo y
para una raacutepida expansioacuten de las estructuras vegetativas despueacutes del
periodo de dormancia durante la germinacioacuten (Bawley amp Black 1994)
Un procedimiento para la determinacioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas en
las semillas es el anaacutelisis Bradford que consiste en la unioacuten de un colorante
Comassie Blue G-250 a las proteiacutenas Las proteiacutenas se unen a la forma azul
para formar un complejo proteiacutena-colorante con un coeficiente de extincioacuten
mayor que el colorante libre Este meacutetodo es sensible (1-15 μg) simple
raacutepido barato y pocas sustancias interfieren en su determinacioacuten como los
detergentes y las soluciones baacutesicas (Bradford 1976 Fernaacutendez 2007)
La peacuterdida neta de las proteiacutenas en las semillas es quizaacutes el deterioro maacutes
baacutesico de todos los eventos relacionados con el envejecimiento por causa de
la deshidratacioacuten ya que estos cambios podriacutean ser la base de todos los
demaacutes aspectos de la disminucioacuten del metabolismo La disminucioacuten en el
contenido de proteiacutenas por envejecimiento de las semillas puede ser debido
2
a 1) un dantildeo extenso en la siacutentesis de proteiacutenas reportado en diferentes
sistemas del cultivo (Hallman et al 1973) una germinacioacuten reducida o
semillas no viables en el aacuterbol (Espiacutendola et al 1994) oacute 2) la siacutentesis o la
activacioacuten de grandes cantidades de enzimas proteoliacuteticas durante el
deterioro de la semilla (Bewley amp Negro 1982)
La deshidratacioacuten es el procedimiento maacutes delicado en el tratamiento de las
semillas y uno de los problemas maacutes difiacuteciles de la conservacioacuten ex situ Es
necesario efectuar un seguimiento continuo de la deshidratacioacuten porque las
distintas etapas del desarrollo de las semillas estaacuten condicionadas por
factores mecaacutenicos quiacutemicos morfoloacutegicos y fisioloacutegicos que pueden
favorecer su germinacioacuten pero tambieacuten determinar la dormicioacuten Cada tipo
de semilla pasa por un proceso diferente de deshidratacioacuten que si se efectuacutea
mal puede comprometer la viabilidad de la misma (Genmedoc 2005)
La semilla es uno de los principales recursos para el manejo agriacutecola y
silviacutecola de las poblaciones vegetales para la reforestacioacuten para la
conservacioacuten del germoplasma vegetal y para la recuperacioacuten de especies
valiosas sobrexplotadas Eacutestas pueden almacenarse vivas por largos
periodos aseguraacutendose asiacute la preservacioacuten de especies y variedades de
plantas valiosas (Trujillo 1990) Para poder almacenar las semillas a largo
plazo es necesario que primero pasen por un proceso de deshidratacioacuten
pero lamentablemente todas las semillas difieren en su tolerancia a la
desecacioacuten Seguacuten este paraacutemetro las semillas se pueden clasificar en
ortodoxas recalcitrantes e intermedias (Farrant et al 1993) Las semillas
ortodoxas toleran una deshidratacioacuten hasta de 5 en el contenido de
humedad por su parte las semillas que toleran la deshidratacioacuten entre 10 y
125 de contenido de humedad se consideran intermedias y las que toleran
la deshidratacioacuten entre 15 y 50 de humedad se denominan recalcitrantes
(Farrant et al 1993 Gentil 2001)
En la mayoriacutea de especies recalcitrantes la reduccioacuten de humedad produce
una reduccioacuten de la germinacioacuten (Floriano 2004) un ejemplo claro es la
especie Quercus nigra que cuando su contenido de humedad baja al 30
la germinacioacuten se anula tal y como han puesto de manifiesto de Zulueta amp
Montoto (1992) Otro ejemplo que se da en las semillas recalcitrantes es la
familia del cafeacute el contenido de humedad miacutenimo que toleran las semillas de
C arabica C canephora y C liberica sin reducir su viabilidad es de
aproximadamente 9 11 y 24 respectivamente (Gentil 2001 amp Eira et al
2006) con reduccioacuten en la viabilidad a bajas temperaturas (Gentil 2001) a
diferencia de las semillas de C costatifructa C racemosa y C sessiliflora las
cuales mostraron un nivel criacutetico de humedad de semilla de 19 30 y 30
respectivamente (Dussert et al 1998)
3
Las semillas Ortodoxas sufren deterioro en su viabilidad pero a una tasa
inferior que las semillas recalcitrantes En estas los cambios en las reservas
de alimento almacenado parecen no afectar la viabilidad o vigor de la semilla
(Black M 1992) Un ejemplo claro de esto es la especie Cratylia argentea la
cual fue sometida a niveles de deshidratacioacuten del 10 8 y 6 siendo su
viabilidad del 95 86 y 76 respectivamente (Montoya amp Bonilla 2009)
El objetivo de este estudio fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes
niveles de humedad en semillas con diferente comportamiento de
conservacioacuten y determinar la tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco
especies
4
METODOLOGIA
COLECCIOacuteN DE MATERIAL
Se colectaron semillas maduras de las siguientes especies Lafoensia
acuminata (Ruiz y Pav) (Lythraceae) Senna alata (L) Roxb
(Cesalpinaceae) Coccoloba ruiziana (Lindau) (Polygonaceae) Myrtus
communis (Linneo) (Myrtaceae) y Capparis flexuosa (Linneo)
(Capparaceae) (figura 1) distribuidas en la provincia de Loja Las semillas
fueron transportadas al laboratorio del Banco de Germoplasma de la
Universidad Teacutecnica Particular de Loja en fundas de tela para evitar una
deshidratacioacuten previa
a b c
d e
Figura 1 Semillas de las cinco especies en estudio a) Lafoensia acuminata b) Senna alata c) Coccoloba ruiziana d) Myrtus communis e) Capparis flexuosa
CONTENIDO DE HUMEDAD
Colectadas la semillas se procedioacute a calcular en el laboratorio el porcentaje de humedad inicial de las mismas para ello se utilizaron dos reacuteplicas de 10 o 20 semillas (dependiendo del tamantildeo) el meacutetodo realizado fue de secado en estufa a temperatura baja y constante 103 degC por 17 horas (ISTA 2005) finalizado el procedimiento se utilizoacute la siguiente foacutermula para calcular el porcentaje de humedad
5
Formula (CH= pi-pfpi times 100) CH= Contenido de Humedad pi= peso inicial pf= peso final
DESHIDRATACIOacuteN DE SEMILLAS Determinado el contenido de humedad inicial de las semillas se determinoacute los diferentes porcentajes de humedad a deshidratar (tabla 1) en base al protocolo ldquoHANDLING OF DESICCATION AND TEMPERATURE SENSITIVE TREE SEEDSldquo establecido por ldquoThomsenrdquo (2000) Las semillas fueron colocadas en frascos de vidrio hermeacuteticos con gel de siacutelice como deshidratante Las semillas fueron pesadas cada 20 minutos durante el primer diacutea y en los posteriores diacuteas la toma de datos se realizoacute de una a dos veces durante el diacutea hasta que las semillas alcanzaron el peso y porcentaje de deshidratacioacuten deseado Tabla 1
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados para
las semillas de las especies en estudio
Especie CH inicial CH a deshidratar
Lafoensia acuminata 1237 129632
Senna alata 125 129632
Coccoloba ruiziana 2144 2015129632
Myrtus communis 35 3025201510532
Capparis flexuosa 45 4030201096532
VIABILIDAD DE SEMILLAS Para determinar la tolerancia a la desecacioacuten se evaluoacute la viabilidad de las semillas expresada en tiempo y porcentaje de germinacioacuten en cada nivel de deshidratacioacuten alcanzado para cada especie Para los ensayos de germinacioacuten se utilizo dos reacuteplicas de 25 semillas en cada nivel estas fueron sembradas en cajas petri sobre papel absorbente huacutemedo y colocadas en germinadores con periodos de 12 horas luz y 12 de oscuridad
EXTRACCIOacuteN Y CUANTIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
En todos los niveles deshidratados para cada una de las especies se realizoacute
la extraccioacuten de proteiacutenas de acuerdo al siguiente protocolo se trituroacute 05
6
gramos de semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido (figura 2 a) una vez
trituradas se maceroacute con el buffer de extraccioacuten de proteiacutenas (Tampoacuten Trisndash
HCl 001 M Mercaptoetanol 01 Aacutecido ascoacuterbico 005 M Tritoacuten Xndash100 al
01 Polivinilpolipirrolidona (PVP)) en tubos eppendorf y centrifugadas en
frio (4deg) a 12000-rpm por 45 minutos El sobrenadante obtenido se colocoacute
en tubos eppendorf (figura 2 b) en algunos casos fue necesario centrifugar
nuevamente por un minuto para eliminar completamente impurezas El
extracto final fue conservado en friacuteo a -20 degC hasta su posterior utilizacioacuten
a b c
Figura 2 Representacioacuten del procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenas a) trituracioacuten
de las semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido b) colocacioacuten del sobrenadante en
tubos eppendorf c) cuantificacioacuten de proteiacutenas en el Nanodrop 2000
La cuantificacioacuten de proteiacutenas totales se la realizoacute utilizando el meacutetodo
espectrofomeacutetrico de Bradford (1976) donde la curva de calibracioacuten se la
elaboro utilizando el reactivo de Bradford (Azuacutel de coomassie G-250 Pierce
Chem USA) y albuacutemina bovina fraccioacuten V (BSA Sigma) como estaacutendar La
cuantificacioacuten se la realizoacute en el equipo espectofotoacutemetro Nanodrop 2000
(figura 2 c)
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
BIBLIOGRAFIA
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
VII
IacuteNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5
VIII
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Especies en estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4 Figura 2 Procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
IacuteNDICE DE GRAFICAS
Grafica 1 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8
Grafica 2 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip9
Grafica 3 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9
Grafica 4 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip10
Grafica 5 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Grafica 6 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip12
Grafica 7 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
Grafica 8 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
Grafica 9 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphellip15
Grafica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16
Grafica 11 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
Grafica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
Grafica 13 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18
Grafica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18
Grafica 15 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip19
Grafica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
IX
Grafica 17 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
Grafica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
Grafica 19 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
IX
RESUMEN
Las semillas como todo ser vivo tienen proteiacutenas las cuales son de gran
importancia para el normal funcionamiento de estas un procedimiento para
determinar la concentracioacuten de proteiacutenas en las semillas es el anaacutelisis
Bradford La peacuterdida neta de proteiacutenas en las semillas estaacute relacionado con
el envejecimiento por causa de la deshidratacioacuten El objetivo de este estudio
fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes niveles de humedad en
semillas con diferente comportamiento de conservacioacuten y determinar la
tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco especies
Los resultados mostraron que Lafoencia acuminata y Senna alata tienen una
tendencia de comportamiento ortodoxo mientras que Coccoloba ruiziana
presentoacute un comportamiento intermedio y en Myrtus communis y Capparis
flexuosa estas mostraron tendencia a un comportamiento recalcitrante
Cuatro especies presentaron concentraciones similares de proteiacutenas en las
semillas que van desde 0042 hasta las 6488 ugml excepto Myrtus
communis que presentoacute 177343 12919 y 16455 ugml proteiacutenas en los
niveles 25 20 y 10 de humedad respectivamente durante la deshidratacioacuten
no existiendo correlacioacuten entre cantidad de proteiacutenas y niveles de humedad
en las semillas
Palabras clave Proteiacutenas totales semillas ortodoxas semillas
recalcitrantes semillas intermedias Anaacutelisis bradford deshidratacioacuten
semillas
X
SUMMARY
The seeds are like all living proteins which are important for the normal
functioning of these a method for determining protein concentration in seed is
the Bradford analysis The net loss of the proteins in the seeds is related to
aging caused by dehydration The objective of this study was to quantify total
protein at various levels of moisture in different seed storage behavior and
determine the desiccation tolerance of the five species
The results showed that Senna alata Lafoencia acuminata and have a
tendency of orthodox behavior while Coccoloba ruiziana presented an
intermediate behavior and in the case of Myrtus communis and Capparis
flexuosa these tended to recalcitrant behavior Four species showed similar
concentrations of protein in seeds ranging from 0042 to the 6488 ug ml
except Myrtus communis presented 177343 12919 and 16455 ug ml
protein at levels 25 20 and 10 humidity respectively for the dehydration no
correlation exists between protein and moisture levels in the seeds
Keywords Total protein orthodox seeds recalcitrant seeds seeds
intermediate bradford Analysis dehydration seeds
1
INTRODUCCIOacuteN
En las semillas como en todo ser vivo existen proteiacutenas las cuales son de
gran importancia para el normal funcionamiento de estas en algunas
especies (Beevers amp Poulson 1992) Ellas constituyen maacutes del 50 del peso
seco de la ceacutelula las proteiacutenas maacutes comunes que encontramos en las
semillas son las globulinas albuminas prolaminas y proteiacutenas de
almacenamiento (Nielsen et al 1995) Ciertas cantidades de eacutestas se
acumulan en un corto periacuteodo de tiempo durante el desarrollo de la semilla
en muchas especies Las proteiacutenas de almacenamiento las prolaminas las
globulinas y las albuminas se acumulan poco en especies sin embargo
constituyen una alta proporcioacuten de la proteiacutena total de la semilla madura
(Laurie amp Robert 1990)
Estudios realizados con diferentes especies de semillas como por ejemplo
en el olivo y soja han demostrado que las proteiacutenas de reserva se
almacenan en el embrioacuten y el endospermo (Bawley amp Black 1994) Las
proteiacutenas de reserva en embriones y ceacutelulas vegetativas son sintetizadas
durante el desarrollo de la semilla e hidrolizadas durante la maduracioacuten
imbibicioacuten y germinacioacuten de estas proporcionando una de las principales
fuentes de carbono nitroacutegeno y azufre para el subsiguiente crecimiento y
desarrollo Estas proteiacutenas de reserva en ceacutelulas vegetativas proporcionan
una base para las semillas y frutos durante el crecimiento reproductivo y
para una raacutepida expansioacuten de las estructuras vegetativas despueacutes del
periodo de dormancia durante la germinacioacuten (Bawley amp Black 1994)
Un procedimiento para la determinacioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas en
las semillas es el anaacutelisis Bradford que consiste en la unioacuten de un colorante
Comassie Blue G-250 a las proteiacutenas Las proteiacutenas se unen a la forma azul
para formar un complejo proteiacutena-colorante con un coeficiente de extincioacuten
mayor que el colorante libre Este meacutetodo es sensible (1-15 μg) simple
raacutepido barato y pocas sustancias interfieren en su determinacioacuten como los
detergentes y las soluciones baacutesicas (Bradford 1976 Fernaacutendez 2007)
La peacuterdida neta de las proteiacutenas en las semillas es quizaacutes el deterioro maacutes
baacutesico de todos los eventos relacionados con el envejecimiento por causa de
la deshidratacioacuten ya que estos cambios podriacutean ser la base de todos los
demaacutes aspectos de la disminucioacuten del metabolismo La disminucioacuten en el
contenido de proteiacutenas por envejecimiento de las semillas puede ser debido
2
a 1) un dantildeo extenso en la siacutentesis de proteiacutenas reportado en diferentes
sistemas del cultivo (Hallman et al 1973) una germinacioacuten reducida o
semillas no viables en el aacuterbol (Espiacutendola et al 1994) oacute 2) la siacutentesis o la
activacioacuten de grandes cantidades de enzimas proteoliacuteticas durante el
deterioro de la semilla (Bewley amp Negro 1982)
La deshidratacioacuten es el procedimiento maacutes delicado en el tratamiento de las
semillas y uno de los problemas maacutes difiacuteciles de la conservacioacuten ex situ Es
necesario efectuar un seguimiento continuo de la deshidratacioacuten porque las
distintas etapas del desarrollo de las semillas estaacuten condicionadas por
factores mecaacutenicos quiacutemicos morfoloacutegicos y fisioloacutegicos que pueden
favorecer su germinacioacuten pero tambieacuten determinar la dormicioacuten Cada tipo
de semilla pasa por un proceso diferente de deshidratacioacuten que si se efectuacutea
mal puede comprometer la viabilidad de la misma (Genmedoc 2005)
La semilla es uno de los principales recursos para el manejo agriacutecola y
silviacutecola de las poblaciones vegetales para la reforestacioacuten para la
conservacioacuten del germoplasma vegetal y para la recuperacioacuten de especies
valiosas sobrexplotadas Eacutestas pueden almacenarse vivas por largos
periodos aseguraacutendose asiacute la preservacioacuten de especies y variedades de
plantas valiosas (Trujillo 1990) Para poder almacenar las semillas a largo
plazo es necesario que primero pasen por un proceso de deshidratacioacuten
pero lamentablemente todas las semillas difieren en su tolerancia a la
desecacioacuten Seguacuten este paraacutemetro las semillas se pueden clasificar en
ortodoxas recalcitrantes e intermedias (Farrant et al 1993) Las semillas
ortodoxas toleran una deshidratacioacuten hasta de 5 en el contenido de
humedad por su parte las semillas que toleran la deshidratacioacuten entre 10 y
125 de contenido de humedad se consideran intermedias y las que toleran
la deshidratacioacuten entre 15 y 50 de humedad se denominan recalcitrantes
(Farrant et al 1993 Gentil 2001)
En la mayoriacutea de especies recalcitrantes la reduccioacuten de humedad produce
una reduccioacuten de la germinacioacuten (Floriano 2004) un ejemplo claro es la
especie Quercus nigra que cuando su contenido de humedad baja al 30
la germinacioacuten se anula tal y como han puesto de manifiesto de Zulueta amp
Montoto (1992) Otro ejemplo que se da en las semillas recalcitrantes es la
familia del cafeacute el contenido de humedad miacutenimo que toleran las semillas de
C arabica C canephora y C liberica sin reducir su viabilidad es de
aproximadamente 9 11 y 24 respectivamente (Gentil 2001 amp Eira et al
2006) con reduccioacuten en la viabilidad a bajas temperaturas (Gentil 2001) a
diferencia de las semillas de C costatifructa C racemosa y C sessiliflora las
cuales mostraron un nivel criacutetico de humedad de semilla de 19 30 y 30
respectivamente (Dussert et al 1998)
3
Las semillas Ortodoxas sufren deterioro en su viabilidad pero a una tasa
inferior que las semillas recalcitrantes En estas los cambios en las reservas
de alimento almacenado parecen no afectar la viabilidad o vigor de la semilla
(Black M 1992) Un ejemplo claro de esto es la especie Cratylia argentea la
cual fue sometida a niveles de deshidratacioacuten del 10 8 y 6 siendo su
viabilidad del 95 86 y 76 respectivamente (Montoya amp Bonilla 2009)
El objetivo de este estudio fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes
niveles de humedad en semillas con diferente comportamiento de
conservacioacuten y determinar la tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco
especies
4
METODOLOGIA
COLECCIOacuteN DE MATERIAL
Se colectaron semillas maduras de las siguientes especies Lafoensia
acuminata (Ruiz y Pav) (Lythraceae) Senna alata (L) Roxb
(Cesalpinaceae) Coccoloba ruiziana (Lindau) (Polygonaceae) Myrtus
communis (Linneo) (Myrtaceae) y Capparis flexuosa (Linneo)
(Capparaceae) (figura 1) distribuidas en la provincia de Loja Las semillas
fueron transportadas al laboratorio del Banco de Germoplasma de la
Universidad Teacutecnica Particular de Loja en fundas de tela para evitar una
deshidratacioacuten previa
a b c
d e
Figura 1 Semillas de las cinco especies en estudio a) Lafoensia acuminata b) Senna alata c) Coccoloba ruiziana d) Myrtus communis e) Capparis flexuosa
CONTENIDO DE HUMEDAD
Colectadas la semillas se procedioacute a calcular en el laboratorio el porcentaje de humedad inicial de las mismas para ello se utilizaron dos reacuteplicas de 10 o 20 semillas (dependiendo del tamantildeo) el meacutetodo realizado fue de secado en estufa a temperatura baja y constante 103 degC por 17 horas (ISTA 2005) finalizado el procedimiento se utilizoacute la siguiente foacutermula para calcular el porcentaje de humedad
5
Formula (CH= pi-pfpi times 100) CH= Contenido de Humedad pi= peso inicial pf= peso final
DESHIDRATACIOacuteN DE SEMILLAS Determinado el contenido de humedad inicial de las semillas se determinoacute los diferentes porcentajes de humedad a deshidratar (tabla 1) en base al protocolo ldquoHANDLING OF DESICCATION AND TEMPERATURE SENSITIVE TREE SEEDSldquo establecido por ldquoThomsenrdquo (2000) Las semillas fueron colocadas en frascos de vidrio hermeacuteticos con gel de siacutelice como deshidratante Las semillas fueron pesadas cada 20 minutos durante el primer diacutea y en los posteriores diacuteas la toma de datos se realizoacute de una a dos veces durante el diacutea hasta que las semillas alcanzaron el peso y porcentaje de deshidratacioacuten deseado Tabla 1
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados para
las semillas de las especies en estudio
Especie CH inicial CH a deshidratar
Lafoensia acuminata 1237 129632
Senna alata 125 129632
Coccoloba ruiziana 2144 2015129632
Myrtus communis 35 3025201510532
Capparis flexuosa 45 4030201096532
VIABILIDAD DE SEMILLAS Para determinar la tolerancia a la desecacioacuten se evaluoacute la viabilidad de las semillas expresada en tiempo y porcentaje de germinacioacuten en cada nivel de deshidratacioacuten alcanzado para cada especie Para los ensayos de germinacioacuten se utilizo dos reacuteplicas de 25 semillas en cada nivel estas fueron sembradas en cajas petri sobre papel absorbente huacutemedo y colocadas en germinadores con periodos de 12 horas luz y 12 de oscuridad
EXTRACCIOacuteN Y CUANTIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
En todos los niveles deshidratados para cada una de las especies se realizoacute
la extraccioacuten de proteiacutenas de acuerdo al siguiente protocolo se trituroacute 05
6
gramos de semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido (figura 2 a) una vez
trituradas se maceroacute con el buffer de extraccioacuten de proteiacutenas (Tampoacuten Trisndash
HCl 001 M Mercaptoetanol 01 Aacutecido ascoacuterbico 005 M Tritoacuten Xndash100 al
01 Polivinilpolipirrolidona (PVP)) en tubos eppendorf y centrifugadas en
frio (4deg) a 12000-rpm por 45 minutos El sobrenadante obtenido se colocoacute
en tubos eppendorf (figura 2 b) en algunos casos fue necesario centrifugar
nuevamente por un minuto para eliminar completamente impurezas El
extracto final fue conservado en friacuteo a -20 degC hasta su posterior utilizacioacuten
a b c
Figura 2 Representacioacuten del procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenas a) trituracioacuten
de las semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido b) colocacioacuten del sobrenadante en
tubos eppendorf c) cuantificacioacuten de proteiacutenas en el Nanodrop 2000
La cuantificacioacuten de proteiacutenas totales se la realizoacute utilizando el meacutetodo
espectrofomeacutetrico de Bradford (1976) donde la curva de calibracioacuten se la
elaboro utilizando el reactivo de Bradford (Azuacutel de coomassie G-250 Pierce
Chem USA) y albuacutemina bovina fraccioacuten V (BSA Sigma) como estaacutendar La
cuantificacioacuten se la realizoacute en el equipo espectofotoacutemetro Nanodrop 2000
(figura 2 c)
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
VIII
IacuteNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Especies en estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4 Figura 2 Procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
IacuteNDICE DE GRAFICAS
Grafica 1 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8
Grafica 2 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip9
Grafica 3 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9
Grafica 4 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip10
Grafica 5 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
Grafica 6 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphelliphellip12
Grafica 7 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
Grafica 8 Porcentajes de germinacioacuten y diacuteas transcurridos durante la
deshidratacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
Grafica 9 Diferencia significativa en base a la prueba de Tukeyhelliphelliphelliphellip15
Grafica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16
Grafica 11 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
Grafica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
Grafica 13 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18
Grafica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18
Grafica 15 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip19
Grafica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
IX
Grafica 17 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
Grafica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
Grafica 19 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
IX
RESUMEN
Las semillas como todo ser vivo tienen proteiacutenas las cuales son de gran
importancia para el normal funcionamiento de estas un procedimiento para
determinar la concentracioacuten de proteiacutenas en las semillas es el anaacutelisis
Bradford La peacuterdida neta de proteiacutenas en las semillas estaacute relacionado con
el envejecimiento por causa de la deshidratacioacuten El objetivo de este estudio
fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes niveles de humedad en
semillas con diferente comportamiento de conservacioacuten y determinar la
tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco especies
Los resultados mostraron que Lafoencia acuminata y Senna alata tienen una
tendencia de comportamiento ortodoxo mientras que Coccoloba ruiziana
presentoacute un comportamiento intermedio y en Myrtus communis y Capparis
flexuosa estas mostraron tendencia a un comportamiento recalcitrante
Cuatro especies presentaron concentraciones similares de proteiacutenas en las
semillas que van desde 0042 hasta las 6488 ugml excepto Myrtus
communis que presentoacute 177343 12919 y 16455 ugml proteiacutenas en los
niveles 25 20 y 10 de humedad respectivamente durante la deshidratacioacuten
no existiendo correlacioacuten entre cantidad de proteiacutenas y niveles de humedad
en las semillas
Palabras clave Proteiacutenas totales semillas ortodoxas semillas
recalcitrantes semillas intermedias Anaacutelisis bradford deshidratacioacuten
semillas
X
SUMMARY
The seeds are like all living proteins which are important for the normal
functioning of these a method for determining protein concentration in seed is
the Bradford analysis The net loss of the proteins in the seeds is related to
aging caused by dehydration The objective of this study was to quantify total
protein at various levels of moisture in different seed storage behavior and
determine the desiccation tolerance of the five species
The results showed that Senna alata Lafoencia acuminata and have a
tendency of orthodox behavior while Coccoloba ruiziana presented an
intermediate behavior and in the case of Myrtus communis and Capparis
flexuosa these tended to recalcitrant behavior Four species showed similar
concentrations of protein in seeds ranging from 0042 to the 6488 ug ml
except Myrtus communis presented 177343 12919 and 16455 ug ml
protein at levels 25 20 and 10 humidity respectively for the dehydration no
correlation exists between protein and moisture levels in the seeds
Keywords Total protein orthodox seeds recalcitrant seeds seeds
intermediate bradford Analysis dehydration seeds
1
INTRODUCCIOacuteN
En las semillas como en todo ser vivo existen proteiacutenas las cuales son de
gran importancia para el normal funcionamiento de estas en algunas
especies (Beevers amp Poulson 1992) Ellas constituyen maacutes del 50 del peso
seco de la ceacutelula las proteiacutenas maacutes comunes que encontramos en las
semillas son las globulinas albuminas prolaminas y proteiacutenas de
almacenamiento (Nielsen et al 1995) Ciertas cantidades de eacutestas se
acumulan en un corto periacuteodo de tiempo durante el desarrollo de la semilla
en muchas especies Las proteiacutenas de almacenamiento las prolaminas las
globulinas y las albuminas se acumulan poco en especies sin embargo
constituyen una alta proporcioacuten de la proteiacutena total de la semilla madura
(Laurie amp Robert 1990)
Estudios realizados con diferentes especies de semillas como por ejemplo
en el olivo y soja han demostrado que las proteiacutenas de reserva se
almacenan en el embrioacuten y el endospermo (Bawley amp Black 1994) Las
proteiacutenas de reserva en embriones y ceacutelulas vegetativas son sintetizadas
durante el desarrollo de la semilla e hidrolizadas durante la maduracioacuten
imbibicioacuten y germinacioacuten de estas proporcionando una de las principales
fuentes de carbono nitroacutegeno y azufre para el subsiguiente crecimiento y
desarrollo Estas proteiacutenas de reserva en ceacutelulas vegetativas proporcionan
una base para las semillas y frutos durante el crecimiento reproductivo y
para una raacutepida expansioacuten de las estructuras vegetativas despueacutes del
periodo de dormancia durante la germinacioacuten (Bawley amp Black 1994)
Un procedimiento para la determinacioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas en
las semillas es el anaacutelisis Bradford que consiste en la unioacuten de un colorante
Comassie Blue G-250 a las proteiacutenas Las proteiacutenas se unen a la forma azul
para formar un complejo proteiacutena-colorante con un coeficiente de extincioacuten
mayor que el colorante libre Este meacutetodo es sensible (1-15 μg) simple
raacutepido barato y pocas sustancias interfieren en su determinacioacuten como los
detergentes y las soluciones baacutesicas (Bradford 1976 Fernaacutendez 2007)
La peacuterdida neta de las proteiacutenas en las semillas es quizaacutes el deterioro maacutes
baacutesico de todos los eventos relacionados con el envejecimiento por causa de
la deshidratacioacuten ya que estos cambios podriacutean ser la base de todos los
demaacutes aspectos de la disminucioacuten del metabolismo La disminucioacuten en el
contenido de proteiacutenas por envejecimiento de las semillas puede ser debido
2
a 1) un dantildeo extenso en la siacutentesis de proteiacutenas reportado en diferentes
sistemas del cultivo (Hallman et al 1973) una germinacioacuten reducida o
semillas no viables en el aacuterbol (Espiacutendola et al 1994) oacute 2) la siacutentesis o la
activacioacuten de grandes cantidades de enzimas proteoliacuteticas durante el
deterioro de la semilla (Bewley amp Negro 1982)
La deshidratacioacuten es el procedimiento maacutes delicado en el tratamiento de las
semillas y uno de los problemas maacutes difiacuteciles de la conservacioacuten ex situ Es
necesario efectuar un seguimiento continuo de la deshidratacioacuten porque las
distintas etapas del desarrollo de las semillas estaacuten condicionadas por
factores mecaacutenicos quiacutemicos morfoloacutegicos y fisioloacutegicos que pueden
favorecer su germinacioacuten pero tambieacuten determinar la dormicioacuten Cada tipo
de semilla pasa por un proceso diferente de deshidratacioacuten que si se efectuacutea
mal puede comprometer la viabilidad de la misma (Genmedoc 2005)
La semilla es uno de los principales recursos para el manejo agriacutecola y
silviacutecola de las poblaciones vegetales para la reforestacioacuten para la
conservacioacuten del germoplasma vegetal y para la recuperacioacuten de especies
valiosas sobrexplotadas Eacutestas pueden almacenarse vivas por largos
periodos aseguraacutendose asiacute la preservacioacuten de especies y variedades de
plantas valiosas (Trujillo 1990) Para poder almacenar las semillas a largo
plazo es necesario que primero pasen por un proceso de deshidratacioacuten
pero lamentablemente todas las semillas difieren en su tolerancia a la
desecacioacuten Seguacuten este paraacutemetro las semillas se pueden clasificar en
ortodoxas recalcitrantes e intermedias (Farrant et al 1993) Las semillas
ortodoxas toleran una deshidratacioacuten hasta de 5 en el contenido de
humedad por su parte las semillas que toleran la deshidratacioacuten entre 10 y
125 de contenido de humedad se consideran intermedias y las que toleran
la deshidratacioacuten entre 15 y 50 de humedad se denominan recalcitrantes
(Farrant et al 1993 Gentil 2001)
En la mayoriacutea de especies recalcitrantes la reduccioacuten de humedad produce
una reduccioacuten de la germinacioacuten (Floriano 2004) un ejemplo claro es la
especie Quercus nigra que cuando su contenido de humedad baja al 30
la germinacioacuten se anula tal y como han puesto de manifiesto de Zulueta amp
Montoto (1992) Otro ejemplo que se da en las semillas recalcitrantes es la
familia del cafeacute el contenido de humedad miacutenimo que toleran las semillas de
C arabica C canephora y C liberica sin reducir su viabilidad es de
aproximadamente 9 11 y 24 respectivamente (Gentil 2001 amp Eira et al
2006) con reduccioacuten en la viabilidad a bajas temperaturas (Gentil 2001) a
diferencia de las semillas de C costatifructa C racemosa y C sessiliflora las
cuales mostraron un nivel criacutetico de humedad de semilla de 19 30 y 30
respectivamente (Dussert et al 1998)
3
Las semillas Ortodoxas sufren deterioro en su viabilidad pero a una tasa
inferior que las semillas recalcitrantes En estas los cambios en las reservas
de alimento almacenado parecen no afectar la viabilidad o vigor de la semilla
(Black M 1992) Un ejemplo claro de esto es la especie Cratylia argentea la
cual fue sometida a niveles de deshidratacioacuten del 10 8 y 6 siendo su
viabilidad del 95 86 y 76 respectivamente (Montoya amp Bonilla 2009)
El objetivo de este estudio fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes
niveles de humedad en semillas con diferente comportamiento de
conservacioacuten y determinar la tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco
especies
4
METODOLOGIA
COLECCIOacuteN DE MATERIAL
Se colectaron semillas maduras de las siguientes especies Lafoensia
acuminata (Ruiz y Pav) (Lythraceae) Senna alata (L) Roxb
(Cesalpinaceae) Coccoloba ruiziana (Lindau) (Polygonaceae) Myrtus
communis (Linneo) (Myrtaceae) y Capparis flexuosa (Linneo)
(Capparaceae) (figura 1) distribuidas en la provincia de Loja Las semillas
fueron transportadas al laboratorio del Banco de Germoplasma de la
Universidad Teacutecnica Particular de Loja en fundas de tela para evitar una
deshidratacioacuten previa
a b c
d e
Figura 1 Semillas de las cinco especies en estudio a) Lafoensia acuminata b) Senna alata c) Coccoloba ruiziana d) Myrtus communis e) Capparis flexuosa
CONTENIDO DE HUMEDAD
Colectadas la semillas se procedioacute a calcular en el laboratorio el porcentaje de humedad inicial de las mismas para ello se utilizaron dos reacuteplicas de 10 o 20 semillas (dependiendo del tamantildeo) el meacutetodo realizado fue de secado en estufa a temperatura baja y constante 103 degC por 17 horas (ISTA 2005) finalizado el procedimiento se utilizoacute la siguiente foacutermula para calcular el porcentaje de humedad
5
Formula (CH= pi-pfpi times 100) CH= Contenido de Humedad pi= peso inicial pf= peso final
DESHIDRATACIOacuteN DE SEMILLAS Determinado el contenido de humedad inicial de las semillas se determinoacute los diferentes porcentajes de humedad a deshidratar (tabla 1) en base al protocolo ldquoHANDLING OF DESICCATION AND TEMPERATURE SENSITIVE TREE SEEDSldquo establecido por ldquoThomsenrdquo (2000) Las semillas fueron colocadas en frascos de vidrio hermeacuteticos con gel de siacutelice como deshidratante Las semillas fueron pesadas cada 20 minutos durante el primer diacutea y en los posteriores diacuteas la toma de datos se realizoacute de una a dos veces durante el diacutea hasta que las semillas alcanzaron el peso y porcentaje de deshidratacioacuten deseado Tabla 1
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados para
las semillas de las especies en estudio
Especie CH inicial CH a deshidratar
Lafoensia acuminata 1237 129632
Senna alata 125 129632
Coccoloba ruiziana 2144 2015129632
Myrtus communis 35 3025201510532
Capparis flexuosa 45 4030201096532
VIABILIDAD DE SEMILLAS Para determinar la tolerancia a la desecacioacuten se evaluoacute la viabilidad de las semillas expresada en tiempo y porcentaje de germinacioacuten en cada nivel de deshidratacioacuten alcanzado para cada especie Para los ensayos de germinacioacuten se utilizo dos reacuteplicas de 25 semillas en cada nivel estas fueron sembradas en cajas petri sobre papel absorbente huacutemedo y colocadas en germinadores con periodos de 12 horas luz y 12 de oscuridad
EXTRACCIOacuteN Y CUANTIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
En todos los niveles deshidratados para cada una de las especies se realizoacute
la extraccioacuten de proteiacutenas de acuerdo al siguiente protocolo se trituroacute 05
6
gramos de semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido (figura 2 a) una vez
trituradas se maceroacute con el buffer de extraccioacuten de proteiacutenas (Tampoacuten Trisndash
HCl 001 M Mercaptoetanol 01 Aacutecido ascoacuterbico 005 M Tritoacuten Xndash100 al
01 Polivinilpolipirrolidona (PVP)) en tubos eppendorf y centrifugadas en
frio (4deg) a 12000-rpm por 45 minutos El sobrenadante obtenido se colocoacute
en tubos eppendorf (figura 2 b) en algunos casos fue necesario centrifugar
nuevamente por un minuto para eliminar completamente impurezas El
extracto final fue conservado en friacuteo a -20 degC hasta su posterior utilizacioacuten
a b c
Figura 2 Representacioacuten del procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenas a) trituracioacuten
de las semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido b) colocacioacuten del sobrenadante en
tubos eppendorf c) cuantificacioacuten de proteiacutenas en el Nanodrop 2000
La cuantificacioacuten de proteiacutenas totales se la realizoacute utilizando el meacutetodo
espectrofomeacutetrico de Bradford (1976) donde la curva de calibracioacuten se la
elaboro utilizando el reactivo de Bradford (Azuacutel de coomassie G-250 Pierce
Chem USA) y albuacutemina bovina fraccioacuten V (BSA Sigma) como estaacutendar La
cuantificacioacuten se la realizoacute en el equipo espectofotoacutemetro Nanodrop 2000
(figura 2 c)
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
IX
Grafica 17 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip20
Grafica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
Grafica 19 Regresioacuten lineal programa Xlstathelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
IX
RESUMEN
Las semillas como todo ser vivo tienen proteiacutenas las cuales son de gran
importancia para el normal funcionamiento de estas un procedimiento para
determinar la concentracioacuten de proteiacutenas en las semillas es el anaacutelisis
Bradford La peacuterdida neta de proteiacutenas en las semillas estaacute relacionado con
el envejecimiento por causa de la deshidratacioacuten El objetivo de este estudio
fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes niveles de humedad en
semillas con diferente comportamiento de conservacioacuten y determinar la
tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco especies
Los resultados mostraron que Lafoencia acuminata y Senna alata tienen una
tendencia de comportamiento ortodoxo mientras que Coccoloba ruiziana
presentoacute un comportamiento intermedio y en Myrtus communis y Capparis
flexuosa estas mostraron tendencia a un comportamiento recalcitrante
Cuatro especies presentaron concentraciones similares de proteiacutenas en las
semillas que van desde 0042 hasta las 6488 ugml excepto Myrtus
communis que presentoacute 177343 12919 y 16455 ugml proteiacutenas en los
niveles 25 20 y 10 de humedad respectivamente durante la deshidratacioacuten
no existiendo correlacioacuten entre cantidad de proteiacutenas y niveles de humedad
en las semillas
Palabras clave Proteiacutenas totales semillas ortodoxas semillas
recalcitrantes semillas intermedias Anaacutelisis bradford deshidratacioacuten
semillas
X
SUMMARY
The seeds are like all living proteins which are important for the normal
functioning of these a method for determining protein concentration in seed is
the Bradford analysis The net loss of the proteins in the seeds is related to
aging caused by dehydration The objective of this study was to quantify total
protein at various levels of moisture in different seed storage behavior and
determine the desiccation tolerance of the five species
The results showed that Senna alata Lafoencia acuminata and have a
tendency of orthodox behavior while Coccoloba ruiziana presented an
intermediate behavior and in the case of Myrtus communis and Capparis
flexuosa these tended to recalcitrant behavior Four species showed similar
concentrations of protein in seeds ranging from 0042 to the 6488 ug ml
except Myrtus communis presented 177343 12919 and 16455 ug ml
protein at levels 25 20 and 10 humidity respectively for the dehydration no
correlation exists between protein and moisture levels in the seeds
Keywords Total protein orthodox seeds recalcitrant seeds seeds
intermediate bradford Analysis dehydration seeds
1
INTRODUCCIOacuteN
En las semillas como en todo ser vivo existen proteiacutenas las cuales son de
gran importancia para el normal funcionamiento de estas en algunas
especies (Beevers amp Poulson 1992) Ellas constituyen maacutes del 50 del peso
seco de la ceacutelula las proteiacutenas maacutes comunes que encontramos en las
semillas son las globulinas albuminas prolaminas y proteiacutenas de
almacenamiento (Nielsen et al 1995) Ciertas cantidades de eacutestas se
acumulan en un corto periacuteodo de tiempo durante el desarrollo de la semilla
en muchas especies Las proteiacutenas de almacenamiento las prolaminas las
globulinas y las albuminas se acumulan poco en especies sin embargo
constituyen una alta proporcioacuten de la proteiacutena total de la semilla madura
(Laurie amp Robert 1990)
Estudios realizados con diferentes especies de semillas como por ejemplo
en el olivo y soja han demostrado que las proteiacutenas de reserva se
almacenan en el embrioacuten y el endospermo (Bawley amp Black 1994) Las
proteiacutenas de reserva en embriones y ceacutelulas vegetativas son sintetizadas
durante el desarrollo de la semilla e hidrolizadas durante la maduracioacuten
imbibicioacuten y germinacioacuten de estas proporcionando una de las principales
fuentes de carbono nitroacutegeno y azufre para el subsiguiente crecimiento y
desarrollo Estas proteiacutenas de reserva en ceacutelulas vegetativas proporcionan
una base para las semillas y frutos durante el crecimiento reproductivo y
para una raacutepida expansioacuten de las estructuras vegetativas despueacutes del
periodo de dormancia durante la germinacioacuten (Bawley amp Black 1994)
Un procedimiento para la determinacioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas en
las semillas es el anaacutelisis Bradford que consiste en la unioacuten de un colorante
Comassie Blue G-250 a las proteiacutenas Las proteiacutenas se unen a la forma azul
para formar un complejo proteiacutena-colorante con un coeficiente de extincioacuten
mayor que el colorante libre Este meacutetodo es sensible (1-15 μg) simple
raacutepido barato y pocas sustancias interfieren en su determinacioacuten como los
detergentes y las soluciones baacutesicas (Bradford 1976 Fernaacutendez 2007)
La peacuterdida neta de las proteiacutenas en las semillas es quizaacutes el deterioro maacutes
baacutesico de todos los eventos relacionados con el envejecimiento por causa de
la deshidratacioacuten ya que estos cambios podriacutean ser la base de todos los
demaacutes aspectos de la disminucioacuten del metabolismo La disminucioacuten en el
contenido de proteiacutenas por envejecimiento de las semillas puede ser debido
2
a 1) un dantildeo extenso en la siacutentesis de proteiacutenas reportado en diferentes
sistemas del cultivo (Hallman et al 1973) una germinacioacuten reducida o
semillas no viables en el aacuterbol (Espiacutendola et al 1994) oacute 2) la siacutentesis o la
activacioacuten de grandes cantidades de enzimas proteoliacuteticas durante el
deterioro de la semilla (Bewley amp Negro 1982)
La deshidratacioacuten es el procedimiento maacutes delicado en el tratamiento de las
semillas y uno de los problemas maacutes difiacuteciles de la conservacioacuten ex situ Es
necesario efectuar un seguimiento continuo de la deshidratacioacuten porque las
distintas etapas del desarrollo de las semillas estaacuten condicionadas por
factores mecaacutenicos quiacutemicos morfoloacutegicos y fisioloacutegicos que pueden
favorecer su germinacioacuten pero tambieacuten determinar la dormicioacuten Cada tipo
de semilla pasa por un proceso diferente de deshidratacioacuten que si se efectuacutea
mal puede comprometer la viabilidad de la misma (Genmedoc 2005)
La semilla es uno de los principales recursos para el manejo agriacutecola y
silviacutecola de las poblaciones vegetales para la reforestacioacuten para la
conservacioacuten del germoplasma vegetal y para la recuperacioacuten de especies
valiosas sobrexplotadas Eacutestas pueden almacenarse vivas por largos
periodos aseguraacutendose asiacute la preservacioacuten de especies y variedades de
plantas valiosas (Trujillo 1990) Para poder almacenar las semillas a largo
plazo es necesario que primero pasen por un proceso de deshidratacioacuten
pero lamentablemente todas las semillas difieren en su tolerancia a la
desecacioacuten Seguacuten este paraacutemetro las semillas se pueden clasificar en
ortodoxas recalcitrantes e intermedias (Farrant et al 1993) Las semillas
ortodoxas toleran una deshidratacioacuten hasta de 5 en el contenido de
humedad por su parte las semillas que toleran la deshidratacioacuten entre 10 y
125 de contenido de humedad se consideran intermedias y las que toleran
la deshidratacioacuten entre 15 y 50 de humedad se denominan recalcitrantes
(Farrant et al 1993 Gentil 2001)
En la mayoriacutea de especies recalcitrantes la reduccioacuten de humedad produce
una reduccioacuten de la germinacioacuten (Floriano 2004) un ejemplo claro es la
especie Quercus nigra que cuando su contenido de humedad baja al 30
la germinacioacuten se anula tal y como han puesto de manifiesto de Zulueta amp
Montoto (1992) Otro ejemplo que se da en las semillas recalcitrantes es la
familia del cafeacute el contenido de humedad miacutenimo que toleran las semillas de
C arabica C canephora y C liberica sin reducir su viabilidad es de
aproximadamente 9 11 y 24 respectivamente (Gentil 2001 amp Eira et al
2006) con reduccioacuten en la viabilidad a bajas temperaturas (Gentil 2001) a
diferencia de las semillas de C costatifructa C racemosa y C sessiliflora las
cuales mostraron un nivel criacutetico de humedad de semilla de 19 30 y 30
respectivamente (Dussert et al 1998)
3
Las semillas Ortodoxas sufren deterioro en su viabilidad pero a una tasa
inferior que las semillas recalcitrantes En estas los cambios en las reservas
de alimento almacenado parecen no afectar la viabilidad o vigor de la semilla
(Black M 1992) Un ejemplo claro de esto es la especie Cratylia argentea la
cual fue sometida a niveles de deshidratacioacuten del 10 8 y 6 siendo su
viabilidad del 95 86 y 76 respectivamente (Montoya amp Bonilla 2009)
El objetivo de este estudio fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes
niveles de humedad en semillas con diferente comportamiento de
conservacioacuten y determinar la tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco
especies
4
METODOLOGIA
COLECCIOacuteN DE MATERIAL
Se colectaron semillas maduras de las siguientes especies Lafoensia
acuminata (Ruiz y Pav) (Lythraceae) Senna alata (L) Roxb
(Cesalpinaceae) Coccoloba ruiziana (Lindau) (Polygonaceae) Myrtus
communis (Linneo) (Myrtaceae) y Capparis flexuosa (Linneo)
(Capparaceae) (figura 1) distribuidas en la provincia de Loja Las semillas
fueron transportadas al laboratorio del Banco de Germoplasma de la
Universidad Teacutecnica Particular de Loja en fundas de tela para evitar una
deshidratacioacuten previa
a b c
d e
Figura 1 Semillas de las cinco especies en estudio a) Lafoensia acuminata b) Senna alata c) Coccoloba ruiziana d) Myrtus communis e) Capparis flexuosa
CONTENIDO DE HUMEDAD
Colectadas la semillas se procedioacute a calcular en el laboratorio el porcentaje de humedad inicial de las mismas para ello se utilizaron dos reacuteplicas de 10 o 20 semillas (dependiendo del tamantildeo) el meacutetodo realizado fue de secado en estufa a temperatura baja y constante 103 degC por 17 horas (ISTA 2005) finalizado el procedimiento se utilizoacute la siguiente foacutermula para calcular el porcentaje de humedad
5
Formula (CH= pi-pfpi times 100) CH= Contenido de Humedad pi= peso inicial pf= peso final
DESHIDRATACIOacuteN DE SEMILLAS Determinado el contenido de humedad inicial de las semillas se determinoacute los diferentes porcentajes de humedad a deshidratar (tabla 1) en base al protocolo ldquoHANDLING OF DESICCATION AND TEMPERATURE SENSITIVE TREE SEEDSldquo establecido por ldquoThomsenrdquo (2000) Las semillas fueron colocadas en frascos de vidrio hermeacuteticos con gel de siacutelice como deshidratante Las semillas fueron pesadas cada 20 minutos durante el primer diacutea y en los posteriores diacuteas la toma de datos se realizoacute de una a dos veces durante el diacutea hasta que las semillas alcanzaron el peso y porcentaje de deshidratacioacuten deseado Tabla 1
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados para
las semillas de las especies en estudio
Especie CH inicial CH a deshidratar
Lafoensia acuminata 1237 129632
Senna alata 125 129632
Coccoloba ruiziana 2144 2015129632
Myrtus communis 35 3025201510532
Capparis flexuosa 45 4030201096532
VIABILIDAD DE SEMILLAS Para determinar la tolerancia a la desecacioacuten se evaluoacute la viabilidad de las semillas expresada en tiempo y porcentaje de germinacioacuten en cada nivel de deshidratacioacuten alcanzado para cada especie Para los ensayos de germinacioacuten se utilizo dos reacuteplicas de 25 semillas en cada nivel estas fueron sembradas en cajas petri sobre papel absorbente huacutemedo y colocadas en germinadores con periodos de 12 horas luz y 12 de oscuridad
EXTRACCIOacuteN Y CUANTIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
En todos los niveles deshidratados para cada una de las especies se realizoacute
la extraccioacuten de proteiacutenas de acuerdo al siguiente protocolo se trituroacute 05
6
gramos de semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido (figura 2 a) una vez
trituradas se maceroacute con el buffer de extraccioacuten de proteiacutenas (Tampoacuten Trisndash
HCl 001 M Mercaptoetanol 01 Aacutecido ascoacuterbico 005 M Tritoacuten Xndash100 al
01 Polivinilpolipirrolidona (PVP)) en tubos eppendorf y centrifugadas en
frio (4deg) a 12000-rpm por 45 minutos El sobrenadante obtenido se colocoacute
en tubos eppendorf (figura 2 b) en algunos casos fue necesario centrifugar
nuevamente por un minuto para eliminar completamente impurezas El
extracto final fue conservado en friacuteo a -20 degC hasta su posterior utilizacioacuten
a b c
Figura 2 Representacioacuten del procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenas a) trituracioacuten
de las semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido b) colocacioacuten del sobrenadante en
tubos eppendorf c) cuantificacioacuten de proteiacutenas en el Nanodrop 2000
La cuantificacioacuten de proteiacutenas totales se la realizoacute utilizando el meacutetodo
espectrofomeacutetrico de Bradford (1976) donde la curva de calibracioacuten se la
elaboro utilizando el reactivo de Bradford (Azuacutel de coomassie G-250 Pierce
Chem USA) y albuacutemina bovina fraccioacuten V (BSA Sigma) como estaacutendar La
cuantificacioacuten se la realizoacute en el equipo espectofotoacutemetro Nanodrop 2000
(figura 2 c)
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
IX
RESUMEN
Las semillas como todo ser vivo tienen proteiacutenas las cuales son de gran
importancia para el normal funcionamiento de estas un procedimiento para
determinar la concentracioacuten de proteiacutenas en las semillas es el anaacutelisis
Bradford La peacuterdida neta de proteiacutenas en las semillas estaacute relacionado con
el envejecimiento por causa de la deshidratacioacuten El objetivo de este estudio
fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes niveles de humedad en
semillas con diferente comportamiento de conservacioacuten y determinar la
tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco especies
Los resultados mostraron que Lafoencia acuminata y Senna alata tienen una
tendencia de comportamiento ortodoxo mientras que Coccoloba ruiziana
presentoacute un comportamiento intermedio y en Myrtus communis y Capparis
flexuosa estas mostraron tendencia a un comportamiento recalcitrante
Cuatro especies presentaron concentraciones similares de proteiacutenas en las
semillas que van desde 0042 hasta las 6488 ugml excepto Myrtus
communis que presentoacute 177343 12919 y 16455 ugml proteiacutenas en los
niveles 25 20 y 10 de humedad respectivamente durante la deshidratacioacuten
no existiendo correlacioacuten entre cantidad de proteiacutenas y niveles de humedad
en las semillas
Palabras clave Proteiacutenas totales semillas ortodoxas semillas
recalcitrantes semillas intermedias Anaacutelisis bradford deshidratacioacuten
semillas
X
SUMMARY
The seeds are like all living proteins which are important for the normal
functioning of these a method for determining protein concentration in seed is
the Bradford analysis The net loss of the proteins in the seeds is related to
aging caused by dehydration The objective of this study was to quantify total
protein at various levels of moisture in different seed storage behavior and
determine the desiccation tolerance of the five species
The results showed that Senna alata Lafoencia acuminata and have a
tendency of orthodox behavior while Coccoloba ruiziana presented an
intermediate behavior and in the case of Myrtus communis and Capparis
flexuosa these tended to recalcitrant behavior Four species showed similar
concentrations of protein in seeds ranging from 0042 to the 6488 ug ml
except Myrtus communis presented 177343 12919 and 16455 ug ml
protein at levels 25 20 and 10 humidity respectively for the dehydration no
correlation exists between protein and moisture levels in the seeds
Keywords Total protein orthodox seeds recalcitrant seeds seeds
intermediate bradford Analysis dehydration seeds
1
INTRODUCCIOacuteN
En las semillas como en todo ser vivo existen proteiacutenas las cuales son de
gran importancia para el normal funcionamiento de estas en algunas
especies (Beevers amp Poulson 1992) Ellas constituyen maacutes del 50 del peso
seco de la ceacutelula las proteiacutenas maacutes comunes que encontramos en las
semillas son las globulinas albuminas prolaminas y proteiacutenas de
almacenamiento (Nielsen et al 1995) Ciertas cantidades de eacutestas se
acumulan en un corto periacuteodo de tiempo durante el desarrollo de la semilla
en muchas especies Las proteiacutenas de almacenamiento las prolaminas las
globulinas y las albuminas se acumulan poco en especies sin embargo
constituyen una alta proporcioacuten de la proteiacutena total de la semilla madura
(Laurie amp Robert 1990)
Estudios realizados con diferentes especies de semillas como por ejemplo
en el olivo y soja han demostrado que las proteiacutenas de reserva se
almacenan en el embrioacuten y el endospermo (Bawley amp Black 1994) Las
proteiacutenas de reserva en embriones y ceacutelulas vegetativas son sintetizadas
durante el desarrollo de la semilla e hidrolizadas durante la maduracioacuten
imbibicioacuten y germinacioacuten de estas proporcionando una de las principales
fuentes de carbono nitroacutegeno y azufre para el subsiguiente crecimiento y
desarrollo Estas proteiacutenas de reserva en ceacutelulas vegetativas proporcionan
una base para las semillas y frutos durante el crecimiento reproductivo y
para una raacutepida expansioacuten de las estructuras vegetativas despueacutes del
periodo de dormancia durante la germinacioacuten (Bawley amp Black 1994)
Un procedimiento para la determinacioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas en
las semillas es el anaacutelisis Bradford que consiste en la unioacuten de un colorante
Comassie Blue G-250 a las proteiacutenas Las proteiacutenas se unen a la forma azul
para formar un complejo proteiacutena-colorante con un coeficiente de extincioacuten
mayor que el colorante libre Este meacutetodo es sensible (1-15 μg) simple
raacutepido barato y pocas sustancias interfieren en su determinacioacuten como los
detergentes y las soluciones baacutesicas (Bradford 1976 Fernaacutendez 2007)
La peacuterdida neta de las proteiacutenas en las semillas es quizaacutes el deterioro maacutes
baacutesico de todos los eventos relacionados con el envejecimiento por causa de
la deshidratacioacuten ya que estos cambios podriacutean ser la base de todos los
demaacutes aspectos de la disminucioacuten del metabolismo La disminucioacuten en el
contenido de proteiacutenas por envejecimiento de las semillas puede ser debido
2
a 1) un dantildeo extenso en la siacutentesis de proteiacutenas reportado en diferentes
sistemas del cultivo (Hallman et al 1973) una germinacioacuten reducida o
semillas no viables en el aacuterbol (Espiacutendola et al 1994) oacute 2) la siacutentesis o la
activacioacuten de grandes cantidades de enzimas proteoliacuteticas durante el
deterioro de la semilla (Bewley amp Negro 1982)
La deshidratacioacuten es el procedimiento maacutes delicado en el tratamiento de las
semillas y uno de los problemas maacutes difiacuteciles de la conservacioacuten ex situ Es
necesario efectuar un seguimiento continuo de la deshidratacioacuten porque las
distintas etapas del desarrollo de las semillas estaacuten condicionadas por
factores mecaacutenicos quiacutemicos morfoloacutegicos y fisioloacutegicos que pueden
favorecer su germinacioacuten pero tambieacuten determinar la dormicioacuten Cada tipo
de semilla pasa por un proceso diferente de deshidratacioacuten que si se efectuacutea
mal puede comprometer la viabilidad de la misma (Genmedoc 2005)
La semilla es uno de los principales recursos para el manejo agriacutecola y
silviacutecola de las poblaciones vegetales para la reforestacioacuten para la
conservacioacuten del germoplasma vegetal y para la recuperacioacuten de especies
valiosas sobrexplotadas Eacutestas pueden almacenarse vivas por largos
periodos aseguraacutendose asiacute la preservacioacuten de especies y variedades de
plantas valiosas (Trujillo 1990) Para poder almacenar las semillas a largo
plazo es necesario que primero pasen por un proceso de deshidratacioacuten
pero lamentablemente todas las semillas difieren en su tolerancia a la
desecacioacuten Seguacuten este paraacutemetro las semillas se pueden clasificar en
ortodoxas recalcitrantes e intermedias (Farrant et al 1993) Las semillas
ortodoxas toleran una deshidratacioacuten hasta de 5 en el contenido de
humedad por su parte las semillas que toleran la deshidratacioacuten entre 10 y
125 de contenido de humedad se consideran intermedias y las que toleran
la deshidratacioacuten entre 15 y 50 de humedad se denominan recalcitrantes
(Farrant et al 1993 Gentil 2001)
En la mayoriacutea de especies recalcitrantes la reduccioacuten de humedad produce
una reduccioacuten de la germinacioacuten (Floriano 2004) un ejemplo claro es la
especie Quercus nigra que cuando su contenido de humedad baja al 30
la germinacioacuten se anula tal y como han puesto de manifiesto de Zulueta amp
Montoto (1992) Otro ejemplo que se da en las semillas recalcitrantes es la
familia del cafeacute el contenido de humedad miacutenimo que toleran las semillas de
C arabica C canephora y C liberica sin reducir su viabilidad es de
aproximadamente 9 11 y 24 respectivamente (Gentil 2001 amp Eira et al
2006) con reduccioacuten en la viabilidad a bajas temperaturas (Gentil 2001) a
diferencia de las semillas de C costatifructa C racemosa y C sessiliflora las
cuales mostraron un nivel criacutetico de humedad de semilla de 19 30 y 30
respectivamente (Dussert et al 1998)
3
Las semillas Ortodoxas sufren deterioro en su viabilidad pero a una tasa
inferior que las semillas recalcitrantes En estas los cambios en las reservas
de alimento almacenado parecen no afectar la viabilidad o vigor de la semilla
(Black M 1992) Un ejemplo claro de esto es la especie Cratylia argentea la
cual fue sometida a niveles de deshidratacioacuten del 10 8 y 6 siendo su
viabilidad del 95 86 y 76 respectivamente (Montoya amp Bonilla 2009)
El objetivo de este estudio fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes
niveles de humedad en semillas con diferente comportamiento de
conservacioacuten y determinar la tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco
especies
4
METODOLOGIA
COLECCIOacuteN DE MATERIAL
Se colectaron semillas maduras de las siguientes especies Lafoensia
acuminata (Ruiz y Pav) (Lythraceae) Senna alata (L) Roxb
(Cesalpinaceae) Coccoloba ruiziana (Lindau) (Polygonaceae) Myrtus
communis (Linneo) (Myrtaceae) y Capparis flexuosa (Linneo)
(Capparaceae) (figura 1) distribuidas en la provincia de Loja Las semillas
fueron transportadas al laboratorio del Banco de Germoplasma de la
Universidad Teacutecnica Particular de Loja en fundas de tela para evitar una
deshidratacioacuten previa
a b c
d e
Figura 1 Semillas de las cinco especies en estudio a) Lafoensia acuminata b) Senna alata c) Coccoloba ruiziana d) Myrtus communis e) Capparis flexuosa
CONTENIDO DE HUMEDAD
Colectadas la semillas se procedioacute a calcular en el laboratorio el porcentaje de humedad inicial de las mismas para ello se utilizaron dos reacuteplicas de 10 o 20 semillas (dependiendo del tamantildeo) el meacutetodo realizado fue de secado en estufa a temperatura baja y constante 103 degC por 17 horas (ISTA 2005) finalizado el procedimiento se utilizoacute la siguiente foacutermula para calcular el porcentaje de humedad
5
Formula (CH= pi-pfpi times 100) CH= Contenido de Humedad pi= peso inicial pf= peso final
DESHIDRATACIOacuteN DE SEMILLAS Determinado el contenido de humedad inicial de las semillas se determinoacute los diferentes porcentajes de humedad a deshidratar (tabla 1) en base al protocolo ldquoHANDLING OF DESICCATION AND TEMPERATURE SENSITIVE TREE SEEDSldquo establecido por ldquoThomsenrdquo (2000) Las semillas fueron colocadas en frascos de vidrio hermeacuteticos con gel de siacutelice como deshidratante Las semillas fueron pesadas cada 20 minutos durante el primer diacutea y en los posteriores diacuteas la toma de datos se realizoacute de una a dos veces durante el diacutea hasta que las semillas alcanzaron el peso y porcentaje de deshidratacioacuten deseado Tabla 1
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados para
las semillas de las especies en estudio
Especie CH inicial CH a deshidratar
Lafoensia acuminata 1237 129632
Senna alata 125 129632
Coccoloba ruiziana 2144 2015129632
Myrtus communis 35 3025201510532
Capparis flexuosa 45 4030201096532
VIABILIDAD DE SEMILLAS Para determinar la tolerancia a la desecacioacuten se evaluoacute la viabilidad de las semillas expresada en tiempo y porcentaje de germinacioacuten en cada nivel de deshidratacioacuten alcanzado para cada especie Para los ensayos de germinacioacuten se utilizo dos reacuteplicas de 25 semillas en cada nivel estas fueron sembradas en cajas petri sobre papel absorbente huacutemedo y colocadas en germinadores con periodos de 12 horas luz y 12 de oscuridad
EXTRACCIOacuteN Y CUANTIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
En todos los niveles deshidratados para cada una de las especies se realizoacute
la extraccioacuten de proteiacutenas de acuerdo al siguiente protocolo se trituroacute 05
6
gramos de semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido (figura 2 a) una vez
trituradas se maceroacute con el buffer de extraccioacuten de proteiacutenas (Tampoacuten Trisndash
HCl 001 M Mercaptoetanol 01 Aacutecido ascoacuterbico 005 M Tritoacuten Xndash100 al
01 Polivinilpolipirrolidona (PVP)) en tubos eppendorf y centrifugadas en
frio (4deg) a 12000-rpm por 45 minutos El sobrenadante obtenido se colocoacute
en tubos eppendorf (figura 2 b) en algunos casos fue necesario centrifugar
nuevamente por un minuto para eliminar completamente impurezas El
extracto final fue conservado en friacuteo a -20 degC hasta su posterior utilizacioacuten
a b c
Figura 2 Representacioacuten del procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenas a) trituracioacuten
de las semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido b) colocacioacuten del sobrenadante en
tubos eppendorf c) cuantificacioacuten de proteiacutenas en el Nanodrop 2000
La cuantificacioacuten de proteiacutenas totales se la realizoacute utilizando el meacutetodo
espectrofomeacutetrico de Bradford (1976) donde la curva de calibracioacuten se la
elaboro utilizando el reactivo de Bradford (Azuacutel de coomassie G-250 Pierce
Chem USA) y albuacutemina bovina fraccioacuten V (BSA Sigma) como estaacutendar La
cuantificacioacuten se la realizoacute en el equipo espectofotoacutemetro Nanodrop 2000
(figura 2 c)
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
X
SUMMARY
The seeds are like all living proteins which are important for the normal
functioning of these a method for determining protein concentration in seed is
the Bradford analysis The net loss of the proteins in the seeds is related to
aging caused by dehydration The objective of this study was to quantify total
protein at various levels of moisture in different seed storage behavior and
determine the desiccation tolerance of the five species
The results showed that Senna alata Lafoencia acuminata and have a
tendency of orthodox behavior while Coccoloba ruiziana presented an
intermediate behavior and in the case of Myrtus communis and Capparis
flexuosa these tended to recalcitrant behavior Four species showed similar
concentrations of protein in seeds ranging from 0042 to the 6488 ug ml
except Myrtus communis presented 177343 12919 and 16455 ug ml
protein at levels 25 20 and 10 humidity respectively for the dehydration no
correlation exists between protein and moisture levels in the seeds
Keywords Total protein orthodox seeds recalcitrant seeds seeds
intermediate bradford Analysis dehydration seeds
1
INTRODUCCIOacuteN
En las semillas como en todo ser vivo existen proteiacutenas las cuales son de
gran importancia para el normal funcionamiento de estas en algunas
especies (Beevers amp Poulson 1992) Ellas constituyen maacutes del 50 del peso
seco de la ceacutelula las proteiacutenas maacutes comunes que encontramos en las
semillas son las globulinas albuminas prolaminas y proteiacutenas de
almacenamiento (Nielsen et al 1995) Ciertas cantidades de eacutestas se
acumulan en un corto periacuteodo de tiempo durante el desarrollo de la semilla
en muchas especies Las proteiacutenas de almacenamiento las prolaminas las
globulinas y las albuminas se acumulan poco en especies sin embargo
constituyen una alta proporcioacuten de la proteiacutena total de la semilla madura
(Laurie amp Robert 1990)
Estudios realizados con diferentes especies de semillas como por ejemplo
en el olivo y soja han demostrado que las proteiacutenas de reserva se
almacenan en el embrioacuten y el endospermo (Bawley amp Black 1994) Las
proteiacutenas de reserva en embriones y ceacutelulas vegetativas son sintetizadas
durante el desarrollo de la semilla e hidrolizadas durante la maduracioacuten
imbibicioacuten y germinacioacuten de estas proporcionando una de las principales
fuentes de carbono nitroacutegeno y azufre para el subsiguiente crecimiento y
desarrollo Estas proteiacutenas de reserva en ceacutelulas vegetativas proporcionan
una base para las semillas y frutos durante el crecimiento reproductivo y
para una raacutepida expansioacuten de las estructuras vegetativas despueacutes del
periodo de dormancia durante la germinacioacuten (Bawley amp Black 1994)
Un procedimiento para la determinacioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas en
las semillas es el anaacutelisis Bradford que consiste en la unioacuten de un colorante
Comassie Blue G-250 a las proteiacutenas Las proteiacutenas se unen a la forma azul
para formar un complejo proteiacutena-colorante con un coeficiente de extincioacuten
mayor que el colorante libre Este meacutetodo es sensible (1-15 μg) simple
raacutepido barato y pocas sustancias interfieren en su determinacioacuten como los
detergentes y las soluciones baacutesicas (Bradford 1976 Fernaacutendez 2007)
La peacuterdida neta de las proteiacutenas en las semillas es quizaacutes el deterioro maacutes
baacutesico de todos los eventos relacionados con el envejecimiento por causa de
la deshidratacioacuten ya que estos cambios podriacutean ser la base de todos los
demaacutes aspectos de la disminucioacuten del metabolismo La disminucioacuten en el
contenido de proteiacutenas por envejecimiento de las semillas puede ser debido
2
a 1) un dantildeo extenso en la siacutentesis de proteiacutenas reportado en diferentes
sistemas del cultivo (Hallman et al 1973) una germinacioacuten reducida o
semillas no viables en el aacuterbol (Espiacutendola et al 1994) oacute 2) la siacutentesis o la
activacioacuten de grandes cantidades de enzimas proteoliacuteticas durante el
deterioro de la semilla (Bewley amp Negro 1982)
La deshidratacioacuten es el procedimiento maacutes delicado en el tratamiento de las
semillas y uno de los problemas maacutes difiacuteciles de la conservacioacuten ex situ Es
necesario efectuar un seguimiento continuo de la deshidratacioacuten porque las
distintas etapas del desarrollo de las semillas estaacuten condicionadas por
factores mecaacutenicos quiacutemicos morfoloacutegicos y fisioloacutegicos que pueden
favorecer su germinacioacuten pero tambieacuten determinar la dormicioacuten Cada tipo
de semilla pasa por un proceso diferente de deshidratacioacuten que si se efectuacutea
mal puede comprometer la viabilidad de la misma (Genmedoc 2005)
La semilla es uno de los principales recursos para el manejo agriacutecola y
silviacutecola de las poblaciones vegetales para la reforestacioacuten para la
conservacioacuten del germoplasma vegetal y para la recuperacioacuten de especies
valiosas sobrexplotadas Eacutestas pueden almacenarse vivas por largos
periodos aseguraacutendose asiacute la preservacioacuten de especies y variedades de
plantas valiosas (Trujillo 1990) Para poder almacenar las semillas a largo
plazo es necesario que primero pasen por un proceso de deshidratacioacuten
pero lamentablemente todas las semillas difieren en su tolerancia a la
desecacioacuten Seguacuten este paraacutemetro las semillas se pueden clasificar en
ortodoxas recalcitrantes e intermedias (Farrant et al 1993) Las semillas
ortodoxas toleran una deshidratacioacuten hasta de 5 en el contenido de
humedad por su parte las semillas que toleran la deshidratacioacuten entre 10 y
125 de contenido de humedad se consideran intermedias y las que toleran
la deshidratacioacuten entre 15 y 50 de humedad se denominan recalcitrantes
(Farrant et al 1993 Gentil 2001)
En la mayoriacutea de especies recalcitrantes la reduccioacuten de humedad produce
una reduccioacuten de la germinacioacuten (Floriano 2004) un ejemplo claro es la
especie Quercus nigra que cuando su contenido de humedad baja al 30
la germinacioacuten se anula tal y como han puesto de manifiesto de Zulueta amp
Montoto (1992) Otro ejemplo que se da en las semillas recalcitrantes es la
familia del cafeacute el contenido de humedad miacutenimo que toleran las semillas de
C arabica C canephora y C liberica sin reducir su viabilidad es de
aproximadamente 9 11 y 24 respectivamente (Gentil 2001 amp Eira et al
2006) con reduccioacuten en la viabilidad a bajas temperaturas (Gentil 2001) a
diferencia de las semillas de C costatifructa C racemosa y C sessiliflora las
cuales mostraron un nivel criacutetico de humedad de semilla de 19 30 y 30
respectivamente (Dussert et al 1998)
3
Las semillas Ortodoxas sufren deterioro en su viabilidad pero a una tasa
inferior que las semillas recalcitrantes En estas los cambios en las reservas
de alimento almacenado parecen no afectar la viabilidad o vigor de la semilla
(Black M 1992) Un ejemplo claro de esto es la especie Cratylia argentea la
cual fue sometida a niveles de deshidratacioacuten del 10 8 y 6 siendo su
viabilidad del 95 86 y 76 respectivamente (Montoya amp Bonilla 2009)
El objetivo de este estudio fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes
niveles de humedad en semillas con diferente comportamiento de
conservacioacuten y determinar la tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco
especies
4
METODOLOGIA
COLECCIOacuteN DE MATERIAL
Se colectaron semillas maduras de las siguientes especies Lafoensia
acuminata (Ruiz y Pav) (Lythraceae) Senna alata (L) Roxb
(Cesalpinaceae) Coccoloba ruiziana (Lindau) (Polygonaceae) Myrtus
communis (Linneo) (Myrtaceae) y Capparis flexuosa (Linneo)
(Capparaceae) (figura 1) distribuidas en la provincia de Loja Las semillas
fueron transportadas al laboratorio del Banco de Germoplasma de la
Universidad Teacutecnica Particular de Loja en fundas de tela para evitar una
deshidratacioacuten previa
a b c
d e
Figura 1 Semillas de las cinco especies en estudio a) Lafoensia acuminata b) Senna alata c) Coccoloba ruiziana d) Myrtus communis e) Capparis flexuosa
CONTENIDO DE HUMEDAD
Colectadas la semillas se procedioacute a calcular en el laboratorio el porcentaje de humedad inicial de las mismas para ello se utilizaron dos reacuteplicas de 10 o 20 semillas (dependiendo del tamantildeo) el meacutetodo realizado fue de secado en estufa a temperatura baja y constante 103 degC por 17 horas (ISTA 2005) finalizado el procedimiento se utilizoacute la siguiente foacutermula para calcular el porcentaje de humedad
5
Formula (CH= pi-pfpi times 100) CH= Contenido de Humedad pi= peso inicial pf= peso final
DESHIDRATACIOacuteN DE SEMILLAS Determinado el contenido de humedad inicial de las semillas se determinoacute los diferentes porcentajes de humedad a deshidratar (tabla 1) en base al protocolo ldquoHANDLING OF DESICCATION AND TEMPERATURE SENSITIVE TREE SEEDSldquo establecido por ldquoThomsenrdquo (2000) Las semillas fueron colocadas en frascos de vidrio hermeacuteticos con gel de siacutelice como deshidratante Las semillas fueron pesadas cada 20 minutos durante el primer diacutea y en los posteriores diacuteas la toma de datos se realizoacute de una a dos veces durante el diacutea hasta que las semillas alcanzaron el peso y porcentaje de deshidratacioacuten deseado Tabla 1
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados para
las semillas de las especies en estudio
Especie CH inicial CH a deshidratar
Lafoensia acuminata 1237 129632
Senna alata 125 129632
Coccoloba ruiziana 2144 2015129632
Myrtus communis 35 3025201510532
Capparis flexuosa 45 4030201096532
VIABILIDAD DE SEMILLAS Para determinar la tolerancia a la desecacioacuten se evaluoacute la viabilidad de las semillas expresada en tiempo y porcentaje de germinacioacuten en cada nivel de deshidratacioacuten alcanzado para cada especie Para los ensayos de germinacioacuten se utilizo dos reacuteplicas de 25 semillas en cada nivel estas fueron sembradas en cajas petri sobre papel absorbente huacutemedo y colocadas en germinadores con periodos de 12 horas luz y 12 de oscuridad
EXTRACCIOacuteN Y CUANTIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
En todos los niveles deshidratados para cada una de las especies se realizoacute
la extraccioacuten de proteiacutenas de acuerdo al siguiente protocolo se trituroacute 05
6
gramos de semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido (figura 2 a) una vez
trituradas se maceroacute con el buffer de extraccioacuten de proteiacutenas (Tampoacuten Trisndash
HCl 001 M Mercaptoetanol 01 Aacutecido ascoacuterbico 005 M Tritoacuten Xndash100 al
01 Polivinilpolipirrolidona (PVP)) en tubos eppendorf y centrifugadas en
frio (4deg) a 12000-rpm por 45 minutos El sobrenadante obtenido se colocoacute
en tubos eppendorf (figura 2 b) en algunos casos fue necesario centrifugar
nuevamente por un minuto para eliminar completamente impurezas El
extracto final fue conservado en friacuteo a -20 degC hasta su posterior utilizacioacuten
a b c
Figura 2 Representacioacuten del procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenas a) trituracioacuten
de las semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido b) colocacioacuten del sobrenadante en
tubos eppendorf c) cuantificacioacuten de proteiacutenas en el Nanodrop 2000
La cuantificacioacuten de proteiacutenas totales se la realizoacute utilizando el meacutetodo
espectrofomeacutetrico de Bradford (1976) donde la curva de calibracioacuten se la
elaboro utilizando el reactivo de Bradford (Azuacutel de coomassie G-250 Pierce
Chem USA) y albuacutemina bovina fraccioacuten V (BSA Sigma) como estaacutendar La
cuantificacioacuten se la realizoacute en el equipo espectofotoacutemetro Nanodrop 2000
(figura 2 c)
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
1
INTRODUCCIOacuteN
En las semillas como en todo ser vivo existen proteiacutenas las cuales son de
gran importancia para el normal funcionamiento de estas en algunas
especies (Beevers amp Poulson 1992) Ellas constituyen maacutes del 50 del peso
seco de la ceacutelula las proteiacutenas maacutes comunes que encontramos en las
semillas son las globulinas albuminas prolaminas y proteiacutenas de
almacenamiento (Nielsen et al 1995) Ciertas cantidades de eacutestas se
acumulan en un corto periacuteodo de tiempo durante el desarrollo de la semilla
en muchas especies Las proteiacutenas de almacenamiento las prolaminas las
globulinas y las albuminas se acumulan poco en especies sin embargo
constituyen una alta proporcioacuten de la proteiacutena total de la semilla madura
(Laurie amp Robert 1990)
Estudios realizados con diferentes especies de semillas como por ejemplo
en el olivo y soja han demostrado que las proteiacutenas de reserva se
almacenan en el embrioacuten y el endospermo (Bawley amp Black 1994) Las
proteiacutenas de reserva en embriones y ceacutelulas vegetativas son sintetizadas
durante el desarrollo de la semilla e hidrolizadas durante la maduracioacuten
imbibicioacuten y germinacioacuten de estas proporcionando una de las principales
fuentes de carbono nitroacutegeno y azufre para el subsiguiente crecimiento y
desarrollo Estas proteiacutenas de reserva en ceacutelulas vegetativas proporcionan
una base para las semillas y frutos durante el crecimiento reproductivo y
para una raacutepida expansioacuten de las estructuras vegetativas despueacutes del
periodo de dormancia durante la germinacioacuten (Bawley amp Black 1994)
Un procedimiento para la determinacioacuten de la concentracioacuten de proteiacutenas en
las semillas es el anaacutelisis Bradford que consiste en la unioacuten de un colorante
Comassie Blue G-250 a las proteiacutenas Las proteiacutenas se unen a la forma azul
para formar un complejo proteiacutena-colorante con un coeficiente de extincioacuten
mayor que el colorante libre Este meacutetodo es sensible (1-15 μg) simple
raacutepido barato y pocas sustancias interfieren en su determinacioacuten como los
detergentes y las soluciones baacutesicas (Bradford 1976 Fernaacutendez 2007)
La peacuterdida neta de las proteiacutenas en las semillas es quizaacutes el deterioro maacutes
baacutesico de todos los eventos relacionados con el envejecimiento por causa de
la deshidratacioacuten ya que estos cambios podriacutean ser la base de todos los
demaacutes aspectos de la disminucioacuten del metabolismo La disminucioacuten en el
contenido de proteiacutenas por envejecimiento de las semillas puede ser debido
2
a 1) un dantildeo extenso en la siacutentesis de proteiacutenas reportado en diferentes
sistemas del cultivo (Hallman et al 1973) una germinacioacuten reducida o
semillas no viables en el aacuterbol (Espiacutendola et al 1994) oacute 2) la siacutentesis o la
activacioacuten de grandes cantidades de enzimas proteoliacuteticas durante el
deterioro de la semilla (Bewley amp Negro 1982)
La deshidratacioacuten es el procedimiento maacutes delicado en el tratamiento de las
semillas y uno de los problemas maacutes difiacuteciles de la conservacioacuten ex situ Es
necesario efectuar un seguimiento continuo de la deshidratacioacuten porque las
distintas etapas del desarrollo de las semillas estaacuten condicionadas por
factores mecaacutenicos quiacutemicos morfoloacutegicos y fisioloacutegicos que pueden
favorecer su germinacioacuten pero tambieacuten determinar la dormicioacuten Cada tipo
de semilla pasa por un proceso diferente de deshidratacioacuten que si se efectuacutea
mal puede comprometer la viabilidad de la misma (Genmedoc 2005)
La semilla es uno de los principales recursos para el manejo agriacutecola y
silviacutecola de las poblaciones vegetales para la reforestacioacuten para la
conservacioacuten del germoplasma vegetal y para la recuperacioacuten de especies
valiosas sobrexplotadas Eacutestas pueden almacenarse vivas por largos
periodos aseguraacutendose asiacute la preservacioacuten de especies y variedades de
plantas valiosas (Trujillo 1990) Para poder almacenar las semillas a largo
plazo es necesario que primero pasen por un proceso de deshidratacioacuten
pero lamentablemente todas las semillas difieren en su tolerancia a la
desecacioacuten Seguacuten este paraacutemetro las semillas se pueden clasificar en
ortodoxas recalcitrantes e intermedias (Farrant et al 1993) Las semillas
ortodoxas toleran una deshidratacioacuten hasta de 5 en el contenido de
humedad por su parte las semillas que toleran la deshidratacioacuten entre 10 y
125 de contenido de humedad se consideran intermedias y las que toleran
la deshidratacioacuten entre 15 y 50 de humedad se denominan recalcitrantes
(Farrant et al 1993 Gentil 2001)
En la mayoriacutea de especies recalcitrantes la reduccioacuten de humedad produce
una reduccioacuten de la germinacioacuten (Floriano 2004) un ejemplo claro es la
especie Quercus nigra que cuando su contenido de humedad baja al 30
la germinacioacuten se anula tal y como han puesto de manifiesto de Zulueta amp
Montoto (1992) Otro ejemplo que se da en las semillas recalcitrantes es la
familia del cafeacute el contenido de humedad miacutenimo que toleran las semillas de
C arabica C canephora y C liberica sin reducir su viabilidad es de
aproximadamente 9 11 y 24 respectivamente (Gentil 2001 amp Eira et al
2006) con reduccioacuten en la viabilidad a bajas temperaturas (Gentil 2001) a
diferencia de las semillas de C costatifructa C racemosa y C sessiliflora las
cuales mostraron un nivel criacutetico de humedad de semilla de 19 30 y 30
respectivamente (Dussert et al 1998)
3
Las semillas Ortodoxas sufren deterioro en su viabilidad pero a una tasa
inferior que las semillas recalcitrantes En estas los cambios en las reservas
de alimento almacenado parecen no afectar la viabilidad o vigor de la semilla
(Black M 1992) Un ejemplo claro de esto es la especie Cratylia argentea la
cual fue sometida a niveles de deshidratacioacuten del 10 8 y 6 siendo su
viabilidad del 95 86 y 76 respectivamente (Montoya amp Bonilla 2009)
El objetivo de este estudio fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes
niveles de humedad en semillas con diferente comportamiento de
conservacioacuten y determinar la tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco
especies
4
METODOLOGIA
COLECCIOacuteN DE MATERIAL
Se colectaron semillas maduras de las siguientes especies Lafoensia
acuminata (Ruiz y Pav) (Lythraceae) Senna alata (L) Roxb
(Cesalpinaceae) Coccoloba ruiziana (Lindau) (Polygonaceae) Myrtus
communis (Linneo) (Myrtaceae) y Capparis flexuosa (Linneo)
(Capparaceae) (figura 1) distribuidas en la provincia de Loja Las semillas
fueron transportadas al laboratorio del Banco de Germoplasma de la
Universidad Teacutecnica Particular de Loja en fundas de tela para evitar una
deshidratacioacuten previa
a b c
d e
Figura 1 Semillas de las cinco especies en estudio a) Lafoensia acuminata b) Senna alata c) Coccoloba ruiziana d) Myrtus communis e) Capparis flexuosa
CONTENIDO DE HUMEDAD
Colectadas la semillas se procedioacute a calcular en el laboratorio el porcentaje de humedad inicial de las mismas para ello se utilizaron dos reacuteplicas de 10 o 20 semillas (dependiendo del tamantildeo) el meacutetodo realizado fue de secado en estufa a temperatura baja y constante 103 degC por 17 horas (ISTA 2005) finalizado el procedimiento se utilizoacute la siguiente foacutermula para calcular el porcentaje de humedad
5
Formula (CH= pi-pfpi times 100) CH= Contenido de Humedad pi= peso inicial pf= peso final
DESHIDRATACIOacuteN DE SEMILLAS Determinado el contenido de humedad inicial de las semillas se determinoacute los diferentes porcentajes de humedad a deshidratar (tabla 1) en base al protocolo ldquoHANDLING OF DESICCATION AND TEMPERATURE SENSITIVE TREE SEEDSldquo establecido por ldquoThomsenrdquo (2000) Las semillas fueron colocadas en frascos de vidrio hermeacuteticos con gel de siacutelice como deshidratante Las semillas fueron pesadas cada 20 minutos durante el primer diacutea y en los posteriores diacuteas la toma de datos se realizoacute de una a dos veces durante el diacutea hasta que las semillas alcanzaron el peso y porcentaje de deshidratacioacuten deseado Tabla 1
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados para
las semillas de las especies en estudio
Especie CH inicial CH a deshidratar
Lafoensia acuminata 1237 129632
Senna alata 125 129632
Coccoloba ruiziana 2144 2015129632
Myrtus communis 35 3025201510532
Capparis flexuosa 45 4030201096532
VIABILIDAD DE SEMILLAS Para determinar la tolerancia a la desecacioacuten se evaluoacute la viabilidad de las semillas expresada en tiempo y porcentaje de germinacioacuten en cada nivel de deshidratacioacuten alcanzado para cada especie Para los ensayos de germinacioacuten se utilizo dos reacuteplicas de 25 semillas en cada nivel estas fueron sembradas en cajas petri sobre papel absorbente huacutemedo y colocadas en germinadores con periodos de 12 horas luz y 12 de oscuridad
EXTRACCIOacuteN Y CUANTIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
En todos los niveles deshidratados para cada una de las especies se realizoacute
la extraccioacuten de proteiacutenas de acuerdo al siguiente protocolo se trituroacute 05
6
gramos de semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido (figura 2 a) una vez
trituradas se maceroacute con el buffer de extraccioacuten de proteiacutenas (Tampoacuten Trisndash
HCl 001 M Mercaptoetanol 01 Aacutecido ascoacuterbico 005 M Tritoacuten Xndash100 al
01 Polivinilpolipirrolidona (PVP)) en tubos eppendorf y centrifugadas en
frio (4deg) a 12000-rpm por 45 minutos El sobrenadante obtenido se colocoacute
en tubos eppendorf (figura 2 b) en algunos casos fue necesario centrifugar
nuevamente por un minuto para eliminar completamente impurezas El
extracto final fue conservado en friacuteo a -20 degC hasta su posterior utilizacioacuten
a b c
Figura 2 Representacioacuten del procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenas a) trituracioacuten
de las semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido b) colocacioacuten del sobrenadante en
tubos eppendorf c) cuantificacioacuten de proteiacutenas en el Nanodrop 2000
La cuantificacioacuten de proteiacutenas totales se la realizoacute utilizando el meacutetodo
espectrofomeacutetrico de Bradford (1976) donde la curva de calibracioacuten se la
elaboro utilizando el reactivo de Bradford (Azuacutel de coomassie G-250 Pierce
Chem USA) y albuacutemina bovina fraccioacuten V (BSA Sigma) como estaacutendar La
cuantificacioacuten se la realizoacute en el equipo espectofotoacutemetro Nanodrop 2000
(figura 2 c)
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
2
a 1) un dantildeo extenso en la siacutentesis de proteiacutenas reportado en diferentes
sistemas del cultivo (Hallman et al 1973) una germinacioacuten reducida o
semillas no viables en el aacuterbol (Espiacutendola et al 1994) oacute 2) la siacutentesis o la
activacioacuten de grandes cantidades de enzimas proteoliacuteticas durante el
deterioro de la semilla (Bewley amp Negro 1982)
La deshidratacioacuten es el procedimiento maacutes delicado en el tratamiento de las
semillas y uno de los problemas maacutes difiacuteciles de la conservacioacuten ex situ Es
necesario efectuar un seguimiento continuo de la deshidratacioacuten porque las
distintas etapas del desarrollo de las semillas estaacuten condicionadas por
factores mecaacutenicos quiacutemicos morfoloacutegicos y fisioloacutegicos que pueden
favorecer su germinacioacuten pero tambieacuten determinar la dormicioacuten Cada tipo
de semilla pasa por un proceso diferente de deshidratacioacuten que si se efectuacutea
mal puede comprometer la viabilidad de la misma (Genmedoc 2005)
La semilla es uno de los principales recursos para el manejo agriacutecola y
silviacutecola de las poblaciones vegetales para la reforestacioacuten para la
conservacioacuten del germoplasma vegetal y para la recuperacioacuten de especies
valiosas sobrexplotadas Eacutestas pueden almacenarse vivas por largos
periodos aseguraacutendose asiacute la preservacioacuten de especies y variedades de
plantas valiosas (Trujillo 1990) Para poder almacenar las semillas a largo
plazo es necesario que primero pasen por un proceso de deshidratacioacuten
pero lamentablemente todas las semillas difieren en su tolerancia a la
desecacioacuten Seguacuten este paraacutemetro las semillas se pueden clasificar en
ortodoxas recalcitrantes e intermedias (Farrant et al 1993) Las semillas
ortodoxas toleran una deshidratacioacuten hasta de 5 en el contenido de
humedad por su parte las semillas que toleran la deshidratacioacuten entre 10 y
125 de contenido de humedad se consideran intermedias y las que toleran
la deshidratacioacuten entre 15 y 50 de humedad se denominan recalcitrantes
(Farrant et al 1993 Gentil 2001)
En la mayoriacutea de especies recalcitrantes la reduccioacuten de humedad produce
una reduccioacuten de la germinacioacuten (Floriano 2004) un ejemplo claro es la
especie Quercus nigra que cuando su contenido de humedad baja al 30
la germinacioacuten se anula tal y como han puesto de manifiesto de Zulueta amp
Montoto (1992) Otro ejemplo que se da en las semillas recalcitrantes es la
familia del cafeacute el contenido de humedad miacutenimo que toleran las semillas de
C arabica C canephora y C liberica sin reducir su viabilidad es de
aproximadamente 9 11 y 24 respectivamente (Gentil 2001 amp Eira et al
2006) con reduccioacuten en la viabilidad a bajas temperaturas (Gentil 2001) a
diferencia de las semillas de C costatifructa C racemosa y C sessiliflora las
cuales mostraron un nivel criacutetico de humedad de semilla de 19 30 y 30
respectivamente (Dussert et al 1998)
3
Las semillas Ortodoxas sufren deterioro en su viabilidad pero a una tasa
inferior que las semillas recalcitrantes En estas los cambios en las reservas
de alimento almacenado parecen no afectar la viabilidad o vigor de la semilla
(Black M 1992) Un ejemplo claro de esto es la especie Cratylia argentea la
cual fue sometida a niveles de deshidratacioacuten del 10 8 y 6 siendo su
viabilidad del 95 86 y 76 respectivamente (Montoya amp Bonilla 2009)
El objetivo de este estudio fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes
niveles de humedad en semillas con diferente comportamiento de
conservacioacuten y determinar la tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco
especies
4
METODOLOGIA
COLECCIOacuteN DE MATERIAL
Se colectaron semillas maduras de las siguientes especies Lafoensia
acuminata (Ruiz y Pav) (Lythraceae) Senna alata (L) Roxb
(Cesalpinaceae) Coccoloba ruiziana (Lindau) (Polygonaceae) Myrtus
communis (Linneo) (Myrtaceae) y Capparis flexuosa (Linneo)
(Capparaceae) (figura 1) distribuidas en la provincia de Loja Las semillas
fueron transportadas al laboratorio del Banco de Germoplasma de la
Universidad Teacutecnica Particular de Loja en fundas de tela para evitar una
deshidratacioacuten previa
a b c
d e
Figura 1 Semillas de las cinco especies en estudio a) Lafoensia acuminata b) Senna alata c) Coccoloba ruiziana d) Myrtus communis e) Capparis flexuosa
CONTENIDO DE HUMEDAD
Colectadas la semillas se procedioacute a calcular en el laboratorio el porcentaje de humedad inicial de las mismas para ello se utilizaron dos reacuteplicas de 10 o 20 semillas (dependiendo del tamantildeo) el meacutetodo realizado fue de secado en estufa a temperatura baja y constante 103 degC por 17 horas (ISTA 2005) finalizado el procedimiento se utilizoacute la siguiente foacutermula para calcular el porcentaje de humedad
5
Formula (CH= pi-pfpi times 100) CH= Contenido de Humedad pi= peso inicial pf= peso final
DESHIDRATACIOacuteN DE SEMILLAS Determinado el contenido de humedad inicial de las semillas se determinoacute los diferentes porcentajes de humedad a deshidratar (tabla 1) en base al protocolo ldquoHANDLING OF DESICCATION AND TEMPERATURE SENSITIVE TREE SEEDSldquo establecido por ldquoThomsenrdquo (2000) Las semillas fueron colocadas en frascos de vidrio hermeacuteticos con gel de siacutelice como deshidratante Las semillas fueron pesadas cada 20 minutos durante el primer diacutea y en los posteriores diacuteas la toma de datos se realizoacute de una a dos veces durante el diacutea hasta que las semillas alcanzaron el peso y porcentaje de deshidratacioacuten deseado Tabla 1
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados para
las semillas de las especies en estudio
Especie CH inicial CH a deshidratar
Lafoensia acuminata 1237 129632
Senna alata 125 129632
Coccoloba ruiziana 2144 2015129632
Myrtus communis 35 3025201510532
Capparis flexuosa 45 4030201096532
VIABILIDAD DE SEMILLAS Para determinar la tolerancia a la desecacioacuten se evaluoacute la viabilidad de las semillas expresada en tiempo y porcentaje de germinacioacuten en cada nivel de deshidratacioacuten alcanzado para cada especie Para los ensayos de germinacioacuten se utilizo dos reacuteplicas de 25 semillas en cada nivel estas fueron sembradas en cajas petri sobre papel absorbente huacutemedo y colocadas en germinadores con periodos de 12 horas luz y 12 de oscuridad
EXTRACCIOacuteN Y CUANTIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
En todos los niveles deshidratados para cada una de las especies se realizoacute
la extraccioacuten de proteiacutenas de acuerdo al siguiente protocolo se trituroacute 05
6
gramos de semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido (figura 2 a) una vez
trituradas se maceroacute con el buffer de extraccioacuten de proteiacutenas (Tampoacuten Trisndash
HCl 001 M Mercaptoetanol 01 Aacutecido ascoacuterbico 005 M Tritoacuten Xndash100 al
01 Polivinilpolipirrolidona (PVP)) en tubos eppendorf y centrifugadas en
frio (4deg) a 12000-rpm por 45 minutos El sobrenadante obtenido se colocoacute
en tubos eppendorf (figura 2 b) en algunos casos fue necesario centrifugar
nuevamente por un minuto para eliminar completamente impurezas El
extracto final fue conservado en friacuteo a -20 degC hasta su posterior utilizacioacuten
a b c
Figura 2 Representacioacuten del procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenas a) trituracioacuten
de las semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido b) colocacioacuten del sobrenadante en
tubos eppendorf c) cuantificacioacuten de proteiacutenas en el Nanodrop 2000
La cuantificacioacuten de proteiacutenas totales se la realizoacute utilizando el meacutetodo
espectrofomeacutetrico de Bradford (1976) donde la curva de calibracioacuten se la
elaboro utilizando el reactivo de Bradford (Azuacutel de coomassie G-250 Pierce
Chem USA) y albuacutemina bovina fraccioacuten V (BSA Sigma) como estaacutendar La
cuantificacioacuten se la realizoacute en el equipo espectofotoacutemetro Nanodrop 2000
(figura 2 c)
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
3
Las semillas Ortodoxas sufren deterioro en su viabilidad pero a una tasa
inferior que las semillas recalcitrantes En estas los cambios en las reservas
de alimento almacenado parecen no afectar la viabilidad o vigor de la semilla
(Black M 1992) Un ejemplo claro de esto es la especie Cratylia argentea la
cual fue sometida a niveles de deshidratacioacuten del 10 8 y 6 siendo su
viabilidad del 95 86 y 76 respectivamente (Montoya amp Bonilla 2009)
El objetivo de este estudio fue cuantificar proteiacutenas totales en diferentes
niveles de humedad en semillas con diferente comportamiento de
conservacioacuten y determinar la tolerancia a la deshidratacioacuten de las de cinco
especies
4
METODOLOGIA
COLECCIOacuteN DE MATERIAL
Se colectaron semillas maduras de las siguientes especies Lafoensia
acuminata (Ruiz y Pav) (Lythraceae) Senna alata (L) Roxb
(Cesalpinaceae) Coccoloba ruiziana (Lindau) (Polygonaceae) Myrtus
communis (Linneo) (Myrtaceae) y Capparis flexuosa (Linneo)
(Capparaceae) (figura 1) distribuidas en la provincia de Loja Las semillas
fueron transportadas al laboratorio del Banco de Germoplasma de la
Universidad Teacutecnica Particular de Loja en fundas de tela para evitar una
deshidratacioacuten previa
a b c
d e
Figura 1 Semillas de las cinco especies en estudio a) Lafoensia acuminata b) Senna alata c) Coccoloba ruiziana d) Myrtus communis e) Capparis flexuosa
CONTENIDO DE HUMEDAD
Colectadas la semillas se procedioacute a calcular en el laboratorio el porcentaje de humedad inicial de las mismas para ello se utilizaron dos reacuteplicas de 10 o 20 semillas (dependiendo del tamantildeo) el meacutetodo realizado fue de secado en estufa a temperatura baja y constante 103 degC por 17 horas (ISTA 2005) finalizado el procedimiento se utilizoacute la siguiente foacutermula para calcular el porcentaje de humedad
5
Formula (CH= pi-pfpi times 100) CH= Contenido de Humedad pi= peso inicial pf= peso final
DESHIDRATACIOacuteN DE SEMILLAS Determinado el contenido de humedad inicial de las semillas se determinoacute los diferentes porcentajes de humedad a deshidratar (tabla 1) en base al protocolo ldquoHANDLING OF DESICCATION AND TEMPERATURE SENSITIVE TREE SEEDSldquo establecido por ldquoThomsenrdquo (2000) Las semillas fueron colocadas en frascos de vidrio hermeacuteticos con gel de siacutelice como deshidratante Las semillas fueron pesadas cada 20 minutos durante el primer diacutea y en los posteriores diacuteas la toma de datos se realizoacute de una a dos veces durante el diacutea hasta que las semillas alcanzaron el peso y porcentaje de deshidratacioacuten deseado Tabla 1
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados para
las semillas de las especies en estudio
Especie CH inicial CH a deshidratar
Lafoensia acuminata 1237 129632
Senna alata 125 129632
Coccoloba ruiziana 2144 2015129632
Myrtus communis 35 3025201510532
Capparis flexuosa 45 4030201096532
VIABILIDAD DE SEMILLAS Para determinar la tolerancia a la desecacioacuten se evaluoacute la viabilidad de las semillas expresada en tiempo y porcentaje de germinacioacuten en cada nivel de deshidratacioacuten alcanzado para cada especie Para los ensayos de germinacioacuten se utilizo dos reacuteplicas de 25 semillas en cada nivel estas fueron sembradas en cajas petri sobre papel absorbente huacutemedo y colocadas en germinadores con periodos de 12 horas luz y 12 de oscuridad
EXTRACCIOacuteN Y CUANTIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
En todos los niveles deshidratados para cada una de las especies se realizoacute
la extraccioacuten de proteiacutenas de acuerdo al siguiente protocolo se trituroacute 05
6
gramos de semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido (figura 2 a) una vez
trituradas se maceroacute con el buffer de extraccioacuten de proteiacutenas (Tampoacuten Trisndash
HCl 001 M Mercaptoetanol 01 Aacutecido ascoacuterbico 005 M Tritoacuten Xndash100 al
01 Polivinilpolipirrolidona (PVP)) en tubos eppendorf y centrifugadas en
frio (4deg) a 12000-rpm por 45 minutos El sobrenadante obtenido se colocoacute
en tubos eppendorf (figura 2 b) en algunos casos fue necesario centrifugar
nuevamente por un minuto para eliminar completamente impurezas El
extracto final fue conservado en friacuteo a -20 degC hasta su posterior utilizacioacuten
a b c
Figura 2 Representacioacuten del procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenas a) trituracioacuten
de las semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido b) colocacioacuten del sobrenadante en
tubos eppendorf c) cuantificacioacuten de proteiacutenas en el Nanodrop 2000
La cuantificacioacuten de proteiacutenas totales se la realizoacute utilizando el meacutetodo
espectrofomeacutetrico de Bradford (1976) donde la curva de calibracioacuten se la
elaboro utilizando el reactivo de Bradford (Azuacutel de coomassie G-250 Pierce
Chem USA) y albuacutemina bovina fraccioacuten V (BSA Sigma) como estaacutendar La
cuantificacioacuten se la realizoacute en el equipo espectofotoacutemetro Nanodrop 2000
(figura 2 c)
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
4
METODOLOGIA
COLECCIOacuteN DE MATERIAL
Se colectaron semillas maduras de las siguientes especies Lafoensia
acuminata (Ruiz y Pav) (Lythraceae) Senna alata (L) Roxb
(Cesalpinaceae) Coccoloba ruiziana (Lindau) (Polygonaceae) Myrtus
communis (Linneo) (Myrtaceae) y Capparis flexuosa (Linneo)
(Capparaceae) (figura 1) distribuidas en la provincia de Loja Las semillas
fueron transportadas al laboratorio del Banco de Germoplasma de la
Universidad Teacutecnica Particular de Loja en fundas de tela para evitar una
deshidratacioacuten previa
a b c
d e
Figura 1 Semillas de las cinco especies en estudio a) Lafoensia acuminata b) Senna alata c) Coccoloba ruiziana d) Myrtus communis e) Capparis flexuosa
CONTENIDO DE HUMEDAD
Colectadas la semillas se procedioacute a calcular en el laboratorio el porcentaje de humedad inicial de las mismas para ello se utilizaron dos reacuteplicas de 10 o 20 semillas (dependiendo del tamantildeo) el meacutetodo realizado fue de secado en estufa a temperatura baja y constante 103 degC por 17 horas (ISTA 2005) finalizado el procedimiento se utilizoacute la siguiente foacutermula para calcular el porcentaje de humedad
5
Formula (CH= pi-pfpi times 100) CH= Contenido de Humedad pi= peso inicial pf= peso final
DESHIDRATACIOacuteN DE SEMILLAS Determinado el contenido de humedad inicial de las semillas se determinoacute los diferentes porcentajes de humedad a deshidratar (tabla 1) en base al protocolo ldquoHANDLING OF DESICCATION AND TEMPERATURE SENSITIVE TREE SEEDSldquo establecido por ldquoThomsenrdquo (2000) Las semillas fueron colocadas en frascos de vidrio hermeacuteticos con gel de siacutelice como deshidratante Las semillas fueron pesadas cada 20 minutos durante el primer diacutea y en los posteriores diacuteas la toma de datos se realizoacute de una a dos veces durante el diacutea hasta que las semillas alcanzaron el peso y porcentaje de deshidratacioacuten deseado Tabla 1
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados para
las semillas de las especies en estudio
Especie CH inicial CH a deshidratar
Lafoensia acuminata 1237 129632
Senna alata 125 129632
Coccoloba ruiziana 2144 2015129632
Myrtus communis 35 3025201510532
Capparis flexuosa 45 4030201096532
VIABILIDAD DE SEMILLAS Para determinar la tolerancia a la desecacioacuten se evaluoacute la viabilidad de las semillas expresada en tiempo y porcentaje de germinacioacuten en cada nivel de deshidratacioacuten alcanzado para cada especie Para los ensayos de germinacioacuten se utilizo dos reacuteplicas de 25 semillas en cada nivel estas fueron sembradas en cajas petri sobre papel absorbente huacutemedo y colocadas en germinadores con periodos de 12 horas luz y 12 de oscuridad
EXTRACCIOacuteN Y CUANTIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
En todos los niveles deshidratados para cada una de las especies se realizoacute
la extraccioacuten de proteiacutenas de acuerdo al siguiente protocolo se trituroacute 05
6
gramos de semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido (figura 2 a) una vez
trituradas se maceroacute con el buffer de extraccioacuten de proteiacutenas (Tampoacuten Trisndash
HCl 001 M Mercaptoetanol 01 Aacutecido ascoacuterbico 005 M Tritoacuten Xndash100 al
01 Polivinilpolipirrolidona (PVP)) en tubos eppendorf y centrifugadas en
frio (4deg) a 12000-rpm por 45 minutos El sobrenadante obtenido se colocoacute
en tubos eppendorf (figura 2 b) en algunos casos fue necesario centrifugar
nuevamente por un minuto para eliminar completamente impurezas El
extracto final fue conservado en friacuteo a -20 degC hasta su posterior utilizacioacuten
a b c
Figura 2 Representacioacuten del procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenas a) trituracioacuten
de las semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido b) colocacioacuten del sobrenadante en
tubos eppendorf c) cuantificacioacuten de proteiacutenas en el Nanodrop 2000
La cuantificacioacuten de proteiacutenas totales se la realizoacute utilizando el meacutetodo
espectrofomeacutetrico de Bradford (1976) donde la curva de calibracioacuten se la
elaboro utilizando el reactivo de Bradford (Azuacutel de coomassie G-250 Pierce
Chem USA) y albuacutemina bovina fraccioacuten V (BSA Sigma) como estaacutendar La
cuantificacioacuten se la realizoacute en el equipo espectofotoacutemetro Nanodrop 2000
(figura 2 c)
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
5
Formula (CH= pi-pfpi times 100) CH= Contenido de Humedad pi= peso inicial pf= peso final
DESHIDRATACIOacuteN DE SEMILLAS Determinado el contenido de humedad inicial de las semillas se determinoacute los diferentes porcentajes de humedad a deshidratar (tabla 1) en base al protocolo ldquoHANDLING OF DESICCATION AND TEMPERATURE SENSITIVE TREE SEEDSldquo establecido por ldquoThomsenrdquo (2000) Las semillas fueron colocadas en frascos de vidrio hermeacuteticos con gel de siacutelice como deshidratante Las semillas fueron pesadas cada 20 minutos durante el primer diacutea y en los posteriores diacuteas la toma de datos se realizoacute de una a dos veces durante el diacutea hasta que las semillas alcanzaron el peso y porcentaje de deshidratacioacuten deseado Tabla 1
Tabla 1 Contenido de humedad inicial y los diferentes niveles deshidratados para
las semillas de las especies en estudio
Especie CH inicial CH a deshidratar
Lafoensia acuminata 1237 129632
Senna alata 125 129632
Coccoloba ruiziana 2144 2015129632
Myrtus communis 35 3025201510532
Capparis flexuosa 45 4030201096532
VIABILIDAD DE SEMILLAS Para determinar la tolerancia a la desecacioacuten se evaluoacute la viabilidad de las semillas expresada en tiempo y porcentaje de germinacioacuten en cada nivel de deshidratacioacuten alcanzado para cada especie Para los ensayos de germinacioacuten se utilizo dos reacuteplicas de 25 semillas en cada nivel estas fueron sembradas en cajas petri sobre papel absorbente huacutemedo y colocadas en germinadores con periodos de 12 horas luz y 12 de oscuridad
EXTRACCIOacuteN Y CUANTIFICACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
En todos los niveles deshidratados para cada una de las especies se realizoacute
la extraccioacuten de proteiacutenas de acuerdo al siguiente protocolo se trituroacute 05
6
gramos de semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido (figura 2 a) una vez
trituradas se maceroacute con el buffer de extraccioacuten de proteiacutenas (Tampoacuten Trisndash
HCl 001 M Mercaptoetanol 01 Aacutecido ascoacuterbico 005 M Tritoacuten Xndash100 al
01 Polivinilpolipirrolidona (PVP)) en tubos eppendorf y centrifugadas en
frio (4deg) a 12000-rpm por 45 minutos El sobrenadante obtenido se colocoacute
en tubos eppendorf (figura 2 b) en algunos casos fue necesario centrifugar
nuevamente por un minuto para eliminar completamente impurezas El
extracto final fue conservado en friacuteo a -20 degC hasta su posterior utilizacioacuten
a b c
Figura 2 Representacioacuten del procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenas a) trituracioacuten
de las semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido b) colocacioacuten del sobrenadante en
tubos eppendorf c) cuantificacioacuten de proteiacutenas en el Nanodrop 2000
La cuantificacioacuten de proteiacutenas totales se la realizoacute utilizando el meacutetodo
espectrofomeacutetrico de Bradford (1976) donde la curva de calibracioacuten se la
elaboro utilizando el reactivo de Bradford (Azuacutel de coomassie G-250 Pierce
Chem USA) y albuacutemina bovina fraccioacuten V (BSA Sigma) como estaacutendar La
cuantificacioacuten se la realizoacute en el equipo espectofotoacutemetro Nanodrop 2000
(figura 2 c)
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
6
gramos de semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido (figura 2 a) una vez
trituradas se maceroacute con el buffer de extraccioacuten de proteiacutenas (Tampoacuten Trisndash
HCl 001 M Mercaptoetanol 01 Aacutecido ascoacuterbico 005 M Tritoacuten Xndash100 al
01 Polivinilpolipirrolidona (PVP)) en tubos eppendorf y centrifugadas en
frio (4deg) a 12000-rpm por 45 minutos El sobrenadante obtenido se colocoacute
en tubos eppendorf (figura 2 b) en algunos casos fue necesario centrifugar
nuevamente por un minuto para eliminar completamente impurezas El
extracto final fue conservado en friacuteo a -20 degC hasta su posterior utilizacioacuten
a b c
Figura 2 Representacioacuten del procedimiento para la obtencioacuten de proteiacutenas a) trituracioacuten
de las semillas en morteros sobre nitroacutegeno liquido b) colocacioacuten del sobrenadante en
tubos eppendorf c) cuantificacioacuten de proteiacutenas en el Nanodrop 2000
La cuantificacioacuten de proteiacutenas totales se la realizoacute utilizando el meacutetodo
espectrofomeacutetrico de Bradford (1976) donde la curva de calibracioacuten se la
elaboro utilizando el reactivo de Bradford (Azuacutel de coomassie G-250 Pierce
Chem USA) y albuacutemina bovina fraccioacuten V (BSA Sigma) como estaacutendar La
cuantificacioacuten se la realizoacute en el equipo espectofotoacutemetro Nanodrop 2000
(figura 2 c)
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
BIBLIOGRAFIA
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Germinacioacuten y del Banco de Semillas del Suelo de Podocarpus
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
7
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Con los resultados obtenidos en deshidratacioacuten viabilidad y cuantificacioacuten de
proteiacutenas se realizoacute un Anaacutelisis de Varianza (ANOVA) por el meacutetodo de
TUKEY en el programa estadiacutestico R-PROJECT 2150 y un Anaacutelisis de
Regresioacuten Lineal en el programa XLSTAT
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
8
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 DESHIDRATACIOacuteN Y VIABILIDAD
Lafoencia acuminata
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente bajo 1237 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 88 (blanco) y a medida que descendioacute su
contenido de humedad su germinacioacuten tambieacuten como nos muestra la graacutefica 1
Graacutefica 1 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 11 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo relativamente alto en el 70
indicando la capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos
contenidos de humedad esta capacidad unido al bajo contenido de humedad inicial de
las semillas hace suponer que eacutestas semillas pueden tener una tendencia ortodoxa pues
como menciona Bonner (1996) Magnitskiy amp Plaza (2007) las semillas ortodoxas
poseen un contenido de humedad bajo al momento de alcanzar su maduracioacuten
fisioloacutegica y pueden soportar deshidratacioacuten hasta bajos niveles de humedad
manteniendo su viabilidad alta Los altos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en esta
especie puede deberse ademaacutes a que las semillas presentan una textura fina este tipo
de cubierta seminal presenta una permeabilidad lo cual facilita el paso del agua al
embrioacuten y activa su metabolismo (Carreras 2001)
Con respecto al anaacutelisis de regresioacuten lineal este mostroacute que existe una correlacioacuten (Rsup2
0623) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(Graacutefica 2) esto ademaacutes se corroboroacute realizando una prueba de Tukey la cual mostroacute
que presentan diferencias significativas los niveles 12 2 y el blanco (Anexo 6) con
respecto al porcentaje de deshidratacioacuten Confirmando que si existe una correlacioacuten
entre germinacioacuten y deshidratacioacuten
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
9
Graacutefica 2 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
El contenido de humedad inicial de esta especie fue de 125 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial del 54 (blanco) y a medida que su contenido de humedad
descendiacutea su viabilidad se perdiacutea a tal punto que en los niveles 9 y 2 de humedad
su germinacioacuten fue nula (graacutefica 3)
Graacutefica 3 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el ultimo contenido de
humedad (2) este largo tiempo de secado en las semillas pudo ser causado por las
proteiacutenas denominadas Late Embriogenesis abundan (LEA) las cuales confieren
resistencia al secado al momento de ser expuestas a bajas temperaturas en semillas
Ortodoxas (Shin et al 2008)
Durante el proceso de deshidratacioacuten el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo muy
bajo en el 16 esto sin tomar en cuenta al blanco (54) Esta cualidad para soportar ser
deshidratadas a bajos contenidos de humedad sin perder su viabilidad unido al bajo
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
10
contenido de humedad inicial de las semillas hace presumir que estas pueden tener una
tendencia ortodoxa (Bonner 1996)
Los bajos porcentajes de germinacioacuten adquiridos en esta especie pueden deberse a que
las semillas presentan una testa gruesa algo que es muy comuacuten en la familia de las
Caesalpinaceae (Lemes 1998 Bekker 2003) Debido esta caracteriacutestica las semillas
pudieron entrar en un estado de dormancia exoacutegena por impermeabilidad de las
cubiertas seminales al agua retardando asiacute su germinacioacuten (Saacutenchez et al 2003) Por
esta razoacuten Lemes (1998) recomienda hacer tratamientos pregerminativos con aacutecido
sulfuacuterico en S alata para lograr un oacuteptimo porcentaje de germinacioacuten
En cuanto a los anaacutelisis estadiacutesticos el de regresioacuten lineal mostroacute que no existe
correlacioacuten (Rsup2 0033) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de
las semillas como se muestra en la graacutefica 4 y al realizar la prueba de Tukey se
determinoacute que existe una diferencia significativa en los niveles de humedad 12 9
6 3 y el blanco (Anexo 6) con respecto al porcentaje de germinacioacuten Lo que
significa que en los tratamientos o niveles de humedad no existe una correlacioacuten
significativa es decir que al bajar el contenido de humedad no afecta el porcentaje de
germinacioacuten
Graacutefica 4 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Su contenido de humedad inicial fue de 2144 alcanzando a este nivel un maacuteximo de
32 de germinacioacuten y a medida que descendiacutea su contenido de humedad su
germinacioacuten aumentaba como podemos observar en la graacutefica 5
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
11
Graacutefica 5 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante el proceso de deshidratacioacuten que duroacute 87 diacuteas hasta alcanzar el 2 de
humedad el porcentaje de germinacioacuten se mantuvo sobre el 50 mostrando la
capacidad de las semillas para soportar la deshidratacioacuten a bajos niveles de humedad
esta capacidad unido al contenido de humedad inicial (caracteriacutestico en especies
intermedias) corrobora lo expuesto por Hong et al(1996) que menciona que la mayoriacutea
de especies del geacutenero Coccoloba podriacutea formar parte del grupo de las semillas
intermedias
El aumento del porcentaje de germinacioacuten en los contenidos de humedad inferiores
pueden deberse a la falta de maduracioacuten fisioloacutegica de las semillas en el aacuterbol ya que en
la mayoriacutea de especies de estas caracteriacutesticas su fase final de maduracioacuten esta
acompantildeada por deshidratacioacuten celular lo cual las hace tolerantes a la deshidratacioacuten
caracteriacutestica que mejora su viabilidad y el potencial de almacenamiento (Nkang 2002
Hoekstra et al 1994) Por esta razoacuten el blanco el cual no fue deshidratado pudo tener
tan bajo porcentaje de germinacioacuten
Respecto al anaacutelisis estadiacutestico esta especie mostroacute a traveacutes del anaacutelisis de regresioacuten
lineal una correlacioacuten negativa moderada (Rsup2 0426) entre el porcentaje de germinacioacuten y
el contenido de humedad de las semillas (graacutefica 6) se pudo verificar esto mediante la
prueba de Tukey donde los niveles de humedad que presentaron mayor diferencia
significativa con respecto al porcentaje de germinacioacuten fueron el 20 y el 3 (Anexo 6)
Confirmando que a medida que el contenido de humedad desciende el porcentaje de
germinacioacuten aumenta
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
12
Graacutefica 6 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
La especie presentoacute un contenido de humedad inicial relativamente alto 35 con un
porcentaje de germinacioacuten inicial del 4 (blanco) y a medida que su contenido de
humedad descendiacutea su germinacioacuten se hizo nula (graacutefica 7)
Graacutefica 7 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
El proceso de deshidratacioacuten duroacute 66 diacuteas hasta llegar al 2 de humedad durante este
proceso el porcentaje de germinacioacuten fue nulo por lo que se realizoacute un corte a las
semillas para evaluar su estado y se determinoacute que el 90 de sus embriones no
manteniacutean su estructura normal por lo que posiblemente ya no eran viables Indicando la
incapacidad de las semillas para tolerar la deshidratacioacuten a bajos contenidos de
humedad esta incapacidad unido al alto contenido de humedad inicial de las semillas
nos hace suponer que eacutestas pueden tener una tendencia recalcitrante pues como
menciona Saacutenchez et al (2005) las semillas recalcitrantes poseen un alto contenido de
humedad inicial y al ser deshidratadas pierden casi toda su viabilidad La mayoriacutea de
semillas con estos altos contenidos de humedad (30-60) no resisten la
deshidratacioacuten (Floriano 2004) puesto que un secado excesivo puede ocasionar dantildeos
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
13
en su membrana (envejecimiento de la misma) ya que estas estaacuten acostumbradas a
climas con altos contenidos de humedad (Leopold 1995)
Los nulos porcentajes de germinacioacuten obtenidos en M communis pueden deberse
ademaacutes a que su cubierta era de tipo impermeable y al estar expuestas a la
deshidratacioacuten su embrioacuten no pudo recibir la humedad necesaria para germinar
(Carreras 2001) Otro factor determinante en su baja germinabilidad pudo ser el estado
de madurez de las semillas que con frecuencia es extremamente difiacutecil de determinar
para los tipos recalcitrantes (Berjak amp Pammenter 1997)
Para esta especie no se pudo realizar los respectivos anaacutelisis estadiacutesticos de regresioacuten
lineal y de varianza (ANOVA) debido a que no existioacute germinacioacuten en ninguno de los
niveles deshidratados obteniendo solamente datos en el blanco
Capparis flexuosa
Su contenido de humedad inicial fue relativamente alto 45 con un porcentaje de
germinacioacuten inicial de 100 (blanco) y a medida que descendiacutea su contenido de
humedad su germinacioacuten tambieacuten lo hacia a tal punto que del 10 de humedad en
adelante su germinacioacuten fue nula (graacutefica 8)
Graacutefica 8 Variacioacuten en el porcentaje de germinacioacuten acumulada ( )
plusmn ES en cada uno de los niveles deshidratados y los diacuteas transcurridos
( ) durante la deshidratacioacuten
Durante los 28 diacuteas que duro el proceso de deshidratacioacuten la viabilidad se mantuvo
sobre el 60 en los tres primeros niveles de humedad mientras que en los demaacutes
niveles la germinacioacuten fue nula debido a que fue perdiendo raacutepidamente su capacidad
de germinacioacuten al quedar expuesta a condiciones de baja humedad (Kermode amp Finch-
Savage 2002) y a su alto contenido de humedad inicial podemos suponer que C
flexuosa tiene tendencia a ser recalcitrante Ademaacutes las semillas recalcitrantes rodeadas
por pericarpio y testa delgadas como es el caso de C flexuosa se desecan en un
tiempo relativamente corto y genera la muerte de sus semillas cuando son colocadas en
condiciones de baja humedad (Pukacka amp Ratajczak 2005)
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
14
En esta especie se presento un alto grado de contaminacioacuten en sus semillas lo cual
tambieacuten pudo afectar a la muerte de las mismas
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que existe una correlacioacuten elevada (Rsup2
0845) entre el porcentaje de germinacioacuten y el contenido de humedad de las semillas
(graacutefica 9) y al realizar la prueba de Tukey para confirmar esto nos mostroacute que los
niveles de humedad 40 20 y el blanco (Anexo 6) fueron los que presentaron
diferencias significativas en relacioacuten al porcentaje de germinacioacuten
Graacutefica 9 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
15
2 PROTEIacuteNAS TOTALES
Lafoencia acuminata
Todos sus niveles de humedad presentaron bajas concentraciones de proteiacutenas
obteniendo una mayor concentracioacuten cuando las semillas tuvieron un 12 de humedad y
como podemos observar en la graacutefica 10 el contenido de humedad con menor
concentracioacuten de proteiacutenas fue 6 Estas bajas concentraciones pueden deberse a la
baja presencia de aacutecido absciacutesico (ABA) que es el que influye en la siacutentesis de varias
clases de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994) Otro factor a tomar en cuenta es la testa
delgada que posee L acuminata esta es una caracteriacutestica de las semillas que
presentan bajas concentraciones de ABA (bewley amp black 1994) debido a este factor
pudo existir una perdida neta de las proteiacutenas en las semillas causada por el
envejecimiento de las mismas los cambios que se dan a consecuencia de dicho
envejecimiento podriacutean ser la base de todos los demaacutes aspectos relacionados con la
perdida de las proteiacutenas (chaitanya amp naithani 1998)
O bien puede deberse a caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta y a las condiciones
ambientales que hicieron que esta produzca semillas con bajos niveles de proteiacutenas
(Rengel 2009)
Graacutefica 10 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en L acuminata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0018)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 11) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
16
Graacutefica 11 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Senna alata
Para esta especie ya hubo un aumento en el contenido proteico el 12 fuel el que
mayor proteiacutenas mostroacute mientras que el 9 y el 2 fueron los que menos proteiacutenas
presentaron (graacutefica 12) Estos resultados al igual que en L acuminata pudieron estar
relacionados con caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que afectaron su fisiologiacutea y
mecanismos bioquiacutemicos alterando la cantidad de proteiacutenas en las semillas (Rengel
2009) Tambieacuten se pudo deber a los bajos niveles de ABA los cuales alcanzan su
maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla y estaacuten
directamente relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Kermode 1990)
Graacutefica 12 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en S alata
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten es casi nula (Rsup2
0091) entre el contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las
semillas (graacutefica 13) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
17
Graacutefica 13 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Coccoloba ruiziana
Esta especie fue la que mostroacute mayor equilibrio en el nuacutemero de proteiacutenas totales
presentes en cada nivel pero aun asiacute la concentracioacuten de proteiacutenas fue baja Siendo el
6 el que presentara maacutes proteiacutenas y el 9 el que menos mostrara (graacutefica 14) Estas
bajas concentraciones pueden deberse a los mismos factores que influyeron en las dos
anteriores especies (L acuminata amp S alata) los cuales podriacutean estar relacionados con
caracteriacutesticas intriacutensecas de la planta que altera sus caracteriacutesticas fisioloacutegicas
(Magnitskiy et al 2007) y a los bajos niveles de ABA los cuales estaacuten directamente
relacionados con la siacutentesis de proteiacutenas (Bewley amp Black 1994)
Graacutefica 14 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C ruiziana
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que la correlacioacuten que existe entre las
variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas
(graacutefica 15) es negativa moderada (Rsup2 0256) significando que la cantidad de proteiacutenas
presentes en las semillas se ven afectadas en un miacutenimo porcentaje por los niveles de
deshidratacioacuten
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
18
Graacutefica 15 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Myrtus communis
Myrtus communis presentoacute el mayor porcentaje de proteiacutenas totales de las cinco
especies en estudio siendo el 25 el que maacutes nuacutemero de proteiacutenas totales presentoacute y
el 2 el que menos proteiacutenas mostroacute en el proceso de cuantificacioacuten (graacutefica 16) Esta
gran cantidad de proteiacutenas podriacutea estar asociada a la presencia de las proteiacutenas
deshidrinas (Galau et al 1986) las cuales incluyen una serie de proteiacutenas hidrofiacutelicas
resistentes al calor asociadas con la adquisicioacuten de tolerancia a la deshidratacioacuten (Ried amp
Walker-Simmons 1993) Su siacutentesis parece estar asociada con niveles altos de ABA que
alcanzan su maacuteximo nivel durante las etapas maacutes tardiacuteas del desarrollo de la semilla
(Kermode 1990)
La presencia de bajas concentraciones de proteiacutenas en el 2 y 5 de humedad pueden
deberse a la existencia de diversos mecanismos asociados con la tolerancia a la
desecacioacuten de semillas por lo tanto acumulacioacuten de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA)
sacarosa y oligosacaacuteridos (Leprince et al 1995)
Graacutefica 16 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en M communis
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
19
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe una correlacioacuten (Rsup2 0015)
entre el contenido de humedad de las semillas y cantidad de proteiacutenas presentes en las
mismas (graacutefica 17) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes en las semillas no
se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 17 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
Capparis flexuosa
Sus niveles mostraron una concentracioacuten maacutes elevada de proteiacutenas a diferencia de las
otras especies sobre todo en el 40 9 y 5 Mientras que el 20 y 10 fueron los que
mostraron menor concentracioacuten (graacutefica 18) Estos porcentajes pudieron estar dados por
la ausencia o la expresioacuten inefectiva de moleacuteculas de proteccioacuten (LEA) sacarosa y
oligosacaacuteridos los cuales pueden determinar la sensibilidad a la desecacioacuten (Farrant et
al 1993) El aumento proteico en semillas puede deberse a distintas caracteriacutesticas
como acumulacioacuten de sacarosa y oligosacaacuteridos reduccioacuten de la superficie de las
membranas presencia y eficiencia en los sistemas antioxidantes y principalmente la
participacioacuten de mecanismos de reparacioacuten durante la rehidratacioacuten caracteriacutesticas
intriacutensecas de la planta que estaacuten sujetas a condiciones de presencia o ausencia de
proteiacutenas (Leprince et al 1995)
Graacutefica 18 Fluctuacioacuten en la cantidad de proteiacutenas totales en diferentes
porcentajes de contenido de humedad en C flexuosa
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
20
El anaacutelisis estadiacutestico de regresioacuten lineal mostroacute que no existe correlacioacuten (Rsup2 0058)
entre las variables de contenido de humedad y la cantidad de proteiacutenas encontradas en
las semillas de esta especie (graacutefica 19) Es decir que la cantidad de proteiacutenas presentes
en las semillas no se ven afectadas por los diferentes niveles de deshidratacioacuten
Graacutefica 19 Regresioacuten lineal en base al programa estadiacutestico Xlstat
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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Combinados de Escarificacioacuten y de Hidratacioacuten Parcial en la Germinacioacuten
de Semillas Envejecidas de Leguminosas Pastos y Forrajes Vol 26
No1 27-30
Shih Ming-Der Hoekstra Folkert amp Hsing Yue‐ie 2008 Late
Embryogenesis Abundant Proteins Institute of Plant and Microbial
Biology Academia Sinica Taipei 11529 Taiwan
Vargas G amp Pire R 2010 Efecto de dos condiciones de
almacenamiento en la germinacioacuten de semillas de uva de playa (Coccoloba
uvifera (L) Jacq) Villahermosa Tabasco Meacutexico Rev Fac Agron (LUZ)
27 559-573
26
Vaacutesquez T Corvera R Nimer G (2007) Viabilidad de semillas de
Shiringa (Hevea brasiliensis) sometidas a diferentes tratamientos de
almacenamiento Iquitos Peruacute Biodamaz 3-5
27
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Proteiacutenasrdquo Coacuterdoba Argentina Consultado el 12 de Diciembre del
2011 Disponible en httpwwwucoes
28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
21
CONCLUSIONES
En base a sus porcentajes de germinacioacuten tolerancia a la deshidratacioacuten y a
sus contenidos de humedad inicial de las semillas se podriacutea concluir que
Lafoencia acuminata y Senna alata son especies que presentan una tendencia
de comportamiento ortodoxo y en base a estos mismos paraacutemetros
Coccoloba ruiziana presenta una tendencia de comportamiento de
conservacioacuten intermedio
En el caso de Myrtus communis y Capparis flexuosa presentaron un alto
contenido de humedad inicial una poca tolerancia a la deshidratacioacuten y
porcentajes de germinacioacuten nula en sus uacuteltimos niveles (1096532) por
todo se podriacutea concluiriacutea que las semillas de las dos especies presentar una
tendencia de comportamiento recalcitrante
Mediante el anaacutelisis estadiacutestico regresioacuten lineal en el programa Xlstat y en la
prueba de Tukey podemos concluir que existe una correlacioacuten entre la
germinacioacuten de semillas y su deshidratacioacuten es decir que las semillas pierden
su viabilidad mientras su contenido de humedad desciende a excepcioacuten de
Coccoloba ruiziana que su viabilidad aumentoacute cuando su contenido de
humedad descendiacutea Y en el caso de las proteiacutenas y el contenido de humedad
no existe una correlacioacuten es decir que la cantidad de proteiacutenas no se ve
afectada por la deshidratacioacuten
En lo que se refiere a cuantificacioacuten de proteiacutenas todas las especies excepto
Myrtus communis presentan una concentracioacuten similar de proteiacutenas que a lo
largo de todo el proceso de deshidratacioacuten no varia demasiado Por lo que se
podriacutea concluir que la deshidratacioacuten no influye directamente en las
concentraciones de proteiacutenas encontradas en las semillas
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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Proteiacutenasrdquo Coacuterdoba Argentina Consultado el 12 de Diciembre del
2011 Disponible en httpwwwucoes
28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
22
RECOMENDACIONES
Realizar los procesos de extraccioacuten de proteiacutenas y contenidos de humedad el
mismo diacutea en que las semillas llegan al laboratorio para que el contenido de
humedad inicial de las semillas no se pueda ver afectado por factores
ambientales y no se tenga problemas con la deshidratacioacuten causada por el
ambiente externo
Se recomienda tambieacuten hacer estudios con especies que posean contenidos
de humedad inicial maacutes altos que los estudiados aquiacute para asiacute obtener mayor
informacioacuten uacutetil para la conservacioacuten de especies
Se debe realizar estudios posteriores de conservacioacuten de las semillas en
diferentes contenidos de humedad y con diferentes tiempos de conservacioacuten
para confirmar verdaderamente su comportamiento de conservacioacuten de las
semillas
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
23
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
24
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28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
25
Pukacka S amp E Ratajczak 2005 Antioxidative response of
ascorbateglutathione pathway enzymes and metabolites to desiccation of
recalcitrant Acer saccharinum seeds J Plant Physiol (En prensa)
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Zigoacuteticos Inmaduros de Aguacate Maacutelaga Espantildea Actas V Congreso
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Combinados de Escarificacioacuten y de Hidratacioacuten Parcial en la Germinacioacuten
de Semillas Envejecidas de Leguminosas Pastos y Forrajes Vol 26
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27 559-573
26
Vaacutesquez T Corvera R Nimer G (2007) Viabilidad de semillas de
Shiringa (Hevea brasiliensis) sometidas a diferentes tratamientos de
almacenamiento Iquitos Peruacute Biodamaz 3-5
27
ENLACES WEB
Berjak P amp Pammenter N Semillas Ortodoxas y Recalcitrantes Durban
4041 Sudaacutefrica Consultado el 16 de Abril del 2012 Disponible en
wwwrngrnet
Fernaacutendez E amp Galvaacuten A ldquoMeacutetodos Para la Cuantificacioacuten de
Proteiacutenasrdquo Coacuterdoba Argentina Consultado el 12 de Diciembre del
2011 Disponible en httpwwwucoes
28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
26
Vaacutesquez T Corvera R Nimer G (2007) Viabilidad de semillas de
Shiringa (Hevea brasiliensis) sometidas a diferentes tratamientos de
almacenamiento Iquitos Peruacute Biodamaz 3-5
27
ENLACES WEB
Berjak P amp Pammenter N Semillas Ortodoxas y Recalcitrantes Durban
4041 Sudaacutefrica Consultado el 16 de Abril del 2012 Disponible en
wwwrngrnet
Fernaacutendez E amp Galvaacuten A ldquoMeacutetodos Para la Cuantificacioacuten de
Proteiacutenasrdquo Coacuterdoba Argentina Consultado el 12 de Diciembre del
2011 Disponible en httpwwwucoes
28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
27
ENLACES WEB
Berjak P amp Pammenter N Semillas Ortodoxas y Recalcitrantes Durban
4041 Sudaacutefrica Consultado el 16 de Abril del 2012 Disponible en
wwwrngrnet
Fernaacutendez E amp Galvaacuten A ldquoMeacutetodos Para la Cuantificacioacuten de
Proteiacutenasrdquo Coacuterdoba Argentina Consultado el 12 de Diciembre del
2011 Disponible en httpwwwucoes
28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
28
ANEXOS
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Anexo 1
Procedimiento de Germinacioacuten de Semillas
Enjuague las semillas con agua destilada por varios segundos
Inmersioacuten alcohol al 70 por 2 minuto
Enjuague con agua destilada (repita este paso 3 veces)
Llevar las cajas Petri y las pinzas a la cabina de flujo laminar y dejar esterilizar por 15 minutos
Sembrar en cajas Petri utilizando como sustrato papel absorbente Expuestas a 12 horas de luz y 12 horas de obscuridad
Anexo 2
Tablas de los Resultados de Germinacioacuten () Lafoencia acuminata Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
1 000 000 000 000 000 000
2 3200 566 283 3200 566 283
3 1600 1131 566 4800 1697 849
4 1000 283 141 5800 1414 707
7 1600 000 000 7400 1414 707
10 600 849 424 8000 566 283
14 200 283 141 8200 283 141
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 2400 2828 1414 2400 2828 1414
10 4400 1697 849 6800 4525 2263
14 1000 1414 707 7800 3111 1556
20 1000 1414 707 8800 1697 849
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 1600 1131 566 1600 1131 566
10 3600 566 283 5200 566 283
14 1400 283 141 6600 849 424
22 400 566 283 7000 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
9 3200 566 283 3200 566 283
13 2800 000 000 6000 566 283
21 1400 849 424 7400 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
10 3000 283 141 3000 283 141
14 1400 283 141 4400 566 283
18 2600 283 141 7000 283 141
Senna alata
Contenido de humedad 12
DIacuteA GD sd se GA sd se
39 200 283 141 200 283 141
53 200 283 141 400 566 283
62 200 283 141 600 849 424
81 400 000 000 1000 849 424
105 200 283 141 1200 566 283
109 200 283 141 1400 849 424
131 200 283 141 1600 1131 566
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
18 200 283 141 200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA se
0 000 000 000 000 000 000
Coccoloba ruiziana
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
7 400 566 283 400 566 283
8 600 283 141 1000 283 141
9 600 849 424 1600 1131 566
10 200 283 141 1800 849 424
16 2600 849 424 4400 000 000
24 400 000 000 4800 000 000
27 400 000 000 5200 000 000
31 200 283 141 5400 283 141
34 200 283 141 5600 000 000
41 600 283 141 6200 283 141
Contenido de humedad 15
DIacuteA GD sd se GA sd se
5 600 283 141 600 283 141
6 1400 283 141 2000 000 000
7 800 000 000 2800 000 000
8 400 566 283 3200 566 283
9 200 283 141 3400 283 141
15 1000 283 141 4400 566 283
19 200 283 141 4600 849 424
23 200 283 141 4800 1131 566
26 200 283 141 5000 849 424
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Contenido de humedad 12 DIacuteA GD sd se GA sd se
3 400 000 000 400 000 000
4 400 000 000 800 000 000
5 1000 849 424 1800 849 424
6 200 283 141 2000 566 283
7 800 000 000 2800 566 283
13 1000 283 141 3800 849 424
17 600 283 141 4400 566 283
19 600 283 141 5000 849 424
28 200 283 141 5200 1131 566
38 200 283 141 5400 1414 707
Contenido de humedad 9
DIacuteA GD sd se GA sd se
8 3000 1414 707 3000 1414 707
12 1000 1414 707 4000 000 000
14 600 283 141 4600 283 141
16 600 283 141 5200 000 000
19 600 283 141 5800 283 141
23 200 283 141 6000 566 283
26 200 283 141 6200 849 424
33 600 283 141 6800 566 283
40 200 283 141 7000 283 141
54 200 283 141 7200 000 000
Contenido de humedad 6
DIacuteA GD sd se GA sd se
17 1000 849 424 1000 849 424
20 2600 849 424 3600 000 000
24 1200 566 283 4800 566 283
26 400 000 000 5200 566 283
31 400 000 000 5600 566 283
34 200 283 141 5800 283 141
39 400 566 283 6200 849 424
46 200 283 141 6400 1131 566
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Contenido de humedad 3
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 3000 849 424 3000 849 424
14 1000 283 141 4000 566 283
19 600 283 141 4600 283 141
26 400 566 283 5000 283 141
39 1200 000 000 6200 283 141
Contenido de humedad 2
DIacuteA GD sd se GA sd se
11 4400 000 000 4400 000 000
14 800 566 283 5200 566 283
19 400 566 283 5600 000 000
26 800 000 000 6400 000 000
32 200 283 141 6600 283 141
Capparis flexuosa
Contenido de humedad 40
DIacuteA GD sd se GA sd se
4 3800 849 424 3800 849 1049
6 4200 283 141 8000 566 766
11 800 566 283 8800 1131 566
Contenido de humedad 30
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 2200 283 141 2200 283 141
10 2400 000 000 4600 283 141
15 1400 283 141 6000 566 283
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Contenido de humedad 20
DIacuteA GD sd se GA sd se
6 1400 283 141 1400 283 141
10 3000 1414 707 4400 1131 566
15 1200 000 000 5600 1131 566
20 400 566 283 6000 566 283
Contenido de humedad 10
DIacuteA GD sd se GA sd se
0 000 000 000 000 000 000
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Anexo 3
Protocolo para Extraccioacuten de Proteiacutenas
Reactivos
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70
Aacutecido ascoacuterbico 005 M
Mercaptoetanol 01
Tritoacuten Xndash100 al 01
Agua destilada
Nitroacutegeno Liacutequido
Soluciones para la Extraccioacuten de Proteiacutenas
TrisndashHCl 001M
100ml
Tris-base 012114 gr
Agua destilada 70ml
Ajustar el pH a 7
Agua destilada Aforar hasta 100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 005M
100ml
Aacutecido Ascoacuterbico 08805gr
Agua destilada 100ml
Preparacioacuten de la Solucioacuten Tampoacuten de Extraccioacuten
100ml
Tampoacuten Tris ndash HCl 001 M pH 70 1ml
Aacutecido ascoacuterbico 005 M 5ml
Mercaptoetanol 01 100ul
Tritoacuten Xndash100 al 01 100ul
Agua destilada Aforar hasta
100ml
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Anexo 4
Protocolo para Cuantificacioacuten de Proteiacutenas Bradford
Reactivos
Reactivo de Bradford Sigma
Buffer de Extraccioacuten de Proteiacutenas
Suero Fetal Bovino (BSA-Sigma)
Extracto proteico de Senna mollissima Ipomoea carnea Capparis
flexuosa y Caesalpinia spinosa
Soluciones para cuantificacioacuten de proteiacutenas
Preparacioacuten de la solucioacuten madre
Solucioacuten Madre de ABS
Suero Fetal Bovino 4mg
Buacutefer de extraccioacuten 1ml
Preparacioacuten de la curva de calibracioacuten
Preparar una solucioacuten madre de ABS a una concentracioacuten de 4mgml diluyendo 4mgde
ABS en 10 ml de buffer de extraccioacuten de proteiacutenas A partir de esta solucioacuten inicial
preparar 7 estaacutendares en diluciones seriadas (4-2-1-05-025-0125-0054 mgml) para
elaborar las soluciones seriadas se disponen 6 tubos con 500ul de buffer de extraccioacuten
de proteiacutenas
De cada una de las diluciones se toman 5ul al cual se le antildeade 145ul de reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Preparacioacuten de las muestras
Tomar 5ul de cada una de las muestras a cuantificar y antildeadir 145ul del reactivo de
Bradford Se deja 15 minutos en oscuridad
Cuantificacioacuten en el Nanodrop
El procedimiento usado para la cuantificacioacuten de proteiacutenas totales en el Nanodrop fue el
siguiente
Para realizar la cuantificacioacuten poner las muestras de calibracioacuten en cubetas
las cuales se las colocaron una por una en el nanodrop Una vez prendida la
computadora ingresar en el programa escoger la opcioacuten Proteiacutenas de
Bradford Luego seleccionar la opcioacuten de cubeta de la medida y despueacutes la
ventana de curva estaacutendar
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
En la ventana de curva estaacutendar (a la derecha de al pantalla) ingresar los
valores de las diferentes diluciones (las colocamos de menor a mayor ejm
00540125025 asiacute hasta llegar al 4) Recuerde que debe estar seleccionada
la opcioacuten add to report para grabar los datos
Antes de correr las muestras colocar una muestra como blanco que puede ser
agua (aproximadamente unos 200 ul) y presionar la tecla Blank Finalmente
correr en las cubetas cada una de las muestras en nuestro caso de cada uno
de los niveles de deshidratacioacuten
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Anexo 6
Anaacutelisis Estadiacutestico resultados y graacuteficas de Tukey en el programa R
Lafoencia acuminata
aovlafo=aov(germinacion~nivellafo)
summary(aovlafo)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 5 39065 78130 10388 2326e-08
Residuals 126 94768 7521
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Senna alata
aovsenna=aov(germinacion~nivelsenna)
summary(aovsenna)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 113860 284649 30582 lt 22e-16
Residuals 650 60499 931
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Coccoloba uvifera
aovcoco=aov(germinacion~nivelcoco)
summary(aovcoco)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 7 17483 249754 59996 1113e-06
Residuals 424 176505 41629
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level
Capparis flexuosa
aovcappa=aov(germinacion~nivelcappa)
summary(aovcappa)
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(gtF)
nivel 4 88672 221681 31142 lt 22e-16
Residuals 95 67624 7118
Signif codes 0 bdquo‟ 0001 bdquo‟ 001 bdquo‟ 005 bdquo‟ 01 bdquo ‟ 1
Tukey multiple comparisons of means
95 family-wise confidence level